JPS625129B2

JPS625129B2 -

Info

Publication number: JPS625129B2
Application number: JP53020403A
Authority: JP
Inventors: Ikuo Suzuki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-02-25
Filing date: 1978-02-25
Publication date: 1987-02-03
Also published as: JPS54113414A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアロエより分離できる新規物質アロク
チンＢに関する。本発明者は、アロエより次の物理化学特性を有
するアロクチンＢを分離し、この新規物質がレク
チン活性を有する試薬としてあるいは癌等の医薬
としての使用が期待できることを見出し、本発明
を完成するに至つた。 (1) 分子量：2.4×10⁴ (2) 構造：糖分量が50％以上（重量）であるグリ
コプロテイン (3) ソデイウムドデシルサルフエート−ポリ
アクリルアミド・ゲル電気泳動で単一バンドを
与え、これを２−メルカプトエタノールにより
Ｓ−Ｓ結合を切断した場合においても分子量は
低下するが単一バンドを与える。 (4) 赤血球凝集活性を有する。古くからアロエは、薬用植物として知られてお
り、日本薬局方にもアロエ末、アロエエキスが集
録されている。これらの主成分は低分子物質であ
り、本発明のアロクチンＢはこれら公知の低分子
物質とは異なる高分子物質、グリコプロテインで
ある。一方、植物成分コンカナバリンＡ
（Concan−avalin Ａ）等公知のレクチン
（Lectin）のいずれとも、本発明のアロクチンＢ
は、分子量、ソデイウムドデシルサルフエー
ト（以下、SDSという）−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動上の特性及び前記本発明のアロクチン
Ｂの有する生理活性の点で異なる。さらに、アロ
エの中に制癌活性を有する成分があることは知ら
れているが、純粋な形で分離された例はなく、グ
リコプロテインが分離されたこともない。本発明のアロクチンＢはユリ科のアロエ
（Aloe）属植物例えばキダチアロエ（Aloe
arborescens MILL）、ソコトラアロエ（Aloe
perryi BAKER）、キユラソウアロエ（Aloe
barbadensis MILLER）、ケープアロエ（Aloe
ferox MILLER）等（本明細書中でアロエとい
う）より分離でき、またその葉、幹、根等地上
部、地下部いずれからも分離できる。その分離方
法の一実施例を次に述べる。キダチアロエ（Aloe arborescens Mill）の葉
１Kgをよく破砕後ガーゼを用いてジユースを分離
した。10000回転30分間の遠心分離操作で夾雑、
粗大物質を沈殿除去し上清を分離した。０−40％
硫安分画に付し、沈殿物を分取し、0.05M炭酸−
重炭酸緩衝液（PH9.5）を加え、透析、脱塩し、
ついで凍結乾燥法により濃縮した。なお、このようにして得られた透析処理物（以
下AS−40という）は赤血球凝集活性を有してい
た。AS−40を炭酸−重炭酸緩衝液に溶解（PH
9.5）し、ついで内1M酢酸を加えることによりPH
を4.4に調整した。遠心分離（10000回転、20分）
操作で上清液（酸性Supという）と沈殿物（酸性
Pptという）を分離した。酸性Pptよりも酸性Sup
中により高い赤血球凝集活性が見出された。酸性Supは凍結乾燥後、0.05M燐酸緩衝液（PH
8.0）４mlに溶解し、あらかじめ、0.05M燐酸緩
衝液（PH8.0）で平衡化したセフアデツクスＧ−
100（フアルマシア社製架橋デキストランゲ
ル）を2.0×30cmカラムに詰め、その上に上記溶
液をのせ、0.05M燐酸緩衝液で溶出した。溶出は同一緩衝液を用い４℃流速５ml／ｈの条
件下に行い、2.5mlづつ分取した。結果を図１に
示した。赤血球凝集活性を斜線で表示した。この
凝集活性はＳ−１画分の方にのみ見出され、Ｓ−
２にはこの生理活性は見出されなかつた。Ｓ−１
画分は再び同様にゲルクロマトグラフイーに付し
精製し活性物質Ｓ−１すなわち本発明のアロクチ
ンＢを得た。上記の実験より、本発明のアロクチンＢはセフ
アデツクスＧ−100によるゲルクロマトグラフイ
ーを、必要により前記生理活性をチエツクして、
繰返すことにより単離することができる。以上の実験結果を表１に整理して示した。

