JPS6269989A - 新規フア−ジベクタ− - Google Patents
新規フア−ジベクタ−Info
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- JPS6269989A JPS6269989A JP60208160A JP20816085A JPS6269989A JP S6269989 A JPS6269989 A JP S6269989A JP 60208160 A JP60208160 A JP 60208160A JP 20816085 A JP20816085 A JP 20816085A JP S6269989 A JPS6269989 A JP S6269989A
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- Japan
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- gene
- phage
- vector
- plasmid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、プロモータを検索するに有用な新規なファー
ジベクターに関するものである。
ジベクターに関するものである。
近年、組換えＤＮＡ技術の発達及びその産業への応用に
伴い、遺伝子をより効率的に発現させるための試みが種
々行われているが、プロモータープローブベクターによ
るプロモーターの検索もその一つである。このプロモー
タープローブベクターとは、それ自身のプロモーターを
欠失した構造遺伝子を含むベクターで、プロモーター活
性を構造遺伝子の発現を通して検出しようとするもので
ある。大腸菌ではプラスミドｐＭＣ１４０３（Ｃａｓａ
ｄａｂａｎ、Ｍ、 Ｊ 、 ｅｔ ａｌ、Ｊ 。
伴い、遺伝子をより効率的に発現させるための試みが種
々行われているが、プロモータープローブベクターによ
るプロモーターの検索もその一つである。このプロモー
タープローブベクターとは、それ自身のプロモーターを
欠失した構造遺伝子を含むベクターで、プロモーター活
性を構造遺伝子の発現を通して検出しようとするもので
ある。大腸菌ではプラスミドｐＭＣ１４０３（Ｃａｓａ
ｄａｂａｎ、Ｍ、 Ｊ 、 ｅｔ ａｌ、Ｊ 。
Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、 、 １４３巻、９７１頁（１９
８０年）〕、枯草菌ではプラスミドｐＧＲ７１（Ｇｏｌ
ｄｆａｒｂ、 Ｄ、 Ｓ 、 ｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ
、２９３巻、３０９頁（１９８１年） ） 、 ｐＰＬ
６０３（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、 Ｄ、Ｍ、ｅｔ ａｌ、
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １４６巻、１１６２頁
（１９８１年）〕などがすでに開発されている。
８０年）〕、枯草菌ではプラスミドｐＧＲ７１（Ｇｏｌ
ｄｆａｒｂ、 Ｄ、 Ｓ 、 ｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ
、２９３巻、３０９頁（１９８１年） ） 、 ｐＰＬ
６０３（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、 Ｄ、Ｍ、ｅｔ ａｌ、
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １４６巻、１１６２頁
（１９８１年）〕などがすでに開発されている。
しかしながら、これらのプラスミドベクターは、いずれ
も菌体内で多コピーの状態で存在する。枯草菌の遺伝子
、特に胞子形成遺伝子は菌体内で複雑な制御を受けてお
り、上記の様な多コピープラスミドベクター上にこれら
の遺伝子をクローン化すると、正常に発現しないことが
しばしば観察される（ Ｚ ｕｂｅｒ、 Ｐ 、＆ Ｌ
ｏｓｉｃｋ、 Ｒ、＋Ｃｅ１ｌ、３５巻、２７５頁（
