JPS6251110B2

JPS6251110B2 -

Info

Publication number: JPS6251110B2
Application number: JP59115162A
Authority: JP
Inventors: Osamu Suzuki; Toshihiro Yokochi
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1984-06-05
Filing date: 1984-06-05
Publication date: 1987-10-28
Also published as: JPS60259192A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はモルテイエレラ属に属するイサベリ
ナ、ビナセア、ナナ、ラマニアナ、ラマニアナ・
アングリスポラの菌株を炭水化物を炭素源とする
培地に培養し脂質含量の高い菌体を培地中に増殖
するのに際して培地に酢酸あるいは酢酸塩を加え
ることにより、菌体の増殖量及び菌体中の脂質含
量の大幅な増加を図り、その菌体より脂質〔中性
脂質（油脂など）、極性脂質（リン脂質、糖脂質
など）〕を採取する生産性の高い脂質の生産方法
に関するものである。本発明者らは既にモルテイエレラ属に属するイ
サベリナ、ビナセア、ナナ、ラマニアナ・アング
リスポラの糸状菌菌株が高濃度に炭水化物を炭素
源とする培地に培養することにより脂質含量の高
い菌体が培地中に高密度の製造されること並びに
その菌体より脂質を採取することによる生産性高
く脂質が製造されることを見出した。また、同じ
くモルテイエレラ属に属する同種の糸状菌菌株が
高濃度の炭水化物を炭素源とした培地において培
養された場合、γ−リノレン酸含有脂質の高含量
菌体が高密度に生産され、培養菌体よりγ−リノ
レン酸含有脂質あるいはγ−リノレン酸が生産性
高く製造されることを見出した。以上の発明はそれぞれ動、植物に代わる微生物
（糸状菌）による脂質（油脂など）の生産に関す
るものあり、後者の場合特につきみ草
（Oenotbera biennie L.）の種子から採取されて
いるγ−リノレン酸あるいはその含有脂質の製造
方法に代るものである。本発明者らは更にモルテイエレラ属に属するイ
サベリナ、ビナセア、ナナ、ラマニアナ、ラマニ
アナ・アングリスポラの糸状菌菌株を炭水化物を
炭素源とする培地に培養して得られた菌体から脂
質を採取する脂質の製造に際して、培地に添加物
あるいは補助炭素源として酢酸あるいは酢酸塩を
加えることにより、同じ培養条件下で加えない場
合よりも乾燥菌体中に占める脂質の含量が10〜
300％増加し、しかも菌体増殖量の増加が同時に
認められるため、脂質の生産性が著しく高くなる
ことを見出した。また、生成脂質の脂肪酸組成の
分析を行つた結果、酢酸あるいは酢酸塩を添加し
た系では、γ−リノレン酸を含めた全不飽和脂肪
酸の脂肪酸中に占める含量が３〜18％増加するこ
とを見出し、本発明は完成するに至つた。すなわ
ち、本発明はモルテイエレラ属に属するイサベリ
ナ、ビナセア、ナナ、ラマニアナ、ラマニアナ・
アングリスポラの菌株を炭水化物を炭素源とする
培地に培養し、脂質含量の高い菌体を培地中に増
殖するに際して、培地に酢酸あるいは酢酸塩を加
えることにより、菌体の増殖量及び菌体中の脂質
含量の大幅な増加を図り、その菌体より脂質〔中
性脂質（油脂など）極性脂質（リン脂質、糖脂質
など）〕を採取する生産性の高い脂質の生産方法
である。本発明で用いる使用菌はモルテイエレラ
