JPS6293233A - Ｄｎａ及びそれを有する微生物を用いる抗腫瘍性ポリペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ＤＮＡ詳しくは抗１１ｆｆｉ瘍性ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ及びそれを有する微生物を用い
る抗腫瘍性ポリペプチドの製造法に関する。

〔従来の技術〕

Ｌ−９２９マウス繊維芽細胞に対し毒作用を有するヒト
超厚の抗腫瘍性ポリペプチドとしては、ＴｈｅＪｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　　２６
０．　２３４５−２３５４．　　（１９８５）に記載さ
れているヒト細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ２４０）より
得られたＴＮＦと名付けられたポリペプチドが知られて
いる。このポリペプチドは、そのアミノ酸配列も殆ど全
部が知られている。

更に、ＴＮＦと名付けられたポリペプチドは、組換えプ
ラスミドにより形質転換された大腸菌により生産される
ことも知られている（Ｎａｔｕｒｅ。

３１２、　７２４−７２９．　　（１９Ｂ４．　１２゜
２０／２７）、Ｎａｔｕｒｅ、　　３１３．　８０３−
８０６゜（１９８５，２，２８）、５ｃｉｅｎｃｅ、　
　２２８゜１４９−１５４．　　（１９８５，４，１２
））　　。

これらの形質転換された大腸菌により産生されるポリペ
プチドも又、クローン化されたＤＮＡの塩基配列より推
測すればＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ。

ＣｈｅＩｌｌ、、　２６０に記載されたものと同じであ
り、またＮａｔｕｒｅ、　　３１３に記載されたものは
、上記ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸の２個即ち、バ
リンとアルギニンが欠落している点が相違するのみであ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

この発明の目的は、畝上のような状況下において、ＴＮ
Ｆとしての活性を有する新規な抗腫瘍性ポリペプチドを
コードする遺伝子及びその遺伝子を利用することにより
新規な抗腫瘍性ポリペプチドを製造する方法を見い出す
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕 本発明者等は畝上の、目的を達成するものとして、下記
のアミノ酸配列をコードする遺伝子を得ることに成功し
、この遺伝子を用いて新規な抗腫瘍性ポリペプチドを製
造する方法を見い出した。

Ｘ−へｌａ−へ５ｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−八Ｉａ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−
Ａｓｎ−Ａｒｇ−へｒｇ−Ａｌａ−へ５ｎ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−八ｌａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｕ−Ｌａｕ−へｒｇ−へｓｐ−へ５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｖａ　Ｉ　−ｔ’ｒｏ−５ｅｒ−、Ｇ　Ｉｕ
−Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ
−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｇ　１ｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｔ　ｉｓ　−Ｖａ　Ｉ　−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−ＩＩ　ｉｓ−Ｔｈｒ−［１ｅ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−１１ｅ−Ａ　１ａ−Ｖａ　Ｉ　−３ｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　−Ｖａ　ｌ−Ａｓｎ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−３
ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−八１ａ−Ｇｌｕ−＾１ａ
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌｕ−Ｐｒｏ
−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａ
　ｌ　−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−へｓｐ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−八１ａ−Ｇ
ｌｕ−１１ｅ−へｓｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−へ５ｐ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−＾３ｐ−Ｐｈｅ−八Ｉａ−Ｇｌｕ−３ｃｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｃ−Ｇｌｙ−
１１ｅ−Ｔｌｅ−八１ａ−ＬｅｕここでＸは、アミノ酸
敗１〜３９個のペプチドであり、具体例としては以下の
ものがある。

（１）翻訳開始コドンとしてのＭｅｔ （２）翻訳開始コドンとしてのＭｅｔに続＜　　Ｔｈｒ
−ＭｅＬ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−３ｅｒ−５ｅｒ−
３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−八ｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−＾１ａ−Ａｒｇ−Ｍｅむ−Ｔｒ
ｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ
−１１ｉｓ−Ｔｈｒ−＾５ｐ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

（３）翻訳開始コドンとしてのＭｅｔにＶｔ＜　　Ｖａ
ｌ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｓｅｒ−＾ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
−Ｓｅｔ−八５ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌへ八１ａ−
１１ｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ′４）翻訳開始コドンとして
のＭｅｔに続（Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−５ｅｒ−５ｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｃｒ−八５ｐ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−へ１ａ−１１ｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
（５）翻訳開始コドンとしてのＭｅＬに続＜　　Ｔｒｐ
−八ｒｇ−Ｖａｌ−＾ｓｎ−＾ｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−
１１ｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

本発明のＤＮＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒ
ｅｓ　１０　＋７４３９−７４４８　　（１９８１）　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７．１２５７−１２６７　
（１９７８）等に記載されている方法により、化学的に
合成することができるが、ヒト骨髄性白血病細胞Ｔ　Ｈ
Ｐ　−１のゲノムＤＮＡより本発明のＤＮＡを得る。よ
り具体的な方法は、実施例にて詳しく述べる。

得られたＤＮＡを用いて抗腫瘍性ポリペプチドを得るに
は、このＤＮＡを適当なベクターＤＮＡに発現されるよ
うに組込み、得られた組換えＤＮＡを用いて、動物細胞
、酵母、枯草菌、大腸菌等の微生物等の宿主を形質転換
する。

本発明のＤＮＡを、ベクターＤＮＡに発現可能なように
組込むには、よ（知られているようにプロモータ配列（
通常オペレータ配列の下流に存在している）、その下流
にＳＤ配列を有するベクターＤＮＡのＳＤ配列の下流に
本発明のＤＮＡを組込むか、ベクターＤＮＡに本発明の
ＤＮＡを組込んだ後に、その上流にプロモータ配列（通
常オペレーター配列も）及びＳＤ配列を挿入すればよい
。

組換えＤＮＡ技術により外来遺伝子の遺伝情報を微生物
細胞内で発現せしめる方法は、［遺伝子組換え実用化技
術（４）　Ｊ　　（１９８，３年）サイエンスフォーラ
ム社、　　ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｔｎｇ　Ｊ
　Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　　（１９８２
）　＋　　’組換え遺伝子の細胞への導入と発ＪｊＬ　
　（１９８３）（共立出版株式会社）等に一般的手法が
記載されている。