【表】ず
AS〓40 320.0 250 4 100

【表】＊：人の赤血球に対する最少凝集量
本発明のアロクチンＢはSDS−ポリアクリルア
ミド・ゲル電気泳動上特異性を示すことは次の実
験から理解できる。なお、SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動分析は10％ゲルによるソデイウムドデシル
サルフエートを用いてウエバーとオスボーン法
（Weber、K.、and Osborn、M.（1969）J.Biol.
Chem.244、4406−4412）に従つて行つた。ゲル
はクマジ−ブリリアントブルー（Coomassie
brilliant blue）で蛋白染色し、10％酢酸と10％
イソプロパノールの混合物で脱色した。 SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動分析実
験：Ｓ−１についてSDS−ポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動分析を行つた。0.1％SDSを含む0.1M
燐酸緩衝液（PH＝7.2）中10％ゲルを用いた。試
料は、還元剤２−メルカプトエタノール処理した
ものと、処理しないものを用い、１％SDS、10％
グリセロール及び0.001％ブロムフエノールを含
む0.01M燐酸緩衝液（PH＝7.2）中で５分間100℃
に加熱した。得られたパターンを図２に示した。ａはＳ−１をメルカプトエタノール処理しない
もの、ｂはＳ−１を２−メルカプトエタノール処
理したものを示す。図２より明白な如く、２−メルカプトエタノー
ル処理しないとＳ−１は単一バンドを与えた。Ｓ−１の２−メルカプトエタノール処理物は、
処理しない物と同様単一バンドを与えるが、処理
しないものに比べ分子量の小さい位置にバンド
（γ）を与えた。本発明のアロクチンＢを特定する手段の一つと
しては本発明のアロクチンＢの有する他の特性を
有するものについてSDS−ポリアクリルアミド・
ゲル分析を行い、単一バンドを与え、２−メルカ
プトエタノール処理物について分子量の小さい位
置に単一バンドを与えるかどうかチエツクする。
前記同様のSDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気
泳動分析実験をある物質について行い、得られた
結果と、この実験と同条件下でのアロクチンＢの
SDS−電気泳動分析実験結果と比較し、同一かど
うかをチエツクし、全く同一であればその物質は
アロクチンＢと決めることができる。もちろん、
ある物質について前記SDS−ポリアクリルアミ
ド・ゲル電気泳動分析実験と全く同一条件で実験
を行い、図２におけるＳ−１の結果と比べ同一で
あればその物質がアロクチンＢであると決めるこ
とができる。本発明のアロクチンＢの分子量をSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動分析法による分子量測
定実験結果から求めた。分子量測定実験：２−メルカプトエタノール処理しない試料の
SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動分析か
ら図３に示す如く分子量既知の標準蛋白について
その分子量の対数値と移動度の関係をプロツトし
標準曲線を求め決める。なお、SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動分析実験は前記図２において記載の方法と同様
に行つた。下記標準蛋白標品（括弧内に分子量を
示す）を用い移動度と分子量の対数値の関係をプ
ロツトし図３に示した。チトクロムＣ（12500）、キモトリプシノーゲン
Ａ（25000）、オブアルブミン（45000）、ボバイン
シーラムアルブミン（67000）次に、Segrestらの方法（Jere P.Segrest and
Richard L.Jackson、Methods in Enzymology
28、54−63、1972）に従い各種濃度を有するゲ
ルによるSDSを用いたポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動分析での分子量測定実験を行つた。結果を図４に示した。図４においては次の如く
である。〓〓〓：Ｓ−１、２−メルカプトエタノール無処
理（γ_２）〓〓〓：Ｓ−１、２−メルカプトエタノール処理
（γ）この結果から、Ｓ−１（アロクチンＢ）の分子
量は2.4×10⁴であることがわかる。サブユニツトの構造：表２に示すようにＳ−１（γ_２）は１分子内に
２個即ちγ分子１個内に１個の半シスチン残基を
有する。すなわち、γ_２分子は１個のＳ−Ｓ結合
によつて結合するものと理解される。２−メルカプトエタノール処理しないSDS−ポ
リアクリルアミド・ゲル電気泳動分析で、Ｓ−１
はほぼ2.4×10⁴の分子量の単一バンドを示すのに
対し、２−メルカプトエタノール処理したＳ−１
についての電気泳動分析でほぼ1.2×10⁴の分子量
に対応する位置に単一バンドを与えた（γ）。こ
のことからほぼ2.4×10⁴の分子量を有する本発明
のアロクチンＢであるＳ−１分子は二個のγ−サ
ブユニツトからＳ−Ｓ結合で構成され、その各々
はほぼ1.2×10⁴の分子量のものであることがわか
る。アロクチンＢがグリコプロテインであることは
ニンヒドリン反応が陽性であり、中性糖の呈色反
応例えば、モリツシユ・ピアール反応が陽性であ
ることから確認され、またアミノ酸分析において
アロクチンＢはＮ−アセチルグルコサミンが証明
された。定量分析結果からＳ−１の糖含量は50％以上
（重量）であることが確かめられた。次に示すアミノ酸分析実験結果より、アロクチ
ンＢは構成アミノ酸としてアスパラギン酸、グル
タミン酸等酸性アミノ酸を多量に含有しているこ
とがわかる。アミノ酸分析：Ｓ−１（γ_２）のアミノ酸組成を表２に示し
た。トリプトフアンは定量しなかつた。 γ−サブユニツトに最少割合で存在するリジ
ン、フエニルアラニン、ヒスチジン、アルギニン
に対して整数値１が与えられると他のアミノ酸に
ついては表２に示したような値が得られこれがγ
分子を構成する各アミノ酸分子の比を示す。