（Mortierella）属のイサベリナ（isabellina）
〔IFO7824、7884、7873、8183、8309〕ビナセア
（Vinacea）〔IFO6738〕、ナナ（nana）
〔IFO8794〕、ラマニアナ（ramaniana）
〔IFO8287〕、ラマニアナ・アングリスポラ
（ramaniana var.anglispora）〔IFO8187〕の各種
菌株である。なお、上記した菌はいずれも財団法
人発酵研究所に保存され、IFOカタログ（菌株自
録）に記載されている糸状菌である。上記の糸状菌を培養する培地の炭素源である炭
水化物としては、たとえばグルコース、フラクト
ース、サツカロース、精密、デン粉、木材糖化液
などが用いられる。炭水化物は培地１中に20〜
400ｇ用いられるのが好ましい。また窒素源とし
ては、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなど
の様な無機窒素源、または尿素、ペプトン、酵母
エキス、コーン・スチーブ・リカーなど有機窒素
源が用いられる。無機塩としては、例えば
KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaCl、FeSO₄・7H₂O、
MgSO₄・7H₂O、ZnSO₄・7H₂Oなどが用いられ
る。その他必要に応じて微量要素、その他の栄養
源を添加する。上記糸状菌の培養は通常液体培地で、振とう培
養、通気撹拌培養などにより行われる。培地のPH
は3.0〜6.0が良く、通常２日〜10日間位培養が行
われる。更に、培養の初期すなわち初期培地に、
また通気撹拌培養の場合では前培養培地に、ある
いは培養の中間段階で酢酸あるいは酢酸塩（ナト
リウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩）を
炭素源濃度など培養条件に応じて0.1〜20ｇ／
培地の割合で加えることにより菌体の培養が行わ
れる。かくして、培養物中にγ−リノレン酸など
不飽和脂肪酸含量が高い脂質の高含量菌体が生産
性高く生産されるので、培養物より菌体を分離
し、脂質が糸状菌菌体中に含まれるので、この菌
体よりγ−リノレン酸など不飽和脂肪酸含量の高
い脂質を採取するのが好適である。培養物より菌
体の分離に当つては菌体があまりのびず極めて小
単位（１〜10細胞）で培養されており、従つて、
例えば遠心脱水器などにより極めて容易に分離さ
れ、乾燥度の高い菌体（含水率約60％）になる利
点を有することが明らかになつた。γ−リノレン
酸など不飽和脂肪酸含量の高い脂質の採取は常法
によつて溶媒抽出などにより行われる。かくして、本発明によればγ−リノレン酸など
の不飽和脂肪酸含量が高い脂質を生産性高く製造
することができ、本発明はγ−リノレン酸含有脂
質の製造法あるいは脂質の改質方法として優れた
ものである。本発明は、特に現在植物種子から採
取されているγ−リノレン酸含有脂質の生産方法
としてすぐれたものである。なお、γ−リノレン酸〔18：３（６、９、
12）〕はリノール酸と共に哺乳動物では体内で合
成することのできない、食飼として要求される脂
肪酸（必須脂肪酸）である。これはγ−リノレン
酸が体内でビスホモ−γ−リノレン酸となり、さ
らにはアラキドン酸となる前駆体であること、ビ
スホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸はそれぞ
れプロスタグランジン、E₁、Ｆ₁〓及びE₂、Ｆ₂〓
となり生体中で極めて重要な生理的な役割をはた