より具体的には、大腸菌を宿主として用いた場合の例を
実施例に記載した。

また、酵母を宿主として用いるときは、以下のようにし
て本発明のＤＮＡの遺伝情報を発現せしめることができ
る。

アルコールｍ　水素酵素（ＡＤＨＩ）のプロモーターを
挿入したプラスミドベクターｐＭＡ５６（Ｎａｔｕｒｅ
　　２９８．３４７−３５０　（１９８２））は、プロ
モーター下流にＥ　ｃｏ　ＲＥ部位を有しているため、
実施例（２）に記載しであるＤＮＡをｐＵｃ５４０ＴＮ
’２１／２２．ｐＵｃ５４０”’６９／７０．又はｐＵ
Ｃ５４０ＴＮ’７２／７３よりＢａｍＨＩ、ＰｓＬＩ断
片として回収し、ｐＭＡ５６のＡＤＨプロモーター下流
のＥｃｏＲ１部位にＥｃｏＲ１，ＢａｍＨＩリンカ−、
Ｂａｔａｌｌｌ、　　Ｐｓｔｌリンカ−を用いて挿入す
ればアルコール脱水素酵素（ＡＤＨＩ）プロモーターの
支配になり、酵母で発現可能となる。

また、抑制酸性フォスターゼ（ＰＨ０５）プロモーター
を有するｐＡＭ　８２　　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、８０　１−５（１９８３））は、ＰＨ０５プロ
モーター下流にＸｈｏ１部位を有するため、実施例（２
）に記載しであるＤＮＡ−ｔ−ｐ　ＵＣ５４０””２１
／２２．ｐＵｃ５４０ＴＮ’６９／７０．又はｐＵｃ５
４０ＴＮ’７２／７３　（抗腫瘍性ボリペブ　。

チド）よりＢａｍＨＩ　、　　Ｐｓｔ　Ｉ断片として回
収し、ｐＡＭ８５．ｐＡＭ８２のＰＨ０５プロモーター
下流のＸｈｏ１部位にＢａｍＨＩ　／　Ｘｈｏ　Ｉリン
カ−２Ｐｓｔｌ／Ｘｈｏｌリンカ−を用いて挿入すれば
抑制性酸性フォスターゼプロモーターの支配になり酵母
で発現可能となる。

また、枯草菌を宿主として用いることは、以下のように
して本発明のＤＮＡ遺伝情報を発現せしめることができ
る。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｉｔｉ目ｓ　Ｍａｒｂｕｒｇ
株の有するα−アミラーゼプロモーターを有するｐＴＵ
８２８５（Ｇｅｎｅ、　　３４．　１−８　　（１９８
５）　）は、プロモーター及びシグナルペプチドの下流
にＨ４ｎｄＩ１１部位を有しているため、実施例（２）
に記載されているＤＮＡをｐＵｃ５４０ＴＮ’２１／２
２．ｐＵＣ５４０”’６９／７０又はｐ　ＵＣ５４０”
’７２／７３より、ＢａｍＨＩ　、　　Ｐｓｔ　Ｉ断片
として回収し、ｐＴＵＢ２８５のＨｔｎｄｌＩＩ部に、
シグナルペプチドのアミノ酸フレームと合うような、Ｈ
ｉｎｄｌ［Ｉ／ＢａｍＨＩリンカ−、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ／
ＰｓＬＩリンカ−を用いて挿入してやればα−アミラー
ゼプロモーター支配をうけ、枯草菌でも発現可能となる
。

形質転換された宿主細胞が生産した抗腫瘍性ポリペプチ
ドは、以下のようにして分離、精製することができる。

宿主細胞を遠心分離などによって集め、超音波あるいは
リゾチームなどの処理方法を用いて細胞を破砕する。こ
のとき低張液を用いるが、ＳＤＳなどの界面活性剤や塩
酸グアニジンなどの蛋白変性剤を共存させた方が良い結
果が得られる場合もある。細胞破砕液は遠心分離に付し
上清液を得る。

このようにして得られる抗腫瘍性ポリベブチドを含む破
砕上清液は通常の蛋白質の精製法に阜じて精製され、本
発明の抗腫瘍性ポリペプチドが精製される。即ち、塩基
性陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィー
、塩析法、透析法。

ゲル濾過法、疎水クロマトグラフィー、高速分子篩クロ
マトグラフィー、電気泳動法等を順次又は適宜組み合せ
ることによって精製される。以下、更に具体的に説明す
る。塩基性陰イオン交換体としてはＤＥＡＥ−セファデ
ックスＡ−２５，Ａ−５０、ＤＥＡＥ−セファロースＣ
Ｌ−６８゜ＤＥＡＥ−セファミル（以上、ファルマシア
社製）が好ましく、その他ジエチルアミノ基、アミノエ
チル基または四級化アミノエチル基含有陰イオン交換体
等も使用される。使用される緩衝液としてはｐＨ６，０
〜９．０のトリス−塩酸塩またはリン酸緩衝液が望まし
く、これら０．０５Ｍ程度の希薄な緩衝液で抗腫瘍性ポ
リペプチドの培養液を稀釈し、塩濃度０．１Ｍ以下の溶
液としてて陰イオン交換体と接触せしめて抗腫瘍性ポリ
ペプチドを吸着させる。抗腫瘍性ポリペプチドの溶出は
０．１〜０．２　Ｍの食塩又は塩化カリウム等の塩類溶
液で行なわれ、抗腫瘍性ポリペプチドは０．２　Ｍ付近
の塩濃度で溶出される。当該陰イオン交換体との接触は
カラム法が望ましいが、大量の場合にはバッチ法も採用
される。

陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう前に、前処理
として限外濾過膜で低分子物質を除去することが望まし
く、精製効果を上げることが出来る。

陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶液は透析
後、濃縮してゲル濾過に付される。ゲル濾適用の担体と
してはセファデックスＧ−７５゜Ｇ−１００（ファルマ
シア社製）、セファクリルＳ−２００（ファルマシア社
製）、バイオゲルＰ−１００（バイオランド社製）及び
トーヨーハールＨＷ−５０，ＨＷ−５５（東洋曹達工業
社製）等が使用される。ゲル濾過に使用する緩衝液は１
）Ｈ６，Ｏ〜９．０のトリス−塩酸塩またはリン酸緩衝
液が使用され、吸着を防ぐ目的で０．２〜０．５Ｍの食
塩等の塩類を添加して使用すことが望ましい。

また、陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた抗腫
瘍性ポリペプチド活性溶液は疎水クロマトグラフィーで
精製することもでき、この場合はブチルート−ヨーバー
ル６５０　（東洋曹達工業社製）等を担体とし、硫安２
食塩等の塩類を用いて抗腫瘍性ポリペプチドを溶出せし
める。