１９８３年）〕。
も菌体内で多コピーの状態で存在する。枯草菌の遺伝子
、特に胞子形成遺伝子は菌体内で複雑な制御を受けてお
り、上記の様な多コピープラスミドベクター上にこれら
の遺伝子をクローン化すると、正常に発現しないことが
しばしば観察される（ Ｚ ｕｂｅｒ、 Ｐ 、＆ Ｌ
ｏｓｉｃｋ、 Ｒ、＋Ｃｅ１ｌ、３５巻、２７５頁（
１９８３年）〕。
それゆえ、枯草菌遺伝子の多くは、テンペレートファー
ジｐＨあるいはφ１０５を用いて染色体当り１コピーの
状態でクローン化する試みがなされている。本発明を完
成するに至ったプロモーターを検索する場合も同様の現
象が考えられるため、１コピーベクターを用いる必要が
あると考えられる。
ジｐＨあるいはφ１０５を用いて染色体当り１コピーの
状態でクローン化する試みがなされている。本発明を完
成するに至ったプロモーターを検索する場合も同様の現
象が考えられるため、１コピーベクターを用いる必要が
あると考えられる。
本発明者らは、従来の枯草菌プロモータープローブベク
ターが多コピープラスミドであるために生ずる上記の様
々な問題点を克服するため、ρ１１あるいはφ１０５の
一部遺伝子を脱落させたプロモータープローブベクター
を作製することを試みたが、適当な選択マーカーがなく
、それゆえ形質転換体の検出が困難であるという認識に
至った。そこで鋭意研究を進め、抗生物質耐性マーカー
としてタロラムフェニコール耐性遺伝子を、指標遺伝子
としてプロモーター領域を欠失したアミラーゼ遺伝子（
構造遺伝子のみ）を組み込んだ、テンペレートファージ
φ１０５の新規誘４体ファージベクターφＰＡを開発し
、本研究を完成するに至った。なお、本発明のファージ
ベクターφＰＡはプロモータープローブベクターとして
開発されたものであるが、使用用途は単にこの目的のみ
に限られたものではない。
ターが多コピープラスミドであるために生ずる上記の様
々な問題点を克服するため、ρ１１あるいはφ１０５の
一部遺伝子を脱落させたプロモータープローブベクター
を作製することを試みたが、適当な選択マーカーがなく
、それゆえ形質転換体の検出が困難であるという認識に
至った。そこで鋭意研究を進め、抗生物質耐性マーカー
としてタロラムフェニコール耐性遺伝子を、指標遺伝子
としてプロモーター領域を欠失したアミラーゼ遺伝子（
構造遺伝子のみ）を組み込んだ、テンペレートファージ
φ１０５の新規誘４体ファージベクターφＰＡを開発し
、本研究を完成するに至った。なお、本発明のファージ
ベクターφＰＡはプロモータープローブベクターとして
開発されたものであるが、使用用途は単にこの目的のみ
に限られたものではない。
以下、本発明の概要及び詳細につき順次説明する。
本発明のファージベクターを作製するに当り、以下の要
素を用いる。すなわち、抗生物質耐性マーカーとしては
スタフィロコッカス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプラス
ミドｐＣ１９４のタロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａ
ｔを用いる。この遺伝子は詳細な制限地図及び全塩基配
列が報告されているため、必要最小限のＤＮＡ断片のみ
をとり出すことが可能である。
素を用いる。すなわち、抗生物質耐性マーカーとしては
スタフィロコッカス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプラス
ミドｐＣ１９４のタロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａ
ｔを用いる。この遺伝子は詳細な制限地図及び全塩基配
列が報告されているため、必要最小限のＤＮＡ断片のみ
をとり出すことが可能である。
指標遺伝子としてはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細
菌の代表的な分泌酵素であるアミラーゼの遺伝子の一つ
ａｍｙ Ｆを用いる。この遺伝子はバチルス・アミロリ
ケフェシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ） Ｆ株山来で、すでにファージある
