JPS62501469A

JPS62501469A - Canine and equine interferon

Info

Publication number: JPS62501469A
Application number: JP50035486A
Authority: JP
Inventors: ヒムラー，アドルフ; ハウプトマン，ルドルフ; ハウエル，ノルベルト; アドルフ，ギユンター; スウエツトリイ，ピーター
Original assignee: ベ−リンガ−　インゲルハイム　インタ−ナシヨナル　ゲゼルシヤフト　ミツト　ベシユレンクテル　ハフツング
Priority date: 1984-12-18
Filing date: 1985-12-17
Publication date: 1987-06-18
Also published as: DE3586243D1; SU1642956A3; ZA859635B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

[Detailed description of the invention]

イヌおよびウマインターフェロン本発明は、組換えウマおよびイヌインターフェロンの製造方法およびそのインターフェロン自体に関する。インターフェロンは、ウィルス感染または他の刺激後に真核ＩＩＩ胞によって分泌される蛋白質であり、それがまた細胞をウィルス感染から保護する。現在では、４種類のインターフェロンが知られていて、それぞれα−インターフェロン、 β−インターフェロン、ω−インターフェロンおよびγ−インターフェロンと呼ばれている＜ＫＦＮ−α、ＩＦＮ−β、［ＦＮ−ωおよびＩ　ＦＮ−γと省略）。これらは構造および作用が相異する。すなわち、インターフェロンは、細胞に対する免疫の調節作用を有するか、あるいはｍ胞の分化および腫瘍の生長に影響する。長い間、インターフェロンには秤特異性があると考えられてきた。しかしながら、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの試験で、ウシから得られたインターフェロンプレバレージョンがサルおよびヒトで抗ウィルス活性を示すことが明らかにされｒ＆Ｎる（３２）。この異種間活性は多かれ少なかれ遺伝子および蛋白質のホモロジーの程度に関連するものと思われる。しかしながら、動物インターフェロンは少量しか得られなかったため、この推論は検討できなかった。異種間活性が明らかにされたとはいえ、ｊ！ａ種からのインターフェロンを使用した場合には、治療上容認できない抗原性のような２１作用を生じることが考えられる。しかしながら、一方、農耕畜産用動物および家畜の飼育の場合には経済的因子が重要であって、獣医によって使用できる異杆インターフェロンの需要がある。さらに、各９１動物からの高度にｍＷされた動物インターフェロンは、ヒトに適用できるモデルに到達するため、インターフェロンの活性の機構を検討する機会を与える点で歓迎される。動物・インターフェロンを用いた最初の検討は天然の細胞物質からのプレバレージョンについで行われた。この方法で調製されるインターフェロンは、収率と純度の点で、医薬組成物の製造には適当でない。組換えＤＮＡ技術の発痕の結果として、微生物に責任インターフェロンの産生を誘発することが可能になった。ヒトインターフェロン（ＨＵ−ＩＦＮ）もこの方法で製造された。さらに最近に１よって、ウシα−インターフェロンおよびウシβ−インターフェロンも製造されるようになった。本発明は新規なウマインターフェロンおよびイヌインターフェロン（ＥｑｌＮＦおよびＣａ　Ｉ　ＦＮ）ならびにそのＮ−グリコジル化ｆｆ１１体に関する。本発明はさらに、これらのインターフェロンをコードする遺伝子配列およびこれらの配列を含有づる組換え分子し、これらの配列を挿入体として含有するプラスミドのような発現ベクター、ならびにウマインターフェロンの製造を可能にする各種の宿主生物または培養物を”包含する。本発明はとくに、ウマインターフエＯ＞およびそれらをコードする次式の配列：ＯＣｙｓ　Ａａｎ　Ｉｔｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｔｓ　’ｒ？＋ｒ　Ｈｌｓ　Ｓ＝ｒ　ｒｓ＝ｕ　Ｇ１．、ｙ　Ａｓｒ、　鉗ｒ　Ａｒ６　Ｖｉｌ　１D５ｕＴＧＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＡＣＡＣＣＣＡＴ　ＡＧＣｃ’ｒｃ　ｃｃｃ　ＡＡＣＡＣＡ　ＡＧＧ　ＧＴＣＴＴＧＭｅｔ　ｒｓ’ｕ　ＴＡｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｒ、　門ｅｔ　Ａｒｑ　Ａｒｑ　ＩＦ、２５ｒ＝ｒ　Ｐｒｏ　ｒ’ｌｓｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｃ■ ＡＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＧＧＧ　ＣＡＡ　ＡＴ：Ｇ　ＡＧＯＡＧＡ　ＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＬｙｓ　Ａｓｐ　ＡｒＩ、Ａｓ Canine and equine interferon The present invention provides a method for producing recombinant equine and canine interferon and an interferon thereof. – Concerning Felon itself. Interferon is secreted by eukaryotic III cells after viral infection or other stimuli. A secreted protein that also protects cells from viral infections. Currently , four types of interferon are known, respectively α-interferon, Also known as β-interferon, ω-interferon and γ-interferon. <KFN-α, IFN-β, [abbreviated as FN-ω and IFN-γ) . These differ in structure and action. In other words, interferon causes cells to or have an immunomodulatory effect on m-cell differentiation and tumor growth. do. For a long time, interferons were thought to have scale specificity. however , interferon prevarage obtained from cattle in in vitro studies. r&N revealed that the antiviral agent showed antiviral activity in monkeys and humans (3). 2). This cross-species activity is due to the degree of homology of genes and proteins. It seems to be related to. However, only small amounts of animal interferon are available. This inference could not be considered because it was not possible. Although cross-species activity has been revealed, j! Uses interferon from species a It is thought that this may result in therapeutically unacceptable antigenic effects. It will be done. However, on the other hand, economic factors are important in the case of farming and livestock farming. There is an important need for heterologous interferons that can be used by veterinarians. Furthermore, highly mW animal interferon from each 91 animals is suitable for humans. Opportunity to examine the mechanism of interferon activity in order to arrive at a model that can be used It is welcomed in that it provides. The first study using animal interferon was pre-valley from natural cell materials. It was done after John. Interferon prepared by this method has a high yield and purity. Due to its high strength, it is not suitable for the production of pharmaceutical compositions. As a result of recombinant DNA technology, microorganisms are responsible for producing interferon. It is now possible to trigger. Human interferon (HU-IFN) was also produced by this method. even more recently 1 Therefore, bovine α-interferon and bovine β-interferon are also produced. It became as to be. The present invention provides novel equine interferon and canine interferon (EqlNF and CaIFN) and its N-glycosylated ff11 form. The present invention further provides gene sequences encoding these interferons and A recombinant molecule containing these sequences and a plus containing these sequences as inserts. Enables the production of expression vectors such as Mido, as well as equine interferon. "includes a variety of host organisms or cultures." The invention particularly relates to equine interfaces O> and the sequences encoding them: O Cys Aan Iteu Pro Its’r? +r　Hls　S=r　r s=u　G1. , y Asr, forceps Ar6 Vil 1D5u TGT GACCTG CCT CACACCCAT AGCc’rc ccc AACACA AGG GTCTTGMet rs’u TAu Gly G lr, gate et Arq Arq IF, 25r=r Pro r’lse S er　Cys　Lc■ ATG CTCCTCGGGG CAA AT:G AGOAGA ATCTCC CCCTTCTCCTGCCTCLys Asp ArI, As

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に関する。本発明の目的は、上述の動物の組織、好ましくは肝臓から、Ｂ１１ｎおよび５ｔａｆｒｏｒｄの方法（１８）によって高分子ＤＮＡを単離し、それを特定のエンドヌクレアーゼを用いて統計的に断片化することによって達成された。生成り、た勺・イスのＷなるフラグメント−を、ベクターたとえばう・ムダベクター・にり１−］−ン化俳るために１、ぞれらのサイズによつＣ好ましく　ｉｔ　１ｏ・・・２３！ｉｂノラグメ：。パ）−をご（−成するように分画した。ついでイーれらのベクターをバクテリア、好ましくは大腸菌内で複製させた。ウマ［）　Ｎ　Ａ　ｌ；、ｔ　、非緊縮条件１；、成熟１＝　Ｉ−（＞ターノ工！＝ｌンー・αシ）△Ｒ（〜１をニオ・・・トリ：？’、＞　Ｌ）　ＮΔお９１、げに１−β−イン台−ノＪ目ン；ｐ　：Ｔ１　、、、・ドＡ−るＣ　Ｄ　Ｎ　Ａター用いてスクリーニングした。一１’　メＤ　Ｎ　Ａ　！１、被２１ｉｉ条ｆ４下、Ｉｍ　熟１：　ｉ□　−（ン９−７１「］ンーα２ΔＩＲＯを１−トリ′？）１］トＩＡを用い−（スクリーニングした。緊縮を欠りｌ、：めに、配夕１１がＨＬＪ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−α−２ＡＲＧＪ３Ｊ、び１−１ｕｌＦＮ−βと異なるり１〕−ンｔ３（９ら４また、ウマ１〕トＩＡを、ｌ′：１・α苛伝イーを用いでサザンｌξ（１調べたところ、ウシ、ブタおよびｅ）の場合ど同様に、数個のバンドが認められた。したがって、ウマにも１群のα−インターフエｊコン遺伝子が存在プるものと推測できる。ハイブリダ・イス１．ノた組換ン体からファージＤＮΔを調製し、生じたクローン、ＥＱ−Ｃ１、Ｅｑ−βＧから制限酵素地図〈第２回および第３図）を作成した。さらに、ヒトＩＦＮプローブとハイブリダイズした２個のラムダクローン、［ｑ−α１６およびＥｑ−・α２０が得られた。クローンＥｑ−ａからの３．２ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［［フラグメント、クローンＥＱ−β６の４．５ｋｂ　ＰｖｕＩＩ７ラグメント、クローンＥｑ−α９の２°８ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［［７ラグメント、クローンＥｑ−α１６の３．３ｋｂＥｃ。Ｒ１および５．５ｋｂ　［：ｃｏＲＩフラグメント、クローンＥ（１−α２０の２，２ｋｂ　ＥＣ０ＲＩフラグメントまたはクローンＥｑ−α２４の３．２ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［Ｉフラグメントを、ベクターたとえばｐｕｃ９またはｐ　Ｕ　Ｃ８にサブクローニングし、ついで宿主生物たとえば大腸菌ＪＭ１０１を形質転換した。正しい表現型の単離により、それぞれウマインターフェロンをコードする配列を挿入体として含有するプラスミド、ｐＡＨ５０，１）ＡＨ６０、ｐＲＨ６１、Ｉ）ＲＨ６２、ｐＲＨ６３，１）ＲＨ８２およびｐＲＨ８３が生成した。ｐＲＨ６１およびｐＲＨ６３の制限酵素地図を第９図に、またｐＲｔ−１６２の制限酵素地図をｆｆ１３０図に示ず。プラスミドの挿入体の配列はパショットガン法″を用い、Ｓａｎｇｅｒ　（３２）によって記載されたジデオキシ法によって決定した。改良フンピユータプログラムを用いてこれらの挿入体の部分配列を合して、全配列を構成した（第４図、第８図、第１０図、第１２図、第３１図、第３４図および第３５図）。クローンＥＱ−α１からのＥｑ−ＩＦＮ−α遺伝子の細長読み取り枠は、１８４個のアミノ酸をフードする。他の種の公知α−インターフェロンと有意なホモロジーを示したことは特筆に価する。ヒト、ウシおよび唱歯類α−インターフェロン場合と同様、このウマα− インク−・フエロンは２３個のアミノ酸庖右万る疎水性シグナルペプチドからなり、これに続く成熟蛋白質は、驚くべきことにわずか１６１個のアミノ酸をもつに゛リ−ぎない（Ｅｑ−Ｉ　ＦＮ−Ｃ１）。位置１．２９．９９および１３９にあるシスティン基については、ウマ、ウシ、マウス、ラットおよびヒトの種間で正確に維持され′Ｃいる（第７図）。このウマα−インターフェロンのアミノ酸１６１個への短縮は１５９番目のアミノ酸の後の塩閃が１個欠失したためと考えらね、これがなｃプれば転写は１６６番目のアミノ酸の１６６番目のコドン、停止コドンＴＧＡまで続いたものと思われる。この所見は、成熟ウマインターフェロン−Ｃ１のポリペプチド鎖は１６１個のアミノ酸環を右ずが、１６６個までのアミノ酸をもつ他の型も存在する可能性があることを示している。これらのポリペプチドも、もちろん、本発明の対象である。アミノ酸配列を一対ずつ比較していくと、菜くべぎことに、ウマインターフェロン−Ｃ１はヒトα−インターフェロン（７１〜７７％）と、ウシ（５７−・６７％）、ラット（６１％）またはマウス（５４−５９％）α−インターフェロンよりも高いホモロジーを示した（第５図）。几が異なるα−・インターフェロンの間のホモ［］ジーは、種の異なるα−インターフェロン間のホモロジーよりも有意に大きい（たとえば、ヒ１−７７〜１００％、ウシ９１〜９９％）。クローンＥｑ−α１６からのＥ　ｑ−Ｉ　Ｆ　Ｎ−α遺伝子の細長読み取り枠も１８４ｇのアミノ酸からなるポリペプチドをフードする（シグナルペプチド＝２３個のアミノ酸、成熟蛋白質＝１６１個のアミノ酸）。クローンｐＲ）４６３の挿入体のＤＮＡ配列は、クローンｐＡＨの蛋白質コード領域における挿入体のＤＮＡ配列にきわめて類似している。この事実はその遺伝子の発現に利用できる（例Ｍ：第１１図および第１５図参照）。クローンｐＲ）１６３によってコードされるインターフェロンは、Ｅｑ−Ｉ　ＦＮ−α１（クローンｐＡＨ５０によってコードされる）と高いホモロジーを示寸ことからＥｑ−ＩＦＮ−α２と命名された。成熟Ｅａ−Ｉ　ＦＮ−α２は、ＥＱ −ＩＦＮ−α１に比べて、Ｃ末端におけるわずか２個のアミノ酸残基が異なるにすぎないが、ＥＱ−ＩＦＮ−（２２では１５１位のＳｅｒがｃｙｓに交換されていて、これまで他のインターフェロンに認められたことのない位置に第５のシスティン基をもっている（第１９図参照）。伯の点では、Ｅａ−１ＦＮ−α１について述べたことはまたＥＱ−Ｉ　ＦＮ−α ２にもあてはまる。プラスミドｐＲＨ８２およびｐ　ＲＨ８３のＤＮＡ配列の決定によって（第３４図および第３５図）、これらのフラグメントが、機能的ウマα−インターフェロン遺伝子を含有することが明らかにされ、Ｅ（ＩＩＦＮ−α３（ｐＲＨ８３から）およびＥｑＩＦＮ−α４　（ｐＲＨ８２から〉と命名された。これらの遺伝子は２３個のアミノ酸のシグナルペプチドと１６１個のアミノ酸長の成熟蛋白質からなるポリペプチドをコードする。ＥＱＩＦＮ−α１　（＋）ＡＨ５０）とＥａＴＦＮ−α３（ρＲＨ８３）　、およびＥＱＩＦＮ−α２（ｐＲＨ６２）とＥＱＩＦＮ−α４（ｐＲ８８４）工ｉ、　−Ｆ　ｆｌのＤＮＡ配列の間にはとくに茗しく高いホモロジーが存在す゛る。ＥａｌＦＮ−α１とＥａｌｌτＮ−α３の成熟蛋白質のアミノ酸配列は同一である。遺伝子コードの縮重により、この場合、ヌクレオチド配列の差はアミノ酸残基の変化を生じない。ＥｑＩＦＮ−α３はＥ（ＩＩＦＮ−α１の対立遺伝子変異体と考えられる。ＥＱ−α２０のＤＮＡフラグメントは、１７２個のアミノ酸をもつ蛋白質と２３個のアミノ酸をもつ疎水性シグナルペプチドをコードする配列を含有する。この成熟蛋白質の位置７８〜８０にはグリコジル化部位の可能性があるＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒが存在し、これはＥＱ−ＩＦＮ−β、！−１ｕ　−Ｉ　Ｆ　Ｎ−β、Ｍｕ−ＩＦＮ−β、Ｍｕ−ＩＦＮ−α１，２，４，５．６の部位と完全に一致する（第１９図）。この図の蛋白質配列は各インターフェロン間のホモロジーが最大になるように配列された。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β配列を比較するために、後者では３個のアミノ酸を置き換え、ギャップを設けた。第２０図におけるアミノ酸配列の一対ごとの比較は、この配列に出発し、蛋白質の最長の共通鎖にわたって行またものである。第１９図および第２０図には、クローンｐＲ８６１のＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質が■型インターフェロン（α−およびβ−ＩＦＮ）に関連することを示す。１７２個のアミノ酸の性質、７８位におけるグリコジル化部位、異なるＥａ（ヒト、ウシ、ウマ）間のまた同じ局内のこれらの長鎖インターフェロンと α−インターフェロン間のこの種類のインターフェロンのほぼ等しいホモロジー、ならびにα−インターフェロンおよびクローンｐＲＨ６１からのプローブとハイブリダイズ [,Asp F lee GILy Pji]e Pro Gl, l”+ Glu Vai, Ph e Asp fay AAG GA'CAGA AAT GACTTT GGA TTCCCCAG GAG GT, G TTT CACGGCAsc Gln fh?A rq Lys Pro Glr, Ala Ile Ser Ala Vat Hls Glu ThrAACCAGbuyCCGG AAG CCT CAA GCCAT CTCTGCG GTCCAT GAG ACGG'Lra Gin Lcu Thr Glu Leu GLu Ala Cys Leu Ser Gtr, C1u Val GlyCAG CAG CTG ACT GAG CTCG AA GCC'Ill;T CTCAGCCAG GAG GTG GOGll o 115 120 VaL Glu GLu Thr F'ro lau Met Asn G1.u A!3pSsr Iau Ibu Ala ValCTCGAA GAG ACG CCCCTSUATG AACGAG GACTCCCTG CTG G CT GTC125+301:5 5 Ar@ ArgTyr P?Ie C1r, Arc Ile Ala Lau Tyr Leu GLr+ Glu L, Y!!L, v■ AGOAGA TACTTCCAA AGA ATCGTCCTCTAT CT CCAA GAG AAG AAASer Phc :3er Ser Ser Ser Thr Asr, [i* Pro G1.r, Ser *TCCTTCT CT TCA TCCACA AACTTG CCG CAG A: JT TA A.Met Leu Iau Gly G1.rx Met Arc Arq II s Ser I'ro Pne Ser Cys IguATG CTCCTG GGA CAA ATG AGG AGA ATCTCCCCCTTCTCC TCCCTCLys Aap Ar5 Asri Asp Phe Gly E 'he Pro Gin Glu'/il Phe Asp GLyAAG GACAGA AAT GA (: TTT GGA TTCCCC TCTTCAGAC A GACGGCTCG TCT GCTAla Trp Asp Glu 5 errAu Iau Asp Lys Leu Tyr Thr Gly Tp u TyrGCCTGG GACGAG AGCCTCCTA GACAAG CTCi'Ac ACT GGA CTCTA'! 'Gin Glr, rAu Thr GLu rAu G'Lu Ala Cys Leu Ser G' Lr-Glu Va, I GLyCAG CAG CTG A(, T GAG CTCGAA GCCTGT CTG AGCCAG GAG GTG GGG llo 115 +20 Va, 1 G1.u Glu Thr Pro h=u Met Asri Q 'a Asp Ser Tau Ibu Aha ValGTG GAA GA G ACG CCCCTG ATG AACGAG GkCTCCC'G C TG GC Ding GTGArgAr/cTyr E'ne Glr, Ar q l[ 'Le Aia Leu Tyr ku Glr G1.u L,ys Lys AGG AG＾τACTTCCAA AGA ATCGTCCTCTAT CT CCAA GAG AAGAAA+40 145 150 Tyr Ser Pro Cys A1.a Trp Gl,u ne VaI Arq A la G1.u ne Met ArcTACAGCCCT TGT GCCTOOGAG ATCGi'CAGA GCA GAA A'r(: ATQ AGA155 160 +65 C, vs Phs 5erSer Ser Thr Asr, Iteu GLr b Gun Ser ÷TOCTTC'rCT TCA T("CACA AA CTTG CAG CAG AGT TAA. Equation 5 to t5 V al Asn 'ryr Asp Lsu Leu Arg Ser Gln ku Arg Ser Ser Asn 3erG?G AACTAT GA CT1'G CTT CGG rcc CAA CTA AGA AGCAGC AAT TCA20 25 5゜ A], a Cys TAu Met Leu 工au Arg G1.n Is u As n Gly /M1.a Pro Gin Ar5GCA TCT C TG ATG CTCCTG CGG CAG ffl'G AAT GGA GCCCCT CAA CGTCya Pro Glu Asp Thr Me t Asn I”he Gl-n Va:1.Pro Glu Glu ne G1.u?GCCCCGAG G ACACA ArG AACTTc CAG GTCCCT GAG GAG Al!'l' GAGGin Ala Gin Gin Phs Gln Lye Glu Asp Aha, Jua Leu Val, Engineering is TyrCAA GCA CAG CAG'! '! ``C CAG AAG GAG GAF GCT GCA TTG G1'CATC' !'A'lI's, u Met Ieu Gin 11is '[hr 'fl'rp Ar5 Tle l'he Arg Arg, Aai ICrx■@Ala GAG ATG CTCCAG CACACCTGCG 'l' A'l'l' TTCAGA AGA AA'l' TTC0CTso a5 g. Ser 'L'hr G1. Y? rp Asn G1. u Thr Ile Vt+1. Ly13Jksn Lau Lju Val, @Glu AGCAC’I’ GGCTGG AA’! 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CcAGCAG Ar c GTCAGCCTCTTCCACACA GAG CGCTCCTCCT G CTAla i'rp Aan Thr Thr ACG AIJ CTG COG GACCGA CTCCOG: GCG G GA (J'CCAI! Gln, G1 .n Leu Glu Asp Leu Asn Thr Cys Leu Asp Glu Gln Thr G17C AG CAG C'I'G GAA GACCTCAACAce 'll'Gc ?'l'G GA'l' GAG CAG ACA GfA l lo 115 120 Glu (nu Glu Ser fla Iau Gly '[hr Va: L Gly ho Thr Iau na VanGAG GAA GAA T CCGCCC11'G GGA AC? rg Arg ne ArgLeu Tyr kn Thr Glu Lya LysAAG AGG TACT'l'C AGG AGA ATG CGT CTG TACCTG ACA GAG A AG AAA'l'yr Ser Asp Cys Ala Nop Glu n e Van Arg Vta Asp ne Met Arg. TACAG? GAC!'GT GCCTCG GAG Alr'l' G1C AGA G'KG GACA1'CA'l'G AGASer Phe Ser Bar Ser Ala Asn Leu Gln Gly Arg TAu Gly Met Arg'!'CCTT C'IC?rGA 'ICA GC A AACCTG CAA GGA AGG 'I'TA GGA ATG A AGAsp Gly Asp ku's J 3er o +GA?GGA G ACCTG GGG !'CA CCT T:GA canine interferon and the sequence that feeds it: Cys Us Len Pro As p' Ihr Hil!G1:T Arg Aan Trp Arg Val LeuTGCCACCTG C CCGACACCCACGGCC'lG CGCAACTGG AGG GTC CTG, Thr Leu Leu Gay Gin Met Arg Arg Iau Ser Ala Gly 3er Cys AspACG CTCCT G GGA CAG ATG AGG AGA CTCTCCGCCGGCTC T TG' f GACR1s Tyr Thr Aan Aap Phe Al a Phe 'Pro Lys Glu Txu Phe Asp GlyCA CteACACCAAT GAC'I:T? GCC buy CCCCAAG GAG C’l’G? 'fT GA'! GeOGln Arg Lsu Gln, G1. u A: La Gln Ala ku Ser Van, Val Hl s VaIMetCAG CGG CTCCAG G in G GCG CAfl GCCC'EC'fcT G'rG'G1'CCACGTG ATG65 7o 75 Thr G'Ln Dy e V'al Fhe Hls ku Phe Cys Pro Asp Thr sir 3er AhaACCCAG・AAGG'l' C'! ? 'l'CCACCTC'! 'TOTCC, CCG G1CAG 'jl 'cc TC'l' CCTProτ! ”p Asn Met Thr Lau 'XAu Glu G1.u Lau C715Bar Gly ku 5e rCC'!'τGG AACATG AC'!!CTCCTG GAG GA A CTG ?GCTCCG溜CTCTCTGlu Gin k u Asp A ap Lsu G3, u Ala Cya I'ro ku Gln Glu ua GlyGAG CAG C'l:G GAT GACCTG GAG G CCTGT CCCC'!'G CAG GAG GCG GGGllo 11 5 120 Leu Aha Glu Thr P'rosiu Met H ls Glu A sp Ser Thr Leu Ar5 ThrCTG GCCGAG A( , CCCCCTCATG CA'l!GAG GAC1'CCACCC'l'G AGG ACCPro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala Glu 11.e Gay Arg Ser PheCCG TCT GCCTCG G AG ATG CTCCGA GCA GAA AT G GGG AGA 'f'cc '!' I'CPhe 3er 3er Th r ne Isu's n Glu Arg, ns Ar5 Arg Arg p e +'E"I'C'l'cc 'l'cG ACA 人τCTTCCAA G AA AGA A'll'CAGG AGG AGG AAA rf A and equine interferon of the following formula: The object of the present invention is to isolate high-molecular DNA from the tissues of the above-mentioned animals, preferably from the liver, by the method of B11n and 5t afrod (18), and to transform it into specific enzymes. This was achieved by statistical fragmentation using a donuclease. Generate a W fragment of a taki-isu into a vector, such as a waste vector. It is preferable to use C according to each size in order to convert it into 1-]-23! ib noragume:. The vectors were then replicated in bacteria, preferably E. coli. 1= I-(>Tano-work!=l-α-shi)△R(~1 ni...tori:?',>L) NΔo91, geni1-β-indai-noJ ;p:T1,... Screening was carried out using a CD-A-R CDN Ater. 11’ MEDN A! 1, under Article 21ii f4, Im ripe 1: i - (9-71 "] - α2ΔIRO 1-tri'?) 