JPS63223561A - 試料精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）試料の精製操作
の自動化に好適であり、特にフェノールを用いて蛋白質
を変性させ遠心分離してフェノール層（下層）と水層（
上層）とに分けた後に行う水層の採取動作に好適な試料
精製方法に関する。

〔従来の技術〕

ＤＮＡ試料の精製プロセスは、まずＤＮＡ試料と酵素等
の蛋白質が混合した溶液にフェノールを注入混合するこ
とによって蛋白質を変性させ不溶化し、遠心分離して水
層にＤＮＡを残し、フェノール層と水層の境界面に蛋白
質を分離する。次いで目的とするＤＮＡを得るため、Ｄ
ＮＡを含む水層のみを採取し、これにエタノールを添加
して水層に溶解しているＤＮＡを沈殿させ、遠心分離し
て沈殿を集め、７０〜８０％エタノールで洗浄して塩類
を除く。ＤＮＡを含む水層を得るための従来の方法は、
二層に分離した液の上層のＤＮＡを含む水溶液を実験者
がピペッティング操作により吸引し目的とするＤＮＡ試
料を得ｔいた。かかる操作の類似操作を自動化する方法
として、特公昭５６−５１２９９号が開示されて詔り、
その方法は分岐端の一方よ°り光が入射され、他方より
二層の境界面からの反射光が受光される投受光軸を構成
し、これを液中に挿入して直接境界面を検知しながら別
に設けた吸引ノズルにより、上層の液を吸引し採取する
ものであった。

〔発明が解決しようとする問題点３ μｍオーダのＤＮＡ試料液をフェノールを用いて精製抽
出する場合のように堰板試料量が少ない場合、種々の操
作の利便性等から、容量１．５ｍｇ糧度の小型の容器が
使用されている。かかる精製プロセスを自動化するため
には、実験者のピペッティング操作によるＤＮＡ試料の
吸引採取は採用出来ない。自動化のひとつの方法として
前記従来技術（特公昭５６−５１２９９号）を用いると
すると、以下の問題点がある。すなわち上記光検知手段
を用いることは試料容器の大きさの点で寸法的に難しい
ばかりでなく、また装置の動作を制御する方式も複雑に
なるので、装置のハード、ソフト共に負担が増すという
問題点があった。

本発明の目的は上記問題点を解決し、μｍオーダのＤＮ
Ａ試料をフェノールを用いて精製する場合に好適な方法
を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本プロセスの特徴は、フェノールを注入する量が予め設
定されていることである。

上記目的は容器内で試料溶液とフェノールを混合し遠心
分離した後に、容器下方に位置するフェノールを前記分
注装置を用いて供給したフェノールと同量もしくはこれ
以上の量を吸引除去する方法を採用することによって達
成される。

〔作用〕

ＤＮＡ試料と酵素等の蛋白質が混合した溶液にフェノー
ルを注入混合することによってまず蛋白質を変性させ不
溶化する。次に遠心分離して水層にＤＮＡを残し、フェ
ノール層と水層の境界面に蛋白質を分離する。ここでＤ
ＮＡを含む水層のみを採取することが課題であるが、本
発明で開示した方法では、容器の下端に分注装置の先端
（分注用チップ）を位置させ、この状態で先にフェノー
ルを注入したのと同量かまたはそれ以上の量の液体を吸
引し適当な場所に廃棄し残った水溶液より目的とするＤ
ＮＡを精製する０ 〔実施例〕 第２図はこの発明に係る試料自動処理装置の概要図であ
る。本装置は、複数の容器８の間に液体試料の移動を行
なう分注装置１５、分注用チップ１（第１図）及び容器
８を搬送する搬送台９ａ及び搬送機構９ｂ　、　９ｃ　
、容器８中の溶液を遠心分離する遠心分離機１６．容器
８中の溶液を混合する混合機１７９以上の機械要素の動
作を制御するコントローラ１０９分注用チップ１．容器
８並びに試料試薬等の供給部１８よりなる。