いはプラスミド上にクローン化されており、更に、プロ
モータを含む上流領域の塩基配列が決定さｆｉ ｆいる
ため、人為的にプロモータ領域を欠失したものを得るこ
とは可能である。
菌の代表的な分泌酵素であるアミラーゼの遺伝子の一つ
ａｍｙ Ｆを用いる。この遺伝子はバチルス・アミロリ
ケフェシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ） Ｆ株山来で、すでにファージある
いはプラスミド上にクローン化されており、更に、プロ
モータを含む上流領域の塩基配列が決定さｆｉ ｆいる
ため、人為的にプロモータ領域を欠失したものを得るこ
とは可能である。
複数のクローニング部位をもつＤＮＡ断片としては、プ
ラスミドρＵ Ｂ １１０の誘導体プラスミドｐＨＲ１
０１中に存在する合成ポリリンカーを用いる。このポリ
リンカー中にはＢｇｌＩＩ、Ｘｂａｌ及びＣ１ａＩの制
限酵素切断部位がある。
ラスミドρＵ Ｂ １１０の誘導体プラスミドｐＨＲ１
０１中に存在する合成ポリリンカーを用いる。このポリ
リンカー中にはＢｇｌＩＩ、Ｘｂａｌ及びＣ１ａＩの制
限酵素切断部位がある。
以上の３要素を枯草菌テンペレートファージφ１０５に
意図した順序に組み込み、目的と−するファージベクタ
ーを作製する。
意図した順序に組み込み、目的と−するファージベクタ
ーを作製する。
次に本発明のファージベクター作製方法の詳細を実験例
により述べるが、その各過程における個々の操作は当該
技術分野の慣用手段による。
により述べるが、その各過程における個々の操作は当該
技術分野の慣用手段による。
例１ アミラーゼ遺伝子からのプロモーターの欠失
バチルス・アミロリケファシエンスＦ株山来のアミラー
ゼ遺伝子ａｍｙ Ｆを含む約２４００塩基対のＢａｍＨ
Ｉ断片を、そのＤＮＡ配列上に保持するプラスミドｐＨ
ＩＡ６（ｐＵＢｌｌｏの誘導体）を用いて以下の操作を
行った。すなわち、ｐＨＩＡ ６中のａ［ＩＩｙ Ｆプ
ロモーター領域より約１３０塩基対上流部位をＣ１ａｌ
で切断、開環後、エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を用い
て１２ｍＭ塩化カルシウム／１２ｍＭ塩化マグネシウム
１０．２Ｍ塩化ナトリウム／ １ ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ ／ ２０ｍＭ トリス塩酸緩？＃液ＰＨ８，０中で
３０℃１〜５分間処理し、欠失を行わせた。次に反応を
停止するためエチレングリコール（β−アミノエチルエ
ーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’。
ゼ遺伝子ａｍｙ Ｆを含む約２４００塩基対のＢａｍＨ
Ｉ断片を、そのＤＮＡ配列上に保持するプラスミドｐＨ
ＩＡ６（ｐＵＢｌｌｏの誘導体）を用いて以下の操作を
行った。すなわち、ｐＨＩＡ ６中のａ［ＩＩｙ Ｆプ
ロモーター領域より約１３０塩基対上流部位をＣ１ａｌ
で切断、開環後、エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を用い
て１２ｍＭ塩化カルシウム／１２ｍＭ塩化マグネシウム
１０．２Ｍ塩化ナトリウム／ １ ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ ／ ２０ｍＭ トリス塩酸緩？＃液ＰＨ８，０中で
３０℃１〜５分間処理し、欠失を行わせた。次に反応を
停止するためエチレングリコール（β−アミノエチルエ
ーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’。
Ｎ′四酢酸を終濃度が２０ｍ Ｍとなるよう加えた後、
ＴＡ緩衝液（６６ｍＭ酢酸カリウム／ｌｏｍＭ酢酸マグ
ネシウム１０．５ｍＭジチオスレイ１−−ル１０．０１
％牛血清アルブミン／３３ｍＭトリス・酢酸緩衝液ｐＨ
７，９）中で、２ ｍＭｄ Ｎ Ｔ Ｐ存在下大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼフレノウ断片を４℃１５時間作用させ