ゲル濾過あるいは疎水クロマトグラフィーで精製した抗
１１ｆｆｌｉ性ポリペプチド含有液は、次いでＭｏｎｏ
　Ｑ　ＨＲ５１５カラム（ファルマシア社製、高性能陰
イオン交換体カラム）を使用するファルマシアＦ　Ｐ　
Ｌ　Ｃ（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、　　Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ。

Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、　　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　）システムによる高性能
陰イオン交換クロマトグラフィーに付され、精製標品が
得られる。

この高性能陰イオン交換体クロマトグラフィーの条件は
最初のＤＥＡＥ−セファローズ等の担体を使用する陰イ
オン交換クロマトグラフィーの場合と同じ条件下である
。

本発明の抗腫瘍性ポリペプチドは以下のように定性及び
定量分析できる。即ち、標的細胞であるＬ−９２９細胞
　（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、　　Ｕ、Ｓ、八。

７２．３６６６−３６７０）をイグールミニマムエッセ
ンシャル培地（以下ＭＥＭと記す）に５％仔牛脂児血清
を加え育成し、８Ｘ１０’細胞がｌＯＯμｌの同上培地
に含まれる様にし、９６大の平底プレートに育種する。

育種条件は３７℃、２時間５％ＣＯ□１００％Ｈ２０で
通常細胞培養に用いられる方法でよい。その後アクチノ
マイシンＤを培地中に終濃度１μｇ１ｍｌとなる様に加
え、培養液の液量を１５０μｌとする。即座に検体を適
当にＭＥＭ培地で稀釈したものを５０μ！加える。この
際ｆ４釈率を適宜調製し、ＥＤ５０を求める事ができる
。更に最終液量２００μｌとなったＬ９２９細胞を上記
条件で１８ｈｒ培養を継続する。細胞壊死活性は、まず
全培地を除去し、ここに０．２％クリスタルバイオレッ
トを含む２％メチルアルコール溶液を加え固定染色する
。クリスタルバイオレットは全有核細胞を染色し細胞壊
死を生じた結果フラスコ底面より遊離した細胞は染色さ
れないので、細胞壊死活性を直接測定できる。この染色
度をＯＤ５９０ｎｍの吸収で測定し、対照群に対する染
色度と比較する事で細胞壊死活性を測定する。活性の定
義は次の様に行う。

Ｌ９２９細胞が５０％生存できる検体原液の稀釈率を原
液のｌｎｊ！あたりの活性とする。即ち原液の１倍稀釈
でＥＤ５０を与える検体の活性は１単位／　ｍ　１であ
る。

実施例 （１）ｉ腫　主ポリペプチドの生産 ５％牛脂児性血清を有するＲＰＭＩ−１６４０無菌培地
２００１を３００１容培養槽に張り込み、この培地にＴ
ＨＰ−１細胞を２Ｘ１０’個／ｒｍ（１になるように懸
濁した。これを３７℃で４日間培養し、得られた培養液
を遠心分離してＴＨＰ−１細胞を無菌的に採取した。こ
の細胞を別の培養槽に入れた血清を含まない上記ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地２００７！に移し、これにＴＰＡを１
１００ｎ／ｍｅ添加し、ゆるやかに液を攪拌（１００ｒ
、ｐ、ｍ、）しつつ無菌的条件下３７．０℃で５日間培
養（誘導）を行った。このようにして得られた培養液を
遠心分離して細胞を分離、除去してｉ、５Ｘ１０３単位
／　ｒａ　ｌの抗腫瘍性ポリペプチド活性を有する培養
液を得た。このようにして得られた培養上清液を限外濾
過膜（ミリボア社製、ＨＶＬＰ　　０ＨＶ２０）で１／
１０量になるまで濃縮した。この濃縮液に固形硫酸アン
モニウムを加え（６５％飽和量）て溶解し、蛋白を沈澱
させた。該沈澱物を遠心分離（１０００ｒ、ｐ、ｍ、、
　　２０分間）により採取し、少量の０．０５Ｍ）リス
−塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，７）に溶解せしめた。次いで
、これを同緩衝液に対し透析しく５℃、２４時間）、内
液に等量の緩衝液を加え、これを予め同緩衝液で平衡化
させたＤＥＡＥ−）−ヨーバール６５０８ラム（５Ｘ４
０ＣＩｍ）に負荷した。このカラムを同緩衝液１．ＯＲ
で洗浄後、０．２Ｍの食塩を含有する同緩衝液で溶出し
た。

抗腫瘍性ポリペプチド活性区分２．０１を集め、硫安分
画（４０％〜５５％飽和画分）を行い、得られた硫安沈
澱を少量の水に溶かし、この水溶液を同緩衝液で十分透
析した（５℃、２４時間）。

透析内液に４０％飽和量の硫安を加えて溶解し、遠心分
離して不溶物を除去し、予め４０％飽和硫安を含む０．
０５Ｍトリス−塩酸塩緩衝液で平衡化したブチルート−
ヨーバール６５０８カラム（２，５Ｘ３０ｃｍ）を用い
流速２．０　ｍｌ　／ｍｉｎ。

の条件で疎水クロマトグラフィーを行った。次いで、抗
腫瘍性ポリペプチド活性画分を集め、０．０５Ｍトリス
−塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，８）で透析し　。

た。透析内液を予め５０ｍＭトリス−塩酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）で平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５１５カラ
ムに負荷し、同緩衝液で洗浄した後、０．１゜０、１５
．０．２．０．３Ｍと順次食塩濃度を上げる段階的溶出
法により抗腫瘍性ポリペプチド活性物質を溶出した。抗
腫瘍性ポリペプチド活性は０．２Ｍの食塩で溶出され、
比活性Ｉ　Ｘ　１０”単位／曙蛋白質まで精製された。

この工程における精製麿は５〜１５倍、回収率は８０％
以上であった。

このようにして得られた活性区分を集め、Ｍｏｎｏ　Ｑ
　ＨＲ５／　５カラムを用いて同条件で再びＦＰＬＣを
行った。再ＦＰＬＣの溶出パターンを第１図に示す。こ
の図において縦軸は２８０ｎｍおける吸光度（％）を示
し、横軸は溶出時間（分）を示す。図面から明らかなよ
うに、抗腫瘍性ポリペプチド活性は０．１　Ｍの食塩で
溶出され、２８０ｎｍのピークと良く一敗した。この活
性区分を集めて純水で透析した後、凍結乾燥して２００
μｇの精製標品を得た。この標品の比活性は５．０×１
０１＋単位／■蛋白質である。