1] Using ToIA - (Screen -ning. Lack of austerity: In order to avoid austerity, the sequence 11 is different from HLJ IF N-α-2ARGJ3J, and 1-1ulFN-β. l′: 1・α Using the Iden E, Southern lξ (1 According to research, cows, pigs and Similarly to cases of e), several bands were observed. Therefore, it can be inferred that a group of α-interfaecon genes exists in horses as well. Hybrida chair 1. Phage DNAΔ was prepared from the recombinant cells, and the resulting clone was Create a restriction enzyme map (Figures 2 and 3) from Equation, EQ-C1, and Eq-βG. Ta. Additionally, two lambda clones, [q-α16 and Eq-α20, were obtained that hybridized with the human IFN probe. 3.2 kb HindI [[fragment, 4.5 kb PvuII7 fragment of clone Eq-β6, 2°8 kb HindI [[7 fragment, 3.3 kb Ec of clone Eq-α16] from clone Eq-α9. R1 and 5.5 kb [:coRI fragment, clone E (2,2 kb EC0RI fragment of 1-α20 or 3.2 kb Hindl [I fragment of clone Eq-α24) were subcloned into vectors such as puc9 or pUC8 and then A host organism, for example E. coli JM101, was transformed. Isolation of the correct phenotype resulted in plasmids containing as inserts the sequences encoding horse interferon, pAH50,1) AH60, pRH61, I) RH62, pRH63,1), respectively. RH82 and pRH83 were generated. The restriction enzyme maps of pRH61 and pRH63 are shown in Figure 9, and the restriction enzyme map of pRt-162 is not shown in Figure ff130. The sequence of the plasmid insert was determined by the dideoxy method described by Sanger (32) using the "Pashotgun method". The partial arrays of these inserts were combined using a ram to form the entire array (Figures 4, 8, 10, 12, 31, 34, and 35). . The elongated open reading frame of the Eq-IFN-α gene from clone EQ-α1 covers 184 amino acids. It is noteworthy that it showed significant homology with known α-interferons from other species. As with human, bovine, and odontocetic alpha-interferons, this equine alpha-inferon consists of a hydrophobic signal peptide of 23 amino acids. The mature protein that follows is surprisingly only 161 amino acids long (Eq-IFN-C1). The cysteine groups at positions 1,29,99 and 139 are precisely maintained among the horse, bovine, mouse, rat and human species (Figure 7). This shortening of equine α-interferon to 161 amino acids is thought to be due to the deletion of one salt flash after the 159th amino acid.If this was omitted, transcription would occur at the 166th codon of the 166th amino acid. ,stop It seems that it continued until the stop codon TGA. This finding suggests that the polypeptide chain of mature equine interferon-C1 consists of 161 amino acids. However, other types with up to 166 amino acids may also exist. Which indicates that. These polypeptides are of course also the subject of the present invention. Comparing the amino acid sequences pair by pair revealed that horse interferon N-C1 is a combination of human α-interferon (71-77%), bovine (57-67%), rat (61%) or mouse (54-59%) α-interferon. It also showed high homology (Fig. 5). The homology between α-interferons of different types is more significant than the homology between α-interferons of different species. significantly larger (e.g., 1-77% to 100% in sheep, 91-99% in cattle). The elongated open reading frame of the Eq-IF N-α gene from clone Eq-α16 also harbors a polypeptide consisting of 184 g of amino acids (signal peptide = 23 amino acids, mature protein = 161 amino acids). The DNA sequence of the insert in clone pR)463 is very similar to the DNA sequence of the insert in the protein coding region of clone pAH. This fact is its inheritance can be used for expression of offspring (Example M: see Figures 11 and 15). The interferon encoded by clone pR)163 was named Eq-IFN-α2 because it showed high homology with Eq-IFN-α1 (encoded by clone pAH50). Mature Ea-IFN-α2 differs from EQ-IFN-α1 in only two amino acid residues at the C-terminus; been The fifth system is located at a location never seen before in other interferons. It has a Tin group (see Figure 19). In terms of weight, what has been said about Ea-1FN-α1 also applies to EQ-IFN-α2. Determination of the DNA sequences of plasmids pRH82 and pRH83 (Figures 34 and 35) revealed that these fragments contain functional equine α-interferon proteins. These genes were found to contain a signal peptide of 23 amino acids and a 161 amino acid long The mature protein of It encodes a polypeptide consisting of: EQIFN-α1 (+)AH50) and EaTFN-α3 (ρRH83), There is particularly high homology between the DNA sequences of EQIFN-α2 (pRH62) and EQIFN-α4 (pR884) -Ffl. The amino acid sequences of the mature proteins of EalFN-α1 and EallτN-α3 are the same. Ru. Due to the degeneracy of the genetic code, differences in nucleotide sequence do not result in changes in amino acid residues in this case. EqIFN-α3 is considered to be an allelic variant of E(IIFN-α1). The DNA fragment of EQ-α20 contains a sequence encoding a protein with 172 amino acids and a hydrophobic signal peptide with 23 amino acids. Asn-Thr-Thr, a potential glycosylation site, exists at positions 78-80 of this mature protein, and this is associated with EQ-IFN-β, !-1u-IFN-β, Mu- IFN-β, Mu-IFN-α1, 2, 4, 5.6 sites completely match. (Figure 19). The protein sequences in this diagram are arranged to maximize the homology between each interferon. Lined up. To compare the IFN-α and IFN-β sequences, three amino acids were replaced in the latter, creating a gap. The pairwise comparison of amino acid sequences in Figure 20 starts from this sequence and runs across the longest common chain of the protein. Figures 19 and 20 show that the protein encoded by the DNA sequence of clone pR861 is related to the types of interferon (α- and β-IFN). the nature of the 172 amino acids, the glycosylation site at position 78, the nearly equal homology of this type of interferon between different Ea (human, bovine, horse) and between these long-chain interferons and α-interferon within the same region, and alpha-interferon and probes from clone pRH61 Ibridize

【ノたＤＮＡフラグメントが異なるセットを与えること（第１８図）は、クローンρＲ）１６１の挿入体が、ω−インターフェロンと命名されている（３３）Ｉ型インターフェロンの新秤に爲するものと推測させる。この命名法は、■型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）と混同を沼きやすい１型りラス■インターフェロンとするＣａｐｏｎら（３４）の用いた命名法よりも混乱が少ない。決定されたプラスミドｐ　Ｒ）！　６２のＤＮＡ配列（第３１図）はａ随性ウマインターフェロン遺伝子の全暗号領域を含有する。それは、プラスミドｐＲＨ６１のウマインターフェロンおよびＨｕｌＦＮ−ω１とのホモロジーにより、ＥＱＩＦＮ−ω２と命名された。ＥＱＩＦＮ−ω２は驚くべきことに、その成熟蛋白質の８６位に第５のシスティン残基を含有する。２１Ｎのウマω−インターフェロンの間のホモロジーは、成熟蛋白質の２９位のアミノ酸に出発するときわめて高い、４個のシスティン残塁、ならびに７８〜８０位のＮ−グリコジル化可能部位（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ）は完全に保持されている（第３１図、第３２図）、ウシおよびヒトβ−インターフェロンに対するアミノ酸ボモロジ−（６１〜７０％）は、ウマα−インターフェロンに対するホモロジー（５７〜６０％、第３３図）よりも高い。ウマβ−インターフェロンの配列はα−インターフェロンの場合と同様に決定された。β−ＩＦＮ遺伝子の最長読み取り枠は１８６個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードし、この場合も多種の既知β−インターフェロンとのホモロジーは注目すべきである。ヒトβ−インターフェロンの場合と同様、３種のウシβ− インターフェロン、嗜歯類β−インターフェロン、ウマβ−インターフェロンは、２１個のアミノ酸からなる疎水性シグナルペプチドを有する。驚くべきことに、β−インターフェロンにおいても、アミノ酸配列の対ごとの比較では、ウマβ−インターフェロンは、ウシ（５０〜５５％）またはマウス（４４％）β−インターフェロンよりもヒ！・β−インターフェロン（５９％）と高いホモロジーを示す（第６図）。一方、ウマおよびヒトβ−インターフェロンの間の予想外に高いホモロジーにもかかわらず、ヒＩ−β−インターフェロンの１１９位に存在するアミノ酸が、３種のウシβ−インターフェロンの場合と同様、ウマβ−インク−フエロンには欠けている。ウマβ−インターフェロンは、２個のＮ−グリコジル化可能部位を、成熟蛋白質の８０位（ヒ！・およびマウスβ−インターフェロンの場合と同様Ａｓｎ−Ｇ１！ｕ　−Ｔｈｒ）と１１５位（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ）に有する。ウシβ−インターフェロンには、２個のＮ−グリコジル化可能部位は１１０位’ （Ａ　ｓ　ｎ−Ｐ　ｈ　ｅ　−Ｔ　ｈ　ｒまたはＡｓｎ−３ｅｒ−Ｐｈｅ）と　１５２位＜ＡＳｎ−Ｖａ！−３ｅｒまたはＡｓｎ−Ｐｈｅ−５ｅｒ）に存在する。ウシおよびヒｈの場合と同様、３種のシスディン基は正確に同じ位置に保持されている（位１１１７．３１および１４０またはヒトの場合１４１）。イヌＤＮＡをヒトα−遺伝子を用いて検討したところ、ウシ、ブタおよびヒトの場合と全く同様に数個のバンドが見出され、これからイヌにおける１群のα−インターフエ［］ン遺伝子の存在が推謂できる。ファージＤＮＡをハイ１リダ・イヌした組換体から調製し、生成したクローンＣａα−１１−２から制限肝素地図を作成した（第２２図）。このクローンの３．７ｋｂｓｍａｉフラグメン１へど２．４ｋｂ　ＳｍａｌフラグメントをベクターたとえＧｔ　ｐｕ　ｃ　Ｑ中にサブクローニングし、ついで微生物たとえば大腸菌、Ｊ　Ｍ　１０１中に形質転換した。正しい表現型の単離により、イヌインターフェロンをフードする配列を挿入体として含有する２個のプラスミドｐ　Ａ　Ｈ２および１）ＡＨ４が得られた。これらのプラスミド中の挿入体の配列は、“ショット・ガン法”を用い、Ｓａｎｇｅｒによって記載されたジデオキシ法（２３）により決定した。こわらの挿入体の部分配列を、改良コンピュータプログラムを使用し・て合し、全配列を形成させた（第２４図および第２５図）。両プラスミド配列の最長読み取り枠１．！、捻くべきことに、１８７個のアミノ酸からなる完全に同じポリペプチドをコードする。細杆の既知α〜インターフェロンと有意なホを一ロジーを示し・たことは）１［１に価づ−る９、蛋白５！ｆ＝１−ド配列は全く同一・で、５′非翻訳領域の１７０ｊ′ＡＩの３個のヌ４ル：ｔ　ｙ−ドのみ（１，８％）が相異１する（２８参照）、ｌ・、ウシおよび聞歯類α−イ゛ンターフ１０ンの場合と同様９、イヌーα−インターノ王「」ンは２３１ｉＡＩのアミノ酸を右４る疎水↑↑−：、／　ｌ　罎−ルベブフードどぞれに続く、驚くべき５とｋわ・Ｉか１６１１１Ａｊツバ′・ミ、ノ酸をイｊする成Ｒハリｉ白質からなるａ報告さ４１ている仙のｌχ・・イソ′ターフエロン遺伝子の張白質配３７１１と比斡褪る、見′、イヌα−インターフェロン！ｉｆの成熟車内質の１１９位Ｊ５よび１２０位の２個のアミ５ノ醒を欠いでいる（第２６　ｒＵ　）。驚くべきことに、成熟イメα−インターフｒｎンは、これまで知られているα− インターフ〕ロン中、６四のシスティン基をもつ唯一のα−インターフェロンであり、したがって３個の分子内ジスルフィド橋の形成が可能である。これらのシスティン基のうら１，２９．９９および１３９位にある４個は、イヌ、ウシ、マウス、ラットおよびヒトの各種間で全く同一である。８６位のシスティンは、Ｃａ１ＦＮ−ａｌ、Ｃａ１ＦＮ−α２、ＭｕＩＦＮ−ａｌ、Ｍｕ　Ｉ　ＦＮ−α２、ＲａＩＦＮ−ａおよびＨ１４ＩＦＮ−α０間で保持されている。驚くべきことに、イヌα−インターフェロンは、Ｎ−グリコジル化可能部位を２個、すなわち７８位（Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ）および１３３位（、Ａ　Ｓ　ｎ −１１ｔ　Ｓ　−３ｅｒ）に有する。７８位のグリコジル化部位はＭ　１．ＪＩＦＮ−α１およびα２のグリコジル化部位（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ）に相当する。それはまた、ヒトおよびマウスからのβ−インターフェロンの８０位のグリコジル化部位（Ａｓｎ−（３ｉｕ−Ｔｈｒ）に相当する。アミノ酸配列の対ごとの比較では、イヌα−インターフェロンは、ヒ１〜α−インターフェロンと５２〜５７％、ウシα−インク・〜フエロンと５４〜５５％、ラットα−インターフェロンと５０％、マウスα−インターフェロンと４８〜５１％のホモロジーをもっことが明らかにされた（第２７図）。本発明のインターフェロンは、詳述する成熟インターフェロンのみを包含するものではなく、ウマ／イヌ−ＩＦＮ活性が実質的に変化しないこれらのポリペプチドの任意の修飾体も包含するものであることに留意すべきである。これらの修飾の例としては、分子のたとえばＮまたはＣ末端における短縮、アミノ酸の他の基による置換、分子の伯の不活性または活性分子への化学的または生化学的結合等がある。最後に挙げた修飾の例には、たとえば１ｇまたは２種以上の本発明のインターフェロンおよび／′または既知のα−ｂ＋、＜はβ−インターフェロンからのハイブリッド分子がある。したがって、本発明は、本発明によるインターフェロンを特菫的に：】−ドする遺伝子配列のみでなく、突然変異、縮重、１１移または付加によって容易におよび常法で得られる修飾配列にも関する。本発明のインターフェロン（すなわち本明細書に記載の生物活性スペクトルを右するインターフェロ〕／）をコードトノ、示された配列に比較して縮重の配列である全配列も包含する。本技術分野の熟練者によれば、暗号領域のＩＴ）　Ｎ　Ａ配列の縮重配列を作成することは容易である。同様Ｖ１本発明のインターフェロンの活性スペクトルを有するポリペプチドをコードし、示された配列（またはその部分）と緊縮条件下に（たとえば、８５％以上、好ましくは９０％以上のホモロジーを選択する条件下に）ハイブリダイズした全配列も包含する。ハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ１５ｘデンハルト〜溶液１０．１％ＳＤＳ中、６５℃で実施される。緊縮の程度は洗浄工程で副室する。たとえば、約８５％またはそれ以上のホモロジーをもつＤＮＡ配列の選択に適当な条件は０．２ｘＳＳＣ１０，０１％ＳＤＳ／６５℃、約９０％またはそれ以上のホモロジーをもつＤＮ・Ａ配列の選択に適当な条件は０．１ｘＳＳＣ１０，０１％ＳＤＳ／６５℃である。本発明のインターフェロン遺伝子は、高収率を！Ｊ−しる条件下に、任意の生物中に導入することができる。適当な宿主およびベクターは本技術分野の熟練者にはよく知られているとおりである。たとえばヨーロッパ特許出願箱０．０９３° ６１９号の記載が参考になる。発現には、原核生物がとくに好ましい。たとえば、大ることができる。上述の株とは別に、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ”　、Ｌａ１１１ｄａ　−、原栄養株、ＡＴＣＣＮＱ２７３２５＞、枯草菌（Ｂａｃｉｌ！ｕｓ　ｓｕｂ口Ｉｔｓ　）のような桿菌、ならびにネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｔｕｍ）または霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ　１ａｒｃｅｓｅｅｎｓ　）および各種シュードモナス民菌類のような腸内細菌も使用できる。一般に、宿主ＩＯ胞と適合性のある種起源のレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主と組合せて使用できる。ベクターは通常、複製部位のほかに、形質転換細胞の表現型による選択を可能にする認識部位をもっている。たとえば、大ＭＷは通常、大腸筒袖起源のプラスミド、ｐＢＲ３２２によって形質転換される（　８０１１ｖａｒほか：Ｇｅｎｅ　２．９５（１９７７）］。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を含有し、したがって形質転換細胞の曲中な同定方法が利用できる。１）ＢＲ３２２プラスミドまたは伯のプラスミドはさらに、ブロモ−・ター自体を含むか、あるいは微生物（よりそれ自身の蛋白質の発現に使用可能なプロモーターを含むように修飾されなければならない。組換＾ＤＮＡの製造に最も頻繁に用いられる７Ｄモーター・には、β−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクｊ−〜ゼプロモーターらひにトリプトファン（ｔｒｐ＞プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅ　Ｉほか：　！１ｕｅ１．Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、　、ａ、　４０５７　（１９８０）：ＥＰ−Ａ−０，０３６，７７６］がある。これらは最も一般的なプロモーターであるが、伯の微生物プロモーターも開発され、使用されている。本発明のインターフェロンの遺伝配列は、たとえばバクテリオファージラムダの左方プロモーター（Ｐ、）の１ｉ１１１１１下に使用できる。このプロモーターは、とくに強力でまたｉｔ、＋＋御可能なことが知られているプロモーターのひとつである。制御は、その隣接制限切断部位が知られているラムダリプレッサーにより可能である。このリプレッサー遺伝子の温度感受性対立遺伝子を完全ＩＦＮ−ω配列を含有するベクター中に挿入できる。温度を４２℃に上昇させるとリプレッサーが不活性化され、プロモーターはその最大濃度まで発現される。これらの条件下に産生される全ｍＲＮＡは、その新しい合成リボ核酸中にＰ、プロモーター起源の約１０％を含む細胞を得るのに十分でなければならない。この方法で、機能性ＩＦＮ配列がリポソーム結合部位の近隣、ラムダＰ１プロモーターから種々の距離に位置するクローンバンクを確立することが可能である。ついでこれらのクローンをチックし、Ｒ高収率のクローンを選択することができる。本発明の蛋白質をコードする配列の発現および翻訳は、非形質転換型の生物に“ 相同性”とみなされる他の調節系の制御下に行うこともできる。たとえば、ラクトース依存性大腸菌からの染色体ＤＮＡは、酵素β−ガラクトシダーゼの分泌によってラクトースの分解が可能なラクト−スまたは１ａＣ−オペロンを含有する。１ａＣｉｔｌｌＩｇＢ要素は、大腸菌に感染性の、バクテリオファージラムダ− ｐｉａｃ５から得ることができる。そのファージのＪａｃ−オペロンは同じｔｉａ菌秒から形質導入によって得ることができる。本発明の方法に使用できる調節系は、その生物の原プラスミドＤＮＡに由来するものであってもよい、１ａＣ− プロモーターオペレーター系はＩＰ’丁Ｇによって誘導できる。他のプロモーター−オペレーター系またはその部分が同様に良好な効果をもって使用できる。たとえば、アラビノースオペレーター、コリシンＥ１−オペレーター、ガラクトースオペレーター、アルカリホスファターゼオペレーター、ｔｒｐ −オペレーター、キシロース−Ａ−オペレーター、ｔａｃ−プロモーター等である。原核生物のほかに培ｒ１酊母のような真核微生物も使用できるゆビールＦｔ母（Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が最も一般に用いられる真核微生物であるが、一般的には他の５４０種が得られエイル。酵母菌（Ｓａｅｃｈａｒｏｍｙｅｅｓ　）内での発現には、通常たとえばプラスミドＹＴｐ７［Ｓｔ　ｔｎｃｈｅｏｍｂほか：　Ｎａｔｕｒｅ２８２．３９　（１９７９）　：Ｋｉｎｇｓｍａｎほか：　ｃｅｎｅ　ヱ、１４１　（１９７９）：ＴＳＣｈＬＩｎ＋ｐｅｒほか：Ｇｅｎｅ　、７１．１２１〜１３３　（１９７ブラスミドＹＲｐ７は、トリプトファンを含まない培地中では生育できない酵母突然変異株たとえばＡＴＣＣ１１ｆ１４４０７６の選択マーカーとなるＴＲＰ１遺伝子を含有する。酵母宿主ゲノムの特性としてＴＲＰ１欠損があると形質転換の検出に有力な助けとなる。この場合、培養はトリプトファンを加えないで行われる。事情はプラスミドＹＥｐ１３の場合も酷似していて、このプラスミドは酵母遺伝子ＬＥＵ２を含有し、これはＬＥＵ−２−マイナス突然変異株を補足するために使用できる。酵母ベクターに適当なプロモーター配列は、ＡＤＨＩの遺伝子の５′側領域［Ａ１１１ｅｒｅｒ　Ｇ、　：　ｏｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　［ｎｚｙｍｏ＋ｏｏｙ上旦ユ、１９２〜２０１　（１９８３）］、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ［旧ｔ　ｚ　ｅ　ｍ　ａ　ｎ　ｔｔか：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩＩｌ、２５５．２０７３　（１９ｆ３０）］または他の解助系酵素［にａｗａｓｋｉ　＆　Ｆｒａｅｎｋｅｌ：　ＢＢＲＣ１０８，１１０７〜１１１２（１９８２）］たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルつ一スー６ −リン酸イソメラーゼ、ホスホグルコース、１゛ツメラーゼおよびホスボグル］４ニナー・ゼを含有する１、適当な発現プラスミドを１Ｂ築することにより、これらの遺伝子１．二結合する終結配列を発現ベクター・中発現させる配列の３′ 末ξ：に挿入し、ｉＴＩ　ＲＮＡ３）ポリアデニル化と終結を予示′りるｉＸども′ｃ８６、生育条ｎにコ、：、１′ｃ転写が調節できる利点もある伯のブＯＴ：＝ターシ′−（ま、アル゛〕−・ルデにド目グｔ　−＝　ｉｆｆ　２、イソシトり目−・・ムＣ１窒索代謝１、：坤引昆）酸ｒｉ・ス゛〕！Ｊ′夕・へ”ｉ２　分ＦＡ’　ｉｌ　ＦＡＩ、上述（１）　リ！Ｊ　１？　ｊｌｙ　’：ｉ’　ル ’ｊ’　Ｅ：　ト−３〜す’、：ｉ　Ｑｉ　ｉ’ヒト目グナー・ぜイｚｔ５げに：　Ｑ、、’　／Ｉメトース、；３よｉ：′ＦＩＪＪう・′、ｌ１１−ズの処理に団Ｉ糸覆るＭス臼、゛対すイｉ遺伝ｊ°のｔ　Ｏ“１予−・ター領域がある１、’ｔ３’；　ｍ　１Ｂ　９　Ｌ”Ｓ　蓋４ｓ　ｉ−）＋ｊ　’；：　ｃＪ：′ 、１”’Ｕ　６Ｅ　ｊｌｔｊ　、！５　Ｂ、　−Sｂ　−、＝’　Ｉ’］十−゛ター、たと引４ば遺伝子Ｂ　Ａ　Ｒ１、、Ｍ「αｑ　、ｒ；　Ｔ−ＥＰ、Ｓ　Ｔ　Ｃ３お、ＬびＳ１′１−ｊ〜）のプロー［・−クーが、ｈ、ム１す依存性ｓｉｒ突■１〜！体のイソ［用１て−よりにＲ痘調節糸中（に用いられる［Ｒｂ１ｎｅ　Ｐｈ、　Ｄ、オｌ／ゴン人学、Ｅ　ｕ　ｇ　＝　ｒｌｅ、ｌ）　ｒ　ｅ　Ｑ　Ｏｎ学位論文（１９’７９　）　、、　１１ｅｒｓｋｏｌ＃ｉｔＺ　＆　０３ｈｉｔｌａ　：　ｔｈｆ、４）１ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　５ａｃｅｈａｒｏｒａｙｃｅ！ｉ、１部、１８１〜２０９頁（１９８１）　、Ｃｏｔｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　］。これらの突然変異イイは、酵母接合型カセットの発現に影響１ノ、１またがって間接的に接合型依存性ブロモ・−に影響づ゛る。１ノかしながら、一般には、酵母適合性７日モーター、原袴製および終結配列を含む任意の１ラスミドベクターが適当である。微生物のＩＪかに、培養多細胞生物６Ｔ＋イＪユ箇胞とし・て適しでいる３、理り的１”：　ｌａ−、￥′Ｔイ（１動物ｄ・３」、び熱ＩＲ曲動物のい“４゛すか６１ｉＮ　＋３４７Ｌ、４　ｆｆ　ｆｉ　ｉｌ、１．＋へＢ’（ｆ’ｌ　／１ ”イｊ；用て’ｃ！”ｃ）　Ｂ　シがしな１ｉＮ　６　、　￥Ｔ　’ｈ：　＃ＪＪ　’ｌ）ｉ　’７）　ｊｇ　ｎ　：ＪＩ　Ｄｉ’Ｌｌ　（＜Ｄ　４ｆＫ　３０　’ｊ、＜　）　ｊ７j　！！　７ａｌｉ　Ｉ；ｉ　ｌ　３ｆｉ’　、日常的り作器、９八゛−〕（いｌ）を二５１：から、１°オ゛椎勅１１ガＢ１胞にノ′リド：　ＩＪＱ　昧ｉ−ｉ：　、Ｉ、た＃シ、＋　ｌ、　ｉ（１”’ｕｓｅ　＆　Ｐａｌ：↑ｆ’！Ｔ’Ｓｌ’ｌｌｌ　ｊ！＝４　：　ｒｉ唐唐浮狽■ Ｃ，ｕ　Ｉ　ｔ　ｕ　Ｉ’　ｅ　、　Δｃａｔｉ　ｅ＋、＋ｉｃ　Ｐｒａｓｓ　（’ｌ　９　’７　、！ｌ　＞　ｌ　＋ｌ　イーｔｉ　ｙｌfｌ　’、＝　；０） ’４４ｏ”）宿−Ｊ−ＩＩ　ｌｉｉ、ｑ糸ｒ７）　ｉ′／ｌｌ　Ｌ’ｉ　−＝　ｆＪ）　ｋｌ、　（４ｊ？＞　’ｌｊ：　ｌ、ｊｌ、！Ｅ旨f；　）　沙り、Ｉ　ｊ３ｉｉ　（Ｃ７、発車ｌ！づ−べ；＝　’ｌ！ｌｌｊ　（’、ｊｆｆｉ　” ｊ”　’）　ｉｆｉ’ｌ　ｉ３、ｆ９パ置、１ご１、臼ｒ　：１　ノζ　・ヅ・、P１′息髪−′、〕　さ−表ｊｌＮｉ“　、・バ　、・°−４′八　左、″、　７合　ｉ ”：ＩＩ　Ｇ屯　、ｌｊ　きｊ　Ａ　；ζ　ノ゛　し・　ｆ@・ン　、ン　リ　、ボ　リ　ノ“ｊ゛　９、　！・　・　パ、・　ヨ　シ　ｆｐＨイ）”ノ　（］ＩＩ　、：、　Ｕ　中へ　′・５゛　柊　枯　ｈｉ”　ソｉＪ@＊（ａ、　；ｆ： ’、ｉ　”（’、する。１ −（口［、煩雅１泡中イ＋’ｌＪＩ用・；ミ〔・揚−５〉、〕・−リベ・′ノづ；ミ　中の制い１１）復１ｉ□１はライ刀くべ拐？Ｎｉか１３１４７ノ３１）イ）ｌ４１が“、璽、）４、ｌｈ、−、、／；ノ、Ｕ丈、通常ポリ；’ｌ”　、、、、、、　＝；、＋　Ｌ％デノ９１′ルス２　Ｅ！：ｌ　４　（７）”、ノ１− １１−・〜す・−１とくにし参；；、１．