JPS626680A - 酵素の溶解法 - Google Patents
酵素の溶解法Info
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- JPS626680A JPS626680A JP61116325A JP11632586A JPS626680A JP S626680 A JPS626680 A JP S626680A JP 61116325 A JP61116325 A JP 61116325A JP 11632586 A JP11632586 A JP 11632586A JP S626680 A JPS626680 A JP S626680A
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- amine
- enzyme
- resin
- glucose isomerase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は水性グルコースイソメラーゼの精製法に関し、
特に該溶液をアミンで処理して該酵素を含有する不溶性
錯体をつくシ、そこからのグルコースイソメラーゼの再
可溶化法に関する。
特に該溶液をアミンで処理して該酵素を含有する不溶性
錯体をつくシ、そこからのグルコースイソメラーゼの再
可溶化法に関する。
グルコースイソメラーゼはグルコースを７ラクトスに変
換する酵素である。種々の微生物がグルコースイソメラ
ーゼを生産することが知られている。たとえばアクチッ
プラｙｘ （Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ）、エアロバ
クター（４ｅｒｏｂａｃｔｅｒ ）、７ｙプラリエラ（
Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ ）、アースロバフタ−（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）、 バシルス（Ｂａｃｉ
１ｌｕｓ ）、ラクトバシルス（Ｌａｅｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕａ ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅａ ）属の微生物がグラコースイソメラーゼを
生産する。一般にグルコースイソメラーゼは主に細胞内
で主に生産され、従ってイソメラーゼの要部は微生物の
細胞壁内及び又はその上に見出される。それ故、可溶性
酵素をつくるには微生物細胞から酵素を抽出する必要が
ある。
換する酵素である。種々の微生物がグルコースイソメラ
ーゼを生産することが知られている。たとえばアクチッ
プラｙｘ （Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ）、エアロバ
クター（４ｅｒｏｂａｃｔｅｒ ）、７ｙプラリエラ（
Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ ）、アースロバフタ−（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）、 バシルス（Ｂａｃｉ
１ｌｕｓ ）、ラクトバシルス（Ｌａｅｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕａ ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅａ ）属の微生物がグラコースイソメラーゼを
生産する。一般にグルコースイソメラーゼは主に細胞内
で主に生産され、従ってイソメラーゼの要部は微生物の
細胞壁内及び又はその上に見出される。それ故、可溶性
酵素をつくるには微生物細胞から酵素を抽出する必要が
ある。
抽出操作は少なくとも一部の細胞外皮の破壊をもたらし
、酵素その他の細胞質物質が微生物酵素抽出液中に拡散
する。
、酵素その他の細胞質物質が微生物酵素抽出液中に拡散
する。
それ故酵素抽出液は可溶及び不溶の両不純物を含む。不
溶性不純物は、濾過や遠心分離といった公知の方法で容
易に分離しうる。しかし、たとえば核酸、非酵素性蛋白
又は細胞壁酸物、たとえばポリ尿酸等、のような生物学
的オリゴマーと考えられる可溶性不純物は、それらがし
ばしば目的物に類似した化学的又は物理的性質を有する
が故に、除去が困難で且つ高価につく。
溶性不純物は、濾過や遠心分離といった公知の方法で容
易に分離しうる。しかし、たとえば核酸、非酵素性蛋白
又は細胞壁酸物、たとえばポリ尿酸等、のような生物学
的オリゴマーと考えられる可溶性不純物は、それらがし
ばしば目的物に類似した化学的又は物理的性質を有する
が故に、除去が困難で且つ高価につく。
微生物的酵素抽出物から望ましくない可溶性物質を除去
又は分離する方法は知られている。最近それら方法の要
約が、「メンットインエ／ザイモロジーＪ （Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｘｏｇ）ｒ ） 、Ｍｏ１．
ＸＸＩＩ、 ２７３〜２８７頁及び４７６〜５５６頁
（ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｅｓ社、Ｗ
、 Ｅ、 Ｊａｋｏｂｙ著）に紹介されている。溶解度
に基づく分離、特異的親和性に基づく分離、クロマトグ
ラフィーによる分離等の種々の方法が述べられている。
又は分離する方法は知られている。最近それら方法の要
約が、「メンットインエ／ザイモロジーＪ （Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｘｏｇ）ｒ ） 、Ｍｏ１．
ＸＸＩＩ、 ２７３〜２８７頁及び４７６〜５５６頁
（ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｅｓ社、Ｗ
、 Ｅ、 Ｊａｋｏｂｙ著）に紹介されている。溶解度
に基づく分離、特異的親和性に基づく分離、クロマトグ
ラフィーによる分離等の種々の方法が述べられている。
酵素の精製については多くの特許もある。米国特許第３
゜７６９．１６８号（増田）はベータアミラーゼの精製
法として該酵素を吸着、洗浄、イオン性溶液を用いて溶
離する方法を開示している。米国特許第３．９１４５９