次に本蛋白質についてファルマシア製、ＦＰＬＣシステ
ムのアニオン交換カラムＭｏｎｏ　Ｑ　カラムクロマト
を行い、第１表に示す条件で溶出を行った。

第　　１　　表 この溶出条件においてリテンションタイム３５分、３６
分、３７．８分に溶出される３つのピークを分取した。

（これら３つのピークはそれぞれＴＮＦ−１，ＴＮＦ−
２，ＴＮＦ−３である。）さらに、各々について上記の
条件で再クロマトを行い、純化した。それぞれの抗腫瘍
性ポリペプチドは以下に示す方法でいずれも単一な蛋白
であることが証明される。

（２）？−重　主ポリペプチドの性 それぞれのサンプルについてＰｒｏ−ＲＰＣＨＲ５／２
　（ファルマシア社製、Ｃ−４逆相担体）カラムを用い
て逆相ＦＰＬＣを行った。０．１％トリフルオロ酢酸を
展開液とし、アセトニトリルの濃度を０％から７０％直
線時に変えて溶出した。

この内ＴＮＦ−１の溶出パターンを第２図に示す。

ＴＮＦ−１ポリペプチドはアセトニトリル３６％付近で
溶出され、他に蛋白のピークは認められない。ＴＮＦ−
２およびＴＮＦ−３についても同じような結果が得られ
た。従って、逆相ＦＰＬＣ的に単一物質といえる。

次に、同じサンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）にかけた。

すなわち、バイオランド社製のスラブ電気泳動装置（ｒ
ＰＲＯＴＥＡＮＪ、１６ｃｍ）を用い、０．１％ＳＤＳ
を含有する１５．０％のポリアクリルアミドゲルにサン
プルを負荷し、２０ｍＡの定電流で電気泳動を行った。

次いで銀染色を行って蛋白を検出した。この結果、いず
れも１７，４Ｋｄの位置に単一バンドとして検出され、
他に蛋白のバンドは認められなかった。従って、本蛋白
標品は５ＤＳ−ＰＡＧＥ的に均一な蛋白であることが証
明された。またこれらの蛋白標品についてＬＫＢ社製の
アンホライン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）ポリアクリルアミ
ドゲルを使用するポリアクリルアミドゲル等電点電気泳
動法により等電点を測定した結果、いずれも等電点（ｐ
ｒ）は５．７であった。

次に、これら３つの抗腫瘍性ポリペプチドについて、Ｎ
末端よりアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列の決定
はガスフェイズアミノ酸シークエンサー（モデル４７０
Ａ）を用い、各々のサンプルについて約１０μｇを分析
した。その結果、ＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２及びＴＮＦ−
３ＯＮ末端末端アミノ列配、以下のとおりであった。

Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｌ　　Ｖａｔ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｘ−Ｔ
ｈｒ−＾ｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ又はＰｒｏ−５ｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙｓ又はＶａｌ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−八１ａ−Ｈ
４ｓ−ａｌ ＴＮＦ−２Ｖａｌ−八ｒｇ又はＬｙｓ−５ｅｒ−Ｘ−Ｔ
ｈｒ−八ｒｇ又はＰｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ又は
Ｉ、ｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ又はＶａｌ−Ｐｒｏ又はＡｌ
ａ−Ｖａｌ−八１ａ−１１３ｓ−ＶａｌＴ　Ｎ　Ｆ　　
−３Ｖａｌ−へｒｇ−５ｅｒ−Ｘ−Ｔｈｒ−八ｒｇ又は
Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ又は＾ｒｇ−５ｅｒ又はＬｙｓ
−Ｐｒｏ又はＡｒｇ−Ｌｙｓ又はＶａｌ−Ｐｒｏ又はＡ
ｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ上記Ｎ末端アミ
ノ酸配列においてＸで示される第４番目のアミノ酸は気
相アミノ酸配列分析機で同定されないアミノ酸であり、
Ｓｅｒは検出されず、この方法では検出されないアミノ
酸であるＣｙｓの可能性がある。

一方、本発明の抗腫瘍性ポリペプチドについてＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で単一なハンドを示ず抗
腫瘍性ポリペプチド（ＴＮＦ−１゜ＴＮＦ−２およびＴ
ＮＦ−３の混合物）１００μｇを含む水溶液１００μｇ
にトリプシン３．３μｇを加え３７℃、ｐＨ８，０で２
２時間放置してトリプシン分解を行った。分解物をＲＰ
３１８カラム（バイオランド社製、逆相ＨＰＬＣ用カラ
ム）を使用するＨＰＬＣによりＦ−１からＦ−８のフラ
グメントとして分離した。それぞれのフラグメントにつ
いてアプライド・バイオシステムズ社製、アミノ酸シー
クエンシングアナライザー（モデル４７０Ａ）を用いて
エドマン分解を行った。遊離してくるフェニルチオヒダ
ントイン−アミノ酸をＨＰＬＣ（島津ＬＣ−４Ａ型）に
て分析を行い常法に従ってアミノ酸を決定した。その結
果は次のとおりであった。

Ｆ　−１：　　Ｖａｌ−Ｖａｔ−＾１ａ−八５ｎ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｉｎ−八１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ Ｆ　−２：　八Ｉａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−＾１ａＦ　−３：　八５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−ＬｅｕＦ　−４：　１
ｉｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｘ−ＴｙｒＦ−５：Ｖａｌ−Δ
５ｎ−Ｌｅｕ−ＬｅｕＦ　−６：　Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−ｒ
’ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｇｌｕ−八１ａＦ　
−７：　Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−ＰｈｅＦ　−８：　Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−
Ｐｒｏ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｐｈｅ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ （３）査底エユニヱ旦作ｌ 抗腫瘍性ポリペプチドのアミノ酸配列の内、前記Ｆ−７
の内の８個のアミノ酸に対応する第２表に示すＤＮＡを
、固相法にて合成した。

第　　　２　　　表 ＴＨＰ−１細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４
０培地で、３７°ｃ、　　５％ＣＯＺ存在下で培養し、
細胞数がＩ　Ｘ　１０６ｃａｌｌｓ／ｍｊ！になった時
に、１００μｇ／ｍｇの１２−テトラデカノイル−フォ
ルボール−１３−アセテート（以下「１２−テトラデカ
ノイル−フォルボール−１３−アセテート」をｒＴＰＡ
Ｊと記す、）存在下で更に培養をつづけ、ＴＰＡ添加後
、８時間及び７０時間後の細胞を集めて、これをｍＲＮ
Ａ抽出用の細胞とする。