１、ｆジノ″、ミ〉“つｌルλ４　（、’）　（Ｓ　％〆４０）由来の１ｃｌＩｒＨター、−が用いら；１、？′）１、Ｓ　Ｖ　・ｉ　Ｑ　（７’）　ｊ□す１１１」８よび後期ブＤ−）ニー・ターｌま、い、ずれもウィルスかりｒ；　Ｖ　４０のウィルス複ま４部１）ζも含むフ−）グメン１−とＩ、、＋　”ｌ’、容易に得られるノテ、とくに有用ぐあるｌ：　Ｆｉｅｒｓはが：　Ｎａｊｕｒｅ２７３　。１１３（１９７８）ゴ、５Ｖ４０（７）小または人７５グメントも、それらがウィルス複製部位中の）ｌ　ｉ　ｎｃｊｌ［切断部位からＢＱＪ　Ｉ切断部位に及ぶ約２５０ｂｐ長の配列を含有づる限り、使用可能である。さらに、所望の遺伝子配列に通常結合１）でいるプロモーターまたはＩＪＪ　ｌ卸配列も、これらの制御配列が宿主細胞系に適合性を示づ−ならば、使用ひきるし、またその使用が望ましい場合が多い。複製部位は、たとえばＳＶ４０もしくは他のウィルス（たとえばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、、ＰＢＶ等〉からの外因性部位を導入プるため相当するベクター溝築によって提供してもよいし、また宿主細胞の染色体複製機構を用いてもよい。ベクタ・−が宿主細胞染色体中に組込まれる場合は１通常後者の方法で十分である。しかしながら、遺伝子は、、発現プラスミドｒＪＥ　Ｒ１０３［［。Ｒａ５ｊｌ −ＤＷＯｒｋ！ｎＧａ、か：　Ｇｅｎｅ２ユ、２３７〜２３８（１９８３）、１５ｔよびＥＰ−Ａ−Ｏ，１１５，６１３８１Ｋｔ　ｍ　号Ｄ　Ｓ　Ｍ　２７７３　号Ｔ’　１９８３　年１２　月２０　Ｂ　Ｄ　ＳＭｌ、：寄託ＪまたはプラスミドＤａｌ’ｔ３ＥＲ３３（ＥＰ−・Ａ−０，１１５，６１３）中で発現させるのが好ましい１、これらのベクター・はすべて、クローン化遺伝子の高い発現率を生じる調節要素を含有するからである。発現プラスミドＤ−ａｌ”ｐＥＲ３３に出発する場合、大１１Ｑ萌内でのプラスミドの安定性の増加に有効な“ｐａｒ“配列およびトリプトファンプロモーター −オペレーター配列と人“Ｊ−リポソーム結合部位を１．ンスξ−，１・゛ベクター・ｐＡＴ５３に挿入し、た、ｐＡＴ１５３は、ＤＮＡの移動の短縮誘ミ！参体でｄ５る（　３６　）　、、。プラスニド１Ｊａｒｌ”）ＲＡ丁ＦＥ　Ｒ−１０、’３　ｉｌ）　ｆ’、！Ｉ　Ｑ　ｊｉ　２’には第１３図１示１　、プラスミドＤ　ａ　ｒ　ｐ　Ｅ　Ｒ３３をト１ｉｎｄら単離し、Ｉ’３Ｒし、ＥｃｏＲ１，？［−１ｉ　ｎｄｌｉで２回予め切断したρΔ丁１５３と結合さｔｒ　ｔζ。大腸菌ＨＢ　１０１の形質転絶後に１！？られ、各種ｉｌｌ眼醇素Ｃ消１１．Ｌ、　”を同定した所望構造のブラスミＦ　Ｄ　ａ　ｒ　ｐΔ丁ＥＲ１０３と命名した。ｌ：のプラスミドはブー、プ・スミｉ’１１ＡＴ１５３υ凄製源どアンじジ・リン抵抗性遺伝子、イ弧・らσ１．Ｓ人腸閾内ｅの安定化に有効なｐ　ａ　ｒ配列および＞！Ｊ　’ｙ；　 ’ｆの効率的な発現に使用できるトリプトファンブ［１１ンータ・〜　オペレーター領域、リポソーム結合部位を含ζ了す−る。発現プラスニドＤ　Ａ　Ｈ５２，１）Ａ　（４５２／　２およびｐＡＨ５３のｙ））うならび（、゛ぞ−の：ｐ備段階は第１４図に示す、これらの発現シラスミドの製）み（１，（ｊｌ、プラスニドｒ）　Ａ　）−１５（、）　ｌｊ、・Ｈｉ　ｎ　ｄ　■で消化し、全ＦＥ　（１１Ｆ　Ｎ・−α１遺伝子を含有する４、２ｋｂ長のＤ　ＮＡフラグメントを単離（〕・精製した。Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｉｌｌフラグメントの末端はＳｐｈ　ｌリンカ−によって与えた。ついでこのＤＮＡをＳ　ｐｈｌで消化し、フェノールとクロロホルムで抽出し、工タノールで沈殿させた。ＤＮＡをリガーゼで環化し、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。所望の６造のプラスミドをＤＡＨ５１と命名した。これは、Ｅ（ＩＩＦＮ−α１遺伝子と、短縮３′非翻訳領域およびさらにＳｐｈ　ｘ切断部位を含有する。成熟ウマα−インターフェロンのＤＮＡ配列を最終構造中プロモーター配列に正しい距離で結合させるためには、プラスミドｐＡＨ５０からＰｖｕｌｌで切断して単離した０、４ｋｂ、Ｉ長のＤＮＡフラグメントを用いた。配列５’−ＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣを有する合成１５−マーオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。これはクローンｐＡＨ５０からの成熟ＥＱＩＦＮ−α１の最初の５個のアミノ酸をコードする配列を含有する１５−マーを０．５ｋｂ　ＰｖｕＩ［フラグメントと混合し、ＤＮＡ二重鎖を変性させた。− 末鎖に結合したオリゴヌクレオチドブライマーをクレノーフラグメントで延長した。残った３′オーバーハングが安全に除去されることを確実にするため、ＤＮＡについでＴ４ＤＮＡボリメーラゼとインキュベートした。プラント末端をもつ生成したＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、沈殿させた。たがいに相補的な２個のリン酸化オリゴヌクレオチド、すなわち１２−マー５′−＾ＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧおよび８−マー５　’　−ＣＡＴＣＴＴＴＡ　（ヨーロッパ特許出願用８３１１２８１２．９）の混合物を、そのＤＮＡフラグメントにリゲートさせた。この混合物はＨｉ　ｎｄＩ［Ｉ切断部位と翻訳開始コドンＡＴＧを産生ずる。いずれのオリゴヌクレオチドもＤＮＡフラグメントにリガーゼで結合させた。酵素を不活性化したのち、得られたＤＮＡをＨｉｎｄｌｌ［およびＢｇＪＩｒ切断し、約１９０ｂｐ長のＤＮＡフラグメン；・を単離し、精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＦ２Ｏ３１Ｎで二ｍ切断したｐＡＨ５１と結合させ、大腸菌１−（Ｂ　１０１を形質転換した。得られた６５個のコロニー中、所望のゐ１１限パターンを有する４個のプラスミドから１１ｉｎｄｌ／ＢａｍＨＩ　ＤＮＡフラグメントを単離し、このＤＮＡフラグメントをサンガー法で配列決定した。２鈎のり［］−ンが完全に所望の配列を示した。このプラスミドをｐＡ）１５１／２と命名した。これは成熟ＥＱ　Ｉ　ＦＮ− α１をコードする配列と、これに先行する開始コドンＡＴＧ、！５よび）（ｉｎｄＩＩＬＩＪ断部位を含有する。発現プラスミドｐＡＨ５２およびｐＡＨ５２／２を調製するためには、プラスミドｐＡ）１５１／２を２回、Ｓｐｈ　ＩおよびＨｉｎｄｌｆ［で切断し、生成した１°Ｏｋｂ長のＤＮＡフラグメントを７ガロースグルから単離し、ＨｉｎｃｊｌＩ［および５ｐｈＩで二ｍ１７１断したプラスミドｐａｒ　ｐ’ＡＴＥＲ１０３と結合させた。大腸菌ＨＢ１０１を形質転換して得られた所望構造のプラスミドをｐＡＨ５２と命名した。これは、成熟Ｅ（ＩＩＦＮ−α１の誘導発現に必要なすべての情報を含有する。同様に、プラスミドｐＡＨ５２／２は、Ｈｔ　ｎｄｎｌとＢａｍＨＩで二重切断したｐＡＨ５１／２およびＨｉｎｄＩ［［／ＢａｍＨＩで切断したｐａ　ｒｐＡＴＥＲｌ　０３から調製した。この発現プラスミドはｐＡＨ５２より約０．２１１ｂ長く、さらに唯一のＢａｍＨＩ切断部位を有する。トリプトファンプロモーター、インターフェロン遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子および複製源が一方向に並んだ、大ＷＡ菌内で成熟ＥａＩＦＮ−α１を製造するための実質的により小さい発現プラスミドはプラスミドｐＡＨ５２およびｐＢＲ３２２すなわちｐＡＨ５３から調製した。ｐＡＨ５２をＳｐｈ　ＩおよびＥＣ０ＲＩで切断し、酵素を７０℃で不活性化し、ｄＡＴＰＳｄＧＴＰ。ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰをフレノウフラグメントとともに添加してＤＮＡ末端をプラントにした。ＤＮＡフラグメントを７ガロースゲル上サイズによって分画し、プロモーターおよびインターフェロン遺伝子を含有する１、１ｋｂ長フラグメントを単離した。ｐ８Ｒ３２２はＥＣＯＲＩおよびＰｖｕＩＩで二重消化し、末端を上述したと同様にフレノウフラグメントでプラント化し、ついでウシ小腸ホスファターゼで脱リン酸化した。２．４ｋｂかくして得られた２個のＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮΔリガーゼで結合させ、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。２個のＥＣ０ＲＩ冨識部位が９ｊ製された、このようにして得られたプラスミドをｐＡ）１５３と命名した。ＥＱＩＦＮ−α１　（ｐＡ）−ｔ５０）とＥ（ＩＩＦＮ−α２（ｐＲＨ６３，第１１図）をニードプる遺伝子の高いホモロジー故に、ＥＱＩＦＮ−α２の発現プラスミドを、発現プラスミドｐＡＨ５２／２とラムダザブクローンｐＲＨ６３（第１５図）からｍ　ｔＪできる。成熟インターフェロンをコードする領域中、共通のｆ３ｏオ■部位までにわずか２個の塩基の相違があるが、これらの差は縮重アミノ酸コドンのためにアミノ酸の差は生じないので、発現プラスミドｐＡＨ５２／２中のＥＱ［ＦＮ−α１遺伝子の最初の部分がＥＱＩＦＮ−α２の発現にも使用できる。ｐＲ８６３をＢＣ）Ｉ　ＩＩおよびＢａｒｎＨｆｒ２回切ｉｂ、ＥＱＩＦＮ−α２を６４番目のアミノ酸からフードする配列を有する１、Ｏｋｂ　長の生成りＩ’ＪＡフラグメントをアガロースゲルから単離した。ｐＡＨ５２／２もＢＱｉ！　ＴＩとＢａｍＨＩで切断し、末端をウシ小腸ホスファターゼで脱リン酸化し、生成した２個のＤＮＡフラグメントの大きい方をアガロ・−スゲルから分離した。このＤＮＡフラグメントは、プラスミドベクタ一部、プロモーターおよび成熟インターフェロンの最初の６３個のアミノ酸をコードする配列を含有する。以上の２＠のＤＮＡフラグメントをリガーゼでリグートし、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。正しい方向に挿入体を含有する（ＢａｒｎＨｒおよびＢＱＪ　ＩＩで切断可能）得られたプラスミドは、ｐＡＨ５５と命名した。このプラスミドは、大腸菌内での成熟Ｅｑ［ＦＮ−α２の発現を可能にする。ＥＱＩＦＮ−βの発現プラスミドの製造には、まずプラスミドｐＡ）１６０からのウマＤ　Ｎ　Ａ　！ｉ入休体３′末端を短縮し、ついでこれを成熟ＥＱＩＦＮ −β蛋白質がバクテリアプロモータ・−で発現するように操作した。操作を第１６図に図式的に示す、ｐＡＨ６０をｌ−１ｉＡＩで切断した。酵素を不活性化したのち、３′−オーバーハンギングＤＮＡ末端を７４ＤＮＡポリメラーゼ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを添加）でプラント化した。このプラント末端にＳｐｈ　Ｉリンカ−をリゲートし、生成したＤ　Ｎ　Ａをｓｐｈ　ＩおよびＨｉ　ｎｄｌｌ［で切断した。生成した１、８５ｋｂ長（７）ＤＮＡフラグメントを７ガＤ−スゲルから単離し、Ｈｉｎｄｌｆｆおよび５ｔ）ｈ　１で二重切断したプラスミドｐａｒＰＡＴＥＲ１０３とリゲートした。大腸菌ＨＢ１０１の形質転換後に得られた所望のプラスミドをもつクローンをｐＡＨ６１ど命名した。このプラスミドは以後の発現プラスミド構築の中間段階を構成する。　ｐＡＨ６１を３ａｒｎＨ［およびＳａｉ！　Ｉで２回切断し、生成した１、３ｋｂ長のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し、精製し、ＢａｍＨＩ／Ｓａｌ　Ｉで二重消化したＭ１３ａ＋ｐ９ファージＤＮＡとリゲートした。大腸菌ＪＭ１０１の形質転換後、組換Ｍ　１３ファージ（Ｍ１３ｐＡ）１６１　）から−重鎖ファージＤＮＡを得ることができた。この−末鎖ＤＮＡをリン酸化１５マー− オリゴヌクレオチド、５’　−ＧＴＧＡＡＣＴ訂ＧＡＣＴＴＧと混同し、９５℃ に加熱し、常法まで徐々に冷却した。オリゴヌクレオチドはβ−インターフェロンの配列の最初の塩基に正確に結合する。１５７−−プライマーに出発する単一鎖に基づく第二鎖の合成は、ｄＡＴＰ、、（ｊＧＴＰ。ｄＣＴＰＳｄＴＴＰおよびりしノノウフラグメントを添加して行った。ＤＮＡを抽出し、沈殿させた。残った一部１ＤＮＡ部分はＳｌ−ヌクレアーゼで消化した。１２７−・および８マーオリゴヌクレオチド、５′−＾ＧＣＴＴＡＡＡＧ＾ＴＧ６よび５’−ＣＡＴＣＴＴＴＡの混合物を、あらかじめプラント末端にしたＤＮＡ上にこの処理でリグートし、生成したＤＮＡをＨｉｒ＋ｃｊｌｌｌｌａ５よびＳｒ＞ｈＩで切断した。所望の長さ１°１ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し、＠　ｉ　ｒ＋ｄｌｌ１１５ｐｈＩ　テ二重に切断したプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ１０３とリグートした。大腸菌ＨＢ　１０１の形質転換書、５４個のコロニーが得られた。それらから単頭された９個のプラスミドＤＮＡからＥｅｏＲＩ−／Ｓａｉ’　！　１．３ｋｂ７７／メントを単離し、サンガー法で配列を決定した。得られた、所望の配列を右するプラスミドをＤ　Ａ　Ｈ６２と命名した。このプラスミドは、大腸菌内で成熟ＥＣＩＩＦＮ−β蛋白質を効率的に発現できる。成熟βＩＦＮ遺伝子の最初の塩基（Ｇ）の欠失しているプラスミドをｐＡＨ６２ｄｅｆｔａＧ１と命名した。このプラスミドは、次のＡＴＧ　（成熟β−ＩＦＮ中のアミノ酸１９に相当する）での翻訳開始によりアミノ末端で短縮したβ −ＩＦＮの発現を可能にする。これは驚くべきことに、非短縮蛋白質より有意に劣るが抗ウィルス活性を有する。プラスミド１）ＡＨ５２、ｐＡＨ５２／２、ｐＡＨ５３、ｐＡＨ５５またはｐＡＨ６２を含む大腸菌ＨＢ１０１によるインターフェロン活性の発現を明らかにするために、バクテリアを適当な培養メジウム中でインキュベートしたのち溶菌し、上澄液をまず無ｍａ！過し、ついでＶＳＶまたはＥＭＣＶの１１胞変性効果（ＣＰＥ）を測定する方法でインターフェロン活性を試験した。この目的には、水庖性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）に感染させたＮＥＬ−６１ＱＩＩａ（ＡＴＣＣＣＣｌ２７、つｖ［皮Ｆ３カラ（１）表皮ｔＡｍＪ５Ｊ：び／または脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）に感染されたＡ　５４９　（ＡＴＣＣＣＣｌ２た。結果は例Ｏに示す。発現したウマインターフェロンの検出は、マキシ細胞中蛋白質の標識により行った。プラスミドがコードする蛋白質は、ｉｎ　ｖｉｖｏでマキシ細胞法（３７）により、選択的に標識することができる。大腸菌株Ｃ３Ｒ６０３（ＣＧＳＣ５８３０）［Ｆ”　、ｔｈｒ−１゜１ｅｕＢ６、ｐｒＯＡ２、ｐｈｒ−１、ｒｅＣＡｌ、ａｒ（：ｌＥ３、ｔｈ　ｉ−ｉ、ｕｖｒＡｅ、ａｒａ−１４、オａ　ｃ　Ｙ　１　、Ｑ　ａ　Ｉ　Ｋ　２、ＸＶＩ−５、ｍｔｊ−１、ｏｙｒＡ９８　（ｎａｊＡ９８）、ｒｐｓＬ３１、ｔｓｘ−３３、λ−１ｓｕｐＥ４４］は、紫外線照射によって生じたＤＮＡｐＪ害を修復する礪構をもたない。バクテリアの染色体は崩ｔ１ｉするが、ｉｌｌ胞中に数個ずつ存在する比較的鎖長の短いプラスミドＤＮＡの一部は機能の障害を免れるようなｍｍの紫外線を照射する。障害を受けなかった増殖Ｈ８胞を抗生物質Ｄ−サイクＯセリンですべて死滅させ、内因性ｍＲＮＡを消失させたのら、プラスミドにコードされた遺伝子のみを残った細胞内で転写、翻訳させ、生成した蛋白質を放射標識し、３５ｓ−メチオニンの導入により検出できる。大ｍｍｃｓＲ６０３を常法により発現プラスミドで形質転換し、形質転換バクテリアをアンピシリン含有寒天皿上で選択した。マキシ細胞の調製と蛋白質の標識はＡ、　５ａｎｅａｒ　（３７）の記載に従って大腿した。第１７図は、乾燥ゲルのオートラジオグラフである。１４ｃｍメチル化蛋白質混合物（＾ｍｅｒｓｈａｍ）を分子ｆｆ１４１１として用いた。使用した対照は、プロモーターのみを含みインターフェロン遺伝子を含まないプラスミドｐＥＲ１０３およびヒトＩＦＮ−ａ２ａｒｇ遺伝子の２個のコピーを含むプラスミドｐＥＲ２１／１であった。約１８ｋｄの蛋白質バンドはこれらのプラスミドによって発現されたインターフェロンである。クラスＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−ωのインターフェロン遺伝子と高いホモロジーを示すウマゲノム内配列の総数を検出するためには、高分子但ウマＤＮＡを適当な制限酵素で完全に消化し、この切断ＤＮＡをサイズによって分離した。ニドＯセルロースフィルター上にＤＮＡをサザン遷移させ、変性、固定したのち、各フィルターをニックトランスレートしたプローブとハイブリダイズした。ＥＱＩＦＮ−αにプラスミドｐＡＨ５２からの１．Ｏｋｂ長Ｈｔ　ｎｄｌ［Ｉ／Ｓｐｈ　１７ラグメントを、ＥａｌＦＮ−βにはプラスミドＩ）ＡＨ６２の１．ｌｋｂ長Ｈｉ　ｎｄｌ［［／ＳＤｈ　Ｉフラグメントをプローブとして用いた。いずれも全成熟インターフェロンをコードする配列を含んでいる。ＥＱＩＦＮ−ωの場合には、プラスミドｐＲ８６１からの２．１ｋｂＥｃｏＲＩ挿入体をプローブとして使用した。ついでフィルターを、これらの３種のインターフェロン配列の間での交差ハイブリダイゼーションが起らないように緊縮条件下に洗浄した。オートラジオグラフィーはにｏｄａｋ　Ｌａｎｅｘ　−Ｒｅｇｕｌａｒ　ｊｌｌ感フィルムを用い、ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　Ｘｎフィルム上、−８０℃で７日間実茄した。結果は第１８図に示す。驚くべきことに、ウマゲノムは、ＩＦＮ−αクラスの少なくとも７個の遺伝子、ＩＦＮ−βクラスの少なくとも２個の遺伝子、ＩＦＮ−ωクラスの少なくとも８個の遺伝子を含むことが明らかにされた。発現プラスミドｐＲＨ１００の調製には、プラスミドＤ　Ｅ　Ｒ１０３［［：ｖａ　Ｄｗｏｒｋｉｎ　−Ｒｅｓ目ほか：　Ｇｅｎｅ２１（１９８３）、２３７〜２４８　；　ＥＰ−Ａｏ、１１５−６１３］を制限エンドヌクレアーゼＨｉ　ｎｄｌ［［で線状化し、５′末末端リン酸基を除去した。このプラスミドＤＮＡをリン酸化オリゴヌクレオチドｄ　（ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴ）およびｄ　（ＣＡＴＣＴＴＴ八）と混合し、リゲートした。リガーゼ反応液を制限エンドヌクレアーゼＳａｃ　Ｉで消化し、Ｔ４−ＰＮＫを加えてリグートした。オリゴヌクレオチドはＥＰ−Ａ−０，１１５−６１３に２萩の方法と同様にして調整した。このリガーゼ反応液にコンビ−テントな大１菌）−１ｂ１０１を加えて、インキュベートした。生成したバクテリアコロニー中、１２個を無作為に選択し、顕微鏡スケール上でプラスミドを単離した［Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　＆　Ｄｏｌｙ：Ｎｕｅｌ、八ｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、７　（１９７９）　１５１３〜１５２３］、得られたＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ａｃｉで切断し、ＤＮＡをアガロースゲルラスミドへのＳＢ　ＣＩ　ｎ識部位のう入が確認された。これらのプラスミド中の１個を任意に選出した。大腸菌Ｈ８１０１を再び、関連ミニプレバレージョンからのＤＮＡで形質転換した。生成した形質転換バクテリアから、コロニーを選択し、スケールを大きくして生育させた。それから単離されたプラスミドを１１Ｊｒｉ１エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩおよびＢａｍｔ−ＩＩで切断し、ＤＮＡを１％アガロースゲル上で分離し、そのゲルから電気溶出で小フラグメントを単離した。この約４６０ｂｐ　のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡフラグメントの配列をサンガー法で決定した［Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒほか：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。＾ｃａｄ、ｓｅｔ、（１９７７）５４６３〜５４６７）、この方法で解析したプラスミドを１）ＲＨｌｏｏと命名した。発現プラスミドｐＡＨ４／２の［Ｒには、プラスミドｐＲＨ１００を制限酵素ＢａｍＨＩで完全に切断し、ついで５′末端リン酸残ａｔウシ小腸ホスフアターゼ（ＣＩＰ）で除去した。プラスミドｐＡＨ４をＢａｍＨＩで消化し、Ｃａ１ＦＮ−αをコードする全配列を含む０．６ｋｂ艮のＤＮＡフラグメントを単離し、精製した。この０．６ｋｂ　ＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩで線状化したｐＲ）（１００ベクターＤＮＡとリゲートし、コンビ−テントな大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢアガール上に散布した。生成したバクテリアコロニーから、プラスミドを顕微鏡スケール上で単離し、各ａ酵素による制限解析によって特性を調べた。インターフェロン遺伝子とトリプトファンプロモーターを同一方向に含有するプラスミドを、ｐＡＨ１０４と命名した（第２８図）。このプラスミドは、成熟Ｃａ　Ｉ　ＦＮ−αの最終発現プラスミドの製造の中間段階を構成する。プラスミドｐＡＨ４からの０．６ｋｂ　長ＢａｍＨＩフラグメントを、ＥＰ−Ａ −０’、１１５−６１３と同様にして製造した合成オリゴヌクレオチド（５’ＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣ−ＣＧＡＣ）と混合した。この１５マーオリゴヌクレオチドは成熟イヌα−インターフェロンのＮ末端の５個のアミノ酸をコードする配列を含有する。ＤＮＡ溶液を加熱し、ついで冷却すると、大過剰に存在するオリゴヌクレオチドはＤＮＡ−末鎖の相補的部位に結合する。次に、結合オリゴヌクレオチドブライマーに出発して第二鎖を合成した。残った一本鎖ＤＮＡ部分はＳ１ヌクレアーゼで除去した。得られたＤＮＡを消化し、ついで電気泳動によって分割した。約３００ｋｂ　の長さのＤＮＡフラグメントを単離し、精製した。プラスミドｐＡＨ１０４を３ａｃ　ｉで消化し、タレノウポリメラーゼとインキュベートして、ＤＮＡ末端をプラントにする。得られたＤＮＡをｐｓｔｉで部分切断し、ＤＮＡを電気泳動で分割し、長さ４，３ｋｂ　の７ラグメントを単離し、精製した。生成したＤＮＡを前述の０．３ｋｂ　長のＤＮＡフラグメントとリゲートした。このリガーゼ反応液によって大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換し、アンピシリン含有ＬＢアガール上に散布した。生成したバクテリアコロニーを新しいアガール板上、そしてあらかじめアガール板上に置いたニトロセルロースフィルター上に二重に移した。インキュベーション後、バクテリアをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ　＆　Ｈｏｇｎｅｓｓの方法［８゜Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　＆　Ｄ、Ｈｏｏｎｅｓｓ：Ｐｒｏｃ、）ｌａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　（１９７５）二、３９６１１に従って溶菌し、変性後、ＤＮＡをニトロセルロースに結合させた。細胞屑を除去した。ついで、フィルターを、３２ｐａ識オリゴヌクレオチドｄ　（ＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣ”）とハイブリダイズした・フィルターを、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ｏｒｒ＋ａｔレギュラー地感フィル五感フィルムｄａｋ　Ｘ−ｏｍａｔ　Ｓ　Ｘ線フィルムに一８０℃で露出した。プラスミドＤＮＡをオートラジオグラム中に陽性ハイブリダイゼーションシグナルを生成したバクテリアコロニーからミニプレバレージョン法により単離した。プラスミドをＨｉ　ｎｄｌｌｌおよび３ａｍ）−ＩＩで完全に切断した。アガロースゲル中雷気泳動で分割したのち、０．５ｋｂ　長の制限フラグメントを単離し、サンガー法によるＤＮＡ配列決定解析に付した。所Ｔの描造をもつプラスミドをｐＡＨ４／２と命名した。これは大腸菌内で成熟Ｃａ　Ｉ　ＦＮ−αを発現できる。プラスミドｏＡＨ４／３の製造には、ＣａＩＦＮ−ａのバクテリア内発現のために操作した遺伝子を１ラスミドｐＡＨ４／２から、ａｌｌ胞あたりのコピー数が多く、プラスミドの安定性が高い改良プラスミドベクター１）ａｒＤＡＴＥＲ１０３中にサブクローンした。ＤＡＨ４／２の０．５ｋｂ　長Ｈｉ　ｎｄｌ［［／ＢａｍＨＩフラグメントを）ｌ　ｉ　ｎｄｌｌ［およびＢａｍＨＩで切断し、ゲル精製プラスミドベクターｐａｒｐＡＴＥＲ１０３とリゲートした。コンピテントな大腸菌ＨＢ１０１をリガーゼ反応液で形質転換し、プレート上に散布した。生成したバクテリアコロニーから６詞を無作為に選択し、プラスミドを顕微鏡的スケールで単離した。各種制限エンドヌクレアーゼによる制限解析後、所望の栴造を有するプラスミドを１）ＡＩ−ｔ４／３と命名した。プラスミドｐＡＨ４／２またはｐΔＦ（４／３を含む大腸菌Ｈ８１０１によるインターフェロン活性の発現を検出するため、適当な培養メジウム中でインキュベーション後、バクテリアを溶菌し、上澄液を滅菌′ａ過し、ＶＳＶの細胞変性作用（ＣＰＥ）を調べる方法でインターフェロン活性を試験した。水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）をあらかじめ感染させた△−７２ｔＩＡ胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５４２、イヌＨＱ’）を用いた。結果は例Ｋに掲げる。クラスＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−ωのインターフェロン遺伝子と高いホモロジーを有するイヌゲノム中配列の総数を検出するため、高分子量イヌＤＮＡを相当する制限酵素で完全に消化し、切断ＤＮＡをサイズにより９殖した。ＤＮＡをニトロセルロースフィルターにサザン遷移、変性、固定させたのち、各フィルターをニックトランスレートしたＤＮＡプローブとハイブリダイズした。Ｃａ１ＦＮ〜αのプローブどしては、インターフェロンをコードする全配列を含むプラスミド１）ＡＨ４からの０．６ｋｂ　長１３ａｍＨ！フラグメントを用いた。ＥＱＩＦＮ−ωのためのプローブとしてはプラスミドｐＲＨ６１の２，１ｋｂ　ＥｃｏＲＩｌＩ￥ｉ入体を使用した。ハイブリダイズしたフィルターをついで、緊縮条件下に洗浄した。オートラジオグラフィーはＤｕＰｏｎｔ　ＣｒｏｎｅｘＸ線フィルム上Ｋｏｄａｋ　Ｌａｎｅｘレギュラー増感フィルムを用い、−８０℃で７日間実施した。オートラジオグラム（第２９図）は、イヌゲノムにおいて、同一のα−インターフェロンをコードする２個の遺伝子とは別の、他の種ではひとつのインターフェロンクラス内で生じるようなＣａ　Ｉ　ＦＮ−α１と同様の高いホモロジーを示す配列は検出できない。ＥａｌＦＮ−ωの場合のＤＮＡでは緊縮度のもつと低い条件で少なくとも１個の遺伝子が検出できて、これは上述のイヌα−インターフェロンとは異なる。ベクターによる１１１胞の形質転換は、多くの方法で達成できる。たとえば、カルシウムを用い、細胞をマグネシウム中で洗浄しカルシウム中に懸濁した細胞にＤＮＡを加えるか、または細胞をＤＮＡとリン酸カルシウムの共沈殿体に付すことにより実施できる。配列の遺伝子発現には、形質転換細胞のために選択されるメジウムに細胞を移す。宿主を形質転換後、遺伝子の発現および発酵または細胞培養を、本発明の蛋白質を発現する９条件下に実施し、生成物は通常、公知のクロマトグラフィー分離法によって抽出し、先導および後続配列をもつまたはもたない蛋白質を含有する物質が得られる。本発明のインターフェロンはＮ末端に先導配列をもって発現できることもあり（プレＩＦＮ）、これは一部の宿主細胞では除去される。そうでない場合は、先導ポリペプチドがあれば、成熟ＩＦＮを得るためにはこれを除去しなければならない。または、ＩＦＮクローンを、微生物中でプレ１ＦＮの代わりに成熟蛋白質が直接産生するように改良することもできる。この場合、酵素接合フェロモンＭＦ−α １のプレカーサー配列を融合蛋白質の正しい成熟および生成物の生育メジウムまたは細胞周辺腔への沈殿を確実にするために使用できる。機能性または成熟ＩＦＮのＤＮＡ配列は、開始コドンＡＴＧから出発して２５６番目の位置の推定カテプシン様切断部位（Ｌ）／Ｓ−Ａｒｇのあと）活性の生物学的スペクトルに基づいて、本発明の新規インターフェロンは、公知のインターフェロンが使用できる任意の処置に用いられる。これらの処置には、たとえば、ヘルペス、ラインウィルス、ウマ／イヌ流産ウィルス、各種癌等が包含される。新規インターフェロンは単独で、または他の公知のインターフェロンもしくは生物学的活性物質たとえばＩＦＮ−α、ＩＬ−２、他の免疫調節物質等と組合せて使用できる。本発明のインターフェロンは、族１１瘍または抗ウイルス処置が必要な場合、また免疫抑制状態が存在する場合に、経口的に投与することができる。投与Ｂおよび用琶比は、ＩＦＮ−α物質の臨床試験に現在用いられていると同様で、たとえば１８約（１〜１０）ＸＩＯ６単位、純度１％以上の製品の場合は１日５Ｘ１０７単位までである。たとえば、バクテリアによって産生された本発明の実質的に均一なＩＦＮによる慣用剤型では、非経口投与の場合、ＩＦＮ−ω３ＩＦｊを５％動物血清アルブミン好ましくはウマ／イヌ血清アルブミン２５ｄ中に溶解する。この溶液をついで滅菌フィルターに通し、濾液を無口的に１００個のバイアルに分配する。各バイアルは非経口投与に適した純粋なＩＦＮ６ｘ１０６単位を含有する。使用まで、バイアルは冷却条件下（−２０℃）に保存することが好ましい。本発明の物質は、たとえば本発明のポリペプチドを医薬的に許容されるビークルと混合することにより公知方法で製剤化し、医薬的に有用な組成物を得ることができる。慣用のビークルおよびその製剤化については、［、ｌ、１ａｒｔｉｎ著Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｅｅｓの記載が参考になる。本発明のインターフェロンは計口伍のビークルと混合し、患者に有効に投与するのに適当な医薬組成物とする。それらは非軽口的経路で投与するのが好ましい。本発明により、はじめて、ウマおよびイヌインターフェロン、ならびにそれらをコードする遺伝子配列を得ることが可能になった。