５号（ｐｈｉｌｉｐｐ等）は加水分解酵素の精製法とし
て、カラム中の粒状支持体に酵素を可逆的に錯体化して
からバッファーでの溶離によって回収する方法を開示し
ている。米国特許第３．９７Ｚ７７７号（山田等）はβ
−ガラクトシダーゼの精製法とし七酸カチオン交換樹脂
に選択吸着してからバッファーで溶離する方法を開示し
ている。これらの方法はいづれも不純な酵素溶液を酵素
を吸着又は結合するマトリックスと接触させ、次いでイ
オン性溶液を添加してマトリックスから精製酵素を溶離
するものである。
゜７６９．１６８号（増田）はベータアミラーゼの精製
法として該酵素を吸着、洗浄、イオン性溶液を用いて溶
離する方法を開示している。米国特許第３．９１４５９
５号（ｐｈｉｌｉｐｐ等）は加水分解酵素の精製法とし
て、カラム中の粒状支持体に酵素を可逆的に錯体化して
からバッファーでの溶離によって回収する方法を開示し
ている。米国特許第３．９７Ｚ７７７号（山田等）はβ
−ガラクトシダーゼの精製法とし七酸カチオン交換樹脂
に選択吸着してからバッファーで溶離する方法を開示し
ている。これらの方法はいづれも不純な酵素溶液を酵素
を吸着又は結合するマトリックスと接触させ、次いでイ
オン性溶液を添加してマトリックスから精製酵素を溶離
するものである。
米国特許第４，３４７，３２２号（Ｊｏｈｎｓｏｎ等）
はクロｆトゲラフ的な酵素精製法として可溶性不純物を
イオン交換樹脂によシ優先的に吸着する方法を開示して
いる。米国特許第４，１０６，９９２号（ｖａｉｒｅｌ
等）はＤＥＡＥ−４ル。
はクロｆトゲラフ的な酵素精製法として可溶性不純物を
イオン交換樹脂によシ優先的に吸着する方法を開示して
いる。米国特許第４，１０６，９９２号（ｖａｉｒｅｌ
等）はＤＥＡＥ−４ル。
−ス樹脂を用いる除外クロマトグラフィーによるウロキ
ナーゼの精製法を開示している。この方法は特にウロキ
ナーゼからの発熱性物質の除去を対象としている。
ナーゼの精製法を開示している。この方法は特にウロキ
ナーゼからの発熱性物質の除去を対象としている。
いくつかの特許が微生物的酵素抽出物の沈澱による精製
法を開示している。米国特許第３，７２８，２４４号（
Ｂｏｒｇｌｕｍ）は４級アンモニウム化合物による不純
物の沈澱を開示している。米国特許第４，０５５，４６
９号（５ｎｏｋｅ 等）は合成高分子電解質を用いる不
純物の沈澱を開示している。英国特許第１，４１１，５
０３号（Ｍｏｒｉｓｉ等）はカチオン界面活性剤による
不純物の精製を開示している。これらの特許はいづれも
活性薄紫を溶液中に残存させながら不純物を沈澱し除去
するものである。
法を開示している。米国特許第３，７２８，２４４号（
Ｂｏｒｇｌｕｍ）は４級アンモニウム化合物による不純
物の沈澱を開示している。米国特許第４，０５５，４６
９号（５ｎｏｋｅ 等）は合成高分子電解質を用いる不
純物の沈澱を開示している。英国特許第１，４１１，５
０３号（Ｍｏｒｉｓｉ等）はカチオン界面活性剤による
不純物の精製を開示している。これらの特許はいづれも
活性薄紫を溶液中に残存させながら不純物を沈澱し除去
するものである。
少なくとも１つの長鎖炭化水素Ｎ−置換基を持つ４級ア
ンモニウム化合物は溶液中に凝集体又はミセルをつくシ
うる界面活性電解質である。これらの化合物は親水性４
級アミノ基と疎水性炭化水素鎖を持っている。多くの４
級アンモニウム化合物はそれらの微生物を不活性化又は
阻害する能力に基づく抗菌剤として広く用いられている
。この性質は陽性に荷電した４級アミンと陰性に荷電し
た微生物表面間でのアニオン−カチオン錯体の形成に基
づいていると考えられる。
ンモニウム化合物は溶液中に凝集体又はミセルをつくシ
うる界面活性電解質である。これらの化合物は親水性４
級アミノ基と疎水性炭化水素鎖を持っている。多くの４
級アンモニウム化合物はそれらの微生物を不活性化又は
阻害する能力に基づく抗菌剤として広く用いられている
。この性質は陽性に荷電した４級アミンと陰性に荷電し
た微生物表面間でのアニオン−カチオン錯体の形成に基
づいていると考えられる。
４級アンモニウム化合物はまた蛋白質等の種々の陰性に
荷電した高分子と不溶性アニオン−カチオン錯体をつく
る。
荷電した高分子と不溶性アニオン−カチオン錯体をつく
る。
沈澱、不活性化、変性、再分散及び錯体形成はいづれも
蛋白と４級アンモニウム化合物の相互作用に基づくとさ
れている。
蛋白と４級アンモニウム化合物の相互作用に基づくとさ
れている。
ある種のアミン化合物がグルコースイソメラーゼ精製法
で用いうることか意外にも見出された。かかる化合物は
１９８５年９月３０日発行のベルギー特許第９０２，０
４８号に開示されている。
で用いうることか意外にも見出された。かかる化合物は
１９８５年９月３０日発行のベルギー特許第９０２，０
４８号に開示されている。
本発明方法で用いうる３級及び４級アミン化合物は次式
％式％： ここでＲｚは炭素原子少なくとも６個を持つヒドロカル
ビル基であシ、 Ｒ２は炭素原子約８〜２０個を持つヒドロカルビル基で
あり、 １１１１３は低級アルキル基であシ、 Ｒ４は水素又は低級アルキル基である。
％式％： ここでＲｚは炭素原子少なくとも６個を持つヒドロカル
ビル基であシ、 Ｒ２は炭素原子約８〜２０個を持つヒドロカルビル基で
あり、 １１１１３は低級アルキル基であシ、 Ｒ４は水素又は低級アルキル基である。
上記において好ましいヒドロカルビル基はアルキル、シ
クロアルキル、アルケン、アリール及びアラルキルであ
り、これらはクロロ、ブロモの如きハロゲン、ヒドロキ
シ、アルコキシ、その他の基で置換されていてもよい。
クロアルキル、アルケン、アリール及びアラルキルであ
り、これらはクロロ、ブロモの如きハロゲン、ヒドロキ
シ、アルコキシ、その他の基で置換されていてもよい。
またヒドロカルビル基はエーテルやチオエーテル結合に
おけるように酵素又は硫黄原子が介在する炭化水素基、
たとえばジインブチルフェノキシエトキシエチル基、ジ
インプチルクレゾキシエトキシエチル基等、も含むもの
である。
おけるように酵素又は硫黄原子が介在する炭化水素基、
たとえばジインブチルフェノキシエトキシエチル基、ジ
インプチルクレゾキシエトキシエチル基等、も含むもの
である。
Ｘは適宜の無機又は有機アニオンであシ、たとえばハラ
イド、硝酸塩、硫酸塩、ベンゾスルホネート、酢酸塩等
がある。このアニオンは酵素に不活性である。