細胞からのｍＲＮＡ抽出は、以下の方法に従って行った
。遠心で細胞を集め、一度ＰＢＳ（−）（０，８％Ｎａ
Ｃ１，０，０２％ＫＣＩ、　０．０２％ｋｌ！ＰＯ４゜
０．１１５％ＮａＪＰＯ４）で洗浄した。集めた細胞を
５０ｗ１ＲＮＡ抽出緩衝液に十分懸濁した後、「ノニデ
ントＪ　　（Ｎｏｎｉｄｅｎｔ）　−Ｐ　４０を最終濃
度０．５％になるように添加し、テフロンホモゲナイザ
ーを用い、１０ストロークにて、ホモゲナイズを行ない
細胞を破壊した。その後、ホモゲネートを４℃、１分間
、１１００００Ｘの条件下で遠心分離し、上清を細胞質
抽出物とした。細胞質抽出物に等量の緩衝液飽和フェノ
ール／クロロホルム混合溶媒を添加し、室温で３０分以
上混合した。

ついで３０００Ｘｇ、１０分間の条件で遠心を行ないフ
ェノール／クロロホルム溶媒層を取り除き同様のフェノ
ール、クロロホルム抽出の操作を更に２回行なった。

次にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）
混合溶媒を上清に等量添加し、室温で１０分以上混合し
た後、遠心を行ない上清を回収した。上清に２．５倍の
エタノールを添加し、マイナス２０℃で一晩放置するこ
とでＲＮＡを沈澱させ、４°ｃ、１０，０００Ｘｇ、１
０分間の条件で回収し、細胞質ＲＮＡ標品とした。沈澱
物を２０ｍｌの滅菌水に懸濁した後、一部サンプルによ
りＲＮ　Ａ　ｔａ度を測定した。ＲＮＡを懸濁した後、
５倍濃度のＲＮＡ洗浄緩衝液を５ｍｌ添加し、予めＲＮ
Ａ洗浄緩衝液で平衡化していたｐｏｌｙ（Ｕ）セファロ
ースカラムに通した。ｐｏｌｙ　Ｃへ’）ＲＮＡ以外の
ｒＲＮＡ及びＬ　ＲＮＡを上記ＲＮＡ洗浄緩衝液で洗い
流した後、５ｍｌホルムアミドでｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ
を溶出し、ｐｏｌｙ　（Ａ）　ＲＮＡ画分を集め、エタ
ノール沈澱を２回行った後、ｐｏｌｙ　（Ａ）ＲＮ　Ａ
　ｉａ度が１μｇ／１０μｒになるように滅菌水に懸濁
後、小分けしてマイナス８０℃で保存した。

以下ｐｏｌｙ　（Ａ）　ＲＮＡをｍ　ＲＮ　Ａと略す。

（５）ｃＤＮＡ−イブ−１−の　１ 上述のようにして得られたｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡラ
イブラリーを２つの方法で作製した。

（ｉ）ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）法（Ｇｅｎｅ２５　２
６３−２６９　（１８８３））通常の方法通り、ｍＲＮ
Ａの３′のポリ　（Ａ）配列と相補的なオリゴ（ｄＴ）
をｍＲＮＡとアニーリングさせて、逆転写酵素のプライ
マーを調製した。次に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ存在下で逆転写酵素を作用させて
、ｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡを合成した。

ついで、このようにして得られたｍ　ＲＮ　Ａ　／　ｃ
　Ｄ　Ｎ　ＡハイブリッドのｍＲＮＡ側にＲＮａｓｅＨ
でニックを入れ、ＤＮＡポリメラーゼ■、及び大腸菌Ｄ
ＮＡライゲースでｍＲＮＡをＤＮＡに置換させ、２本鎖
のＤＮＡを合成した。得られた２本鎖ＤＮＡの３°末端
にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼを作用させて１０〜２０個のｄＣテールを付加させ、
次に、大腸菌内で複製可能なプラスミドベクターｐＢＲ
３２２を制限酵素ＰｓｔＩで処理して直鎖状のプラスミ
ドＤＮＡとした。３゛末端にターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフエラーゼを作用させて１０〜２０個
のｄＧデテール付加した。そして次にｄＧテールプラス
ミドベクターｄＣテール２本１ｆｉＤＮＡをアニーリン
グさせて、大腸菌へカルシウム法による形質転換法で移
し、得られた形質転換株をｃ　ＤＮＡライブラリーとし
た。

（ｉｉ　）オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂａｒ
ｇ）法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　２＋　　１６１〜ガプラーの方法
と異なり、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列と相補的なオリゴ
（ｄＴ）テールの付加された２本鎖ＤＮＡをアニーリン
グさせ、ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ存在下で逆転写酵素を反
応させて相補的なｃＤＮＡを合成した。次に、新に合成
したｃＤＮＡにターミナルヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼを作用させてｄＧデテール付加した。これと予め
ｄＣテールされていたプラスミドベクターとアニーリン
グ、ライゲーションを行い、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブ
リッドを含むプラスミドを得た。次にガブラーの方法と
同じように、ＲＮａｓｅＨ，ＤＮＡポリメラーゼＩ。

大腸菌ＤＮＡライゲースを作用させて、ｍＲＮＡをＤＮ
Ａへ置換してやる。このようにして、２重鎖ｃＤＮＡを
含むプラスミドを得た。これを大腸菌細胞内へ導入する
ことによりｃＤＮＡライブラリーを作製した。

上述のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーをニト
ロセルロースフィルター上に生育すせ、クロラムフェニ
コールを含む培地で生育させて（Ｇｅｎｅ　　１０．６
３−６７　　（１９８０））、プラスミドの数を増幅さ
せた。

次に、ｃＤＮＡライブラリーの生育したニトロセルロー
スフィルターを０．５Ｎ　　ＮａＯＨ？ｆｆｌに室温で
５分間浸し、大腸菌細胞壁を破壊し、更にプラスミドＤ
ＮＡを２本鎖から１本鎖へと変換し、更にＩＭ）リス−
ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）液に浸し、ついで室温で１０
分間放置後、０．５　Ｍ　）リス−ＨＣｊ！　（ｐＨ７
，５）／１．５Ｍ　　ＮａＣ１液に室温で１００分間浸
た後、　風乾した。十分に乾燥したら次に８０℃にて、
ニトロセルロースフィルターを２時間処理した。合成し
た２３塩基のＤＮＡの５′末端をγ−”ＰＡＴＰ、Ｔ４
ＤＮＡキナーゼでラベルし、この５゛末端の標識された
ＤＮＡを以下、ｃＤＮＡスクリーニングのＤＮＡプロー
ブとした。８０℃にて処理したニトロセルロースフィル
ターを６ｘＮＥＴにて（１ｘＮＥＴ　　０．１５ＭＮａ
Ｃ１，０，０１５）リス−Ｈ（１（ｐＨ７，５）。