しているからである。従つて、γ−リノレン酸含
有脂質は医薬品などとして利用できるものである
ことは明らかである。次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに
より制限を受けるものではない。実施例１グルコース30ｇ、KH₂PO₄2ｇ、MgSO₄・
7H₂O0.3ｇ、NaCl0.1ｇ、FeSO₄・7H₂O10mg、
CaCl₂・2H₂O10mg、CuSO₄・5H₂O0.2mg、
ZnSO₄・7H₂O1.0mg、MnCl₂・4H₂O1.0mg、
Thiamine−HCl2mg、Ｄ−Biotin0.02mgと窒素源
として（NH₄）₂SO₄3ｇ、〔Ｃ／Ｎ比（グルコース
Ｋの炭素原子重量／窒素源中の窒素原子重量）は
22.2〕を脱イオン水1000mlに混合し、PHを4.6に
調整した合成培地を基準として酢酸あるいは酢酸
塩（ナトリウム塩、カリウム塩）を所定量加えて
培地を作成した。この合成培地400mlを１の三
角フラスコに入れ、それぞれ菌株を接種、培養温
度30℃で７日間150rpmで振とう培養を行つた。
培養後、ロ過法あるいは遠心分離法で菌体を集め
た。その一部を含水率の定量の為、精秤し、恒温
槽中120℃で一昼液乾燥し、含水率を求め、残り
の菌体について脂質の抽出を行つた。菌体からの
脂質の抽出は、残りの湿菌体にクロロホルム−メ
タノール（２：1v／ｖ）混液を加え、ガラスビ
ーズ存在下にホモジナイズすることにより菌体の
破砕と脂質の抽出を同時に行つた。なお、抽出を
完全に行うため、これを５回繰返し全抽出液を集
めた。上記抽出液をFolchの分配洗浄法により精
製した後、溶媒を減圧留去し重量法で全脂質を測
定した。得られた脂質について常法によりメチル
エステル化した後、ガスクロマトグラフイーを行
い脂肪酸組成を求めた。このような方法で各種モ
ルテイエレラ属糸状菌について酢酸あるいは酢酸
塩（ナトリウム塩、カリウム塩）を添加した場合
のしない場合との菌体増殖量及び脂肪酸塩組成の
変化について求めた結果を表−１に示した。表−１の結果から、同じ菌株について、酢酸あ
るいは酢酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩）を添
加した場合に添加しない場合よりも常に菌体増殖
量が高く、多くの場合２倍以上の値が得られてい
ることが分る。そのことは脂質生成量に関して、
更に顕著に表れており、1.5〜６倍に増加してい
た。脂質含量においては、あまり変化が認められ
ない場合もあるが、多くの場合10〜20％含量が大
きくなつていることが認められた。これらの事実
はグルコース100ｇの消費に対して出来る菌体量
（ｇ）及び脂質量（ｇ）で表わした菌体係数及び
脂質係数がそれぞれ酢酸あるいは酢酸塩を添加し
ない場合と比べて大幅に増加しており、この系に
おいて脂質及び菌体の生産性が著しく高くなるこ
とが明らかになつた。又、脂肪酸組成としてγ−リノレン酸の含量が
酢酸あるいは酢酸塩（ナトリウム塩、カリウム
塩）を添加することにより増加しており、全不飽
和脂肪酸において1.7〜20.1％の増加が認められ
た。１個の脂肪酸に対する不飽和結合の数を示す
不飽和系数もかなり大きく増加していることか
ら、不飽和脂肪酸の増加と同時に、不飽和脂肪酸
の高度不飽和化が起つていることが明らかであ
る。このことは酢酸あるいは酢酸塩の添加がその
生成脂質において高度不飽和酸であるγ−リノレ
ン酸を含む不飽和脂肪酸含量を増加させると言う
意味における脂質の改質に効果を及ぼしているこ
とが確認される。