イド、硝酸塩、硫酸塩、ベンゾスルホネート、酢酸塩等
がある。このアニオンは酵素に不活性である。
本発明で用いうる上記式で示されるアミン基の例には、
ジメチルベンジルドデシルアンモニウム、ステアリルジ
メチルベンジルアンモニウム、ジステアリルジメチルア
ンモニウム、ジエチルジオクタデシルアンモニウム、ジ
メチルジドデシルアンモニウム、ジメチルドデシルナフ
チルメチルアンモニウム、ジメチルヘキサデシルジクロ
ロベンジルアンモニウム、ジメチルジインブチルフェノ
キシエチルペンジルアンモニウム塩等がある。
ジメチルベンジルドデシルアンモニウム、ステアリルジ
メチルベンジルアンモニウム、ジステアリルジメチルア
ンモニウム、ジエチルジオクタデシルアンモニウム、ジ
メチルジドデシルアンモニウム、ジメチルドデシルナフ
チルメチルアンモニウム、ジメチルヘキサデシルジクロ
ロベンジルアンモニウム、ジメチルジインブチルフェノ
キシエチルペンジルアンモニウム塩等がある。
一旦不溶性アミンーインメラーゼ錯体が形成されると、
該錯体は濾過、遠心分離等の通常の手段で分離しうる。
該錯体は濾過、遠心分離等の通常の手段で分離しうる。
粗製抽出物から錯体を除去して後、インメラーゼを再溶
解する。ベルギー特許第９０４０４８号記載の有用な方
法はイオン化した塩溶液を添加を含む。一旦酵素が溶解
すると塩とアミン化合物が除かれる。
解する。ベルギー特許第９０４０４８号記載の有用な方
法はイオン化した塩溶液を添加を含む。一旦酵素が溶解
すると塩とアミン化合物が除かれる。
再可溶化混合物にカチオン交換樹脂を含めることによυ
アミン化合物が効果的に該樹脂に移行するだけでなく再
可溶化に必要なイオン性塩溶液の濃度を大巾に減少させ
うるという意外な事実を見出した。
アミン化合物が効果的に該樹脂に移行するだけでなく再
可溶化に必要なイオン性塩溶液の濃度を大巾に減少させ
うるという意外な事実を見出した。
本発明は不溶性グルコースイソメラーゼーアミン錯体の
可溶化法を提供するものである。この可溶化は可溶化混
合物にカチオン交換樹脂を加えることによって達成され
る。
可溶化法を提供するものである。この可溶化は可溶化混
合物にカチオン交換樹脂を加えることによって達成され
る。
本発明は不溶性グルコースイソメラーゼーアミン錯体を
カチオン交換樹脂を含有する水性媒体中で反応させるこ
とによる核錯体からのグルコースイソメラーゼの可溶化
法を提供するものである。
カチオン交換樹脂を含有する水性媒体中で反応させるこ
とによる核錯体からのグルコースイソメラーゼの可溶化
法を提供するものである。
本発明によれば、上記のアミン化合物の少なくと本１つ
を、精製すべきグルコースイソメラーゼ水性抽出物に、
該アミンがグルコースイソメラーゼと反応して沈澱する
不溶性インメラーゼーアミン錯体を生成する条件下に加
える。
を、精製すべきグルコースイソメラーゼ水性抽出物に、
該アミンがグルコースイソメラーゼと反応して沈澱する
不溶性インメラーゼーアミン錯体を生成する条件下に加
える。
次いで不溶性インメラーゼーアミン錯体をコ°１過、遠
心分離等の通常の手段で分離する。この沈澱物から酵素
を除くために、インメラーゼーアミン錯体をカチオン交
換樹脂を含有するイオン化した塩溶液に加え、該錯体を
解離しインメラーゼを再溶解させる。アミン化合物は該
樹脂に移行し、酵素溶液から濾過、遠心分離等によって
分離して高い比活性（たとえば蛋白η当シの活性）を持
つ精製され、濃厚化したグルコースイソメラーゼ調合物
が得られる。
心分離等の通常の手段で分離する。この沈澱物から酵素
を除くために、インメラーゼーアミン錯体をカチオン交
換樹脂を含有するイオン化した塩溶液に加え、該錯体を
解離しインメラーゼを再溶解させる。アミン化合物は該
樹脂に移行し、酵素溶液から濾過、遠心分離等によって
分離して高い比活性（たとえば蛋白η当シの活性）を持
つ精製され、濃厚化したグルコースイソメラーゼ調合物
が得られる。
沈澱した酵素−アミン錯体の再溶解に要するイオン化し
た塩と樹脂の量は適宜の電解質の異なる濃度、即ちイオ
ン強度、の溶液を使う簡単な試験法で容易に決めること
ができる。電解質としては経済性及び入手容易性から塩
化ナトリウムが好ましい。グルコースイソメラーゼに対
して悪影響を及ぼすものでない限９種々の電解質を用い
うる。好ましい塩にはＮａｇ Ｓ Ｏ４、ＫＣＩ、Ｋｓ
Ｓｏａ、ＫＮＯｓ、ＮａＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ
４）２ Ｓ Ｏａ、マグネシウム塩、マンガン塩、コバ
ルト塩、酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、ピリジニ
ウムクロライド、１価のアニオン及びカチオンの塩等が
ある。塩の必要量は沈澱を溶解するに要する最小濃度と
して決定しうる。塩化ナトリウムは酵素に対し特別の効
果を持つとは思えずまた沈澱の溶解を完全に行なうべく
濃厚溶液で用いうるが、低い塩濃度での使用が好ましく
それでも酵素の効率的な可溶化が行なえる。可溶化した
酵素をＤＥＡＥ−セルロースへ吸着させるときのように
固定化酵素系に用いる場合にはこのことは確かである。
た塩と樹脂の量は適宜の電解質の異なる濃度、即ちイオ
ン強度、の溶液を使う簡単な試験法で容易に決めること
ができる。電解質としては経済性及び入手容易性から塩
化ナトリウムが好ましい。グルコースイソメラーゼに対
して悪影響を及ぼすものでない限９種々の電解質を用い
うる。好ましい塩にはＮａｇ Ｓ Ｏ４、ＫＣＩ、Ｋｓ
Ｓｏａ、ＫＮＯｓ、ＮａＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ
４）２ Ｓ Ｏａ、マグネシウム塩、マンガン塩、コバ
ルト塩、酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、ピリジニ
ウムクロライド、１価のアニオン及びカチオンの塩等が
ある。塩の必要量は沈澱を溶解するに要する最小濃度と
して決定しうる。塩化ナトリウムは酵素に対し特別の効
果を持つとは思えずまた沈澱の溶解を完全に行なうべく
濃厚溶液で用いうるが、低い塩濃度での使用が好ましく
それでも酵素の効率的な可溶化が行なえる。可溶化した
酵素をＤＥＡＥ−セルロースへ吸着させるときのように
固定化酵素系に用いる場合にはこのことは確かである。