１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）　、２５０Ｍｇ／ｍ１　大腸菌ｔ
ＲＮＡ０．５％ＮＰ−４０，中で４２℃で一晩ハイブリ
ダイズさせた後、６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ。

０．１５Ｍ　　ＮａＣ１，０，０１５Ｍ　　クエン酸ソ
ーダ）０℃で洗浄後２ＸＳＳＣでｏ℃５分間２度洗浄し
た後、更に２ＸＳＳＣ，４２℃で２分間洗浄した。洗浄
の終ったニトロセルロースフィルターは、風乾しオート
ラジオグラフィーを行った。

オートラジオグラフィーでポジティブと検出されたクロ
ーンは、更にマキサム−ギルバート塩基配列決定法に従
って塩基配列を決定し、ポジティブクローンを絞り込ん
だ。

その結果、２３塩基の合成りＮＡとハイブリダイズする
ｃＤＮＡクローン中に、抗腫瘍性ポリペプチドのＣ末端
側を有するｃＤＮＡクローンが存在した。得られたｃＤ
ＮＡクローンは約１．０００塩基対を持つことが判明し
た。

（７）ゲノムＤＮＡの８製 ＴＰＡ　１００　ｎ　ｇ／ｍＪを含む培地で８時間培養
した後ＴＨＰ−１細胞３　Ｘ　１　’０９個を１００ｍ
ｌの１５０ｍＨＮａＣｌ１．ｌｏＯｍＭ　　ＥＤＴＡ溶
液に懸濁した。

さらに、１０ｍｌの１０Ｍ過塩素酸ナトリウム溶液を加
え、更に１０％ＳＤＳを１０ｍｊ２加えた。

次に５ＭのＮａＣ１を１２ｍｌ加え、６０℃で１５分間
加温した。この溶液に専科のクロロホルム、イソアミル
アルコール２４：１混液を加えゆるやかに混合したのち
、４℃で日立高速冷凍遠心機で１０，０００回転にて１
０分間遠心し、上清を得た。この上清に等量のイソプロ
ピルアルコールを加え、生ずるＤＮＡの沈澱をパスツー
ルピペットにまきとった。７０％エタールでＤＮＡを洗
った後、１００ｍｊ！の１０ｍＭトリス塩酸ｐ　Ｈ７，
５１０ｍＭ　　ＮａＣ１０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ溶液（
ＴＳＥ）に溶解した。その後１０％ＳＯ３を終濃度０．
５％になる様に加え、更にプロテアーゼＫを終濃度１■
／ｍβになる様に加え５５℃−晩加温した。この際１０
．０００回転遠心分離後中間層にくるＤＮＡ−蛋白複合
体を刈取し、遠心分離以後の操作を行う事によってＤＮ
Ａ−蛋白複合体を別に分取し、遠心分離以後の操作を行
う事によってＤＮＡの収量を増加させた。プロテアーゼ
にて処理後のＤＮＡ溶液を水飽和フェノール、メタクレ
ゾール、イソアミルアルコール　１００：１４：Ｏ，ｌ
混液とおだやかに混合し、３００回転１０分間常温で遠
心に上清を分取した。この上清に等量のイソプロパツー
ルを加え１、生ずる沈澱をパスツールピペットにまきと
った。７０％エタノールでＤＮＡを洗った後、１００ｍ
ｌのＴＳＥに溶解した。

ＤＮＡ溶液を終濃度８００μｇ　／　ｍ　ｌとなる様に
ＴＳＥを加えた後０．９５ｇ／ｍｌの割合でＣｓＣ１を
加え更に１０分の１容の５■／ｍｌのエチジウムブロマ
イドを加えて、均一な溶液にした後、ベンクマン（Ｂｅ
ｃｋａ＋ａ口）タイプ６０ローターで２０℃４５に４８
時間遠心する事により密度勾配法によるＤＮＡの精製を
行った。遠心終了後３６０ｎｍのＵｖを照射する事でＤ
ＮＡのバンドを直視しつつ、パスツールピペットでＤＮ
Ａを回収した。ついで、ＣｓＣ１飽和イソプロピルアル
コールをＤＮＡ溶液に加え、数回混合する操作を１０回
繰り返す事によって、エチジウムブロマイドを除去した
。

得られたＤＮＡ溶液を２！のＴＳＥに対し４℃−昼夜透
析する事によりＤＮＡを得た。この時のＤＮＡ濃度は６
５０．ｃＺｇ／ｍｌ全量で１８■のＤＮＡを得た。

（８）ゲノムＤＮＡ　　　の　′１ 得られたＤＮＡを１５Ｍｇづフ分取し、数種の制限酵素
による完全分解を行い、抗腫瘍性ポリペプチド遺伝子断
片の各種制限酵素による長さをサチン法により解析した
。Ａｐａｌ　　（ＧＧＧＣＣＣ）。

Ｘｈｏｌ　　（ＣＴＣＧＡＧ）、ＢａｍＨＩ　　（ＧＧ
ＡＴＣＣ）。

ＥｃｏＲＩ　　（ＧＡＡＴＴＣ）、Ｓｓ　ｔ　Ｉ　　（
ＧＡＧＣＴＣ）。

ＫｐｎＩ　　（ＧＧＴＡＣＣ）をそれぞれ５０単位づつ
用いてＤＮＡを、３７℃−５晩適当な緩衝液及び塩濃度
の溶液中で保温し、反応終了後５Ｍ　　ＮａＣ１を終濃
度０．２５Ｍになる様に添加して、２．５容のエタノー
ルを加え、ＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡの分解物を遠心
分離により沈澱として回収した後、１０μ！の水に溶解
し、１．５％寒天ゲルに展開した後ニトロセルロースフ
ィルターにＤＮＡ断片を吸着せしめた。ＤＮＡを吸着せ
しめたニトロセルロースフィルターを風乾後、８０℃真
空下で２時間処理し、以下のハイブリダイゼーションを
行った。

