JPS63216479A - エンベロープ含有ウイルスの不活化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はイン・ビトロで細胞を用いて、特にハイブリド
ーマ法または遺伝子操作により調製されたタンパク質の
調製物中においてエンベロープ含有ウィルスを、前記タ
ンパク質の生物学的活性を保有したままで非イオン界面
活性剤で処理することにより不活化する方法に関する。

かかるタンパク質調製物としては例えばモノクローナル
抗体があげられる。モノクローナル抗体産生性の細胞系
統は、第一次８９７３球を適当な、永久に増殖しうる細
胞系統と融合させていわゆるハイブリドーマとなすか、
またはヒトモノクローナル抗体を得るために第一次ヒト
Ｂリンハ球をエプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ）ウィルスを用いて不死化することにより取得
される。融合に適するマウスの細胞系統はしばしばマウ
スのレトロウィルスまたは他のエンベロープ含有ウィル
スを含有しており、これらは大抵は生成するハイブリド
ーマ中においても検出されうる。エプスタイン−バール
ウィルスの感染により得られた、モノクローナル抗体を
産生するヒト細胞系統はエプスタイン−バールウィルス
粒子を含有しうる。

モノクローナル抗体が治療剤として認可されるにはウィ
ルスにより汚染された細胞系統から導かれた抗体調製物
をウィルス不活化またはウィルス除去する必要がある。

ヨーロッパ特許Ａ　−０，０９９，４４５号には、血漿
またはその誘導体中の肝炎ウィルスがアルコール類、エ
ーテル類または非イオン界面活性剤での処理により如何
にして不活化されうるか記載されている。

今驚くべきことに、非イオン界面活性剤トリドア　（Ｔ
ｒｉｔｏｎ）’！ＤＸ　−１００およびノニデット（Ｎ
ｏｎｉｄｅｔ）■Ｐ−４０が低温例えば４℃および例え
ばｌ＋ｘＱ／ｌｏｏｍαに等しいかまたはそれより低い
濃度で抗体溶液中のエンベロープ含有ウィルスを、前記
抗体の免疫反応性を損なうことなく不活化することが見
出された。

それゆえ本発明はイン・ビトロで細胞を用いて調製され
たタンパク質の溶液中においてエンベロープ含有ウィル
スを不活化するにあたり、この溶液に非イオン界面活性
剤を加えそしてこの混合物を放置することからなる方法
に関する。

イン・ビトロで細胞を用いてタンパク質を調製する方法
の例をあげればハイブリドーマ法または遺伝子操作法で
ある。

本発明における好ましいエンベロープ含有ウィルスはレ
トロウィルスおよびエプスタイン−バールウィルスであ
る。

かかる非イオン界面活性剤は好ましくはポリオキシエチ
レンに基づくもの、例えばそのエーテルおよびエステル
類、そして特にトリトンＸ−１００またはノニデットＰ
−４０である。

かかる界面活性剤はまた何ら外部の電荷を有しないある
ｐＨ範囲の双性イオン性界面活性剤であることもできる
。

このものが使用される最大濃度は生物学的活性を実質的
に損なわない濃度、すなわち抗体溶液１００＋ｍｆｆ当
り２ｇまで、そして好ましくは０．４〜０．６麓ａで使
用される。

この方法は凍結点より高い温度から室温まで、好ましく
は２〜ｌｏ’ｏで実施される。

この界面活性剤は、感染性のウィルスが何ら検出され得
なくなるまで作用させる。処理時間は少なくとも１分間
である。しかしながら抗体の免疫反応性が実質的に損な
われないならばそれより長いインキュベーション時間、
例えば２４時間作用させることも可能である。単純ヘル
ペスウィルスまたはラウス肉腫ウィルスは１時間のイン
キュベーション後ですでに完全に不活化される。このこ
とは、非イオン界面活性剤の存在下に４℃で１時間イン
キュベーションすることはエンベロープを有するウィル
スを殺すのに充分ではあるが、より高い安全性が要求さ
れる場合はインキュベーション時間をより長くすること
も可能であることを意味する。

この方法は、感染性かつエンベロープ含有性であるウィ
ルスを含まない感受性タンパク質、例えばハイブリドー
マ法または遺伝子操作により細胞培養物中において得ら
れるタンパク質を調整するのに適する。

実施例 ■、抗体調製物中における単純ヘルペスウィルスの不活
化 エプスタイン−バールウィルスは生育困難で低濃度でし
か得られないので、高濃度で得ることができ、従って本
発明方法の高い不活化率が示される他のヘルペスウィル
スが用いられた。

モノクローナル抗体調製物（ＭＡｂ）　４７．５ｒａＱ
をｌＱＱｍ１２／１２のトリトンＸ−１００水溶液２．
５＊αと４℃で混合した。この混合物４５ｍｇを単純ヘ
ルペスウィルス調製物５ｍｆｆと混合した（第１表の２
）。次にこの混合物を４℃で最高８時間までインキュベ
ーションした。１．４および８時間後にウィルス力価を
検べるために試料を採取し、直ちに氷冷した細胞用培養
基で希釈しそして試験を行うまで一８０℃で冷凍した。