事実、下記するように、塩の非存在下においてさえ（即
ち沈澱のを樹脂だけと接触させることにより）、ある程
度の再溶解は行なわれる。それ故、沈澱と樹脂との接触
を繰り返すことにより添加塩が存在しなくともインメラ
ーゼの可溶化を行なうことは可能である。
ち沈澱のを樹脂だけと接触させることにより）、ある程
度の再溶解は行なわれる。それ故、沈澱と樹脂との接触
を繰り返すことにより添加塩が存在しなくともインメラ
ーゼの可溶化を行なうことは可能である。
本発明では種々のイオン交換樹脂を用いうる。好ましい
樹脂には、ポリスチレンスルホン酸樹脂、たとえばＤｏ
ｗｅｘＡＧ ５０Ｗ；Ｄｕｏｌｉｔｅ Ｃ２０；Ａ
ｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１１６、ＩＲ−１１８、Ｉ
Ｒ−１２０；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ−７７；Ｉ
ｏｎａｃ Ｃ−２９８： Ｉｏｎａｃ Ｃ−２４９；
Ｚｅｏｃａｒｂ ２２５ ；１）ｉａｎｉｏｎ Ｓ
Ｋ １０２．５Ｋ１０３、ＳＫ １０４．５Ｋ１０６
： Ｌｅｗａｔｉｔ ＰＮ ； Ｌｅｗａｔｉｔ
Ｓ−１００： Ｉｍａｃ Ｃ−２２、Ｃ−１２；Ｋａｓ
ｔｉｌ Ｃ−３００；Ｗｏｆａｔｉｔ ＫＰＳ−２０
０； Ａ１１ａｓｓｉｏｎ−Ｃ８；及びＫａｔｉｏｎｉ
ｔｅ ＫＯ−２；微孔性ポリスチレン樹脂、たとえばＤ
ＯＷ１３Ｘ ＭＰＣ−１；１）ｕｏｌｉｔｅ Ｃ−２５
Ｄ％ＥＳ −２６： Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ２００ ；
工ｍａｃ Ｃ−１６９；及びＩ、ｅｗｔｉｔ ５−１
１５ ；フェノール系樹脂、たとえば竺孔性Ｄｕｏｌｉ
ｔｅ Ｃ−３：ＫａｔｉｏｎｉｔｅＫＯ１： Ｌｅｗａ
ｔｉｔ ＫＳＮ ；Ｗｏｆａｔｉｔ ｐ ；及びＺｅｏ
ｃａｒｂ２１５：カチオン性セルロース系樹脂、たとえ
ばＣｙｃｌａｓｅ−８Ｅ；及びデキストラン樹脂、たと
えばＳｐ ５ｅｐｈａｄｅｘ（スルホプロピルセファデ
ックス）等がある。これらの樹脂はそれぞれ次のところ
で入手しうる。
樹脂には、ポリスチレンスルホン酸樹脂、たとえばＤｏ
ｗｅｘＡＧ ５０Ｗ；Ｄｕｏｌｉｔｅ Ｃ２０；Ａ
ｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１１６、ＩＲ−１１８、Ｉ
Ｒ−１２０；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ−７７；Ｉ
ｏｎａｃ Ｃ−２９８： Ｉｏｎａｃ Ｃ−２４９；
Ｚｅｏｃａｒｂ ２２５ ；１）ｉａｎｉｏｎ Ｓ
Ｋ １０２．５Ｋ１０３、ＳＫ １０４．５Ｋ１０６
： Ｌｅｗａｔｉｔ ＰＮ ； Ｌｅｗａｔｉｔ
Ｓ−１００： Ｉｍａｃ Ｃ−２２、Ｃ−１２；Ｋａｓ
ｔｉｌ Ｃ−３００；Ｗｏｆａｔｉｔ ＫＰＳ−２０
０； Ａ１１ａｓｓｉｏｎ−Ｃ８；及びＫａｔｉｏｎｉ
ｔｅ ＫＯ−２；微孔性ポリスチレン樹脂、たとえばＤ
ＯＷ１３Ｘ ＭＰＣ−１；１）ｕｏｌｉｔｅ Ｃ−２５
Ｄ％ＥＳ −２６： Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ２００ ；
工ｍａｃ Ｃ−１６９；及びＩ、ｅｗｔｉｔ ５−１
１５ ；フェノール系樹脂、たとえば竺孔性Ｄｕｏｌｉ
ｔｅ Ｃ−３：ＫａｔｉｏｎｉｔｅＫＯ１： Ｌｅｗａ
ｔｉｔ ＫＳＮ ；Ｗｏｆａｔｉｔ ｐ ；及びＺｅｏ
ｃａｒｂ２１５：カチオン性セルロース系樹脂、たとえ
ばＣｙｃｌａｓｅ−８Ｅ；及びデキストラン樹脂、たと
えばＳｐ ５ｅｐｈａｄｅｘ（スルホプロピルセファデ
ックス）等がある。これらの樹脂はそれぞれ次のところ
で入手しうる。
Ａｌ１４ｓｓｉｏｎ・・・フランス、ダイア−プロシム
、ビトリーーサーーセーヌ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ・・・フィラデルフィア、ローム＆
ハースＡｎｉｏｎｉｔｔｅ −ソ連 １）６−Ａｃｉｄｉｔｅ・・・ロンドン、パームチット
社］）ｉａｉｏｎ ・・・東京、三菱１）ｕｏｌｉ
ｔｅ ・・・ＣＡ、レットウッドシティ、ダイアモン
ドジャムロック ■ｍａｃ ・・・アムステルダム、インダストリ
ールーナーツシャツピ エｏｎａｃ ・・・ＮＪ１バーミンガム、イオナ
ツク ケミカル社 Ｋａｓｔｅｌ ・・・ミラノ、モンテカチニＫａｔ
ｉｏｎｉｔｅ ・−ソ連 Ｌｅｗａｔｉｔ ・・・西独、バイエルＷｏｆａｔｉ
ｔ ・・・東独、ウォヘンダイ ファクトリ−２ｅｏ
−１（ａｒｂ ・・・ロンドン、パームチット社Ｄｏ
ｗｅｘ ・・・ＭＩ、 ミドランド、ダウ ケミ
カル社Ｃｙｃｌｏｓｅ ・・・ロスアンジエルス、シ
クロ ケミカル社５ｅｐｈａｄｅｘ ・・・アブサラ
、ファルマシア特に好ましい樹脂はＡＧ ５Ｏ−Ｗ−Ｘ
４ （カリホルニア、リッチモンド、バイオ−ラッド
ラボ）である。用いる樹脂量は樹脂濃度を種々変えた簡
単な試験法で決定しうる。
、ビトリーーサーーセーヌ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ・・・フィラデルフィア、ローム＆
ハースＡｎｉｏｎｉｔｔｅ −ソ連 １）６−Ａｃｉｄｉｔｅ・・・ロンドン、パームチット
社］）ｉａｉｏｎ ・・・東京、三菱１）ｕｏｌｉ
ｔｅ ・・・ＣＡ、レットウッドシティ、ダイアモン
ドジャムロック ■ｍａｃ ・・・アムステルダム、インダストリ
ールーナーツシャツピ エｏｎａｃ ・・・ＮＪ１バーミンガム、イオナ
ツク ケミカル社 Ｋａｓｔｅｌ ・・・ミラノ、モンテカチニＫａｔ
ｉｏｎｉｔｅ ・−ソ連 Ｌｅｗａｔｉｔ ・・・西独、バイエルＷｏｆａｔｉ
ｔ ・・・東独、ウォヘンダイ ファクトリ−２ｅｏ
−１（ａｒｂ ・・・ロンドン、パームチット社Ｄｏ
ｗｅｘ ・・・ＭＩ、 ミドランド、ダウ ケミ
カル社Ｃｙｃｌｏｓｅ ・・・ロスアンジエルス、シ
クロ ケミカル社５ｅｐｈａｄｅｘ ・・・アブサラ
、ファルマシア特に好ましい樹脂はＡＧ ５Ｏ−Ｗ−Ｘ
４ （カリホルニア、リッチモンド、バイオ−ラッド
ラボ）である。用いる樹脂量は樹脂濃度を種々変えた簡
単な試験法で決定しうる。
ある場合には、酵素を回収すべき水性酵素溶液は目的と
する酵素を沈澱する前に、加えたアミン化合物で沈澱を
形成する不純物を含有しうる。この場合には、アミン添
加は数段階、通常２段階に行なうべきであり、最初の段