ニックトランスレーシラン （６）で得られたｃＤＮＡ２００ｎｇを３０μｍの反応
液（５０ｍＭ　　ＴｒｉｓＨＣｌ　　ｐＨ７，５１０ｍ
Ｍ　　ＭｇＣ１ｚ　　１０ｍＭ　　ＤＴＴ）に溶解し、
α−”ＰｄＣＴＰ　　２０μＣ：　ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ５μＭになる探加え、Ｄ
ＮａｓｅＩ２．５μｇ、　ＤＮＡ　Ｐｏ１ｙｎ＋ｅｒａ
ｓｅ　１０単位加えて２０’ＣＩ時間反応させた。反応
終了後等量の水飽和フェノール：クロロホルム１：１混
液を加え激しくかくはんした後、遠心分離を行って除蛋
白し、更に等量のクロロホルムを加えて激しくかくはん
後、遠心分離を行い水層を分取した。

この水層をあらかじめ１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　１００μ
ｇ　／　ｍ　ｌ尤ＲＮＡを含む溶液で平衡化したセファ
デックスＧ−５０カラムに重層し、１ｍＭＥＤＴＡ　　
１００μｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡ溶液で溶出させ、ＤＮＡ部
分を回収した。放射比活性１×１０”ｃｐｍ／μｇ　Ｄ
ＮＡの標識ＤＮＡが得られた。

このＤＮＡを１００℃１０分間加温する事で単鎖ＤＮＡ
とし、プローグとして用いた。

（９ノハイブリダイゼーシヨン Ｄ　Ｎ　Ａ　全吸着したニトロセルロースフィルターを
１ｍＡの５０％ホルムアミド５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，
１５ＭＮａＣ１！　　０．０１５Ｍ　　クエン酸ソーダ
）、５×ＦＢＲ，１％グリシン、２０ｍＭリン酸緩衝液
ｐＨ６，８，１００μｇ／ｍｆｆ１．仔牛胸腺変性ＤＮ
Ａを含む溶液に均一に浸し、プラスチックバックにシー
ルした後４２℃で１晩保温した。次に１ｍｆの５０％ホ
ルムアミド５ｘＳＳＣ，１ｘＦＢＰ２０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ６，８１００μｇ／ｍｌ仔牛胸腺変性ＤＮＡを含
む液に２　Ｘ　１０’ＣＩ）０１のプローブを加えた溶
液にフィルターを浸し、４２℃で１晩保温した。保温終
了後ニトロセルロースフィルターを２ＸＳＳＣ溶液中に
移し６８℃でｌｈｒ非特異的なりＮＡプローブの吸着を
除去する為に洗い、さらに０．ｌＸ５ＳＣで５分間同様
の洗いを行った後、フィルターを風乾し、コダックＸ線
フィルムを一昼夜露光させる事によりプローブと特異的
にハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出した。

（１０）特異的なりＮＡ断片の濃縮 以上のサザンハイプリダイゼーションに於て（６）に述
べたプローブＤＮＡと、ゲノムＤＮＡを制限酵素Ａｐａ
ｌで切断した特注ずる２、　６　ｋ　ｂのＤＮＡ断片が
再現性よくハイブリダイゼーションを形成した。そこで
ＴＨＰ−１ゲノムＤＮＡを１．３■用い５ｍＡの反応系
で１５００単位のＡｐａｌを加え、１晩加温する事によ
りＴ　Ｉ−Ｉ　Ｐ　−１ゲノムのＡｐａｌ完全分解物を
得た。

このＤＮＡ断片を１．５％寒天ゲルによって分画し、２
．６　ｋ　ｂ周辺の寒天ゲル部分を切り出した。

寒天からのＤＮＡの回収は次によった、まず１０ｍＭの
リン酸緩衝液ｐＨ７，０１５ｍＪに２２．５ｇのＫＩを
加えた溶液１５ｍＡに寒天を入れ、６０℃に加温する事
により、寒天を溶解せしめた。

その後ＤＮＡを含む溶液をバイオランド（１３ｉｏｒａ
ｄ）社の「バイオゲルＨＴＰＪに吸着せしめ、十分に１
０ｍＭリン酸緩衝液で洗った後、ＩＭのリン酸緩衝液、
０．５％ＳＤＳによりＤＮＡを流出させた。ＴＳＥに対
し透析を一昼夜４℃で行い、ＤＮＡを得た。

（１１）゛ノムライブラ１−の　７ 得られたＤＮＡにｄＧＴＰのテイルをターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて付加した
。一方ベクターとして用いたｐＮＦはＫｐｎｌで単鎖と
した後、ｄＣＴＰのテイルを同様に付加し、アニーリン
グさせキメラ環状体を作製した。このキメラをエシェリ
ヒア・コリＲＲＩに導入し約２Ｘ１０’個の独立なコロ
ニーから成るライブラリーを作成した。

先にのべたプローブを用い、同上ゲノムライブラリーを
選別した結果１種のクローンを得た。得られたクローン
の制限酵素地図（第３図）及び部分的な塩基配列（第４
図）（ＤｒａＩ　　（８５４）からＰｓｔＩ　　（２０
４６）間の塩基配列）を示す。

（１２）ゲノム゛　云　の　　　中での（１）得られた
ゲノム遺伝子の制限酵素ＸｈｏＩ／　Ｐｓｔｌ断片（前
述のＴＮＦゲノムＤＮＡの部分　塩基配列の３４０塩基
から１１５０塩基の８１１塩基ＤＮＡ断片）をプラスミ
ドベクターｐＵｃ１２（ファルマシア社製）の制限酵素
５ａＪＩ／Ｐｓｔ１部位に挿入したプラスミドｐ１２　
ＴＮ’Ｘ／ｐを構築した。本プラスミドは、ラクトース
オペロンのプロモーター領域、オペレーター領域、及び
シャイン・ダルガルノ配列（以下、Ｓ、Ｄ配列と略す。

）を存し、上述の領域の後に、β−ガラクトシダーゼ遺
伝子の５゛末端領域を含む４５塩基対、それにゲノム遺
伝子が結合した融合遺伝子を含んでいる。このため、本
プラスミドを有した大腸菌で発現されてくる蛋白質は、
β−ガラクトシダーゼのＮ末端領域の塩基配列とゲノム
ＤＮＡ断片を含む融合蛋白質である（第５図）。

（ＩＩ）ゲノム遺伝子の制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ　／　Ｐｓ
ｔ　Ｉ断片、８１１塩基対をｔａｃプロモーター及びＳ
Ｄ配列を有したプラスミドベクターｐＵｃ５４０の制限
酵素５ａｌＩ、Ｐｓｔ１部位に挿入したプラスミドｐ　
ＵＣ５４０”’ｘ／ｐを作製した。