本発明はとくに、蛋白質：動物起源の他の蛋白質を実質的に含まないウマα−インターフェロン一実質的に純粋な形一天然のグリコジル化を含まない一リーダーペプチド含有一式１、■もしくは■のアミノ酸配列またはこれらの配列の生物学的に活性な変異体含有一本発明の方法によって製造可能、動物起源の弛の蛋白質を実質的に含まないウマω−インターフェロン一実質的に純粋な形一天然のグリコジル化を含まない一リーダーペプチド含有一式■もしくは■のアミノ酸配列またはこれらの配列の生物学的に活性な変異体含有一本発明の方法によって製造可能動物起源の他の蛋白質を実質的に含まないウマβ−インターフェロン一実質的に純粋な形一天然のグリフシル化を含まない一リーダーペプチド含有一式■のアミノ酸配列またはこれらの配列の生物学的に活性な変異体含有一本発明の方法によって製造可能動物起源の他の蛋白質を実質的に含まないイヌα−インターフェロン一実質的に純粋な形一天然のグリコジル化を含まない一リーダーペプチド含有一式Ｖのアミノ酸配列またはこれらの配列の生物学的に活性な変異体含有一本発明の方法によって製造可能ＤＮＡ配列：ＥｑＩＦＮ−αをコードする配列一ブラスミドｐＬＪｃ９またはｐＬＩｃ８のＨｌｎｄｌｌ［またはＥＣＯＲ１ｇＪ所部位に挿入されるＥＯＩＦＮ−αをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体−プラスミド［）ＡＨ５０一プラスミドｐＲＨ６３一プラスミドｐＲＨ８２一プラスミドｐＲＨ８３一８５％以上、好ましくは９５％以上のホモロジーを示す緊縮条件下でプラスミドｐＡＨ５０もしくは１）ＲＨ６３、ｐＲＨ８２またはｐＲＨ８３の挿入体とハイブリダイズするＥＱＩＦＮ−αをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体 −微生物好ましくは原核生物もしくは真核生物および哺乳類動物細胞内で複製可能な発現ベクターに含まれるＥＱＩＦＮ−αをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体一式１、■、■もしくは■のＤＮＡ配列またはこれらの配列の縮重変異体 −ＥＱＩＦＮ−ωをコードする配列 −プラスミドＤＬＪＣ９またはｐＵｃ８のＥＣ０ＲＩ切断部位に挿入されるＥＱＩＦＮ−ωをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体 −プラスミドｐＲＨ６１一プラスミドｐＲＨ６２一８５％以上、好ましくは９５％以上のホモロジーを示す緊縮条件下でプラスミドｐＲＨ６１またはりＲＨ６２の挿入体とハイブリダイズするＥＱＩＦＮ−ωをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体一微生物好ましくは原核生物もしくは真核生物および噛−乳類動物細胞内で複製可能な発現ベクターに含まれるＥｑＩＦＮ−ωをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体一式ＴＶもしくは■のＤＮＡ配列またはこの配列の縮重変異体 −ＥＱ　Ｉ　ＦＮ−βをコードする配列−プラスミドｐＡＨ６０のＨｉｎｄｌ［［切断部位に挿入されるＥＱ　Ｉ　ＦＮ−βをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体一ブラスミドｐＡＨ６０一８５％以上、好ましくは９５％以上のホモロジーを示す緊縮条件下にプラスミドｐＡＨ６０の挿入体とハイブリダイズするＥＱＩＦＮ−ωをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体 −微生物好ましくは原核生物もしくは真核生物および哺乳類動物ｌ脂肉で複製可能な発現ベクターに含まれるＥｑＩＦＮ−βをフードする配列またはこれらの配列の縮重変異体一式■のＤＮＡ配列またはこの配列の縮重変異体−Ｃａ　Ｘ　ＦＮ−αをコードする配列−プラスミドｐＡＨ２またはρΔＨ４の）−１ｉ　ｎ　ｄ　■切断部位に挿入されるＣａ１ＦＮ−αをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体 −プラスミドＤＡＨ２一プラスミドｏＡＨ４一８５％以上、好ましくは９５％以上のホモロジーを示す緊縮条件下にプラスミドｐＡＨ２またはｐＡ）−１４の挿入体とハイブリダイズするＣａ　ｉ　ＦＮ− αをコードする配列またはこれらの配列のＨ’ｌ変異体−微生物好ましくは原核生物もしくは真核生物および桶乳類動物細胞内で複製可能な発現ベクターに含まれるＣａＩＦＮ−αをコードする配列またはこれらの配列の縮重変異体一式ＶのＤＮＡ配列またはこの配列の縮重変異体形質転換宿主生物ニーＥＱＩＦＮ−α、ωもしくは一βをコードする遺伝子情報またはＣａ　Ｉ　ＦＮ−αをコードする遺伝子情報を含有する形質転換宿主生物、好ましくは原核生物、真核生物または補乳類肋物細胞、とくに大腸菌もしくは大腸菌ＪＭＩＯＩ一本発明の蛋白質の遺伝子情報を、モの宿主生物中で複ツノ可能なベクター中に含有する形質転換宿主生物プラスミドニープラスミドｐＡＨ５０を！−１ｔ　ｎ　ｄ　ｍで切断した４、２ｋｂ　長のＤＮＡフラグメントをＳｏｈ　Ｉリンカ−と結合させ、３ｐｈ　Ｉで切断後に環化づることを特徴とするプラスミドＤＡＨ５１ −プラスミドｐＡＨ５０の０．４ｋｂ　長ｐｖｕｕフラグメントから、１５マーオリゴヌクレオチドプライマー５’ＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣの存在下に変哲したのち、フレノウフラグメントで延長し、オリゴヌクレオチド複合体５°ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧ３’Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｃとリグートし、Ｈｉｎｄｌｔ１８よび１３ｇ！！Ｉｆで切断して得られたフラグメントを、プラスミドｐＡＨ５１のＨｉ　ｎｄｎｌ／Ｂｈｇｊ’ｌｌ切断部位に、その１ラスミドに固有の大フラグメントに代えて含有することを特徴とするプラスミドｐＡＨ５１／２−ＥＣＯＲＩで部分切断し、ＨｉｎｄｌＩ［で部分切断したプラスミドｐａｒｐＥＲ３３の０．／１．７ｋｂＪ％ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＡＴ１５３のＥｃｏＲＩ／Ｈｉ　ｎｄＩ［ｌ切断部位に挿入することを特徴とする発現プラスミドｐａｒｐΔＴＥＥＲ１０３−プラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ１０３のｆ（ｉｒ＋ｄｌｌ／ＢａｍＨＩ切断部位に、それに固有の小フラグメントに代えて、プラスミドｐＡＨ５１／２の１．Ｏｋｂ長Ｈｉ　ｎｄＩ［［／ＢａｍＨＩフラグメントを挿入することを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ５２／２−プラスミドＩ）ａｒｌＡ丁ＥＲ１０３のＨｉｎｄｎ［１５ｐｈＩＦＪＪ断部位に、それに固有の小フラグメントに代えて、プラスミドｐＡＨ５１／２のＨｉｎｄｌ［［１５ｃｈｌフラグメントを挿入することを特徴とする発現プラスミドＤＡＨ５２ −ｐＢＲ３２２の２．４ｋｂ　長ＥｃｏＲ１／ＰｖｕＴｉフラグメントをフレノウフラグメントで線状化し、脱リン酸化し、これをプラスミドｐＡＨ５２の１．１ｋｂ　長ＥｃｏＲＩ／Ｓｐｈ　Ｉフラグメントをフレノウフラグメントでプラント末端にしたフラグメントと結合させることを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ５３一プラスミドｐＲ８６３の１．Ｏｋｂ　長ＢＣＩＩＩ／ＢａｍＨｒフラグメントを、プラスミドｐＡ）−１５２／２に固有の小Ｆ３ＱＩ　ＩＩ／ＢａｍＨ！フラグメントに代えてプラスミド１）ＡＨ５２／２に挿入することを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ５５−プラスミド１）ＡＨ６０をＨＩＡＩで切断し、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼで粒状化し、Ｓｐｈ　Ｉリンカ−と結合させ、ついで）ｌｉｎｄｌ［およびＳｐｈ　Ｉで切断して得られた１、８５ｋｂ　長ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ１０３のＨｉ　ｒｉｄｌ［ｌ／ＳＤｈ　ｌ切断部位に、それに固有の小フラグメントの代わりに挿入することを特徴とするプラスミドｐＡＨ６１一プラスミドｐＡＨ６１のＢａｒｌｌ！−１１／Ｓａｊ　Ｉ。１．３ｋｂ　長を、ＢａｍＨ１／Ｓａｌ　Ｎで二重消化したＭ　１３　ｍｐ９− ファージＤＮＡとリゲートすることを特徴とするＭ１３１）ＡＨ６１ −１５マー、Ｓ’ＧＴＧＡＡＣＴＡＴＧＡＣＴＴＧを用いて二本鎖にしたｐＡＨ６１のフラグメントを、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、オリゴヌクレオチド複合体５′＾ＧＣＴＴ＾八ＡＧ＾ＴＧ３′八ＴＴＴＣＴＡＣとリゲートし、Ｈｉ　ｎｄｌｌｆと５ｐｈＩで切断し、プラスミドｏａｒｐＡＴＥＲ１０３のＨｉｎｄｌｌ［／Ｓｐｈ　ｌ切断部位にそのプラスミドに固有の小フラグメントの代わりに挿入することを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ６２一オリゴヌクレオチド複合体Ｓ’ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴＣＴＴＴＡ３’ＡＴＴＴＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡをプラスミドＥ）ＥＲ１０３の１１ｉｎｄＩ［切断部位に挿入することを特徴とする発現プラスミドｏ　ＲＨ１０〇一プラスミドｐＲＨ１００のＢａｍ）ＩＩｔＵ断部位にＣａ１ＦＮ−α１をコードする配列を含有することを特徴とするプラスミドｐＡＨ１０４ −成熟Ｃａ　Ｉ　ＦＮ−α１をコードする配列を、プラスミドＤＡＨ１０４のプラント末端とした３ａｃ　ｌ切断部位に挿入することを特徴とする発現プラスミド１）ＡＨ４／２一プラスミドｐＡＨ４／２のＨｉ　ｎｄｌｌ［／Ｂａｒｎｌ−１１７ラグメント、０．５ｋｂ長を、プラスミドｐａｒＰＡＴＥＲ１０３のＨｔ　ｎｄＩ［［／ＢａｍＨｌ切断部位に挿入することを特徴とする発現プラスミドＤＡＨ４／３に関する。また上述のプラスミドの製造方法ニープラスミドｐＡＨ５０を＠　ｔ　ｎｄｌ［［で切断し、４．２ｋｂ　長のフラグメントに３ｐｈ　Ｉリンカ−を結合させ、Ｓｐｈ　Ｔで切断し、ＤＮＡリガーゼで環化し、生成したプラスミドで大［５）−！Ｂ１０１を形質転換させ、培養、複製させることを特徴とするプラスミドＥ）ＡＨ５１の製造方法一ブラスミドｏＡ）−１５０をｐｖｕ［で切断し、０．４ｋｂ　長のフラグメントを１５マーオリゴヌクレオチドブライマー５°ＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣの存在下に変性させ、−末鎖に結合したプライマーをフレノウフラグメントで延長し、３゛オーバーハングがあれば除去して、オリゴヌクレオチド複合体５°＾ＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧ３’Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｃを結合させ、生成したＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄｌおよびＢＯＪ　ｍにより υ１限エンドヌクレアーゼ消化したのち、プラスミドｐＡＨ５１のＨｉ　ｎｄｌ［［／８０４！　ＩＩｌ切断部位それに固有の大フラグメントの代わりに挿入し、得られたプラスミドで大腸菌ＨＢＩＯＩを複製のために形質転換し、培！ｌすることを特徴とするプラスミドｐＡＨ５１／２の製造方法 −Ｈ１ｎｄＩ［［で完全に切断し、ＥｃｏＲｌで部分切断したプラスミドｐａｒｐＥＲ３３の０．４７ｋｂ　長フラグメントをリガーゼ反応により、ＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌ［［で制限エンドヌクレアーゼ消化して線状化したプラスミド１）ＡＴ１５３中に挿入し、生成したプラスミドで大腸菌ＨＢＩＯＩを複製のために形質転換し、培養することを特徴とするプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ１０３の製造方法 −プラスミドｏＡＨ５１／２のＨｉｎｄＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメント、１．Ｏｋｂ　長をプラスミドｐａｒｐＴＥＲ１０３のＨｉｎｄｎｌ／ＢａｍＨＩ切断部位に固有の小フラグメントの代わりに挿入し、生成したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を′ａ製のため（形質転換し、培善することを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ５２／２の製造方法 −プラスミドｐＡＨ５１／２のＨｉ　ｎｄＩ［［／Ｓｐｈ　ＩフラグメントをプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ１０３のＨｉ　ｎｄＩ［［／Ｓｐｈ　ｌ切断部位に固有の小フラグメントの代わりに挿入し、生成したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を複製のために形質転換し、培養することを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ５２の製造方法 −２，４ｋｂ　長のＥＣＯＲＩ／ＰＶｕＩ［７ラグメントをフレノウフラグメントでプラント末端とし、脱リン酸化し、これをフレノウフラグメントでプラント末端としたプラスミドｐＡＨ５２のＥｃｏＲＩ／Ａｐｈ　Ｉフラグメント、ｉ、ｉｋｂとリグートし、生成したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を？！製のために形質転換し、培養することを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ５３の製造方法一ブラスミドｐＲＨ６３のＢＯ，ｊＴ［／ＢａｍＨＩフラグメント、１．Ｏｋｂ　長をプラスミドｐＡＨ５２／２に固有の小ＢｇＪ！　ＩＦ／ＢａｍＨＩフラグメントの代わりに挿入し、生成したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を複製のために形質転換し、培養することを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ５５の製造方法一ブラスミドｐＡＨ６（［１−（ａ　ｉ　Ａ　Ｉｔ’切ｉし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、Ｓｐｈ　Ｊリンカ−を結合させ、ついでＨｉ　ｎｄＩＩＩとＳｐｈ　Ｉで切断して得られた１、８ｋｂ　長のＤＮＡフラグメントを、プラスミドＤａｒｐＡ丁ＥＲ１０３のＨｉｎｄｌｌ！／Ｓｐｈ　ｌ切断部位に固有の小フラグメントの代わり　−に挿入し、生成したプラスミドで大ｉ菌ＨＢ１０１を複製のために形質転換し、培養することを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ６１の製造方法−プラスミドＤＡＨ６１の１．３１ｔｂ　長８ａｍＨＩ／Ｓａｊ　Ｉフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＳａＪ　Ｉで二重消化したＭ１３ｒｎｌ）９−ファージＤＮＡとリゲートし、大腸菌ＪＭ１０１を複製のために形質転換し、培養することを特徴とするＭ１３ｐＡＨ６１の製造方法 −Ｍ１３ｐＡＨ６１を１５７−５’ＧＴＧＡＡＣＴ＾ＴＧＡＣＴＴＧを用いて二本鎖とし、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、オリゴヌクレオチド複合体５’ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧ３′＾ＴＴＴＣＴ＾Ｃとリゲートし、ＨｉｎｄｕとＳｐｈ　Ｉで切断したフラグメントを、プラスミドＩ）ａｒｔ）ＡＴＥＲ１０３ノＨｉ　ｎｄｌｌｌ／ＳＤｈ　Ｉｌ、ＩＪ所部位に固有の小フラグメントの代わりに挿入し、生成したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を複製のために形質転換し、培養することを特徴とする発現プラスミドｐＡＨ６２の製造方法一ブラスミド１）ＡＨ１０４のＳａｃ　Ｉｔ７Ｊ断部位をプラント末端とし、これに成熟Ｃａ　Ｉ　ＦＮ−Ｃ１をコードする配列を挿入し、生成したプラスミドで大腸菌ＨＢＩＯ１を複製のために形質転換し、培養することを特徴とするプラスミドｐＡＨ４／２の製造方法−プラスミドｐＡＨ４のＢａｍＨＩフラグメント０．６ｋｂをオリゴヌクレオチドブライマー５　’　ＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣに結合させ、フレノウフラグメントを用いて第２の鎖を合成し、残った一本鎖はＳ１ヌクレアーゼで除去し、ＤＮＡをｐｓｔ■で切り出し、これを、プラスミド１）ＡＨ１０４のＳａｃ　ＩフラグメントをＰＳｔＩで部分消化し、タレノウポリメラーゼでプラント末端として得られた４、３ｋｂ　長の７ラグメントとリゲートすることを特徴とするｐＡＨ４／２の製造方法一ブラスミドｐＥＲ１０３をＨｉ　ｎｄＩ［ＩＦ線状化し、オリゴヌクレオチド複合体５’ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴＣＴＴＴ＾３′＾ＴＴＴＣＴＡＣ丁ＣＧＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡとリゲートさせ、リガーゼ反応物をＳａｃ　Ｉで消化し、ついで環化し、生成したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を複製のために形質転換し、培養することを特徴とする発現プラスミドｐＲＨ１００の製造方法一ブラスミド１）ＡＨ４／２の０．５ｋｂ　長Ｈｔ　ｎｄｎ［／ＢａｍＨＩフラグメンｌ−をプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲｉ０３のＨｉ　ｎｄＵｌ／ＢａｒｒｉＨＩ明所部位に挿入し、生成し）だプラスミドで大腸菌ＨＢ　ｉ　Ｏ１を複製のために形？１転換し、培養Ｊ゛ることを特徴とする発現プラスミドρΔＨ４／３の製造方法も包含する。本発明はまた、本発明の蛋白質のｎＡ迄方法に関する。すなわち、ａ）宿主生物、好ましくは原核生物ｔ）シフは真核生物または哺乳類動物細胞、とくに大腸菌またはビール酵母菌を、ＥｑｌＦＮ−α、−β、−ωまたはＣａ　Ｉ　ＦＮ−αをコードする道伝子情報、好ましくは本発明の蛋白質をコードするプラスミドｐＡ　Ｈ５０５ｐＲＨ６３、ＤＲＨ８２、ｐＲＨ８３、ｐ　ＲＨ６，１、ｏＲＨ６０、ｐＲＨ６２、ｐΔＨ２もしくはｐＡＨ４からの配列またはこれらのプラスミドと緊縮条件下にハイブリダイズして８５％以上好ましくは９０％以上のホモロジーを示す配列、とくに式１から■までのいずれかの配列またはこれらの配列の縮重変異体で形質転換することｂ）　このコード配列は発現ベクター、好ましくはｐＡＨ５２、ｐＡＨ５２／２、ｐＡＨ５３、Ｅ）ＡＨ５５、ｐＡＨ６２、ｐＡＨ４／２またはｐＡＨ４／３のいずれかに含有され、この情報は宿主生物内でＦＱＩＦＮ−α、−β、−ωまたはＣａＸＦＮ−ａを産生ずるために発現すること、およびＣ）　インターフェロンＥｑＩＦＮ−α、−β、−ωまたはＣａ　Ｉ　ＦＮ−α 、好ましくは式１から■までのいずれかのインターフェロンを単離し、精製することを特徴とするＥｑＩＦＮ−α、−β、−ωまたはＣａＩＦＮ−αの製造方法を提供する。本発明はさらに、本発明の蛋白質の治療処置への使用、およびこれらの蛋白質の有効岱と医薬用不活性ビークルを含有する治療処置用組成物に関する。次に本発明を以下の実流例により詳細に説明するが、これは本発明を限定するものではない。原料一部の出発原料は市販品を入手したもので、一部はＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　（Ｈｅ１ｄｅｌｂｅｒｏ）から入手した。大腸菌ＪＭＩＯ１、ｐｕｃｓ、ｐＵＣ９、Ｍｌ　３ｒｒ＋ｐ８およびＭ１３ｍｐ９はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。抑１１ＩＩ囚子５ｕｐＦを有する大腸菌株たとえば大腸菌ＮＭ５２６．５３８および５３９ならびにベクターラムダＥＭＢＬ３または３ＡはＥＭＢＬから入手したが、一部は５ｔｅｈｅｌｉｎ社（Ｂａ５ｉｓ　、　Ｓｗｔｔｚｌａｎｄ　）からも購入した。＾）マＤＮＡの単離凍結組織たとえばウマ肝臓を液体窒素中で微粉末に粉砕し、０．５８　ＥＤＴＡ、１０ｍＨＴｒ　１ｓ−ＨＣｊ！１）Ｉｔ８．０．０．５％ＳＤＳ、０．ＩＪＩＩ！Ｆ／ｄプロテアーゼＫ（２０ｄ／ｇ組織）中、５５℃で３時間インキュベートした。得られた粘稠な溶液をフェノール抽出、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１容）で３回抽出して蛋白質を除去し、５ＱｍＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！１）Ｈ８，０１１（ＩＨＥＤＴＡ、１０１１ＨＮａＣＪで透析し、２倍容のエタノールでＤＮＡを沈殿させた。真空中で完全に乾燥したのち、ＤＮＡを４℃でＴＥ！！！ｉ液（１０ａＨＴｒ　１ｓ−ＨＣ１ｐＨ８，０，１ｓ）ＩＥＤＴＡ）に溶解し、２０℃、４０，０００ｒｐｍで６２時間、溶液１１ｄあたり１．２７３ｇのｅｓｃ、１とともに遠心分離した（　５ｏｒｖａｌｌ　５０　Ｔ　ｉ−ローター）。Ｃ８Ｃ１勾配を滴下して、ＤＮＡを含有する分画をＴＥ緩衝液で透析し、ついでＤＮＡを２倍容のエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、再びＴＥｔ１箇液（４℃）に溶解した。最終ＤＮＡプレバレージョンはＲＮＡを含まず、５０ｋｂ以上であった（０．４５％アガロースゲル上電気泳動により測定）。ウマＤＮＡ５０ｍｃｇを２回、反応メジウム（１０ｍＨＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｊ！Ｉ）８７．５．１０ＩｌｌＨＭＱＣｊ）　、１１＋＋Ｈジチオスレイトール）４５０ｍｃ１中、５ａｕ３Ａ１．６単位と３７℃でインキュベートした。１５．２５および４０分後に、反応液の一部１５０ｒｎＣ７を取り、１５ｍＨＥＤＴＡと混合し、７０℃に１０分間加熱して反応を停止した。０．３Ｍ１Ｍす１−リウムＤＨ６，０を添加後、ＤＮＡを２．５倍容のエタノールで沈殿させた。再びＴＥＦ２ＩＵ液に溶解したのち、０．４５％アガロースゲル上、ＴＢＥ！！Ｉ液＜１０．８ｇ／ＪＴｒｉｓ、５．５ｇ／ｌホウ酸、０．９３ｇ／Ｉ　Ｎａ２ＥＤ丁Ａ）約１容／ｃｔｔｉを用いて一夜電気泳動に付し、ＤＮＡをサイズによって分離した。サイズマーカー（ラムダＤＮＡをＥＣＯＲ■と）ｌｉｎｄｌ［で二重消化し、ＨｉｎｄＩ［ｌＦ消化）を用いて、ＤＮＡ１０〜２３ｋｂ長のゲルフラグメントを切出し、ＤＮＡをゲルから電気溶出し、３時間３００容（緩衝液０．１ｘＴＢＥ）で透析し、ｅｌｕｔ＋ｐ−Ｄカラム（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｅｈｉｉｌｌ）上で製品の指示書に従ッテ粘製し、ついでエタノールで沈殿させた。ひとつにはウマＤＮＡ配列の人工バイブリッドを招き、他方大きすぎてラムダファージ中に充填できないＤＮＡフラグメントを生成させることになるウマＤＮＡフラグメントの自己リゲーションを防止するため、サイズ分画したウマＤＮＡフラグメントは脱リン酸化した。このためには、ＤＮＡを反応メジウム（５０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣＪ！　ｐＨ９° ５．１、０１１１ｔ（Ｍ　ＯＣ１２゜０、１１１１Ｍ酢１亜１．１１１ＩＨスペルミジン）１４０ｍＣＩ中、３７℃で５単位のウシ小腸ホスファターゼと３０分間インキュベートし、さらに５単位の酵素を追加して全反応液を３０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを最終濃度２５ｒｓＨになるように加えたのち、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／２４／１容）で１回、す０１１ホルム／イソアミルアルコール（２４／１容）で２回、ジエチルエーテルで３回抽出し、ついでエタノールで沈殿させ、乾燥し、０．１ＸＴＥ緩衝液に溶解した。Ｃ）マゲノムーＤＩ’ＪＡライブラリーの８１築１０〜２３　ｋｂ長の脱リン酸化ウマＤＮＡフラグメントをラムダベクター、たとえば、ファージＤＮＡの内部ＢａｍＨＩフラグメントを除去して得られたＧ−Ａ−Ｔ−Ｃ付＠端を有するラムダ−ＥＭＢＬ３または３Ａ（３）にりＯ−ン化した。このベクターを抑制因子５ｕｐＦを有する大腸菌株たとえば大腸菌ＮＭ５２６．５３８または５３９　（３）内で、ＬＢ培地（２０）中、５ｉＨＭＯ８Ｏ４とともに生育させ、ポリエチレングリコールで沈殿させ、２回製した。ＴＥ！ｌＩ液で透析したのち、ファージＤＮＡを２回フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１１）　、２回クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／１容）で抽出して蛋白質を除去し、エタノールで沈殿させて淵縮した。ＥＭＢＬ３Ａの末端フラグメントを得るには、ファージＤＮＡ　５０ｍｃｏを反応メジウム（１０＋＋ＨＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｉＨＭａＣＪ　、１ｉＨジチ第スレイトール）４５０ｍＣＪ中、３７℃で２時間、ＢａｍＨＩによって完全に消化し、ついで４５ｉＨＥＤＴＡとともに１０分間消化し、次に７０ ℃で反応を停止させ、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。再すゲーションを防止するためには、中間フラグメントを再びＥｃｏＲＩで切断し、脱落したオリゴヌクレオチドをイソプロパツール沈殿で除去した。３αｍＨＩ消化ラムダーＤＮＡを、１０＋ＨＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１００ｎＨＮａＣ！、ｉＱ＋＋＋８ＭｇＣ１２の４５０ｍｃｌ中、３７℃で２時間、ＥＣＯＲＩにより完全に消化し、１５ｉＨＥＤＴＡを加え１０分間７０℃に加熱することにより反応を停止した。酢酸ナトリウムを最終濃度０．３Ｍになるように加えたのち、０℃で０．６容のイソプロパツールを加えて１５分冊装いて３）Ｉの大ＤＮＡフラグメントを沈殿させ、０．４５ＨＩｆ￥酸ナトリウム１０．６容イソプロパツールで２回、０．３８ＦＦ酸ナトリウム／２．５容エタノールで１回洗浄し、Ｏ，ＩＸＴＥ！ｌ衝液１５ｍｃ！中に溶解した。この操作時にＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩリンカ−は溶液中に残る。ＥＭＢＬ３Ａフラグメント（８ｍＣｇ）を約５ｍｃ　ｇの１０〜２３　ｋｂウマＤＮＡおよび１０単位の７４−ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＮ）と合し、リゲーションメジウム（６６１ｎＨＴｒｉｓ−ＨＣＩＤＨ７，２，０，１ＭＮａＣ１，１０ａ＋ＨＭＯＣ！　、１ｉＨＥＤＴＡ、５ｍ。ジチオスレイトール、０．５ｎ＋ＨＡＴＰ）５０ｍＣＩ中、１４℃で１夜、４℃ で１日インキュベートした。リゲートしたＤＮＡ混合物をｉｎ　ＶｉｔｒＯでラムダ充填システム（２７）を用い成熟ラムダファージ粒子中に充填した。このシステムの成分、すなわち超音波抽出物（ＳＥ）、凍結−解凍分解物（ＦＴＬ）、暖衝液ＭおよびＡは文献（２７）に従って［１した。リゲートしたＤＮＡ混合物の一部１０ｒｎＣｊを、ＦＴＬと同様に氷から３０分間解凍しておいてＳＥ２５ｍｃｉとともに常温で２分間インキュベートし、ついでＦＴＬｌｏｏｍｃｊを加え、混合物を常温で６０分間再びインキュベートした。充填混合物ヲラムタ希釈液（１０００１８Ｔｒｔｓ−ＨＣＪ　ｐＨ７，５，１０ｉＨＭｇＳＯ４，１ｉＨＥＤＴＡ）１５０ｍＣＪで希釈し、４℃に保存した。充填ラムダファージの少聞を大腸菌株ＮＭ５２８ｓｕｐＦ上に散布した。この方法では大体、約１×１０６の独立したウマＤＮＡ組検体を生成した。充填材料の残りをＮＭ５２８よ、ＬＢ／ＭｇＳＯ４アガール板１３．５αあたり３０．０００プラ一り形成単位（ｐｆｕ）の濃度で平板培養し、増殖させた。イヌインターフェロン遺伝子を含む組換えファージを同定するためには、放射標識と１−ＩＦＮ−α道伝子とのサザン法（１７）で示されたヌクレオチドホモロジーを用いた。高分子ウマＤＮＡ　１０ｒｎｃｇをＥＣＯＲＩまたはＨｉｎｄｌで完全に消化し、０．８％アガロースゲル上電気泳動によって万頭し、ニトロセルロースフィルターに移した。Ｒ現プラスミドｐＥＲ３３（１４）起源で、成熟ヒトインターフェロンα２ＡＲＧの蛋白質コード領域すべて−を含む８４５ｂｌ）Ｈｉｎｄｌフラグメントから、常法（２５）により、Ｐ３２−、識ＤＮＡフラグメントを調製した。ウマβ−インターフェロン遺伝子のスクリーニングには、上述したと同様にして、ヒトβ−インターフェロンをコードするｃＤＮＡクローンＰＩＦ１２（１５）の３６３ｂｐＰｓ　ｔ　Ｉ　−Ｂｏｊ！　ＩＩフラグメントから放射標識ＤＮＡプローブをＷＭした。このプローブは成熟β−インターフェロンのアミノ酸４８〜１６６をコードする。ニトロセルロースフィルターは、５ＸＳＳＰＥ（０，９８ＮａＣｊ！、５０ｍＨＮａ）−１２ＰＯ４、！ＭＨＥＤＴＡＳｐ８７．４）　、５Ｘデンハルト♂液（０，１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）０．１％ＳＤＳ、２０ＩＰＪ／ｄザケ精子ＤＮＡ中、６５℃で７時間、予めハイブリダイズし、ついでサケ精子ＤＮＡを含まないほかは同じ溶液中で標識プローブ１３Ｘ１０６ｃｐｍとハイブリダイズした。１夜６５℃でインキュベートしたのち、フィルターを３ＸＳＳＣ（０，４，５）Ｉ　ＮａＣ；１．４５ｍＨクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中６５℃で１〜１．５時間、４回洗浄し、ＫＯｄａｋレギコラー増感フィルムを用い、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ｏｒｎａｔ　Ｓ−Ｘ線フィルムに７日間露出した（第１図）。数個のバンドの出現は、以前にウシ、ブタおよびヒトに検知されたと同じ、ウマのα− インターフェロン逗逗子子一族であることを示唆した。したがって、ウマＤＮＡライブラリー中のインターフェロン遺伝子のスクリーニングにも同じハイブリダイゼーション条件を用いた。６００．０００の組換えラムダファージを大Ｂ菌ＮＭ５２８上、３０，０００ｐｆｕ／平板１３．５ｃｍの濃度で平板培養した。各平板から、５ｅｎｔｏｎとＤａｖｉＳ　（１９）の記載した方法を用いて４ｆ８のニトロセルロースレプリカを調製した。８０℃に２時間加熱したのち、フィルターを１ＨＮａＣ１，１０ｍＨＴｒｉｓ− ＨＣｊ！　ｐｕａ、ｏ。０２１％ＳＤＳ中６５℃で１．５時間洗浄し、上述したと同様にして１夜プレハイブリダイゼーシヨンを行い、各平板からの２個のフィルターレプリカを、１フイルターあたり１．５ｘ１０６ｃｐｍの放射性α−インターフェロンプローブまたは１Ｘ１０６ｃｐｒｎβ−インターフェロンプローブとハイブリダイズした。スクリーニングを３回くり返したのち、陽性ハイブリダイゼーションシグナルを有する８個のウマα−インターフェロンクローンおよび６個のウマβ−インターフェロンクロー・ンな得Ｉこ　。ヒトα−ＩＦＮとハイブリダイズした７個の組換体およびヒトβ−ＩＦＮとハイブリダイズした３個の組換体からファージＤＮＡを調製した。ＤＮＡをＥＣ０ＲＩ。ＢａｍＨＩ、Ｈｉ　ｎｄＩ［［、ＰＳｔ　Ｉ、ＢＱｊ！ＩＩ、Ｓａ１■およびＳａｍｌで消化し、０．８％アガロースゲル中定電気泳動よって分割した。ハイブリダイズしたフラグメントのサイズはサザン法で決定した。ラムダ挿入体内の制限部位は、Ｒａｃｋｗｉｔｚほか（４）の記載した方法を用い、ラムダＤＮＡの部分制限消化、ラムダ技の右端または左端付着端の合成Ｐ３２標識オリゴヌクレオチドによるａ識、および０．４５％アガロースゲル中電気泳動によって決定した。得られたクローンＥｑ−α１、ＥＱ−α１６、ＥＱ−α２０Ｊ３よびＥ（１ −β６の制限酵素地図を第２図、第３図および第９区に示す。 ■文ヱヱ之ｌ：クエロンーα選伝子のす１文旦二三−ンタヒトα−インターフェロンマーカーとハイブリダイズしたクローンＥｑ−α１の制限フラグメントをｐＢＲ３２２誘導体ｐＬＩＣ９の多重制限酵素クローニング部位にザブクローン化した。外来性ＤＮＡフラグメントの挿入はβ−ガラクトシダーゼの１ａｃｚ３１２伝子に障害を生じ、したがってこのプラスミドで形質転換された大腸菌株ＪＭ１０１の表現型は１ａｃ＋から１ａＣ−に変化する。 β−ガラクトシダーゼの機能を欠くためにイソプロピルチオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）でＩＩされたＪ　Ｍ　１０１は無色の基質類縁体５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＢＣＩＧ）を分解して青色染料を与えることはでさなかった。したがって、１ａＣ−表現型のバクテリアコロニー・はぞの白色によって認識できる。クローンＥｑ−α１の３．２ｋｂ　）ｌｉｎｄｍ７５グメントはアガロースゲルから溶出し、ｅｌｕ口叶Ｄカラム、七で精製し、Ｓａｍｌで切断して脱リン酸化したｐＵｃ９４０ｎｇと約１０倍モル過イリでリゲートさせ、ついで大に菌ＪＭＩＯＩを形質転換し、０．２１１１４Ｆ１５ｆｆＢｃ　Ｉ　Ｇ。０．１７Ｉｎｇ／ａｔ！ＩＰＴＧおよび０．１１１１ｆｆ／ｄアンピシリンを含むＬＢトツブアガールに注いだ、　０．１ＷＪ／ＩＩＩｊ！のアンピシリンを含むＬ８培地５ｄ中、３７℃で１夜、白色コロニーを生育させ、プラスミドミニブレバレージョン法（２５）により挿入フラグメントをスクリーニングした。かくして得られたプラスミドをｐＡＨ５０と命名した。灸１ｚ４尤、二２王ミη−二９−１ゴ［らｙとグアー９−ニーイン、矛１ニーｚ ≦１ｐン遺伝子のＤＮＡ配列ｐＡ）４５０の３．２ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩＩ挿入体（Ｅ、　ｑ−ｒｘｌの３°２ｋｉ　）ｌｉｎｄｌｌＪフラグメントザブクローン、第３図）を、ショットガン法を用い、Ｓａｎｇｅｒ　（２３）の記載したジデオキシ法によって配列決定した。Ｉ＞ＡＨ５０プラスミドＤＮＡ６０ｍｃＯをＨｔｎｃｉｍで完全に消化１ノ、３．２ｋｂフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、上述したと同様にしてｔｉ１ｇ製した。このフラグメント１５ｍｃｇを、１４単位の７４−ＤＮＡリガーゼを含むリグ− ジョンメジウム１００ｍＣ１中、１４℃で１夜、さらに４℃で４日、それ自体とりゲートさゼた。このリグートしたＤＮＡを水浴中、２０秒パルスの超音波で計１００〜１４０秒間、小片に分割した。