てＤＮＡ鎖末端の平滑化を行った。その後得られたＤＮ
Ａとリン酸基を付与したＣ１．ａｌリンカ−（ｐＣＡＴ
ＣＧＡＴＧ）とを１０ｍＭ塩化マグネシウム／１０ｍＭ
ジチオスレイトール／ｉｎＭ Ａ Ｔ Ｐ ／ ７０ｍ
Ｍ トリス・塩酸緩衝液ｐＨ７，５中で、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させ（１６°Ｃ１５時間反応）新た
にＣ１ａ ｒ部位を導入した。この様にして得られたプ
ラスミドの中から、所期のプロモーター領域を欠失した
ものを選択するため、本プラスミドＤＮＡを用いてコン
ビテントな状態にある枯草菌アミラーゼ欠損株ＵＯＴ０
７３４を形質転換し、カナマイシン５μｇ／ｍＱ及びコ
ーンスターチ１％を含むＴＢＡＢ （トリプトース・ブ
ラッド寒天培地、ディフコ社製）プレート上にスプレッ
ドして、まずカナマイシン耐性株を選択した。更に、こ
れらの中から、元のｐＨＩＡ６を保有する親株に比ベコ
ロニー周辺に小さなハロー（透明な領域）しか示さない
株を選び出し、アルカリ法によるプラスミドＤＮＡの抽
出５次いで、Ｃ１ａｌとＥｃｏＲＩとの２重切断によっ
て約３２０塩基対のＤＮＡ断片を生じるプラスミドを選
択した。この様にして得られたプラスミドρＡΔ３１４
の新たなＣｌａｌ部位は。
ＴＡ緩衝液（６６ｍＭ酢酸カリウム／ｌｏｍＭ酢酸マグ
ネシウム１０．５ｍＭジチオスレイ１−−ル１０．０１
％牛血清アルブミン／３３ｍＭトリス・酢酸緩衝液ｐＨ
７，９）中で、２ ｍＭｄ Ｎ Ｔ Ｐ存在下大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼフレノウ断片を４℃１５時間作用させ
てＤＮＡ鎖末端の平滑化を行った。その後得られたＤＮ
Ａとリン酸基を付与したＣ１．ａｌリンカ−（ｐＣＡＴ
ＣＧＡＴＧ）とを１０ｍＭ塩化マグネシウム／１０ｍＭ
ジチオスレイトール／ｉｎＭ Ａ Ｔ Ｐ ／ ７０ｍ
Ｍ トリス・塩酸緩衝液ｐＨ７，５中で、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させ（１６°Ｃ１５時間反応）新た
にＣ１ａ ｒ部位を導入した。この様にして得られたプ
ラスミドの中から、所期のプロモーター領域を欠失した
ものを選択するため、本プラスミドＤＮＡを用いてコン
ビテントな状態にある枯草菌アミラーゼ欠損株ＵＯＴ０
７３４を形質転換し、カナマイシン５μｇ／ｍＱ及びコ
ーンスターチ１％を含むＴＢＡＢ （トリプトース・ブ
ラッド寒天培地、ディフコ社製）プレート上にスプレッ
ドして、まずカナマイシン耐性株を選択した。更に、こ
れらの中から、元のｐＨＩＡ６を保有する親株に比ベコ
ロニー周辺に小さなハロー（透明な領域）しか示さない
株を選び出し、アルカリ法によるプラスミドＤＮＡの抽
出５次いで、Ｃ１ａｌとＥｃｏＲＩとの２重切断によっ
て約３２０塩基対のＤＮＡ断片を生じるプラスミドを選
択した。この様にして得られたプラスミドρＡΔ３１４
の新たなＣｌａｌ部位は。
マキサムとギルバートの方法による塩基配列の解析結果
から、上記の諸操作を行う前のプラスミドｐＨＩＡ６の
ＣｌａＩ部位より１５５塩基下流側に位置しており、リ
ボゾーム結合部位は保持されているが、プロモータ一部
位は完全に欠失していることが明らかとなった。
から、上記の諸操作を行う前のプラスミドｐＨＩＡ６の
ＣｌａＩ部位より１５５塩基下流側に位置しており、リ
ボゾーム結合部位は保持されているが、プロモータ一部
位は完全に欠失していることが明らかとなった。
このＰＡΔ３１４の有するＣ１ａ Ｉ−ＢａｍＨＩ断片
を、プロモータを欠失したアミラーゼ遺伝子Δａｍｙ
Ｆの供与体として以下の実験に供した。
を、プロモータを欠失したアミラーゼ遺伝子Δａｍｙ
Ｆの供与体として以下の実験に供した。
例２ ポリリンカー及びクロラムフェニコール耐性マー
カーの付与 例１で得られたΔａｍｙ Ｆ断片の上流に、クローニン
グ時有用と考えられる制限部位を付与すると共に、本断
片と隣接して、形質転換実験において選択マーカーとな
るクロラムフェニコール耐性遺伝子を接続するため以下
の操作を行った。すなわち、 （１） その断片上にＢｇｌｎ及びＸｂａ１部位を有