本プラスミドは、ゲノム遺伝子の制限酵素Ｘｈｏｌ／Ｐ
ｓｔｌ断片中に存在する最初のメチオニンをＮ末端とす
るタンパク質をコードする遺伝子を有することとなる。

（第６図） プラスミドベクターｐ［Ｊｃ５４０は、市販されている
プラスミドベクターｐＵｃ８のＥｃｏＲ［。

ＢａｍＨ１部位に、同様に市販されているｔａｃプロモ
ーターををするプラスミドｐＤＲ５４０のＥｃｏＲＩ、
ＢａｍＨＩ断片をクローニングしたものである、共にフ
ァルマシア社によって販売されている。

このようにして構築して得られた遺伝子は、すべて、ラ
クトースオペロンのプロモーターの制御をうけることよ
り、これらの遺伝子の発現は、イソプロピルβ−Ｄチオ
ガラクトピラノシド（以下イソプロピルβツ吻％クトピ
ラノシドをＩＰＴＧと略す。）で誘導可能となる。

をアンピシリン５０μｇ　／　ｍ　ｌを含むＩＸＹＴ培
地（バクトドリブトン０，８％、バクトイ−ストエクス
トラクト０．５％１食塩０．５％）で３７℃で前培養し
た後、アンピシリン５０μｇ　／　ｍ　１２を含ムＩＸ
ＹＴ培地ｌＯＯｍＮを含む５０　Ｑｍｊ！坂ロフシロフ
ラスコ植菌し、同様に３７℃で培養し、ＯＤ＆６０　＝
０．３に達した時にＩ　ＰＴＧを最終濃度２ｍＭになる
ように添加し、更に培養を続けた。

このようにして得られた大腸菌を遠心機によって集め、
ＩＸＰＢＳ　（ＮａＣＪ　　Ｏ，８％、ＫＣｌ０．０２
％、ＫＨｚＰＯ４０，０２％、ＮａｚＨＰＯ４０、１１
５％）で洗浄後、再びｌ　ｍ　Ｒのｌ　ＸＰＢＳに懸濁
し、超音波で大腸菌を破砕した。その一部を用いて抗腫
瘍性活性を測定した。抗腫瘍性活性の測定はＬ−９２９
細胞を指標とした感受性テストで行った。結果を第３表
に示す。

第　　　３　　　表 実施例２ ｐ　ＵＣ５４０”’ｘ／　ｐプラスミドは、ＳＤ配列の
下に制限酵素ＢａｍＨ１部位を有している。従って、こ
のＢａｍＨ１部位に外来遺伝子を挿入すると、Ｉ　ＰＴ
Ｇの添加によってのみその外来遺伝子の発現が可能とな
る。

第３図に示す抗腫瘍性ポリペプチドゲノム遺伝子をＸｈ
ｏＴ、　　ＰｓｔＩで切断し、Ｘｈｏｌ、Ｐｓｔｌ断片
第７図フラグメント（Ａ）−（Ｅ）を回収した（第７図
）。次に、このＸｈｏ［、Ｐｓｔｌ断片を、ＨｉｎｃＩ
Ｉ断片で切断し、２９４塩基対のＸｈｏＩ。

ＨｉｎｃＩＩ断片（Ａ）−（Ｄ）　、５２１塩基対のＩ
目ｎｃ１１．　　Ｐｓｔｒ断片（Ｄ）−（Ｅ）を回収し
、２９４塩基対の断片をＤｄｅｌで部分分解し、２０６
塩基対のＤｄｅｌ、Ｈ４ｎｃＩＩ断片（Ｂ）−（Ｄ）を
ＰｓｔＩ断片（Ｄ）−（Ｅ）と、第４表に示す７０塩基
、６９塩基の２本鎖ＤＮＡ又、は２２塩基、２１塩基の
２本鎖ＤＮＡ又は７２塩基、７３塩基の２本鎖ＤＮＡの
３種類のＤＮＡを結合させた後、ｐＵｃ５４０ＴＮ’　
ｘ／ｐのＢａ５ＨＩ　、　　Ｐｓｔ　１部位に挿入した
。

このようにして得られた３種類のプラスミドｐＵｃ５４
０”’　　６９／７０．　　ｐＵｃ５４０丁Ｎ’７２／
７３．ｐＵ０５４０７訂２１／２２はラクトースオペロ
ンのプロモーター制御をうけ、大腸菌内においてこれら
合成された３種類の遺伝子の発現が可能となる。

得られたプラスミドｐ　ＵＣ５４０ＴＮ’　６９／７０
゜に示した方法により培養し、ｒＰＴＧを添加してこれ
らの遺伝子の発現を検討した。ただし、今回は１２時間
２ｍＭ　　ＩＰＴＧ″？’誘導をかけた。第５表にその
結果を示す。

〆 第　　　５　　　表

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性ポリペプチド混合物の陰イオン交換ク
ロマトグラフと抗腫瘍性ポリペプチド活性を示すグラフ
、第２図はＴＮＦ−１の逆相クロマトグラフ、第３図は
抗腫瘍性ポリペプチドゲノム遺伝子の制限酵素地図、第
４図は抗腫瘍性ポリペプチドのゲノムＤＮＡの部分塩基
配列、第５図はｐ　１２”’　ｘ／ｐが有する抗腫瘍性
ポリペプチド遺伝子の塩基配列とそれがコードするポリ
ペプチドのアミノ酸配列、第６図はｐＵｃ５４０ｆＮ’
ｘ／ｐが有する抗腫瘍性ポリペプチド遺伝子の塩基配列
とそれがコードするポリペプチドのアミノ酸配列、第７
図は抗腫瘍性ポリペプチドゲノム遺伝子のＸｈｏ　Ｉ　
−Ｐｓｔ　Ｉ断片を示すものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列を有する抗腫瘍性ポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ。 【アミノ酸配列があります】 Ｘは、アミノ酸数１〜３９個のペプチドである。
2. （２）宿主微生物細胞内で増殖しうるプラスミドに挿入
   されている特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
3. （３）宿主微生物細胞内で増殖しうるプラスミドに挿入
   されている下記のアミノ酸配列を有する抗腫瘍性ポリペ
   プチドをコードするＤＮＡを有する微生物を培養するこ
   とを特徴とする抗腫瘍性ポリペプチドの製造法。 【アミノ酸配列があります】 Ｘは、アミノ酸数１〜３９個のペプチドである。