次に本発明に係る試料精製方法について説明する。本方
法は、容器８内で試料溶液とフェノールを混合し遠心分
離した後に、容器下方に位置するフェノール層１４を分
注装置を用いて除去し、容器上方に位置するＤＮＡを含
む水＃１３を得るものである。すなわち巣１図の動作状
態図において、分注用チップ１を着脱する摩擦契合部２
．摩摩擦台部２上部に位置する胴体部３．摩摩擦台部２
及び胴体部３を貫く大気連通孔４．大気連通孔４内を上
下移動するプランジャ５．モータ５ａ、カップリング６
ｂ、ボールネジ５ｃ、プランジャ保持部材６ｄ、プラン
ジャの上下移動部６ｅ、軸受部材６ｆよりなるプランジ
ャ駆動機構６．モータ７ａ、回転動力変換機構７ｂ、軸
受部材７ｃ。

７ｄよりなる上下方向駆動機構７．コントローラ１０、
胴体部３の外側をしゆう動する分注用チップ押出し部材
１１１分注分注用チップ取外材１２よりなる分注装置を
用いて、分注用チップ１先端を容器８の底部に位置させ
、この状態でプランジャ５を上昇させてフェノール層１
４を分注用チップ１内に吸引する。このフェノール層吸
引量の設定値は、予め、注入したフェノール量と同量で
もよいが、分注装置１５の精度に応じて安全サイドにた
った設定をすることもできる。例えば注入したフェノー
ル量が５０μｍの場合を考える。分注装置１５の精度が
±１μ−程度であるとすると、フェノール層吸引量の設
定値Ｘμｍとして少なくとも２μｍ多めに設定しておく
と、 フェノール残存量＝（５０±１）−ｘ ＝（５０±１）−（５２±１） ≦Ｏ となり、μｍオーダでフェノールが溶液中に残存するこ
とはない。フェノール層１４を吸引した後には、分注用
チップ１を所定位置に廃棄し、他方ＤＮＡを含む水層１
３が残っている容器８はそのまま次のプロセスに利用す
る。本方法には操作が容易ということだけでなく、上層
１３を採取して新しい容器に移す場合と比較して、容器
を新たに供給する必要がないという利点もある。

下層のフェノールを除去する方歩と上層のＤＮＡを含む
水層を採取して新らしい容器に移す方法の２つの方法を
用いた場合のＤＮＡクローニング結果を比較した。いず
れのフェノール抽出方法でも目的とする結合ＤＮＡを学
童できることが明らかになった。本発明の下層のフェノ
ール除去方法は簡単にＤＮＡ試料からフェノールを除去
することができる点で、上層のＤＮＡを含む水溶液を採
取する方法よりも有効である。

第３図はこの発明に係る他の試料自動処理製電の動作状
態図で、弾性部材１９を容器８の下部に設け、分注用チ
ップ１の先端が容器８の底部に接触する高さにくるよう
位置決めしたときの状態を示す。弾性部材１９を容器８
の下部に設けたことにより、その長さに多少のばらつき
が存在する分注用チップ１先端が容器８の底に衝突する
場合には、弾性部材１９が収縮して容器８が下方に移動
するので分注用チップ１が破損する恐れはなく、分注用
チップ１の精密な位置決めが不要であるという効果があ
る。

Ｏ下層のフェノール層を直接吸引除去する簡単な操作方
法では溶液中に少しフェノールが残存することも考えら
れるが、次のエタノール沈殿操作でフェノールが除かれ
るので、次反応（ＤＮＡ結合反応）に影響しなかった。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の試料精製方法を用いるこ
とにより二層境界面の検知、演算あるいは分注装置先端
の位置決め制御等の複雑な動作を行うことなく、簡単に
試料水溶液からフェノールを除去できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の試料精製方法に使用される装置の動作
状態図、第２図は本発明の試料精製方法を実施する試料
自動処理装置概要図、第３図は他の実施例における動作
状態図である。 １・・・分注用チップ　５・・・プランジャ　６・・・
プランジャ駆動機構　８・・・容器　９・・・容器・分
注用チップ搬送機構　１３・・・ＤＮＡを含む水層１４
・・・変性蛋白質を含むフェノール層１５・・・分注装
置　１６・・・遠心分離器　１７・・・混合機　１９・
・・弾性部材 代理人弁理士　小　川　勝　男　７ （′

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、容器内で試料水溶液とフェノールを混合後、遠心力
   の作用により上層（試料水溶液）、下層（フェノール）
   の二層に遠心分離した後、試料水溶液を採取し試料水溶
   液中に含まれる試料を精製する方法において、液の吸引
   除去を行なう分注装置の先端部を容器の底部まで挿入し
   、供給したフェノールと同量もしくはそれ以上の量を吸
   引除去して試料水溶液を得る試料精製方法。