階で不純物を沈澱して、第２段階での酵素の最終的な沈
澱の前にこれを除く。最初の段階で必要なアミンの量は
、元の酵素溶液を分割して段階的な量のアミン化合物を
加えるという簡単な方法で決定しうる。各添加で形成し
た沈澱について既に検知された酵素活性を試験する。こ
の酵素活性は最初の段階の沈澱に必要な沈澱剤の盆を示
している。
する酵素を沈澱する前に、加えたアミン化合物で沈澱を
形成する不純物を含有しうる。この場合には、アミン添
加は数段階、通常２段階に行なうべきであり、最初の段
階で不純物を沈澱して、第２段階での酵素の最終的な沈
澱の前にこれを除く。最初の段階で必要なアミンの量は
、元の酵素溶液を分割して段階的な量のアミン化合物を
加えるという簡単な方法で決定しうる。各添加で形成し
た沈澱について既に検知された酵素活性を試験する。こ
の酵素活性は最初の段階の沈澱に必要な沈澱剤の盆を示
している。
本発明の実施において、上記一般式で、Ｒ２が炭素原子
約８〜約１８個を持つアルキル基であり、Ｒ＋が炭素原
子約６〜約１０個を持つ基であシ、Ｒ３とＲ４が低級ア
ルキル基であり、Ｘがハロゲンアニオンである４級アミ
ンを用いることが好ましい。より好ましい化合物は、Ｒ
２が炭素原子１２〜１８個を持つアルキル基であり、Ｒ
１が炭素原子７〜１０個を持つアラルキル基であり、Ｒ
３とＲ４が低級アルキル基であり、Ｘがハロゲンである
ものである。
約８〜約１８個を持つアルキル基であり、Ｒ＋が炭素原
子約６〜約１０個を持つ基であシ、Ｒ３とＲ４が低級ア
ルキル基であり、Ｘがハロゲンアニオンである４級アミ
ンを用いることが好ましい。より好ましい化合物は、Ｒ
２が炭素原子１２〜１８個を持つアルキル基であり、Ｒ
１が炭素原子７〜１０個を持つアラルキル基であり、Ｒ
３とＲ４が低級アルキル基であり、Ｘがハロゲンである
ものである。
最も好ましい化合物は次式で示されうる：ＣＨ。
ここでｎは１２．１４又は１６でありＸはハロゲンであ
る。これらの化合物を含む製品はニューシャーシー州シ
ャーシーシティのオニックスケミカル社からＢＴＣ−８
３５の名で市販されている。ＢＴＣ−８３５は上記式に
おいてｎが１４の化合物５０％、上記式においてｎが１
２の化合物■チ及び上記式においてｎが１６の化合物１
０％からなる混合物である。またＭａｑｕａｔ １４
１２ の名で市販されている化合物（イリノイ州シカゴ
、メーンンケミカル社製、ｎ−アルキルジメチルペンジ
ルアンモニウムクロライド５０チ）も特に有用である。
る。これらの化合物を含む製品はニューシャーシー州シ
ャーシーシティのオニックスケミカル社からＢＴＣ−８
３５の名で市販されている。ＢＴＣ−８３５は上記式に
おいてｎが１４の化合物５０％、上記式においてｎが１
２の化合物■チ及び上記式においてｎが１６の化合物１
０％からなる混合物である。またＭａｑｕａｔ １４
１２ の名で市販されている化合物（イリノイ州シカゴ
、メーンンケミカル社製、ｎ−アルキルジメチルペンジ
ルアンモニウムクロライド５０チ）も特に有用である。
本発明を行なう条件はインメラーゼ抽出物の純度、濃度
及び用いるアミン化合物によって異なる。用いるアミン
の量は活性酵素め実質上すべてを沈澱するに十分な量で
あるべきであシ、通常、重量／容量基準で、少なくとも
１１００ｐｐである。好ましい量は少なくとも約５００
ｐｐｍ、通常約５００ｐｐｍ〜約５．ＯＯＯｐｐｍであ
る。最も好ましくは約１．ＯＯＯｐｐｍ〜約３，０００
ｐｐｍである。
及び用いるアミン化合物によって異なる。用いるアミン
の量は活性酵素め実質上すべてを沈澱するに十分な量で
あるべきであシ、通常、重量／容量基準で、少なくとも
１１００ｐｐである。好ましい量は少なくとも約５００
ｐｐｍ、通常約５００ｐｐｍ〜約５．ＯＯＯｐｐｍであ
る。最も好ましくは約１．ＯＯＯｐｐｍ〜約３，０００
ｐｐｍである。
ｐＨは酵素の等電点（ｐＩ）より上鉤１ ｐＨ単位と用
いるアミン化合物のｐＫａｊ：、９下約１ｐＨ単位の間
にあるべきである。好ましいｐＨは約５．５〜約８．５
、理想的には約６．０〜約８．０、最も好ましくは約７
．０〜約７．４である。
いるアミン化合物のｐＫａｊ：、９下約１ｐＨ単位の間
にあるべきである。好ましいｐＨは約５．５〜約８．５
、理想的には約６．０〜約８．０、最も好ましくは約７
．０〜約７．４である。
温度は０℃といった低温から酵素の熱変性又は不活性化
が起るよシ低い温度という広範囲で変えうる。通常は周
囲温度で十分である。
が起るよシ低い温度という広範囲で変えうる。通常は周
囲温度で十分である。
本発明方法の機構は完全には判っていない。しかし、ア
ミンがグルコースイソメラーゼと反応して不溶性インメ
ラーゼーアミン錯体をつくることは確かと思われる。不
溶性インメラーゼーアミン錯体をカチオン交換樹脂を含
む十分にイオン化した溶液に加えることにより、アミン
が樹脂に移行しインメラーゼを再度可溶化する。
ミンがグルコースイソメラーゼと反応して不溶性インメ
ラーゼーアミン錯体をつくることは確かと思われる。不
溶性インメラーゼーアミン錯体をカチオン交換樹脂を含
む十分にイオン化した溶液に加えることにより、アミン
が樹脂に移行しインメラーゼを再度可溶化する。
本発明方法で出発物質として用いるグルコースイソメラ
ーゼ抽出物をつくる方法は公知である。たとえば、グル
コースイソメラーゼを生産することが知られている池の
微生物を培養し、培養液から酵素を抽出し公知の方法で
不溶性物質を除くことによってグルコースイソメラーゼ
を含む酵素抽出物を得ることができる。
ーゼ抽出物をつくる方法は公知である。たとえば、グル
コースイソメラーゼを生産することが知られている池の
微生物を培養し、培養液から酵素を抽出し公知の方法で
不溶性物質を除くことによってグルコースイソメラーゼ
を含む酵素抽出物を得ることができる。
好ましいグルコースイソメラーゼ抽出物は、アクチップ
ランス、アンプラリエラ、エアロバクター、アースロバ
フタ−、バシルス、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏ
ｎｏｓｐｏｒａ）、ミクロビスポラ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓ
ｐｏｒａ ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｅｌｌｏ
ｂｏｓｐｏｒａ ）、ノルカルブイア（Ｎｏｒｃａｒｄ
ｉａ ）又はストレプトマイセス属の微生物から得るこ
とができる。
ランス、アンプラリエラ、エアロバクター、アースロバ
フタ−、バシルス、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏ
ｎｏｓｐｏｒａ）、ミクロビスポラ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓ
ｐｏｒａ ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｅｌｌｏ
ｂｏｓｐｏｒａ ）、ノルカルブイア（Ｎｏｒｃａｒｄ
ｉａ ）又はストレプトマイセス属の微生物から得るこ
とができる。
グルコースイソメラーゼ抽出物はより代表的には、スト
レプトマイセスルビゲノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｒｕｂｉｇｅｎｏｓｕｓ）、ストレプトマイセスオ
リボクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏｌｉｖ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ） 、パシルス コアギユ
ランス（１３ａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ）
又はバシルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）
＆の微生物から得られる。
レプトマイセスルビゲノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｒｕｂｉｇｅｎｏｓｕｓ）、ストレプトマイセスオ
リボクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏｌｉｖ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ） 、パシルス コアギユ
ランス（１３ａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ）
又はバシルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）
＆の微生物から得られる。
分析法
全蛋白
全蛋白は２８０ｍμの波長でペックマンモデルＤＫ−２
Ａ分光光度計を用いて測定した。
Ａ分光光度計を用いて測定した。
インメラーゼ活性−ＩＧ４Ｕ
ＩＧＩＵは国際グルコースイソメラーゼ単位の略号であ
シ、最初グルコースを１モル／ｌ、Ｍｇ５ｏ、を０．０
２モル／１％ｃｏｃｌ、を０．００１モル／を含む溶液
中で、ｐＨ６，８４〜６．８５（０，２Ｍマレイン酸ナ
トリウム、室温で測定したｐＨ） 、温度６０℃で、グ
ルコース１マイクロモルを分画シクラクトースに変換す
る酵素の量である。グクコースインメラーゼの決定はＮ
、 Ｅ、 Ｌｌｏｙｄ 等著、ＣｅｒｅａｌＣｈｅｍ
、、４９．Ａ５．５４４〜５５３負（１９７２）に記載
の方法で行なった。
シ、最初グルコースを１モル／ｌ、Ｍｇ５ｏ、を０．０
２モル／１％ｃｏｃｌ、を０．００１モル／を含む溶液
中で、ｐＨ６，８４〜６．８５（０，２Ｍマレイン酸ナ
トリウム、室温で測定したｐＨ） 、温度６０℃で、グ
ルコース１マイクロモルを分画シクラクトースに変換す
る酵素の量である。グクコースインメラーゼの決定はＮ
、 Ｅ、 Ｌｌｏｙｄ 等著、ＣｅｒｅａｌＣｈｅｍ
、、４９．Ａ５．５４４〜５５３負（１９７２）に記載
の方法で行なった。
次の例は本発明を例証するだめのものである。
例■
この例は４級アミンーインメラーゼ錯体の可溶化に対す
るカチオン交換樹脂の効果を示す。
るカチオン交換樹脂の効果を示す。
４２、２ ＩＧＩＵ／−のインメラーゼ活性を持つスト
レプトマイセス穐の細胞のない（セルフリー）抽出物の
５ｔバツチをｐＨ７，２に調節した。この攪拌した抽出
物にＭａｑｕａｔＭＣ１４１２−５１（ｎ−アルキルジ
メチルベンジルアンモニウムクロライド、イリノイ州シ
カゴ、メーンンケミカルカンパニー）１０ｆと）（ｙｆ
ｌｏ ５ｕｐｅｒｃｅｌ （カリホルニア州ロムポック
、ジョーンズ−マンスピル）２４Ｍを加えた。この懸濁
物を３０分攪拌し、実験室バキュームで濾過した。フィ
ルターケーキを２００−の水で洗い、約５分吸引して過
剰の湿分を除いた。
レプトマイセス穐の細胞のない（セルフリー）抽出物の
５ｔバツチをｐＨ７，２に調節した。この攪拌した抽出
物にＭａｑｕａｔＭＣ１４１２−５１（ｎ−アルキルジ
メチルベンジルアンモニウムクロライド、イリノイ州シ
カゴ、メーンンケミカルカンパニー）１０ｆと）（ｙｆ
ｌｏ ５ｕｐｅｒｃｅｌ （カリホルニア州ロムポック
、ジョーンズ−マンスピル）２４Ｍを加えた。この懸濁
物を３０分攪拌し、実験室バキュームで濾過した。フィ
ルターケーキを２００−の水で洗い、約５分吸引して過
剰の湿分を除いた。
フィルターケーキ？１．４６ｆを混合しその１０．Ｏｆ
を種々の濃度の塩溶液（ｉ ｓ ｏｖ）に懸濁した。２
０分攪拌後、各懸濁部を濾過した。Ｐ液の可溶性インメ
ラーゼ活性を分析した。
を種々の濃度の塩溶液（ｉ ｓ ｏｖ）に懸濁した。２
０分攪拌後、各懸濁部を濾過した。Ｐ液の可溶性インメ
ラーゼ活性を分析した。
結果は次のとおシである。
ＮａＣ１濃ｉ 可溶性インメラーゼ活性０
１．６ ２４０ ａｂ
ｏｕｔｌＯ，０５１，３１９５ａｂｏｕｔ １ ０．１０ １．６ ２４０
ａｂｏｕｔ １０．２０ ２．７
４０５ １．４０．５０ １１８．
３ １７，７４５ ６０．１１．００
１５６．２ ２３，４３０ ７９．４
０、５ Ｍ以下の塩濃度においてはごくわずかの活性分
が可溶化しただけである。
１．６ ２４０ ａｂ
ｏｕｔｌＯ，０５１，３１９５ａｂｏｕｔ １ ０．１０ １．６ ２４０
ａｂｏｕｔ １０．２０ ２．７
４０５ １．４０．５０ １１８．
３ １７，７４５ ６０．１１．００
１５６．２ ２３，４３０ ７９．４
０、５ Ｍ以下の塩濃度においてはごくわずかの活性分
が可溶化しただけである。
酵素可溶化に対するカチオン交換樹脂の効果をしらべる
ために、ＡＧ５０−Ｗ−Ｘ４樹脂【カリポルニア州、リ
ッテモンド、バイオ−ラッドラボラトリーズ）のｉ、
ｓ ｔ （ｃｔ ｂ、）部分を最初の懸濁物のそれぞれ