する、プラスミドｐＨＲ１０１由来の７０塩基対から成
るＢａｍＨＩ −Ｃ１ａ Ｉ合成ポリリンカー、（２）
そのＤＮＡＮ玉鎖上トラサイクリン耐性遺伝子及び
１ケ所のＢａｍＨＩ部位をもつプラスミドｐＢｃＥ１６
をＢａｍＨＩで切断後、５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液ｐ
Ｈ７，５中、６５℃３０分間アルカリ性フォスファター
ゼ処理して自己閉環を防止したプラスミドＤＮＡ、及び
（３） ＢａｍＨＩとＣ１ａｌとで２重切断したＰＡ
Δ３１４の３者を混合し、例１と同様にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを作用させて接続した後、枯草菌Ｕ ＯＴ ０７３
４を形質転換した。形質転換株からまずテトラサイクリ
ン耐性を示す株を選び、アルカリ法によるプラスミドＤ
ＮＡの抽出、次いでＢｇｌｌｌ処理によって約６６００
塩基対のＤＮＡ断片を生ずるプラスミドρＢＡ７７を選
択した。
カーの付与 例１で得られたΔａｍｙ Ｆ断片の上流に、クローニン
グ時有用と考えられる制限部位を付与すると共に、本断
片と隣接して、形質転換実験において選択マーカーとな
るクロラムフェニコール耐性遺伝子を接続するため以下
の操作を行った。すなわち、 （１） その断片上にＢｇｌｎ及びＸｂａ１部位を有
する、プラスミドｐＨＲ１０１由来の７０塩基対から成
るＢａｍＨＩ −Ｃ１ａ Ｉ合成ポリリンカー、（２）
そのＤＮＡＮ玉鎖上トラサイクリン耐性遺伝子及び
１ケ所のＢａｍＨＩ部位をもつプラスミドｐＢｃＥ１６
をＢａｍＨＩで切断後、５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液ｐ
Ｈ７，５中、６５℃３０分間アルカリ性フォスファター
ゼ処理して自己閉環を防止したプラスミドＤＮＡ、及び
（３） ＢａｍＨＩとＣ１ａｌとで２重切断したＰＡ
Δ３１４の３者を混合し、例１と同様にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを作用させて接続した後、枯草菌Ｕ ＯＴ ０７３
４を形質転換した。形質転換株からまずテトラサイクリ
ン耐性を示す株を選び、アルカリ法によるプラスミドＤ
ＮＡの抽出、次いでＢｇｌｌｌ処理によって約６６００
塩基対のＤＮＡ断片を生ずるプラスミドρＢＡ７７を選
択した。
一方、プラスミドｐｃ１９４由来のクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子ｃａｔを含むファージφＣＭの方からは、
本遺伝子を含む約 １０００塩基対のＢａｍＨＩ−Ｂｇ
ｌｎ断片を切り出した。本ＤＮＡ断片及びＢａｍＨＩで
部分切断した上記プラスミドρＢＡ７７を混合しＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで接続後、常法に従いＵ ＯＴ ０７３４
を形質転換して、まずテトラサイクリン及びクロラムフ
ェニコール両耐性株を選択した。さらに、これらの株か
らアルカリ法でプラスミドＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨＩ
で切断して、約３０００塩基対の断片を示すプラスミド
を選び出した。これらの内、ΔａＩＩＩｙ Ｆの上流に
ｃａｔが接続されたものをｐｊＡ１６０、他方下流にｃ
ａｔが接続されたものをｐＰＡ１６２と名付けた。いず
れのプラスミドとも、ΔａｍｙＦの上流領域にそれぞれ
１ケ所のＰｓｔｌ及びＢｇｌＩＩ切断部位を有し、これ
らがクローニング部位となりうるのでこれらのプラスミ
ドは、すでにしてプロモータープローブベクターとして
機能を備えているといえる。
ル耐性遺伝子ｃａｔを含むファージφＣＭの方からは、
本遺伝子を含む約 １０００塩基対のＢａｍＨＩ−Ｂｇ
ｌｎ断片を切り出した。本ＤＮＡ断片及びＢａｍＨＩで
部分切断した上記プラスミドρＢＡ７７を混合しＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで接続後、常法に従いＵ ＯＴ ０７３４
を形質転換して、まずテトラサイクリン及びクロラムフ