界面活性剤を含有する混合物と平行してウィルス試料を
モノクローナル抗体調製物を用いてｉ：ｔｏに希釈しく
１）そしてこの混合物を同様に４℃で８時間インキュベ
ーションした。これは対照として用いられた。

その結果を第１表にまとめる。

第１表 ンキュベーション） ウィルス＋ＭＡｂ（１）　　　　　　　５．４４　　　
ｎ、ｄ、＊　　　ｎ、ｄ、　　５．４０本　　ｎ、ｄ、
　ｍ測定されず 林　ウィルス調製物の力価を基準とするトリトンＸ−１
００添加前の力価 材木　培地１００顧中に希釈された試料１１１ＱＸ２は
感受性の細胞培養物中において感染性ウィルスを含まず
２、ラウス肉腫ウィルスの不活化 これまでハイブリドーマ細胞中に検出されたレトロウィ
ルスはイン・ビトロで充分に良好には生育できないので
、適当な細胞系中で生育して高力価調製物として得られ
、かつ感染性ウィルスであるので適当な試験系において
定量的に検出されうる鳥類レトロウィルスであるラウス
肉腫ウィルスがこの検査に用いられた。

試験条件は単純ヘルペスウィルスについてのそれと同じ
である（実施例１参照）。但し希釈度は１：５であった
。その結果を下記第２表に示す。

第２表 モノクローナル抗体調製物中におけるラウス肉腫ウィル
スの不活化 ウィルス　　　　　　　４．９　　　ｎ、ｄ、本　　ｎ
、ｄ。

＊　　ｎ、ｄ、−測定されず 零＊　ウィルス調製物の力価を基準とするトリトンＸ−
１ｏｏ添加前の力価 ＊林培地１００ｍ１２中に希釈された試料１ｍ（２Ｘ２
は感受性の細胞培養物中において感染性ウィルスを含ま
ず ３、界面活性剤で処理したモノクローナル抗体の免疫反
応性 モノクローナル抗体ＢＷ４９４／　３２および４９５／
　３６（：ｌ−０ツバ特許８６，１１１，７０８．３）
オＪ：び４３１／２６゜４３１／３１．２５０／１８３
および３７４／　１４（ヨーロッパ特許Ａ−０，１６０
，８９７）の調製物を以下のように処理した。

それぞれ４．７５ｍＱずつのハイブリドーマ上澄み液（
ＭＡｂ濃度−２０μ９／講Ｑ）を２５０μαずつ１００
ｍ１Ｉｆｆ／１２トリトンＸ−１００水溶液と混合しそ
して４℃で１８時間インキュベーションした。Ｌ４．８
および１８時間後に試料を採取しそして各モノクローナ
ル抗体がその特異的な抗原と反応しうる能力をバイオ・
ドツト（Ｂｉｏ　Ｄｏｔ）アッセイにより定量的に測定
した（　ｒｒｎｔ、　Ｊ、ＣａｎｃｅｒＪ　３６゜（１
９８５）　７５−８４）　、　、：の目的にはトリトン
Ｘ−１００とインキュベーションしたＭＡｂ溶液２００
μαずつを連続希釈における最初の抗体として用い、そ
の特異的な免疫反応性を測定した。

低希釈度における検査されたすべてのＭＡｂ（ＭＡｂ４
９４／３２以外）の、対応する特異的な抗原への結合が
トリトンＸ−１００の存在下に阻止されること、しかし
さらに希釈すると免疫反応性は再び完全に出現する（ト
リトン添加なしの対照に匹敵）ことが示された。すなわ
ち界面活性剤とのインキュベーションは免疫反応性の可
逆的遮断をひき起すのみである。

ウィルスを不活化するために界面活性剤で処理されたモ
ノクローナル抗体の特異的な免疫反応性は損われていな
い。

外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）イン・ビトロで細胞を用いて調製されたタンパク質
   の溶液中においてエンベロープ含有ウィルスを不活化す
   るにあたり、この溶液に非イオン界面活性剤を加えそし
   てこの混合物を放置することからなる方法。 ２）非イオン界面活性剤として両性イオン界面活性剤が
   用いられる請求項１記載の方法。 ３）前記タンパク質がハイブリドーマ法または遺伝子操
   作により調製されたものである請求項１記載の方法。 ４）前記界面活性剤が場合によりエーテル化またはエス
   テル化されていてもよいポリオキシエチレンである請求
   項１記載の方法。 ５）前記界面活性剤がトリトンＸ−１００またはノニデ
   ットＰ−４０である請求項１記載の方法。 ６）前記界面活性剤が抗体溶液１００ｍｌ当り２ｇまで
   、好ましくは０．４〜０．６ｍｌの濃度で使用される請
   求項１記載の方法。 ７）界面活性剤を含有する前記溶液を凍結点より高い温
   度から室温までの温度、好ましくは２〜１０℃で放置す
   ることからなる請求項１記載の方法。 ８）界面活性剤を含有する溶液を１分〜４８時間放置す
   ることからなる請求項１記載の方 法。