に加え、６０分攪拌した。
ために、ＡＧ５０−Ｗ−Ｘ４樹脂【カリポルニア州、リ
ッテモンド、バイオ−ラッドラボラトリーズ）のｉ、
ｓ ｔ （ｃｔ ｂ、）部分を最初の懸濁物のそれぞれ
に加え、６０分攪拌した。
次に各懸濁物試料を遠心分離し上澄液の可溶性インメラ
ーゼ活性を分析した。
ーゼ活性を分析した。
結果は次のとおシである。
０ １．５ ５５．５ ８．２９
５ ２＆１０．０５ １．５ １５７．
４ ２３，６１０ ８０．００．１０ １．
５ １４６．５ ２１，９７３ ７４．４
０．２０ １．５ １６８．２ ２５，２
３０ ８５．４０．５０ １．５ １７
５．６ ２６，３４０ ８９．２１．００
１．５ １Ｅ１２ ２７，３３０ ９２．６
塩が存在しない場合には、出発活性の２８．１ ％が可
溶化した。最低塩濃度、０．０５Ｍ、において、８０チ
の活性が、１５７．４ ＩＧＩＵ／−の力価即ち出発酵
素抽出物のほぼ４倍の力価をもつ可溶性酵素として回収
された。従って、カチオン交換樹脂はインメラーゼの可
溶化を大幅に促進することが判る。これは多分、アミン
ーインメラーゼ錯体から４級アミンを優先的に吸着する
ことによるものと思われる。
５ ２＆１０．０５ １．５ １５７．
４ ２３，６１０ ８０．００．１０ １．
５ １４６．５ ２１，９７３ ７４．４
０．２０ １．５ １６８．２ ２５，２
３０ ８５．４０．５０ １．５ １７
５．６ ２６，３４０ ８９．２１．００
１．５ １Ｅ１２ ２７，３３０ ９２．６
塩が存在しない場合には、出発活性の２８．１ ％が可
溶化した。最低塩濃度、０．０５Ｍ、において、８０チ
の活性が、１５７．４ ＩＧＩＵ／−の力価即ち出発酵
素抽出物のほぼ４倍の力価をもつ可溶性酵素として回収
された。従って、カチオン交換樹脂はインメラーゼの可
溶化を大幅に促進することが判る。これは多分、アミン
ーインメラーゼ錯体から４級アミンを優先的に吸着する
ことによるものと思われる。
この場合、錯体を解離させるための高塩濃度の心機を最
小限化できる。
小限化できる。
例■
この例は４級アミンの優先的吸着のためにカチオン交換
樹脂を用い且つ濾過とアミンインメラーゼ沈澱の洗浄が
不必要な例を示す。
樹脂を用い且つ濾過とアミンインメラーゼ沈澱の洗浄が
不必要な例を示す。
例Ｉに示したインメラーゼ抽出物の５００一部をＭａｑ
ｕａｔＭＣ１４１２−５０％の１．０２と混合した。こ
のスラリーを１分攪拌して重力で沈降させた。沈降６０
分後に、透明な上澄液４００ｒｎｔをサイホンを用いて
慎重に除き、可溶性インメラーゼ活性を分析した。この
フラクションは全体で４６０ ＩＧＩＵで、わずか１．
１５ ＩＧＩＵ／−を含んでいるだけつまり出発活性の
約２チだった。
ｕａｔＭＣ１４１２−５０％の１．０２と混合した。こ
のスラリーを１分攪拌して重力で沈降させた。沈降６０
分後に、透明な上澄液４００ｒｎｔをサイホンを用いて
慎重に除き、可溶性インメラーゼ活性を分析した。この
フラクションは全体で４６０ ＩＧＩＵで、わずか１．
１５ ＩＧＩＵ／−を含んでいるだけつまり出発活性の
約２チだった。
沈澱を含む残りのスラリー（約１００ｍ）を水２５０ｍ
ｊｌで稀釈し、約１分攪拌して沈降させた。沈降用に放
置６０分後、透明上澄液２６０ｒｎｔ全量をサイホンで
除いた。このフラクションは１００ＩＧＩＵよシ低いイ
ンメラーゼ活性を含んでいた。
ｊｌで稀釈し、約１分攪拌して沈降させた。沈降用に放
置６０分後、透明上澄液２６０ｒｎｔ全量をサイホンで
除いた。このフラクションは１００ＩＧＩＵよシ低いイ
ンメラーゼ活性を含んでいた。
沈澱を含むスラリー（約９０−）に、水９０−１０．５
ＭＮａＣ１２０ｄ（０，０５ＭＮａＣ１をつくるため）
及びＡＧ５０−Ｗ−Ｘ４樹脂１．４ｆｄ、ｂ、を加えた
。得られたスラリーを等分割して１又は２時間のいづれ
かの時間攪拌した。
ＭＮａＣ１２０ｄ（０，０５ＭＮａＣ１をつくるため）
及びＡＧ５０−Ｗ−Ｘ４樹脂１．４ｆｄ、ｂ、を加えた
。得られたスラリーを等分割して１又は２時間のいづれ
かの時間攪拌した。
次にこれらスラリーを沢過し、ｒ液の可溶性インメラー
ゼ活性を分析した。１時間及び２時間Ｐ液の活性の全回
収は２０．３７０ ＩＧＩＵ又は出発活性の９６．５チ
、平均力価７７．２ＩＧＩＵ／ｍだった。１時間と２時
間の可溶化処理間には大きな差はなかった。
ゼ活性を分析した。１時間及び２時間Ｐ液の活性の全回
収は２０．３７０ ＩＧＩＵ又は出発活性の９６．５チ
、平均力価７７．２ＩＧＩＵ／ｍだった。１時間と２時
間の可溶化処理間には大きな差はなかった。
可溶化した酵素はＤＥＡＥ−セルロースに１９７０ Ｉ
ＧＩＵ／ｌのレベルで吸着した。出発抽出物では９７０
ＩＧＩＵ／ｆのレベルである。
ＧＩＵ／ｌのレベルで吸着した。出発抽出物では９７０
ＩＧＩＵ／ｆのレベルである。
例■
この例は再溶解用のアミンーインメラーゼ沈澱を集める
ために遠心分離を用い最小容量で濃縮化した酵素抽出物
をつくる例を示す。
ために遠心分離を用い最小容量で濃縮化した酵素抽出物
をつくる例を示す。
酵素抽出物の１０００ｄ部を、前記２例に示すように、
Ｍａｑｕａｔで処理した。沈澱を２時間放置して透明な
上澄液８００−を傾斜によって除いた。スラリーの残り
２０〇−を２５０−の遠心分離容器に移し、ＧＳＡ回転
機を具備する５ｏｒｖａｌ ＲＣ−２Ｂ遠心分離機を
用いて８０００ｒｐｍで簡潔に遠心処理した。上澄液を
傾斜し粂てた。沈澱、７．６６ ｆ ｆ、ｂ、、を０．
０５ＭＮａＣ１８０−に再懸濁し、ＡＧ５０樹脂２−Ｏ
ｆを加えた。懸濁液を１時間攪拌し、濾過した。を液は
４３６ ＩＧＩＵ／ｒｄの力価において全体で３７．９
３０ ＩＧＩＵの活性を含んでいた。それ故、回収率は
出発活性（サンプリングロス修正済）の９２．４％であ
シ、最初の抽出物に比し酵素濃度は１０倍以上増加した
。可溶化した酵素はまたＤＥＡＥ−セルロースに２０７
０ ＩＧＩＵ／２のレベルで吸着できた。出発抽出物で
は９７１ ＩＧＩＵ／２のレベルだった。
Ｍａｑｕａｔで処理した。沈澱を２時間放置して透明な
上澄液８００−を傾斜によって除いた。スラリーの残り
２０〇−を２５０−の遠心分離容器に移し、ＧＳＡ回転
機を具備する５ｏｒｖａｌ ＲＣ−２Ｂ遠心分離機を
用いて８０００ｒｐｍで簡潔に遠心処理した。上澄液を
傾斜し粂てた。沈澱、７．６６ ｆ ｆ、ｂ、、を０．
０５ＭＮａＣ１８０−に再懸濁し、ＡＧ５０樹脂２−Ｏ