ェニコール両耐性株を選択した。さらに、これらの株か
らアルカリ法でプラスミドＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨＩ
で切断して、約３０００塩基対の断片を示すプラスミド
を選び出した。これらの内、ΔａＩＩＩｙ Ｆの上流に
ｃａｔが接続されたものをｐｊＡ１６０、他方下流にｃ
ａｔが接続されたものをｐＰＡ１６２と名付けた。いず
れのプラスミドとも、ΔａｍｙＦの上流領域にそれぞれ
１ケ所のＰｓｔｌ及びＢｇｌＩＩ切断部位を有し、これ
らがクローニング部位となりうるのでこれらのプラスミ
ドは、すでにしてプロモータープローブベクターとして
機能を備えているといえる。
第１図に以上の操作過程をまとめて示す。
例３ ファージベクターへの組み込み
例２で得た２種のプラスミドρＰＡ１６０及びｐＰＡ１
６２の有する約３０００塩基対から成るＢａｍＨＩ断片
（Δａｍｙ Ｆ、ポリリンカー及びｃａｔ遺伝子を含む
）をファージベクターに組み込むため以下の操作を行っ
た。
６２の有する約３０００塩基対から成るＢａｍＨＩ断片
（Δａｍｙ Ｆ、ポリリンカー及びｃａｔ遺伝子を含む
）をファージベクターに組み込むため以下の操作を行っ
た。
すなわち、φ１０５の誘導体で、φ１０５ＥｃｏＲＩ断
片Ｇ、Ｉ、Ｅの代りに枯草菌染色体由来の約５０００塩
基対のＥｃｏＲ１断片をもち、豆本断片上にそれぞれ１
ケ所のＢａｍＨＩとＢｇｌｎとの切断部位をもつファー
ジφ１０５ｈｉｓ Ａ＋をＢｇｌＩＩで切断接、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼ■クレノウ断片による末端の平滑化
１次いでＴ４ＤＮＡリガーゼによる、リン酸基を付与し
たＢａｍＨＩリンカ−（ｐＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）の結
合を行った。次にこの様にして得られたＤＮＡ混液をＢ
ａｍＨＩで切断する一方、ｐＰＡ１６０又はｐＰＡ１６
２も同じ＜ＢａｍＨＩで切断し、両者を混合、更にＴ４
ＤＮＡリガーゼで結合させた後ＵＯＴ０７３４ （φ１
０５）を形質転換した。クロラムフェニコール耐性転換
株を得た後、次いでマイトマイシン処理、ファージＤＮ
Ａの回収、ＢａｍＨＩ切断処理を順次行い、約３０００
塩暴対のＢａｍＨＩ断片を生じるファージを選択した。
片Ｇ、Ｉ、Ｅの代りに枯草菌染色体由来の約５０００塩
基対のＥｃｏＲ１断片をもち、豆本断片上にそれぞれ１
ケ所のＢａｍＨＩとＢｇｌｎとの切断部位をもつファー
ジφ１０５ｈｉｓ Ａ＋をＢｇｌＩＩで切断接、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼ■クレノウ断片による末端の平滑化
１次いでＴ４ＤＮＡリガーゼによる、リン酸基を付与し
たＢａｍＨＩリンカ−（ｐＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）の結
合を行った。次にこの様にして得られたＤＮＡ混液をＢ
ａｍＨＩで切断する一方、ｐＰＡ１６０又はｐＰＡ１６
２も同じ＜ＢａｍＨＩで切断し、両者を混合、更にＴ４
ＤＮＡリガーゼで結合させた後ＵＯＴ０７３４ （φ１
０５）を形質転換した。クロラムフェニコール耐性転換
株を得た後、次いでマイトマイシン処理、ファージＤＮ
Ａの回収、ＢａｍＨＩ切断処理を順次行い、約３０００
塩暴対のＢａｍＨＩ断片を生じるファージを選択した。
選択したファージを逐一解析した結果、第２図に示す様
に、ｐＰＡ１６０を用いた場合にはφＰＡＬとφＰＡ５
の２種類、一方ＰＰＡ１６２を用いた場合にはφＰＡ６
とφＰＡ１４の２種類、計４種類のファージが意図した
通りに造成されていることが明らかとなった。更に、上
記４種類のファージを保有する菌株のコーンスターチ寒
天培地上でのハロー形成状況を調べた結果、いずれも小
さなハローしか示さず、いずれのファージともアミラー
ゼ活性を指標としてプロモータを検索するのに有用であ
ると考えられたが、中でもφＰＡ１４を保有する株が示
すハローは最も小さいもので、プロモータープローブベ
クターとして有用なことが示唆された。
に、ｐＰＡ１６０を用いた場合にはφＰＡＬとφＰＡ５