【表】

【表】なお、表−１において、Ａは、モルテイエレラ
イサベリナ（Mortierella isabellina）、Ｂは、モ
ルテイエレラビナセア（Mortierella vinacea）、
Ｃは、モルテイエレラナナ（Mortierella
nana）、Ｄは、モルテイエレララマニアナ
（Mortierella ramaniana）及びＥは、モルテイエ
レララマニアナ・アングリスポラ（Mortierella
ramaniana angulispora）をそれぞれ示す。ま
た、表中のＧはグルコースを示し、不飽和係数は
脂肪酸１個に対する不飽和結合の平均個数を示
す。実施例２グルコース60ｇ、KH₂PO₄2ｇ、MgSO₄・
7H₂O0.3ｇ、NaCl0.1ｇ、マルト・エキス0.2ｇ、
イースト・エキス0.2ｇ、ペプトン0.1ｇ、
FeSO₄・7H₂O10mg、CaCl₂・2H₂O10mg、
CuSO₄・5H₂O0.2mg、MnSO₄・4H₂O1.0mgと窒素
源として尿素〔（NH₂）₂CO〕及び硫酸アンモニウ
ム〔（NH₄）₂SO₄〕をＣ／Ｎ比（炭素源中の炭素原
子重量／窒素源中の窒素原子重量）を約60になる
ように加え、脱イオン水1000mlに混合した培地を
基準として炭素源である炭水化物（グルコース）
の濃度を増加させた場合、その濃度に応じて培地
成分を増加して、また窒素源を尿素などに変えた
場合は同じＣ／Ｎ比になるように培地を調整し
た。この培地を10の培養槽で培養する場合には６
、30の培養槽では20仕込み、それぞれ菌株
を接種し、30℃の培養温度で所定の時間、通気量
0.5〜2.0vvmで300〜700rpmで撹拌して培養を行
つた。培養後遠心分離法で菌体を集めた。また、
菌体の増殖量、脂質生成量及び培地中の炭水化物
濃度の測定を行うため、培養の中間段階において
所定の時間毎に100mlすつ試料の採取を行い、ロ
過法により菌体と培地の分離を行つた。分離され
た菌体からの脂質の抽出、定量は実施例１に従つ
て行つた。菌体を除いた培地については高速液体
クロマトグラフイーにより炭水化物（グルコー
ス）の濃度を測定し、濃度が０になつた時点で培
養を終了した。菌株モルテイエレラ・ラマニアナ・アングリス
ポラIFO8187について、グルコースを炭素源とし
て種々の条件での添加物としての酢酸ナトリウム
の添加効果を調べるため、10及び30培養槽に
より培養を行い、菌体増殖量（乾燥重量ｇ／
）、脂質生成量（ｇ／）、脂質含量（％）など
を求めた。その結果を添加条件など含めて表−２
に示した。表−２において10培養槽を用いた場合、グル
コール濃度約90ｇの系で酢酸ナトリウムの添加量
を0.3〜10ｇ／と変えると同時に、添加条件な
どを変えて培養を行つた結果を無添加の場合と比
較して示した。酢酸ナトリウムを添加した場合は
添加条件によらず特に脂質生成量及び脂質含量の
大幅な増加が認められる。このことは炭素源であ
るグルコース100ｇに対する脂質の生成量である
脂質系数が無添加の場合と比較して大きく増加し
ていることからも分る。菌体の増殖量も無添加の
場合よりも一般的に大きくはなつているが幾分ば
らつきが認められた。30培養槽を用いてのグル
コース濃度約200ｇ／と高濃度炭素源による培
養結果でも無添加の場合よりも0.3及び５ｇ／
SA添加の系ではいずれも菌体増殖は幾分低下し
たが、脂質含量は10％以上増加しており、従つ
て、脂質生成量が20％以上増加していることが認
められた。このことは脂質系数の大きな増加とな
つて表れており、SAの添加効果が0.3〜５ｇ／
とかなり幅を持つて菌体の高密度培養により脂質
生産に対して認められたことを示している。

【表】なお、前記表−２において、Ｇはグルコース、
Ｕは尿素、ASは硫酸アンモニウム、SAは酢酸ナ
トリウムを示す。また、表−２に示した実験番号１〜12におい
て、実験番号１と10は対照試験（コントロール）
であり、実験番号２〜５では、前培養培地に対し
てはSA無添加であり、実験番号４〜５では、培
養スタート後、30時間目にSAを添加し、実験番
号６〜９及び実験番号11、12では前培養地にSA5
ｇ／を添加した。

Claims

【特許請求の範囲】

１モルテイエレラ属に属するイサベリナ、ビナ
セア、ナナ、ラマニアナ、ラマニアナ・アングリ
スポラの菌株を炭水化物を炭素源とする培地に培
養し、培養物より脂質を採取するに際して、菌体
を培養するための培地に酢酸あるいは酢酸塩を加
えることを特徴とする微生物脂質の生産方法。