ｆを加えた。懸濁液を１時間攪拌し、濾過した。を液は
４３６ ＩＧＩＵ／ｒｄの力価において全体で３７．９
３０ ＩＧＩＵの活性を含んでいた。それ故、回収率は
出発活性（サンプリングロス修正済）の９２．４％であ
シ、最初の抽出物に比し酵素濃度は１０倍以上増加した
。可溶化した酵素はまたＤＥＡＥ−セルロースに２０７
０ ＩＧＩＵ／２のレベルで吸着できた。出発抽出物で
は９７１ ＩＧＩＵ／２のレベルだった。
例■
この例は４級アミンーインメラーゼ錯体の再溶解に対す
る異なるカチオン交換樹脂の効果を示すものである。
る異なるカチオン交換樹脂の効果を示すものである。
ストレプトマイセスのセルフリー抽出物（インメラーゼ
活性３５．７ ＩＧＩＵ／ｍ）の４分割した各１０００
一部のｐＨを７．２に調節した。各部にＭａｑｕａｔ
ＭＣ１４１２−５０チの２２を加え、生成スラリーを室
温で２０分攪拌した。
活性３５．７ ＩＧＩＵ／ｍ）の４分割した各１０００
一部のｐＨを７．２に調節した。各部にＭａｑｕａｔ
ＭＣ１４１２−５０チの２２を加え、生成スラリーを室
温で２０分攪拌した。
沈澱を２時間放置して重力沈降させ各透明上澄液８０〇
−を傾斜した。上澄液は０．２ＩＧＩＵ／−以下を含ん
でおりこれははとんどのインメラーゼが４級アミンによ
って沈澱したことを示している。
−を傾斜した。上澄液は０．２ＩＧＩＵ／−以下を含ん
でおりこれははとんどのインメラーゼが４級アミンによ
って沈澱したことを示している。
各スラリーの残シ２００７！を例■と同様に遠心処理し
た。
た。
上澄液を傾斜し除去した。各沈澱を０．０５ＭＮａＣ１
１２０−に再懸濁し、種々の樹脂２．、ＯＰｄ、ｂ、を
加えた。生成懸濁物を２時間攪拌し、濾過した。各フィ
ルターケーキを更なる０、 ０５ Ｍ Ｎａ Ｃ１で洗
い、洗液とＰ液と合せそれぞれの全容量が２００−にな
るようにし、それぞれの試料をインメラーゼ分析と蛋白
測定用に取った。
１２０−に再懸濁し、種々の樹脂２．、ＯＰｄ、ｂ、を
加えた。生成懸濁物を２時間攪拌し、濾過した。各フィ
ルターケーキを更なる０、 ０５ Ｍ Ｎａ Ｃ１で洗
い、洗液とＰ液と合せそれぞれの全容量が２００−にな
るようにし、それぞれの試料をインメラーゼ分析と蛋白
測定用に取った。
結果を次表に示す。
比較 なし ０．７３ １４６ ４．７
０．４１１ ＡＧ−５０１５５３１，０００１２
，８５８５，８３］）ｕｏｌｉｔｅ Ｃ−３、フェノ
ール性微孔性強酸性カチオン交換樹脂（ナトリウム形）
、及び３ｅｐｈａｄｅｘ ５Ｐ−Ｃ−２５，９テキスト
ランのスルホエチル誘導体（ファルマシアファインケミ
カルス社）は共に４級アミンーインメラーゼ錯体の可溶
化にＡＧ−５０樹脂と同様有効であった。
０．４１１ ＡＧ−５０１５５３１，０００１２
，８５８５，８３］）ｕｏｌｉｔｅ Ｃ−３、フェノ
ール性微孔性強酸性カチオン交換樹脂（ナトリウム形）
、及び３ｅｐｈａｄｅｘ ５Ｐ−Ｃ−２５，９テキスト
ランのスルホエチル誘導体（ファルマシアファインケミ
カルス社）は共に４級アミンーインメラーゼ錯体の可溶
化にＡＧ−５０樹脂と同様有効であった。
特許出願人 ナビスコ ブランズ
インコーホレーテッド
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、不溶性グルコースイソメラーゼ−アミン錯体をカチ
オン交換樹脂を含む水性媒体中で反応させることを特徴
とする不溶性グルコースイソメラーゼ−アミン錯体から
グルコースイソメラーゼを可溶化させる方法。 ２、該樹脂がポリスチレンスルホン酸樹脂、フェノール
性スルホン酸樹脂又はデキストランスルホン酸樹脂であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該アミンが式 ▲数式、化学式、表等があります▼、又は▲数式、化学
式、表等があります▼ ここでＲ＿１は少なくとも６個の炭素原子を持つヒドロ
カルビル基であり； Ｒ＿２は約８〜約２０個の炭素原子を持つヒドロカルビ
ル基であり； Ｒ＿３は低級アルキルであり； Ｒ＿４はＨ又は低級アルキルであり； Ｘはアニオンである、 で示される化合物である特許請求の範囲第１項又は第２
項記載の方法。 ４、アミンがｎ−アルキルジメチルベンジルアンモニウ
ムクロライドである特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、水性媒体がイオン性塩を含有する特許請求の範囲第
１項〜第４項のいづれか記載の方法。 ６、イオン性塩がＮａＣｌ、Ｎａ＿２ＳＯ＿４、ＫＣｌ
、Ｋ＿２ＳＯ＿４、ＫＮＯ＿３、ＮａＮＯ＿３、ＮＨ＿
４Ｃｌ、（ＮＨ＿４）＿２ＳＯ＿４、マグネシウム塩、
マンガン塩、コバルト塩、酢酸塩、クエン酸塩、マレイ
ン、塩又はピリジニウムクロライドである特許請求の範
囲第５項記載の方法。 ７、塩がＮａＣｌである特許請求の範囲第６項記載の方
法。 ８、不溶性酵素−アミン錯体を可溶化させる方法におい
て、該錯体をカチオン交換樹脂及びイオン性塩を含有す
る水性媒体中で反応させることを特徴とする改良された
可溶化方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/736,921 US4663288A (en) | 1985-05-22 | 1985-05-22 | Process for purification of enzymes |
| US736921 | 1985-05-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH0783713B2 JPH0783713B2 (ja) | 1995-09-13 |
Family
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| JP (1) | JPH0783713B2 (ja) |
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-
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- 1986-05-22 EP EP86106935A patent/EP0202678B1/en not_active Expired - Lifetime
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