ＤＮＡ末端は、大氏菌ポリメラーゼエの大フラグメント（フレノウフラグメント）１５単位と、反応メジウム（５０ｍＨＴｒｉｓ−）１ｃＪ　ｐＨ７，５，１０ｄのウシ血清アルブミン；０．１ａＨｄＡＴＰ。ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）２５０ｒｎｃｊ！中、１４℃で２時間、修復した。エタノール沈殿によって濃縮したのち、この方法で前処理したＤＮＡを１％アガＯ−スグル上で弁頭し、サイズ範囲０．３５〜１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離し、精製した。このフラグメントを、Ｓａｍｌで切断し脱リン酸化したバタテリオファージＭ１３ｍｐ８の複製型（２２）と１０倍過剰用いてリゲートし、ついで大腸菌ＪＭ１０１を形質転換した。かくして得られた組換えファージの一本鎖ＤＮＡを単離し、合成オリゴヌクレオチドを結合したのち、第二鎖の合成は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメントと４種の各反応で実施した。各種組換えファージの挿入体の配列を、Ｃ，Ｐｉｅｌｅｒにより改良された５ｔａｄｅｎ　（２４）のコンピュータプログラムを用いて組合せ、全配列をめた。これを第４図に示す。１４度±−／＞９−７ｘｏ＞ｍ　負ｊ」生！ＬＬ久ｐ−、＝ンクラムダクローンＥＱ−βθ中に同定されたウマβ−イ〕／ターフエロン道伝子のサブクローニングには、Ｆ）の場合と同じ操作を用いた。ヒ１−β−インターフェロンプローブとハイブリダイズした４°５ｋｂ　ＰｒｕｌＩフラグメントを１［し、精製し、プラント末端をもつプラスミドｐＵｃ９のＳａｍ■制限部位にリゲートし、大腸菌ＪＭ１０１を形質転換した１、所望の挿入体（ｐＡＨ６ｏ）をもつ形質転換体を生育させ、このプラスミドの性質をサザン解析によりさらに正確に調べた。得られたｖ１限酵素地図を第３図に示す。２，５ｋｂ　ＨｉｎｄＩ！ＩフラグメントはＧ）と同様にサンガーのジデオキシ法を用いて配列を決定した。第８図に示した２、５ｋｂの全配列は、５２個の個々の配列から構成された。ヒトα−ＩＦＮマーカー（例り、Ｅ参照）とハイブリダイズさせたうムダクローンＥＱ−α１６からの３．３ｋｂ長ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを、プラスミドｐＵＣ８のＥＣｏＲ１部位にサブクローニングした。得られたプラスミドはｐＲＨ６３と命名した。作成した制限酵素地区（第９図）を用い、明確にされたυ１限フラグメントをＭｉ３ファージに制御された方法でサブクローニングし、ＤＮＡ配列をサンガー法によって決定した（第１０図）。Ｊ）クローンＥＱ−α２０からの　マインターフェロンのサ　クローニン　。ヒトα−ＩＦＮプローブと弱くハイブリダイズさせたうムダクローンＥＱ−α２０の２．２ｋｂ　ＥｃｏｌｌフラグメントをプラスミドｐＵＣ９のＥＣｏＲＩ部位にサブクローニングした。得られたクローンはｐＲ）−１６１と命名した（第９図）、２．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ全挿入体を単列し、サザン法によりショットガン操作を用いて（例Ｇ）ＤＮＡ配列を決定した（第１２図）。Ｋ）発現プラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ１０３の製造発現プラスミドｐａｒｐＥＲ３３に出発し、大腸内でのプラスミドの高い安定性をもたらすｌ　ｐ　ａ　ｒ　＃配列とトリプトファンプロモーターオペレーター配列を人工リポソーム結合部位とともにプラスミドベクターｐＡＴ１５３　（Ａｉｅｒｓｈａｍ）中に挿入した。ｐＡＴ１５３はプラスミドｐＢＲ３２２の短縮誘導体で、ＤＮＡの移動に必要な部分を欠いている（３６）。プラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ１０３の製造操作は第１３図に示す。プラスミドｐａｒｐＥＲ３３をＨｉｎｃｊｍで完全に、ＥＣＯＲＩで部分的に切断し、生成した０、４７ｋｂ　長のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し、生成し、ＥＣ０ＲＩとＨｉ　ｎｄｌｌ［で二重切断したｐＡＴ１５３とリゲートした。大腸菌ＨＢ１０１の形質転換後に得られ、各＠制限酵素で消化して決定された所望構造のプラスミドはｐａｒｐＡＴＥＲｌ　０３と命名された。Ｌ　ＥＱ−ＩＦＮ二且−り辺ｊＳ」画調ｌｉ！、薩１１発現プラスミドｐＡＨ５２、ｐＡ）１５２／２およびｐＡＨ５３の製造およびその予備段階は第１４図に示す。プラスミドＩ）ＡＨ５０（例Ｆ）２０ｍｃｇを３０単位のＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｃ＋ｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｍ　）で消化し、全ＥＱ−ＩＦＮ−α １遺伝子を含有する４°２ｋｂ長のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルからＤＥ８１瀘紙（ＩＪｈａｔｅａｎ　）を用いて単離し、精製した。このためには、単離すべきＤＮＡバンドの前と後でスロットを切断し、このスロットにＤＥ８１瀘Ｍ片を挿入した。所望のＤＮＡフラグメントがＤＥ８１片の前にすべて結合するまで電気泳動を続ける。後部ＤＥ’８１片は大きいＤＮＡフラグメントの混入を防止する。結合したＤＮＡフラグメントを有するＤＥ８１濾紙を低温！１！１１　（０，２ＨＮａＣ１，２５ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　ｐＨ８，０，１ａＨＥＤＴＡ）４００ｍｃＪ中、５分間、２回洗浄し、ついでＤＥ８１濾紙から高塩瑳衝液（１１４ＮａＣ１２５ｍ）ｌＴｒ　１ｓ−Ｈ（ｊｐＨ８，０，１ａＨＥＤＴＡ）２００ｍｃＪｊで１０分間を要し２回溶出し、エタノール１−で沈殿させた。Ｈｉ　ｎｄｌｌｌフラグメントの末端にはＳｐｈ■リンカーを結合させた。このためには、Ｓｐｈ　Ｉリンカ−（Ｗｏｒｔｌｌｉｎｇｔｏｎ　）０．２ｍｃｏを反応メジウム（７０ＩＨＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，６，１０ｍ）ｌ　ＭＯＣＪ２．１１０）Ｉ　ＡＴＰ。５ｍＭジチオスレイトール）１０ｒｎｃ！中、３７℃で４５分間、２単位のポリヌクレオチドキナーゼとインキュベートした。キナーゼ処理したＳｐｈ　Ｉリンカ−とＨｉｎｄＩ［［フラグメントを８単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼと４℃で２０時間開す一トした。ついで７０℃で酵素を不活性化し、ＤＮＡを総合ｆｆｉ１００ｍｃｊ中Ｓｐｈ　１３０単位で消化し、フェノールとクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。このＤＮＡをリガーゼで環化し、大腸菌ＨＢ１０１で形質転換した。所望の構造のプラスミドはｐＡＨ５１と命名した。これはＥ（１−ＩＦＮ−α１遺伝子と短縮３′非翻訳領域とさらに１個のＳｐｈ　Ｉ切ｆｇｉ部位を含有する。成熟ウマα−インターフェロンのＤＮＡ配列を最終構造内の正しい距離でプロモーター配列に結合するには、プラスミドｐＡＨ５０２０ｍｃＯをｐｖｕｍｔ’切断し、単離した０、４ｋｂ　長ＤＮＡフラグメントを出発原料として用いた。配列５’−ＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣの合成１５マーオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌをポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。これはクローンｐＡＨ５０からの成熟ＥＱ−ＩＦＮ−α１の最初の５個のアミノ酸をコードする配列を含有する。１５マーを約７ｐｍｏｌの０．４ｋｂＰｖｕｌＩフラグメントと混合し、計３４ｒｎｌ！容量中で５分間煮沸して、ＤＮＡ二重鎖を変性した。冷却後、一本船に結合したオリゴヌクレオチドブライマーを、反応メジウム（５０ＩＨＴｒｉｓ−ＨＣ１！　ｐＨ７，２，１０ＩＨＭ　Ｑ　Ｓ　Ｏ４，０、１ｍＭジチオスレイトール、５０ｒｎｃｏ／ａＮウシ血清アルブミン、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ各１ｍ１４）７０ｍＣｊ！中、３７℃で３時間、３０単位のフレノウフラグメントで処理して延長させた。残った３′オーバーハングの除去を確実にするために、ＤＮＡをついで反応メジウム＜　３３　ｍＨＴｒｉｓ −酢酸塩ｐＨ７，９，６６ａ）ｌ　ＫＡＣ，ｉＱｏｉ）１ＭＱ　（ＡＣ）２．０．５ｍＭジチオスレイトール、０．１１！９７ｄウシ血清アルブミン、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ各１ｍＨ）　１２０ｒｎｃｊ！中、３７℃で２０分間、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ１６１１位とインキュベートした。生成したプラント末端をもつＤＮＡをフェノールとクロロホルムで抽出し、０．４５Ｎ酢酸ナトリウムと２−プロパツール０．６古諺部を加えて０℃に１５分間置き、沈殿させた。たがいに相補的な２個のリン酸化オリゴヌクレオチド、すなわち１２マー５° −ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧおよび８７−５°−ＣΔＴＣＴＴＴ＾の混合物を、上記ＤＮＡフラグメントにリゲートすると、この混合物がＨｔｎｄｌｌ［切断部位と翻訳開始コドンＡＴＧを生成する。２個のオリゴヌクレオチドの１ｎｍｏｌバッチを、２Ｑｍｃｉ中、１４単位のりガーゼと４℃で４０時間、ＤＮＡフラグメントと処理してリグートし、酵素を７０℃で不活性化したのち、得られたＤＮＡを１００ｍＣＪ中、８０単位のＨｉｎｄＩＩ！および２０ｍ位のＢａＩＩｔで切断し、約１９０ｂＥＪ長のＤＮＡフラグメントを２％アガロースゲルからＤＥ８１ｖ１紙で単離し、精製した。生成したＤＮＡフラグメントを、Ｈｉ　ｎｄｌｌ［およびＢｇＪＩｒで二重切断した１）ＡＨ５１ベクター約５０ｔ＋ｏとリゲートし、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得られた６５のコロニー中、所望のυ１限パターンを有する４個のプラスミドからＨｉ　ｎｄｌ［Ｉ／ＢａｒｎＨ１ＤＮＡフラグメントを単離し、このフラグメントの配列をサンガー法で決定したところ、正確に所望の配列を有する２つのコロニーが得られた。このプラスミドはｐＡＩ−１５１／２と命名した。これは、成熟ＥｑＩＦＮα１の配列とそれに先行する翻訳開始コドンＡＴＧおよびＨ！　ｎｄＩｌ［切断部位を含有する。Ｕ二重ど二二重≧−≦≧ＣＺ４−上ミ一旦Ａト］５−一５≧旦ｊ（と−」芸１− ／きｉ２　、ゴー−千３」Ｊ盗プラスミドｐＡＨ５１／２２０ｍｅｇをＳｐｈ　ＩおよびＨ１ｎｄＩ［で二重切断し、生成した１°Ｏｋｂ長のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルがら単頭し、４゜Ｏ９のＨｉｎｄＩ［［とＳｐｈ　Ｉで二１１３１，７３所したプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ１０３（例Ｋ）とりゲート１ノだ。大腸菌ＨＢ１０１を形質転換して得られた所望溝造のプラスミドをｐＡＨ５２と命名した。これは成熟ＥＱＩＦＮ−α１の誘導性発現に必毀なすべての情報を含有する。同様に、プラスミド１）ＡＨ５２／２は、ｌ−４ｉｎｄｌｌとＢａｍＨＩで二重切断したＤＡＨ５１／２と］→１ｎｄｌ／ＢａｒｎＨＩで切断したｐａｒｐＡＴＥＲ１０３から製造された。この発現プラスミドはｐＡＨ５２より約０．２ｋｂ長く、さらに１個の３ａｒｎｔｌＮ切断部位を有する。プラスミドｐＡＨ５主立ｙ１トリプトファンプロモーター、インターフェロン遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子および複製源が一方向に並んだ、大農園で成熟Ｅ（Ｉ　ＩＮＦ−α１を製造するための実質的小さい発現プラスミドを、プラスミドｌ：）　Ａ　Ｈ５２およびｐＢＲ３２２から！Ｉｉｊ造した。ｌＱｍｃｇのｐΔＨ５２をＳｐｈ　ＩおよびＥ　Ｃ’ＯＲＩで切断し、酵素を７０℃で不活性化し、０．１５ｄのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰと２２℃で１時間にわたって処理したのち、フレノウフラグメントで末端をプラントにした。ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上サイズにより分画し、プロモーターおよびインターフェロン遺伝子を含有プる１、ｌｋｂ長のフラグメントを単離した。ｐＢＲ３２２プラスミド１１０１ｃをＥＣ０ＲＩ、ｔＪＪ：びＰｖｕ　ＴＩで二重消化し、末端を上述のようにりＬノノウフラグメントでプラントにし、ついでウシ小腸ホスファターゼで鋭！Ｊ　ン酸化した。２．４ｋｂ艮のＤＮＡフラグメン１−をアガロースゲルから単離した。かくして得られた２個のＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼでリゲートし、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。２個の［：ｃｏＲＩ認識部位が作成されたこのプラスミドをｐＡＨ５３と命名ΔＮ１ＥｑｌＦＮ−α１の遺伝子（ｐＡＨ５０）とＥｑｌＦＮ−α２の遺伝子（ｐＲＨ６３、第１１図）の高いホモロジーにより、ＥＱＴＦＮ−α２の発現プラスミド（第１５図）は、発現プラスミドｐＡＨ５２／２（例し）およびラムダサブクローンｐＲ）１６３から製造することができる。ｐＲＨ６３プラスミド２０肛すをｆ３Ｇノ■および８ａｒｎＨＩで２回切断し、ＥＱＩＦＮ−α２の６４アミノ酸以下をコードする配列を含む生成した１、Ｏｋｂ長ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離した。１０ｍｃｏのプラスミドＰＡＨ５２／２もＢＱＩ　ＩＩと［３１ｍＨＩで切断し、末端をウシ小腸ホスファターゼで脱リン酸化し、生成した２個のＤＮＡフラグメントの大きい方をアガロースゲルから得た。このＤＮＡフラグメントはプラスミドベクター成分、プロモーターおよび成熟インターフェロンの最初の６３のアミノ酸をコードする配列を含有する。以上述べた２個のＤＮＡフラグメントをリガーゼでリグートし、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。挿入体を正しい方向に含有すル（’Ｂ　ａｍＨＩ　ａ、）：びＢＯｊ！　ＩＩで切断可能）得られたプラスミドをｐΔト１５５と命名した。このプラスミドは大腸菌内での成熟ＥＱＩＦＮ−α２の発現を可能にする。！ＬＬ７ＪｉＥ、Ｑ　ｊ−王−Ｎ−＝ｚ、、　Ｂ　（７）Ｊ３　ｑ７　ｉ３．、、Ｅ、　Ｈ，、ｃ　ｐ、Ａ　Ｈ（２２）の製造操作を図式的に第１６図に示で。ｐ　Ａ　Ｈ６０プラスミド３０ｍｃｇを１５０ｍｃ７容■中、ＨＯｉＡＩ　３Ｏ単位で切断した。酵素を７０℃で不活性化したのち、３個のプライムオーバーハングＤＮＡ末端を７単位のＴ　４．　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（各１１１ＨのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ添加）により、３７℃で３０分間処理して平滑化した。Ｓｐｈ　Ｉリンカ−をプラント末端にリゲートしく例し参照）、生成したＤＮＡをｓｐｈ　ＩおよびＨｉ　ｎｃｉｌｌｌで切断した。生じた１°８５ｋｂ長のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルからＩＪｉ！し、Ｈｉ　ｎｄｌ［［およびＳｐｈ　Ｉで二重切断した５０ｎａのプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ１０３とリゲートした（例Ｋ）。大腸菌ＨＢＩＯＩの形質転換後に得られた所望のプラスミドをもつクローンをｐＡＨ６１と命名した。このプラスミドは、今後の発現プラスミドの構築の中間段階をなすものである。２０１１ＣＯのプラスミドＤＡＨ６１を３１ｍＨＩおよびＳａＪ　Ｉで２回切断し、生成した１、３ｋｂ長のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し、精製し、ＢａｒｎＨＩ／ＳａＪ　Ｘで二重消化したＭ１３１１１９ファージＤＮＡとリグートした。大ｍ菌ＪＭ１０１の形質転換後、Ｉｌｌ換えＭ　１３−ファージから一本鎖ファージＤＮＡを得ることができた（Ｍ１３ｐＡＨ６１）。この一本１ＤＮＡを、２ＱｍＨＴｒｉｓ　−ＨＣＪｐＨ８，ｏ、１０ｍＨＭＯＣＪ２の５０ｒａｃｌ中、リン酸化１５マー　オリゴヌクレオチド５’Ｇ丁ＧＡＡＣＴＡＴＧＡＣＴＴＧ　３３ｇｍｏｌと混合し、ついで９５℃ に加熱して、徐々に常温に冷却した。オリゴヌクレオチドは成熟β−インターフェロンの配列の最初のｆｆ１１から正確に結合する。１５７−プライマーから始まる一本鎖に基づく第二鎖の合成は１００１１Ｃ１容ω中、各３ｍＨのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰならびに１５単位のフレノウフラグメント添加後、２２ ℃で１時間実施した。２０１ＨのＥＤＴＡを添加したのち、ＤＮＡをフェノールとクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。残った一本鎖ＤＮＡフラグメントを反応混合物（４ｍ）ｌＺｎ　（ＡＣ）２．３０ｍＨＮａＡｃ、２５０ｍＨＮａＣオ、５％グリセリン、ｐＨ４，６）４００ｒｎｃ１中、１５０単位の８１ヌクレアーゼ（Ｓｉ井ａ）により、１４℃で２時間消化した。ＥＤＴＡを加えて反応を停止し、フェノールとクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。１２マーおよび８マー　オリゴヌクレオチド、５　’　−ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴおよび５　’　−ＣＡＴＣＴＴＴＡの混合物をＤＮＡ上にリゲ・−トし、例Ｈと同様にこの処理で末端をプラントとし、生成したＤＮＡをＨ＋ｎｄｌおよびＳｌ：ｌｈ　Ｉで切断した。所望の１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを７ガロースゲルから単離し、Ｈｉｎｄ［Ｉ［／Ｓｐｈ　Ｉで二重切断したプラスミドｐａｒｐΔＴＥＲＩ０３とリゲートした。大腸菌ＨＢＩＯＩの形質転換後、５４のコロニーが得られた。それからψ離された９つのプラスミドＤＮＡについてＥｃｏＲＩ／ＳａＪ　Ｉ　１．３ｋｂ長フラグメントを単離し、サンガー法で配列を決定した。これから得られた所望の配列を有するプラスミドを１）ＡＨ６２と命名した。このプラスミドによれば、大腸菌内において成熟ＥＱＩＦＮ−β蛋白質の効率的な発現が可能になる。成熟β−ＩＦＮ遺伝子の最初の塩基Ｇを欠失したプラスミドはｐＡ　Ｈ６２ｄｅｌｅｔａＧ　１と命名した。このプラスミドは、次のＡＴＧ　（成熟β−ＩＦＮのアミノ酸１９に相当）での翻訳開始によりアミノ末端が短縮されたβ−ＩＦＮを発現させる。この蛋白質は、短縮されない蛋白質に比べて弱いが、驚くべきことに抗ウィルス活性を示す（例Ｏ）。バクテリア培養液１００−を３７℃で激しく振盪しながら、以下に特定する６　００　ｎｉｌでの光学密度が達成されるまで以下のトリプトファンを含まないメジウム［ｒ１＃、はメジウム１１中：　（ＮＨ４）２　ＰＯ４１０ｇ、３．５ｇＫＨ２ＰＯ４（Ｎａ０１−１でｐＨ７，３にする）　、Ｎ　ａ　ＣＪＯ１５９、カザミノ酸く酸性加水分解）２１グ、グルフ−ス１１　！７．ＭｇＳＯ４１１１ＤＬ　ＣａＣ１，、Ｏ，ｉｍｐ、チアミン塩酸塩ｉＲｇ、Ｌ−システィン２０Ｗｌ、３−β−インドールアクリルＭ（ＩＡΔ、トリプトファンオペロンのインダクター）２０１ｒ１ｇ、必要に応じてアンピシリン５０〜１００！Ｉｌ！！］中でインキュベートする。ついで５分間４．０００ｒｐｍで遠心分離してバクテリアをベレット状にし、培養容量の１／１０の氷冷５０ｍＨＴｒｉｓ　−ＨＣ１ｐＨ８，０，３０ｎ＋）ｔ　ＮａＣ１に懸ｍし、氷冷シナカラ、超音波プローベ（２０ｋＨｚ　、　１００ｗａｔｔ）を用いて３０秒間、２回破壊した。細胞層を１０，０ＯＯｒｒｌｌｌ　（４℃）で１０分間遠心分離して除去し、残留物を滅菌濾過したのち、水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）または脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）の細胞変性作用（ＣＰＥ）を測定する定ｎ法でインターフェロン活性を試験する。試験系：ＮＢＬ−６細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ５７．ウマ皮膚からの表細細胞）／ＶＳＶ、およびＡ３４９（ＡＴＣＣＣＣＬ１８５、ヒト肺癌細胞系）／ＭＣＶＡ５４９に対する力価を、ヒトインターフェロン標準を用いて国際単位に標準化した。Ｈ８１０１インターフェロン活性形質転換０Ｄ６ｏｏｎ１．ｌ（中位／Ｉ！培益液）７５スミＦ　ＮＢＬ−６／ＶＳＶ　Ａ３４９／ＥＭＶＥ、／Ｊ　ＩＥ／ｊ！ｐＡＨ５２４，２１，８ｘ１０６５．２ｘ１０’ｐＡＨ５２／２　６°０２．０ＸＩＯ７、６Ｘ１０’ｐＡＨ５３５，７１□８Ｘ１０　６、２Ｘ１０４１）ＡＨ５５５，７１，２Ｘ１０９．０刈Ｏ４ｐＡＨ６２３，０１，１刈Ｏ＜１０３１）ＡＨ６２ｄｅｌｔａ　Ｇ１　２．１　４．５Ｘｉ０５＜１０３Ｈ８１２（Ｈｕ　ＩＦＮ−α２Ｃ標準＞　５．２Ｘ１０２２．６刈０４ブロスミドにコードされた蛋白質はマキシｍ胞払（３７）を用いてｉｎ　ｖｉｖｏで標識できる。大腸菌Ｃ３Ｒ６０３を常法により発現プラスミドで形質転換し、形質転換バクテリアはアンピシリン含有アガール板上で選択した。マキシ細胞の製造および蛋白質の標識はＡ、　５ａｎａｅｒ　（３７）の記載に従って実庸した。細胞は１５のインドールアクリル酸を含まないメジウム（例Ｏ参照）中、３７℃で、ＯＤ　−０，５に達するまで生育させ、この培００ｎｍ養液１０−をベトリ皿中で、紫外線殺菌ランプ（１５ｗａｔｔ）を用い５ｏαの距離から５秒間、振盪しないで照射し、３７℃で１時間インキュベーションを続けた。培養液をＤ−サイクロセリン１００ａ＋ｅｇ　／ａｔ！と註合し、３７℃ で１４時間インキュベートし、ついでバクテリアを遠心分離により収穫した。細胞をバージエイ（Ｈａｒｓｈｅｙ）塩溶液５ｍｌで２回洗浄し、２０ｍｃｇ／Ｉｄのインドールアクリル酸とともにバージエイメジウム５−中に懸濁し、３７℃ で２時間インキュベートした。各培養液に３５８−メチオニン５μＣｉ／ｒｄ　（１００Ｃｉ／ｉ　ｎｏｔ　）を加え、３７℃で１時間振盪した。細胞を収穫し、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールを含有する電気泳動プローブ緩衝液中で溶菌し、蛋白質を１５％ポリアクリルアミドゲル中で分離した。バージエイ塩溶液（１１中）：５．４ｇＮａＣ！３．０　ｇ　ＫＣｌ１．１ｇＮＨ４Ｃｚ１５ｒｙＣａＣ１−２８２００°２ＩＩｇＭ（ｊｃｌ　・６日２００、２ＨｇＦ　ｅ　Ｃ１・６　Ｈ２０８７ｑＫＨ２ＰＯ４１２、１ｇＴｒｉｓ＋ＨＣＡ’ｐＨ７、４バージエイメジウム（バージエイ塩溶液１００ｄ中）：２ｄ２０％グルコース０．５ｄ２％スレオニン１．０ｄ１％ロイシン１．０ｄ２％プロリン１．０ｄ２％アルギニン０．１ｍ！０．１％チアミン第１７図は、にｏｄａｃ　１．ａｒｉｅｘ　−Ｒｅｇｕｌａｒ　ＦＩＪｅ８フィルムを用い、ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　Ｘ−Ｍフィルムに、−８０℃で２日間露出したのちの乾燥ゲルのオ・−・トラジオグラムである。分子倒標準としては１４Ｃ−メチル化蛋白質混合物（Ａ＋＋＋ｅｒｓｈａｍ）を用いた。使用する対照は、インターフェロン遺伝子を含まず、プロモーターのみを含むプラスミドｐＥＲ１０３、およびヒトＩＦＮ−α２ａｒ０３ｍ伝子の２コピーを含むプラスミドｐＥＲ２１／１とした。約１８ｋｄにおける蛋白質バンドは、プラスミドによって発現されたインターフェロンである。クラスＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−ωのインターフェロン遺伝子と高いホモロジーを右するウマゲノム中の配列の総数の検知には、次の操作を用いた。高分子最つｖＤＮＡ　（例Ａ）３０ｍｅｇを反応容ｆ１３００ｍＣＩとＩノで相当するυｊ限酵素１００甲佑で完全に消化し、各トレー・スにこの切断ＤＮＡ１０ｅ＋ｃｇを取って０．８％アガロースゲル」二、サイズにより分割した。ニトロセルロースフィルター上にサザン１１移させたのち、ＤＮＡを変性、固定り、、各フィルターを約６Ｘ１０６ＣｐＩｌのニックトランスレーションプローブとハイブリダイズした（６５℃で１７時間、５ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハルト溶液、０．１％ＳＯＳ、変性ザケ精子ＤＮＡ２０ｍｃｏ　／ａｅ）、ＥＱ　ＩＦＮ −ａに用いたプローブはプラスミドｐＡＨ５２からの１．Ｏｋｂ長Ｈｔ　ｎｄｌＩｉ１５ｐｈＩフラグメント、ＥｑｌＦＮ−βに用いたプローブはプラスミドｐＡＨ６２からのｉ、１ｉｔｂ長）１ｉｒｌｄ１１１１５ｐｈＩフラグメントとした。いずれも全成熟インターフェロンをコードする配列を含有プる。ＥＱＴＦＮ −ωに用いるプローブはプラスミドＤＲＨ６１からの２゜１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ挿入体とした。ついでフィルターを３種のインターフェロン配列間で交差ハイブリダイゼーションを起こさないような緊縮条件下で、０．３ＸＳＳＣＣ４５ｍＨＮａＧ！、４．５ｍＨクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳで、６５℃において４５分間、４回洗浄した。オートラジオグラフィーは、にｏｄａｋ　Ｌａｎｅｘ　−Ｒｅｇｕｌａｒ増感フィルムを用い、ＤｕＰｏｎｔ　Ｃ「ｏｎｅｘ　Ｘ−線フイルム上に、−８０℃で７日間露出して実膓した。第１８図中、カラムの上に示したＭはサイズマーカー（ラムダＸＥｃｏＲＩ／Ｈｉ　ｎｄＩ［）　、Ｅ−ＥｃｏＲＩ。Ｈ−Ｈｉｎｄｌ、Ｂａ−ＢａｍＨＩ％Ｐ−Ｐｓｔｌ　。Ｂ＝ＢＯｊ！ｎである。１）イヌＤＮＡの単離凍結組織たとえばイヌ肝臓を液体窒素中で微粉末に粉砕し、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、　１０ａＨＴｒｉｓ−ＨＣｊ！ｐＨ８，０，０，５％ｓｏｓ、ｏ。１η／ｊｄプロテアーゼＫ（２０ｆｄ／を組織）中、５５℃で３時間インキュベートした。得られた粘稠な溶液をフェノール抽出、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１容）で３回抽出して蛋白質を除去し、５０　ａ＋ＨＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ８，０，１０ａＨＥＤＴＡ、１０ｎ＋ＨＮａＣ！で透析し、２倍容のエタノールでＤＮＡを沈殿させた。真空中で完全に乾燥したのち、ＤＮＡを４℃でＴＥｆｆｌ雨液（１０ｄ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ：；Ｊ！　ｐｔ（３° ０．１１１８ＥＤＴＡ）に溶解し、２０℃、４０．００Ｏｒｐｍで６２時間、溶液１−あたりｉ、２７３ｇのＣ３ＣＩとともに遠心分離した（　５ｏｒｖａｌｌ　５０　Ｔ　ｉ−ローター）０ＣｓＣｊ！勾配を滴下１ノで、ＤＮＡを含有づる分画をＴＥ緩衝液で透析し、ついでＤＮＡを２倍容の１タノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し１、乾燥し、再びＴＥ緩衝液（４℃）に溶解した。最終ＤＮΔブ１ノパレーションはＲＮＡを含まず、５０ｋｂ以上であった（０．４５％アガロースゲル上電気泳動により測定）。イヌＤＮＡ５０１１Ｃ！＋を２回、反応メジウム（１０１１８Ｔｒｉｓ−ＨＣＪｐＨ７，５，１０ｍ１４　Ｍ（ＪＣｊ　、１１１８ジチオスレイトール）４５０ｍｃオ中、５ａｕ３Ａ１°６単位と３７℃でインキュベートした。１５．２５および４０分後に、反応液の一部１５０ｍｃ１を取り、１５１ＮＥＤ丁Ａと混合[The DNA fragments give different sets (Fig. 18) ), the insert of clone ρR) 161 was named ω-interferon. (33) It is speculated that this is the result of a new scale of type I interferon. This nomenclature Type 1 interferon (IFN-γ) is easily confused with type 1 interferon (IFN-γ). It is less confusing than the nomenclature used by Capon et al. (34) for terferon. Determined plasmid p R)! The DNA sequence of 62 (Figure 31) is from paraneoplastic horses. Contains the entire coding region of the interferon gene. It is plasmid pRH6 Due to its homology with equine interferon 1 and HulFN-ω1, EQ It was named IFN-ω2. EQIFN-ω2 surprisingly shows that its mature protein It contains a fifth cysteine residue at position 86 of the protein. 21N horse ω-interface The homology between the two groups is extremely large starting from the 29th amino acid of the mature protein. High 4 cysteine residues and 78th to 80th N-glycosylation potential position (Asn-Thr-Thr) is completely maintained (Figures 31 and 32) , amino acid bombology for bovine and human β-interferon (61-7 0%) is homologous to equine α-interferon (57-60%, tertiary Figure 3). The sequence of equine β-interferon was determined in the same way as for α-interferon. It was. The longest open reading frame of the β-IFN gene is a polypeptide consisting of 186 amino acids. Homology with a variety of known β-interferons is noteworthy. As in the case of human β-interferon, three types of bovine β-interferon Interferon, rodent β-interferon, equine β-interferon , has a hydrophobic signal peptide consisting of 21 amino acids. Surprisingly, even in β-interferon, the pairwise ratio of amino acid sequences is In comparison, equine β-interferon is found in bovine (50-55%) or mouse (4%) 4%) Better than β-interferon!