【表】

【表】なお、上記分析実験において、試料は真空密封
の管内で蒸留HClを用い110℃、20時間加水分解
した。加水分解物のアミノ酸含量はスパツクマン
等の方法（Spackman、D.H.、Stein、W.H.、
and moore、S.（1958）Anal.Chem.30、1190−
1206）で日立アミノサンアナライザー（KLA−
3B）で分析し計算した。システインとシスチン
はリユー等の方法（Liu、T.Y.、and lnglis A.S.
、“Methods in Enzymology”ed、by Hirs、C.
H.W.、and Timasheff、S.N.、Acad.Press、
New York、New York、55、1972年）によるＳ
−スルホシステインとして分析した。中性糖の総量はオルシノール−硫酸法
（Winzler、R.J.、“Method of Biochemical
Analysis”ed.by Glick、D.、Interscience、
New York、New York、Vol.、P.279、1956
年）により求めた。以上の実験はすべてのアミノ酸について分析し
たものでないので正確ではないが、他の結果と矛
盾なく説明できる。本発明のアロクチンＢが赤血球凝集活性を有し
ていることは次の試験により確かめた。赤血球凝集活性試験：人、羊、ウサギ等の赤血球標品をＳ−１は凝集
せしめ、人のシステムにおける赤血球凝集活性テ
ストでＡ−Ｂ−Ｏ血液型特異性を示さなかつた。
主な実験は人赤血球を用いて行われた。この結果
Ｓ−１は表１に示した如く強い赤血球凝集活性を
示した。赤血球凝集タイトレーシヨンはマイクロタイタ
ーイクイプメント（Cooke Lab.Prod.、
Virginia、米国）で生理食塩水の２％赤血球サス
ペンジヨンを用いて実施された。0.14M NaClを
含む0.01M燐酸緩衝液に溶かした試料（1.0mg／
ml）を段階的に倍数稀釈した。60分のインキユベ
ーシヨン後、凝集の有無は肉眼で見てわかる。稀
釈倍数からタイター価をタイター／mg蛋白として
測定した。本発明のアロクチンＢが制癌活性を有している
ことは次の実験により確かめた。次のような組織培養株（総て癌細胞）細胞を
夫々固有の培養液中（５ml）で１×10⁶個の細胞
密度で培養し、この中に５μｇのアロクチンＢを
添加すると約24時間から48時間以内に総ての癌細
胞は死滅する。 Molt 4B ヒト急性リンパ性白血病細胞 P3HR−１バーキツトリンパ腫細胞 HeLa ヒト子宮癌由来の細胞 HNG−100 ハムスター肺由来の細胞を化学発癌
剤でトランスホームした細胞上記実験結果から、特にアロクチンＢの制癌活
性は癌細胞に対して直接細胞毒効果であることが
理解される。

【図面の簡単な説明】

図１はアロクチンＢの分離方法の一実施例にお
けるゲルクロマトグラフイー溶出パターン図であ
り、図２はアロクチンＢに関するSDS−ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動パターン図であり、図
３および図４はアロクチンＢに関する分子量測定
結果を示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】１次の物理化学特性を有し、アロエより分離で
きるアロクチンＢ。 (1) 分子量：2.4×10⁴ (2) 構造：糖分量が50％以上（重量）であるグリ
コプロテイン (3) ソデイウムドデシルサルフエート−ポリ
アクリルアミド・ゲル電気泳動で単一バンドを
与え、これを２−メルカプトエタノールにより
Ｓ−Ｓ結合を切断した場合においても分子量は
低下するが単一バンドを与える。 (4) 赤血球凝集活性を有する。