の２種類、一方ＰＰＡ１６２を用いた場合にはφＰＡ６
とφＰＡ１４の２種類、計４種類のファージが意図した
通りに造成されていることが明らかとなった。更に、上
記４種類のファージを保有する菌株のコーンスターチ寒
天培地上でのハロー形成状況を調べた結果、いずれも小
さなハローしか示さず、いずれのファージともアミラー
ゼ活性を指標としてプロモータを検索するのに有用であ
ると考えられたが、中でもφＰＡ１４を保有する株が示
すハローは最も小さいもので、プロモータープローブベ
クターとして有用なことが示唆された。
以上の操作で、ファージ内にクロラムフェニコール耐性
遺伝子、プロモーター領域を欠失したアミラーゼ遺伝子
及び有用な複数制限酵素切断部位をもつ合成ポリリンカ
ーを有する新規なファージベクターφＰＡを完成するに
至った。
遺伝子、プロモーター領域を欠失したアミラーゼ遺伝子
及び有用な複数制限酵素切断部位をもつ合成ポリリンカ
ーを有する新規なファージベクターφＰＡを完成するに
至った。
第１図は本発明によりｐＰＡ１６０及びｐＰＡ１６２を
作製する手順を示す説明図である。第２図はｐＰＡ１６
０及びｐＰＡ１６２を用いた場合の意図したファージが
達成されていることを示す説明図である。
作製する手順を示す説明図である。第２図はｐＰＡ１６
０及びｐＰＡ１６２を用いた場合の意図したファージが
達成されていることを示す説明図である。
Claims (1)
- １、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びプロモーター
領域を欠失したアミラーゼ遺伝子を枯草菌テンペレート
ファージφ１０５に組み込んだファージベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60208160A JPS6269989A (ja) | 1985-09-20 | 1985-09-20 | 新規フア−ジベクタ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60208160A JPS6269989A (ja) | 1985-09-20 | 1985-09-20 | 新規フア−ジベクタ− |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6269989A true JPS6269989A (ja) | 1987-03-31 |
Family
ID=16551643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60208160A Pending JPS6269989A (ja) | 1985-09-20 | 1985-09-20 | 新規フア−ジベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6269989A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5242821A (en) * | 1989-07-10 | 1993-09-07 | Valio, Finnish Co-Operative Dairies' Association | Lactococcus promoter and signal sequences for expression in bacteria |
-
1985
- 1985-09-20 JP JP60208160A patent/JPS6269989A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5242821A (en) * | 1989-07-10 | 1993-09-07 | Valio, Finnish Co-Operative Dairies' Association | Lactococcus promoter and signal sequences for expression in bacteria |
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