・β-interferon (59%) and high It shows good homology (Fig. 6). On the other hand, the unexpectedly high homology between horse and human β-interferon also Regardless, the amino acid present at position 119 of human I-β-interferon is As in the case of species bovine β-interferon, horse β-ink-feron is It's on. Equine β-interferon has two potential N-glycosylation sites in the mature protein. position 80 (Asn-G1 as in the case of Hi! and mouse β-interferon) ! u-Thr) and at position 115 (Asn-Thr-Thr). Bovine β-interferon has two possible N-glycosylation sites at position 110'. (Asn-Phe-Thr or Asn-3er-Phe) and 152nd place<ASn-Va! -3er or Asn-Phe-5er) . As in bovine and buffalo, the three cysdine groups are held in exactly the same position. (1117. 31 and 140 or in humans 141). When dog DNA was examined using the human α-gene, it was found that Several bands were found just as in the case, and from this a group of α-isomers in dogs was found. It can be inferred that there is an interfering gene. Clone C was produced by preparing phage DNA from a recombinant Hyllida dog. A restricted liver map was created from aα-11-2 (Fig. 22). 3. of this clone. 7kbsmai fragment 1 head 2. Vector 4kb Small fragment Even if subcloning into GtpucQ, microorganisms such as colon The bacterium was transformed into JM 101. Isolation of the correct phenotype allows canine - Two plasmids pA containing sequences encoding feron as inserts H2 and 1) AH4 were obtained. The sequences of the inserts in these plasmids were determined using the “shot gun method” by San Determined by the dideoxy method described by Ger (23). Insertion of stiffness Partial sequences of the body are combined to form a complete sequence using an improved computer program. (Figures 24 and 25). Longest open reading frame of both plasmid sequences 1. ! , 187 amino acids should be twisted. encodes exactly the same polypeptide consisting of an acid. Known α of thin rod ~ interface Ron and a significant ho to show a logic) 1 [valued at 1 9, protein 5! f = 1-domain sequence is exactly the same, with 3 nulls at 170j'AI in the 5' untranslated region. : Only ty-do (1.8%) differs (see 28), l., bovine and human. As in the case of the dentate α-interno9, the canine α-interno king “” Hydrophobic ↑↑-: ／　『『-Lubebu food please This is followed by an amazing 5 and kwa・I or 16111Aj Tsuba'・Mi, No acid. It has been reported that the adult Rhari white matter consists of a41 Genetic Zhang white matter distribution 3711 and comparison fade, see', canine α-interferon! if It lacks the two Ami-5 features of mature car interior quality, 119th place J5 and 120th place (2nd 6 rU). Surprisingly, the mature α-interferon is similar to the previously known α- Among interferons, it is the only α-interferon with 64 cysteine groups. , and thus the formation of three intramolecular disulfide bridges is possible. Behind these cysteine groups 1,29. The four at positions 99 and 139 are dog , are identical among bovine, mouse, rat, and human species. 86th place system The ins are Ca1FN-al, Ca1FN-α2, MuIFN-al, MuI Conserved among FN-α2, RaIFN-a and H14IFN-α0. Surprisingly, canine α-interferon has two potential N-glycosylation sites. , i.e., the 78th position (Asn-Met-Thr) and the 133rd position (, A S n -11t S -3er). The glycosylation site at position 78 is M1. J.I. Corresponds to the glycosylation site (Asn-Ala-Thr) of FN-α1 and α2 Ru. It also contains glycan at position 80 of β-interferon from humans and mice. Corresponds to the codylation site (Asn-(3iu-Thr)). Pairwise comparisons of the amino acid sequences show that canine α-interferon 52-57% with interferon, 54-55% with bovine α-ink ~ feron, 50% with rat α-interferon, 48-5 with mouse α-interferon It was revealed that there was a homology of 1% (Figure 27). The interferons of the present invention include only the mature interferons specified in detail. rather than equine/canine--these polypeptides whose IFN activity remains virtually unchanged. It should be noted that it also encompasses any modification of the code. These modifications Examples include shortening the molecule, e.g. at the N- or C-terminus, or shortening other groups of amino acids. substitution, chemical or biochemical attachment of molecules to inert or active molecules, etc. There is. Examples of the last-mentioned modifications include, for example, 1 g or more than one of the inventive compounds. Interferon and/' or known α-b+, < is β-interferon? There are hybrid molecules. Therefore, the present invention specifically provides the interferon according to the present invention as follows: Not only gene sequences, but also mutations, degeneracy, translocations, or additions can easily It also relates to modified sequences obtained by conventional methods. Interferon of the present invention (i.e. Interfero [/) that corresponds to the biological activity spectrum described in the specification] , also includes all sequences that are degenerate compared to the sequence shown. Expertise in this technical field According to experts, it is easy to create a degenerate array of IT) N A arrays in the cryptographic domain. It is. Similar V1 polypeptide with the activity spectrum of the interferon of the present invention encoded by the indicated sequence (or portion thereof) and under stringent conditions (e.g. hybridization (under conditions that select homology of 85% or more, preferably 90% or more) Also includes all soybean sequences. Hybridization was carried out in 6x SSC15x Denhardt to solution 10. 1%SD Performed in S at 65°C. The degree of austerity is determined by the cleaning process. For example, about 8 Appropriate conditions for selecting DNA sequences with 5% or more homology are 0. 2 xSSC10.01% SDS/65℃, approximately 90% or more homology The appropriate conditions for selecting a DNA/A sequence having 0. 1xSSC10,01%SDS/6 The temperature is 5°C. The interferon gene of the present invention has a high yield! J - Any organism under the conditions of can be introduced inside. Suitable hosts and vectors are available to those skilled in the art. As is well known. For example, European patent application box 0. 093° The description in No. 619 is helpful. Prokaryotes are particularly preferred for expression. For example, you can make a big deal. stocks mentioned above Apart from E. coli W3110 (F”, La111da-, prototrophic strain, ATC CNQ27325>, such as Bacillus subtilis Bacilli, as well as Salmonella typhimurium m) or Serratia 1arceseens and various types of Enterobacteriaceae such as Domonas aeruginosa can also be used. In general, all replicons containing a species-originated replicon and control sequences that are compatible with the host IO vacuoles. Plasmid vectors can be used in conjunction with these hosts. Vectors are usually In addition to replication sites, there are recognition sites that allow phenotypic selection of transformed cells. I have it. For example, large MW is usually associated with a plasmid of colonic origin, pBR32. 2 (8011var et al.: Gene 2. 95 (19 77)]. pBR322 is a gene for ampicillin and tetracycline resistance therefore, a flexible method for identifying transformed cells is available. 1) The BR322 plasmid or the BR322 plasmid further contains the bromotar itself. microorganisms (or microorganisms) containing promoters that can be used to express their own proteins. must be qualified to include the Recombinant^Most frequently used in the production of DNA The 7D motor used includes β-lactamase (benicillinase) and Lactamase. tryptophan (trp>promoter system [Go edde I and others: ! 1ue1. Aeids Res, a, 4057 (1980): EP-A-0,036,776]. These are the most common However, microbial promoters have also been developed and used. The genetic sequence of the interferon of the present invention may be derived from, for example, bacteriophage lambda. It can be used under the left promoter (P, ) 1i11111. This promoter is a strain of promoters known to be particularly strong and controllable. It is Totsu. Controlled by lambda repressor whose flanking restriction cleavage sites are known This is possible. The temperature-sensitive allele of this repressor gene contains the complete IFN-ω sequence. can be inserted into a vector. Increasing the temperature to 42°C inactivates the repressor and the promoter Expressed to maximum concentration. The total mRNA produced under these conditions is P in the synthetic ribonucleic acid, sufficient to obtain cells containing approximately 10% of the promoter origin. Must. In this way, a functional IFN sequence is placed near the liposome binding site. Next, we established clone banks located at various distances from the lambda P1 promoter. It is possible to These clones are then ticked and R high yielding clones are selected. can be selected. Expression and translation of sequences encoding the proteins of the invention can be carried out in non-transformed organisms. It can also be carried out under the control of other regulatory systems that are considered homologous. Chromosomal DNA from Tose-dependent E. coli is responsible for the secretion of the enzyme β-galactosidase. Therefore, it contains the lactose or 1aC-operon capable of degrading lactose. . The 1aCitllIgB element is a bacteriophage lambda that is infectious to E. coli. It can be obtained from piac5. The Jac-operon of that phage is the same ti It can be obtained by transduction from a bacterium sec. Adjustments that can be used in the method of the invention The system may be derived from the original plasmid DNA of the organism, 1aC- The promoter operator system can be induced by IP'D. Other promoter-operator systems or parts thereof may have similarly good effects. Can be used. For example, arabinose operator, colicin E1-operator -, galactose operator, alkaline phosphatase operator, trp - operator, xylose-A-operator, tac-promoter, etc. Ru. In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms such as culture medium R1 can also be used. Saceharomyces eerevisiae) is the most commonly used Eukaryotic microorganisms, but other 540 species are commonly found. Yeast (Sae) plasmid YTp7 [ St tncheonb et al.: Nature282. 39 (1979): Kingsman et al.: cene, 141 (1979): TSChLI n+per et al.: Gene, 71. 121-133 (197 Blasmid YR p7 is a yeast mutant strain that cannot grow in tryptophan-free medium. For example, it contains the TRP1 gene, which is a selection marker for ATCC11f144076. Ru. TRP1 deficiency as a characteristic of the yeast host genome is a powerful aid in the detection of transformation. becomes. In this case, culturing is carried out without adding tryptophan. Circumstances are positive The case of mid-YEp13 is very similar, and this plasmid carries the yeast gene LEU2. containing the LEU-2-minus mutant strain, which can be used to complement the LEU-2-minus mutant strain. A suitable promoter sequence for yeast vectors is the 5' region of the ADHI gene [A 111erer G, : oethods of [nzymo+ooy Kamidan Yu, 192-201 (1983)], 3-phosphoglycerate kinase [formerly t z　e　m　a　n　tt?:　J,　Biol,　CheIIl, 255. 2073 (19f30)] or other catalytic enzymes [Niawaski & Fr aenkel: BBRC108, 1107-1112 (1982)] For example enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexoquinar enzyme, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose 6 - phosphate isomerase, phosphoglucose, 1゛tumerase and phosphoglu] This can be achieved by constructing an appropriate expression plasmid containing 4inase. Their genes 1. 3′ of the sequence to be expressed in the expression vector iTI RNA 3) iX, which is inserted at the terminal ξ: Also, it has the advantage of being able to regulate transcription of 1'c in the growing row n. :=Tashi'-(Well, Al゛゛〕-・Dogt for Rude-=　if　2, Isoshi Tori eye-...Mu C1 nitride metabolism 1,: konhikkon) acid ri, su゛]! J′Yu・He”i2 Min FA'il FAI, above (1) li! J 1?　jly　　　　　’:i’　 'j'　E:　To-3~su', :i　Qi　i'Human-eye Gunnar Zt5 ：　Q、、'　/IMETHOS、;3YOi:'FIJJU・'、l11-'s processing The group I thread covers the M thread, and there is a region of ,'t3'; m 1B 9 L"S lid 4s i-)+j';: cJ:' , 1”’U 6E jltj, !5 B, −Sb −, =’I’] 10-ter, if we take 4, we get gene B A R1, , M ``αq, r; T-EP, S Sex Sir Tsu ■ 1~! [R b1ne Ph, D, Orgon anthropology, E u g = rle, l) r e Q On Dissertation (19'79),, 11erskol#itZ & 03 hitla: thf, 4) 1o1ecular Biology o f　the　Yeast　5aceharorayce! i, part 1, 181-2 09 pages (1981), Cotd Spring Harbor Labora tory]. These mutations affect the expression of the yeast mating type cassette. , 1 and indirectly affects mating type-dependent bromo-. While playing one stroke , generally any single layer containing a yeast-compatible 7-day motor, an original hakama, and a termination sequence. Sumid vector is suitable. Suitable for microbial IJ crabs and cultured multicellular organisms 6T + IJU cells 3. ri target 1”: la-, ￥′Ti (1 animal d・3”, bitsu IR song animal’s “4゛su”) or 61iN +347L, 4ff fi il, 1. + to B’(f’l　/1 “Ij;Ute’c!”c) B Shiga Shina 1iN 6, ￥T’h: #J J’l) i’7) jg n: JI Di’Ll (<D 4fK 30 　’j、＜　）　j7j　! ! 7ali I; i l 3fi’, everyday life Author, 98゛-゛-〕(Il) from 251: to 1° Oshiiku 11 G B1 no. Do: IJQ Advantage i-i: , I, ta#shi, + l, i(1”’use & Pal: ↑f’! T’Sl’llll j! =4: ri Tang Tang Floating ■ C, u I t u I' e, Δcati e+, +ic Prass (’l　9　’7　,!l　＞　l　+l　Iti　ylfl　’,=　;0 ) '44o'') Inn-J-II lii, q thread r7) i'/ll L'i -= fJ) kl, (4j?>'lj: l, jl,! E effectf;) Sari, I j3ii (C7, departure l!llj;=’l!llj (’, jffi” j”　’)　ifi’l　i3, f9 pa place, 1 go 1, mortar r:1　ノζ　・ヅ・ , P1′ breath Hair-′,　　　　　　　　　　　　　　　　　　-　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・°-4′8　Left,'',　7　i ”: II G ton, lj ki j A; , BORINO “゛　9,!・・・Pa、・Yoshi　fPHI)」ノ(]I I, :, U inside ′・5゛ Hiiragi withered hi” SoiJ@＊(a, ;f: ’, i” (’, Ru. 1 -(mouth [, Nouga 1 foam middle i +'lJI use・;mi[・age-5>,]・-ribe・'nozu ;Mi middle control 11) Vengeance 1i□1 is Raito Kube kidnapping? Ni?13147ノ31)i ) l41 is ", Seal, )4, lh, -,, /; ノ, U length, normal poly;'l",, ,,,, =;, + L% Deno 91' Luz 2 E! :l　4　(7)”、ノ1- 11-・～su・-1 Especially ginseng;;, 1. 1. ,') (S%〆40) 1clIrHter,- is used; 1,? ')1 , S V・i Q (7') I, I, all of them are viruses; V 40 virus copies part 4 1) Also includes ζ F-) Gumen 1- and I, +"l', notes that are easily obtained, especially useful ones. l: Fiers: Najure273. 113 (1978), 5V40 (7) small or human 75gment, if they are )l i ncjl in the virus replication site [from the cleavage site to the BQJ I cleavage site] It can be used as long as it contains a sequence with a length of approximately 250 bp. Furthermore, the desired genetic Promoter or IJJ sequences that normally bind to child sequences also have these If the control sequences are compatible with the host cell system, they may not be used or their use may be prohibited. Often desirable. The replication site may be, for example, SV40 or other viruses (e.g. polyoma, Equivalent vectors for introducing exogenous sites from Deno, VSV, PBV, etc. It may be provided by chromosomal replication or may be provided using the host cell's chromosomal replication mechanism. . The latter method is usually sufficient when the vector is integrated into the host cell chromosome. be. However, the gene is expressed in the expression plasmid rJE R103 [[. Ra5jl -DWOrk! nGa, ka: Gene2U, 237-238 (1983), 1 5t and EP-A-O, 115, 61381Kt m No. D S M 2773 No. T' December 20, 1983 B D SMl: Deposited J or Plus Expressed in mid-Dal't3ER33 (EP-・A-0,115,613) Preferably 1, all of these vectors have a high expression rate of the cloned gene. This is because it contains regulatory elements that produce. When starting from the expression plasmid D-al”pER33, the plus in the large 11Q moe “par” sequence and tryptophan promoter effective for increasing mido stability - Operator sequence and human "J-liposome binding site" 1. nce ξ−, 1・゛vek When inserted into pAT53, pAT153 shortens the transfer of DNA. three d5 (36) with the body. Plasnido 1Jarl”) RA FE　R-10,’3　il)　f’,!I　 Q　ji　2' contains plasmid D　a　p　E　R33 as shown in Fig. 13 1 1 was isolated, I'3R, EcoR1,? [-1i ndli twice The tr t ζ is combined with the pre-cut ρ Δ 153 . Transformation of E. coli HB101 1 later! ? 11. The block of the desired structure that identified L, It was named Rasumi F D a r pΔd ER103. The plasmid of l: is , Pu Sumi i'11AT153υ amazing source of phosphorus resistance gene, arc . et σ1. p a r sequence effective for stabilizing S human intestine threshold e and >! J’y; Tryptophan, which can be used for efficient expression of 'f The target region contains a liposome binding site. Expression plasmid D A H52,1) A (452/2 and pAH53 y )) Uara and (,゛zo-no:p stage) are shown in Figure 14. (made by de) Mi (1, (jl, plus nido r) A) -15 (,) lj, ・Hi Digested with nd ■ to extract all FE (4,2 A kb-long DNA fragment was isolated () and purified. The ends of the fragment were provided by Sphl linkers. Then this DNA is S Digested with phl, extracted with phenol and chloroform, and precipitated with ethanol. Ta. The DNA was circularized with ligase and transformed into E. coli HB101. Desired 6-piece The plasmid was named DAH51. This is due to E (IIFN-α1 gene and Contains a shortened 3' untranslated region and an additional Sphx cleavage site. The DNA sequence of adult horse α-interferon was inserted into the promoter sequence in the final structure. In order to connect at the correct distance, cut plasmid pAH50 with Pvull. A 0.4 kb, I-length DNA fragment isolated from the laboratory was used. Sequence 5'-TGT A synthetic 15-mer oligonucleotide with GACCTGCCTCAC was Phosphorylated with cleotide kinase. This is the mature EQ from clone pAH50 A 15-mer containing the sequence encoding the first five amino acids of IFN-α1 0. Mixed with 5kb PvuI fragment to denature the DNA duplex. − The oligonucleotide primer attached to the terminal strand is extended with a Klenow fragment. Ta. To ensure that the remaining 3' overhang is safely removed, A was followed by incubation with T4 DNA bolimerase. with plant end The generated DNA was extracted with phenol and chloroform and precipitated. each other two phosphorylated oligonucleotides complementary to, i.e., 12-mer 5'-^G CTTAAAGATG and 8-mer 5'-CATCTTTA (European) Patent application 83112812. 9) to the DNA fragment. I gated it. This mixture contains the HindI [I cleavage site and the translation initiation codon ATG It produces. Both oligonucleotides are ligated to the DNA fragment using ligase. Matched. After inactivating the enzyme, the resulting DNA was incubated with Hindll [and B After gJIr cleavage, a DNA fragment approximately 190 bp in length was isolated and purified. The purified DNA fragment was 2m cut with Hindll and F2O31N. Escherichia coli 1-(B101) was transformed by ligating with the obtained pAH51. Out of 65 colonies, 1 out of 4 plasmids with the desired 11 restriction pattern was selected. 1indl/BamHI DNA fragment was isolated, and this DNA fragment was The samples were sequenced using the Sanger method. The two hook glues []-n showed the desired alignment completely. . This plasmid was named pA)151/2. This is mature EQ I FN- The sequence encoding α1 and the start codon ATG preceding it! 5 and) (in Contains the dIILIJ cleavage site. To prepare expression plasmids pAH52 and pAH52/2, the plasmids pA) 151/2 was cleaved twice with Sph I and Hindlf to generate A 1°Okb long DNA fragment was isolated from 7 galose glucose and Plasmid par p'ATER10 cut with II and 5phI Combined with 3. Plasmid with desired structure obtained by transforming E. coli HB101 The code was named pAH52. This is required for the inducible expression of mature E (IIFN-α1). Contains all relevant information. Similarly, plasmid pAH52/2 is Htnd pAH51/2 and HindI [[/Bam Prepared from pa rpATERl 03 cut with HI. This expression plasmid is about 0. 211b is longer and has a unique BamHI cleavage site. Ru. tryptophan promoter, interferon gene, ampicillin resistance gene Mature EaIFN-α1 is produced in WA bacteria, where the genes and replication sources are aligned in one direction. Substantially smaller expression plasmids for Prepared from BR322, pAH53. pAH52 as Sph I and E Cut with CORI and inactivate the enzyme at 70°C, dATPSdGTP. Add dCTP and dTTP with Flenow fragment to close DNA ends. I made it into a plant. DNA fragments were fractionated by size on a 7-gallose gel. , a 1.1 kb long fragment containing the promoter and interferon gene. isolated. p8R322 was double digested with ECORI and PvuII and the terminal The ends were planted with Flenow fragments as described above and then implanted with bovine small intestine. Dephosphorylated with sphatase. 2. The two DNA fragments thus obtained were 4kb. The fragment was ligated with T4DNA ligase, and E. coli HBIOI was transformed. The plasmid thus obtained, in which two EC0RI-rich sites were constructed was named pA)153. EQIFN-α1(pA)-t50) and E(IIFN-α2(pRH63, No. Because of the high homology of the gene that needs The lasmid was generated using the expression plasmid pAH52/2 and the lambdazab clone pRH63 ( From Fig. 15), m tJ can be obtained. In the region encoding mature interferon, common There are only two base differences between the normal f3o and ■ sites, but these differences are due to degeneracy. Since there are no amino acid differences due to amino acid codons, the expression plasmid pAH5 The first part of the EQ[FN-α1 gene in 2/2 also expresses EQIFN-α2. Can be used. pR863 was cut twice with BC) I II and BarnHfr ib, E 1, Okb, which has a sequence that covers QIFN-α2 from the 64th amino acid The long-form I'JA fragment was isolated from an agarose gel. pAH52/ 2 is also BQi! Cut with TI and BamHI, and remove the ends with bovine small intestine phosphatase. Phosphorylate the larger of the two resulting DNA fragments into an agarose gel. Separated from. This DNA fragment contains part of the plasmid vector and the promoter. - and the sequence encoding the first 63 amino acids of mature interferon. have The above 2@ DNA fragments were ligated with ligase, and E. coli HB 101 was transformed. Contains the insert in the correct orientation (BarnHr and B (Can be cut with QJ II) The obtained plasmid was named pAH55. This program The lasmid allows expression of mature Eq[FN-α2 in E. coli. To produce an expression plasmid for EQIFN-β, first start from plasmid pA)160. Uma D N A! Shorten the 3' end of the i-injection body and then convert this into mature EQIFN. The -β protein was engineered to be expressed using a bacterial promoter. Operation first pAH60 was cleaved with l-1iAI, as shown schematically in Figure 6. inactivate the enzyme Afterwards, the 3'-overhanging DNA ends were treated with 74 DNA polymerase (dA (added TP, dGTP, dCTP, dTTP). this plant Sph I linker is ligated to the end, and the generated DNA is linked to sph I and and Hindll [. The generated 1.85kb long (7) DNA fragment The components were isolated from a 7 gas D-gel and double cut with Hindlff and 5t)h1. It was ligated with the cut plasmid parPATER103. Escherichia coli HB101 The clone containing the desired plasmid obtained after transformation was named pAH61. . This plasmid constitutes an intermediate step in subsequent expression plasmid construction. pAH 61 to 3arnH [and Sai! Cut twice with I and generate a 1.3kb long DNA fragments were isolated from agarose gel, purified and BamHI/Sal It was ligated with M13a+p9 phage DNA double-digested with I. Escherichia coli JM After transformation of 101, the recombinant M13 phage (M13pA) 161) Stranded phage DNA could be obtained. This terminal strand of DNA is phosphorylated into a 15-mer. Oligonucleotide, 5'-GTGAACT, confused with GACTTG, 95°C The mixture was heated to a temperature of 100 mL and gradually cooled to a conventional temperature. Oligonucleotide is β-interfero binds exactly to the first base of the sequence. 157--Single starting from primer Second strand synthesis based on dATP, (jGTP. This was done by adding dCTPSdTTP and Rishinonou fragment. DNA Extracted and precipitated. The remaining 1 DNA portion was digested with Sl-nuclease. . 127- and 8-mer oligonucleotide, 5'-^GCTTAAAG^T A mixture of G6 and 5'-CATCTTTA was pre-plant-terminated in D. Regut onto NA using this process and transfer the generated DNA to Hir+cjlllla5. and Sr>hI. DNA fragment of desired length 1°1 kb is agaro-transferred. Plasma isolated from the base gel and doubly cut into @ir+dll115phI It was regrouped with SUMIDO parpATER103. Transformation of E. coli HB101 54 colonies were obtained. 9 plasmid DNAs single-headed from them From A to EeoRI-/Sai’! 1. 3kb77/ment was isolated and Sangha The sequence was determined using the -method. The obtained plasmid containing the desired sequence is DAH It was named 62. This plasmid can efficiently express mature ECIIFN-β protein in E. coli. Ru. A plasmid lacking the first base (G) of the mature βIFN gene was transformed into pAH. It was named 62deftaG1. This plasmid contains the following ATG (mature β-I β truncated at the amino terminus by initiation of translation at amino acid 19 (corresponding to amino acid 19 in FN) - Allows expression of IFN. This is surprisingly more significant than the non-truncated protein. Has inferior antiviral activity. Plasmid 1) AH52, pAH52/2, pAH53, pAH55 or pA To clarify the expression of interferon activity by E. coli HB101 containing H62 To do this, the bacteria are incubated in a suitable culture medium and then lysed. , first drain the supernatant! and then the 11-cell degenerative effect of VSV or EMCV ( Interferon activity was tested by the method of measuring CPE). For this purpose, water NEL-61QIIa (ATCCC Cl27, Tsuv [Skin F3 color (1) Epidermal tAmJ5J: and/or encephalomyocarditis Wi A549 (ATCCCCCl2 Ta. The results are shown in Example O. Detection of expressed equine interferon was performed by labeling the protein in maxi cells. Ta. Plasmid-encoded proteins can be detected in vivo using the maxi cell method (37). can be selectively labeled. E. coli strain C3R603 (CGSC58 30) [F”　, thr-1゜1euB6, prOA2, phr-1, reCA l, ar(:lE3, th i-i, uvrAe, ara-14, ac Y 1, Q a IK 2, XVI-5, mtj-1, oyrA98 (na jA98), rpsL31, tsx-33, λ-1supE44] were exposed to UV irradiation. There is no mechanism to repair the DNApJ damage caused by the injection. bacterial chromosome t1i, but it is a relatively short plasmid that exists in several cells in each cell. A portion of DNA is irradiated with ultraviolet rays of millimeters, which prevents functional damage. be disabled All remaining proliferating H8 cells were killed with the antibiotic D-cycO serine, and endogenous m Once the RNA has disappeared, only the plasmid-encoded gene remains in the cell. The resulting protein was radiolabeled, and 35s-methionine was introduced into the protein. more detectable. Large mmcsR603 was transformed with an expression plasmid using a standard method. , transformed bacteria were selected on ampicillin-containing agar plates. Maxi cell conditioning A, protein labeling was carried out as described in A, 5Anear (37). No. Figure 17 is an autoradiograph of the dried gel. 14cm methylated protein mixture (^mersham) was used as the molecule ff1411. The control used was Plasmid pER10 containing only promoter and no interferon gene 3 and plasmid pER containing two copies of the human IFN-a2arg gene. It was 21/1. A protein band of approximately 18 kd was generated by these plasmids. It is a newly developed interferon. Interferon genes of classes IFN-α, IFN-β and IFN-ω In order to detect the total number of sequences in the horse genome that show strong homology, it is necessary to Completely digest the DNA with appropriate restriction enzymes and separate the cut DNA by size. did. DNA was Southern-transferred onto a Nido-O cellulose filter, denatured, and fixed. Each filter was then hybridized with the nick-translated probe. Ta. 1 from plasmid pAH52 to EQIFN-α. Okb length Ht ndl [ I/Sph 17 fragment and EalFN-β of plasmid I) AH62. 1. Using the lkb-long Hindl [[/SDh I fragment as a probe] Ta. Both contain sequences encoding the entire mature interferon. EQIF In the case of N-ω, 2. from plasmid pR861. 1kb EcoRI insert Used as a probe. The filter was then treated with these three types of interferon. Washed under stringent conditions to prevent cross-hybridization between sequence sequences. did. Autoradiography odak Lanex-Regular -8 on DuPont Cronex Xn film using jll-sensitive film. The fruit was grown at 0°C for 7 days. The results are shown in FIG. Surprisingly, the horse genome , at least 7 genes of the IFN-α class, at least 7 genes of the IFN-β class 2 genes, and at least 8 genes of the IFN-ω class was made into For the preparation of expression plasmid pRH100, plasmid DE R103 [[:v a　Dworkin　-Res etc.:　Gene21 (1983), 237~ 248; EP-Ao, 115-613] with restriction endonuclease Hi It was linearized with dl[[ to remove the 5' terminal phosphate group. This plasmid DNA was converted into phosphorylated oligonucleotide d (AGCTTAAAG ATGAGCT) and d (CATCTTT8) and ligated. Li The gauze reaction solution was digested with restriction endonuclease Sac I, and T4-PNK was added. I rebooted. The oligonucleotide is 2 hagi in EP-A-0,115-613. Adjustments were made in the same manner as in . Add compatible E. 1)-1b101 to this ligase reaction solution and ink. It was incubated. Among the generated bacterial colonies, 12 were randomly selected and observed on a microscopic scale. The plasmid was isolated [Birnboim & Doly: Nuel, 8eid Res, 7 (1979) 1513-1523], restricting the obtained DNA Cut with endonuclease 5aci and transfer the DNA to agarose gel lasmid. B. A caries in the CI area was confirmed. Any one of these plasmids Selected. E. coli H8101 again with DNA from related minipreventions. Transformed. Colonies are selected from the generated transformed bacteria and scaled. was grown and grown. Then the plasmid isolated from 11Jri1 end Cut with nucleases EC0RI and Bamt-II and transfer the DNA to 1% agarose. The small fragments were isolated from the gel by electroelution. About this Sanger sequence of 460bp EcoRI-BamHI DNA fragment [F, Sanger et al.: Proc, Natl. ^cad, set, (1977) 5463-5467), The lasmid was named 1) RHloo. For [R of expression plasmid pAH4/2, plasmid pRH100 was injected with restriction enzyme B. Complete cleavage with amHI followed by 5' terminal phosphate residue with bovine intestinal phosphatase. (CIP). Plasmid pAH4 was digested with BamHI and the entire sequence encoding Ca1FN-α was extracted. Including 0. A 6 kb DNA fragment was isolated and purified. This 0. 6kb DNA fragment linearized with BamHI (pR) (100 Ligate with vector DNA and transform compatible E. coli HB101. , was sprayed on LB Agar. From the resulting bacterial colonies, plasmids were isolated on a microscopic scale, and each The properties were investigated by restriction analysis using the a enzyme. interferon gene and tripe The plasmid containing the Tophan promoter in the same orientation was named pAH104. (Figure 28). This plasmid is the final expression platform for mature CaIFN-α. It constitutes an intermediate stage in the production of sumid. 0.0 from plasmid pAH4. The 6 kb long BamHI fragment was converted into EP-A Synthetic oligonucleotide (5'T GCCACCTGCC-CGAC). This 15-mer oligonucleotide is a sequence encoding the N-terminal 5 amino acids of mature canine α-interferon. Contains. When a DNA solution is heated and then cooled, the oligos present in large excess are removed. The nucleotides bind to complementary sites on the DNA-terminal strand. The second strand was then synthesized starting with the bound oligonucleotide primer. The remaining Single-stranded DNA portions were removed with S1 nuclease. Digest the obtained DNA and The cells were separated by electrophoresis. A DNA fragment approximately 300 kb long isolated and purified. Plasmid pAH104 was digested with 3aci and injected with Tarenow polymerase and ink. tube to plant the DNA ends. Partialize the obtained DNA with psti The DNA was cut and separated by electrophoresis, and 7 fragments of 4.3 kb in length were isolated. , purified. The generated DNA was diluted with the aforementioned 0. It was ligated with a 3 kb long DNA fragment. E. coli HBIOI was transformed with this ligase reaction solution, and ampicillin-containing Sprayed on LB Agar. Place the generated bacterial colony on a new Agar plate and place it on the Agar plate beforehand. Transferred in duplicate onto a nitrocellulose filter placed on a plate. incubation After washing, the bacteria were removed using the Grunstein & Hogness method [8°Gr. unstein & D, Hooness: Proc, ) latl, 8 cad, After lysis and denaturation according to Sci. UsA (1975) 2, 39611, the DNA was bound to nitrocellulose. Cell debris was removed. Then, the filter 32pa recognition oligonucleotide d (TGCCACCTGCCCGAC”) and Ibridized filter is made of Kodak X-orr+at regular fabric. Five-sensory film dak X-omat S Exposure to X-ray film at -80℃ I put it out. Positive hybridization of plasmid DNA into autoradiograms The bacterial colony that produced the signal was isolated using the miniprevention method. I let go. The plasmid was completely cut with Hindll and 3am)-II. . After separation by electrophoresis in agarose gel, 0. 5kb length limit fragment The cells were isolated and subjected to DNA sequencing analysis using the Sanger method. The plasmid with the T designation was named pAH4/2. This matures in E. coli CaI can express FN-α. For the production of plasmid oAH4/3, for intrabacterial expression of CaIFN-a, The number of copies per all cell is 1 lasmid pAH4/2. Improved plasmid vector with high plasmid stability 1) arDATER1 It was subcloned into 03. DAH4/2's 0. 5kb long Hindl [[/BamHI fragment] l i ndll [and cut with BamHI, gel-purified plasmid vector p It was ligated with arpATER103. Riga-competent E. coli HB101 The transformant was transformed with the enzyme reaction solution and spread on plates. Randomly select 6 cells from the generated bacterial colonies and examine the plasmids microscopically. isolated on scale. After restriction analysis with various restriction endonucleases, the desired The plasmid containing the structure was named 1) AI-t4/3. Infection with E. coli H8101 containing plasmid pAH4/2 or pΔF (4/3) To detect the expression of interferon activity, incubate in a suitable culture medium. After lysis, the bacteria were lysed, the supernatant was sterilized, and the cytopathic action of VSV was removed. Interferon activity was tested using the CPE method. vesicular stomatitis Δ-72tIA cells (ATCC CRL1) pre-infected with virus (VSV) 542, Canine HQ') was used. The results are listed in Example K. High homology with interferon genes of classes IFN-α and IFN-ω To detect the total number of sequences in the dog genome that have The DNA was completely digested with restriction enzymes and the cut DNA was amplified by size. Nito DNA After Southern transition, denaturation, and fixation on cellulose filters, each filter was It was hybridized with a nick-translated DNA probe. Probes for Ca1FN~α include the entire interferon-encoding sequence. Plasmid 1) 0.0 from AH4. 6kb length 13amH! using fragment Ta. As a probe for EQIFN-ω, 2.1 kb of plasmid pRH61 EcoRIII\i integrant was used. The hybridized filters were then washed under stringent conditions. auto radio The graphics are Kodak Lane on DuPont Cronex X-ray film. The test was carried out at -80°C for 7 days using x regular sensitized film. The autoradiogram (Figure 29) shows the presence of the same α-intercept in the dog genome. Separate from the two genes encoding ferons, other species have a single interferon gene. It shows high homology similar to CaIFN-α1 that occurs within Roncras. sequences cannot be detected. In the case of EalFN-ω, the DNA has a low degree of stringency. At least one gene can be detected under the above conditions, and this is the canine α-interface described above. Different from Elon. Transformation of 111 cells with a vector can be accomplished in a number of ways. For example, Using lucium, cells were washed in magnesium and suspended in calcium. Adding DNA or subjecting the cells to a co-precipitate of DNA and calcium phosphate This can be done by For gene expression of the sequence selected for transformed cells Transfer cells to medium. After transforming the host, gene expression and fermentation or cell culture are performed using the protein of the present invention. The product is usually separated by known chromatographic separation methods. containing proteins with or without leading and trailing sequences You get quality. The interferon of the present invention can be expressed with a leader sequence at the N-terminus. (pre-IFN), which is removed in some host cells. Otherwise, the leader polypeptide, if present, is necessary to obtain mature IFN. must be removed. Alternatively, IFN clones can be directly converted into mature proteins instead of pre-1FN in microorganisms. It can also be modified to produce In this case, the enzyme-conjugated pheromone MF-α 1 precursor sequence for correct maturation of the fusion protein and growth medium of the product. or to ensure precipitation into the periplasmic space. Functional or mature IF The DNA sequence of Based on the biological spectrum of activity (after the psin-like cleavage site (L)/S-Arg) Therefore, the novel interferon of the present invention can be used with known interferons. Used for any treatment. These treatments include, for example, herpes, virus, equine/canine abortion virus, various cancers, etc. New interferon alone or in combination with other known interferons or other biologically active substances. For example, it can be used in combination with IFN-α, IL-2, other immunomodulatory substances, etc. The interferon of the present invention can be used to treat group 11 tumors or when antiviral treatment is required. It can be administered orally if an immunosuppressive state is present. Administration B and The ratio for use is similar to that currently used in clinical trials of IFN-α substances, even if Approximately 18 (1-10) XIO6 units, 5X10 per day for products with a purity of 1% or more Maximum of 7 credits. For example, substantially the present invention produced by bacteria In the conventional dosage form with homogeneous IFN, when administered parenterally, IFN-ω3IFj is % animal serum albumin preferably dissolved in horse/dog serum albumin 25d . This solution is then passed through a sterile filter and the filtrate is placed into 100 vials. distribute. Each vial contains 6x106 units of pure IFN suitable for parenteral administration do. Preferably, the vials are stored under refrigerated conditions (-20°C) until use. Main departure For example, a substance of the invention can be used by mixing a polypeptide of the invention with a pharmaceutically acceptable vehicle. By combining them, a pharmaceutically useful composition can be obtained by formulating it by a known method. Ru. For conventional vehicles and their formulation, see [, l, 1artin, Re The description of mington's Pharmaceutical Sciences is It's helpful. The interferon of the present invention can be mixed with a variety of vehicles and delivered to patients. The pharmaceutical composition is suitable for effective administration. They should be administered by a casual route. is preferred. The present invention provides for the first time equine and canine interferons and their It became possible to obtain the encoding gene sequence. In particular, the present invention protein: Equine α-interferon substantially free of other proteins of animal origin a substantially pure form Contains no natural glycosylation Contains one leader peptide amino acid sequences of set 1, ■ or ■ or biologically active variations of these sequences; Contains different substances One that can be produced by the method of the present invention; Equine ω-interferon substantially free of relaxation proteins of animal origin a substantially pure form Contains no natural glycosylation Contains one leader peptide a set of ■ or ■ amino acid sequences or biologically active variants of these sequences; Contains Can be manufactured by the method of the present invention Equine β-interferon substantially free of other proteins of animal origin a substantially pure form Contains no natural glyphsylation Contains one leader peptide Contains a set of amino acid sequences or biologically active variants of these sequences Can be manufactured by the method of the present invention Canine α-interferon substantially free of other proteins of animal origin a substantially pure form Contains no natural glycosylation Contains one leader peptide Containing amino acid sequences of Formula V or biologically active variants of these sequences Can be manufactured by the method of the present invention DNA sequence: Sequence encoding EqIFN-α One plasmid pLJc9 or pLIc8 Hlndll [or ECOR1g A sequence encoding EOIFN-α inserted into the J site or a shortened version of these sequences Heavy mutant-plasmid [)AH50 One plasmid pRH63 One plasmid pRH82 One plasmid pRH83 - Plasmids under stringent conditions exhibiting homology of 85% or more, preferably 95% or more. pAH50 or 1) RH63, pRH82 or pRH83 insert and Sequences encoding hybridizing EQIFN-α or degenerate variations of these sequences variant - capable of replicating in microorganisms, preferably prokaryotes or eukaryotes and mammalian cells; A sequence encoding EQIFN-α or these sequences contained in a functional expression vector. Column degenerate mutant DNA sequences of set 1, ■, ■ or ■ or degenerate variants of these sequences -EQIFN-sequence encoding ω - EQ inserted into the EC0RI cleavage site of plasmid DLJC9 or pUc8 Sequences encoding IFN-ω or degenerate variants of these sequences -Plasmid pRH61 One plasmid pRH62 - Plasmids under stringent conditions exhibiting homology of 85% or more, preferably 95% or more. EQIFN-ω that hybridizes with the insert of pRH61 or pRH62. coding sequences or degenerate variants of these sequences Replicating in a microorganism, preferably a prokaryotic or eukaryotic and mammalian cell Sequences encoding EqIFN-ω contained in possible expression vectors or these Degenerate variants of sequences The DNA sequence of the set TV or ■ or a degenerate variant of this sequence -EQ I Sequence encoding FN-β - Hindl of plasmid pAH60 [ [EQ I FN-β-encoding sequence or these sequences inserted into the cleavage site] Column degenerate mutant One plasmid pAH60 - Plasmids under stringent conditions exhibiting homology of 85% or more, preferably 95% or more. The sequence encoding EQIFN-ω hybridizes with the insert of pAH60. or degenerate variants of these sequences. - capable of replicating in microorganisms, preferably prokaryotes or eukaryotes and mammalian fatty meat; A sequence encoding EqIFN-β or these sequences contained in a functional expression vector. Column degenerate mutant A set of DNA sequences or degenerate variants of this sequence - encoding Ca X FN-α sequence - )-1i n d ■ cleavage site of plasmid pAH2 or ρΔH4 Sequences encoding Ca1FN-α or degenerate variants of these sequences inserted into -Plasmid DAH2 One plasmid oAH4 - Plasmids under stringent conditions exhibiting homology of 85% or more, preferably 95% or more. Ca i FN- that hybridizes with the insert of pAH2 or pA)-14 α-encoding sequences or H'I variants of these sequences - microorganisms, preferably prokaryotes Contained in an expression vector capable of replicating in living organisms or eukaryotic and mammalian cells. Sequences encoding CaIFN-α or degenerate variants of these sequences The DNA sequence of set V or a degenerate mutant of this sequence can be transformed into a host organism. -EQIFN-Gene information encoding α, ω or -β or Ca IF A transformed host organism, preferably a prokaryote, containing genetic information encoding N-α eukaryotic or complement cells, especially E. coli or E. coli JMIOI 1. Genetic information of the protein of the present invention is transferred into a vector that can be multiplied in a host organism. Transformed host organism plasmids containing -Plasmid pAH50! -4.2kb long D cut at 1tndm The NA fragment was combined with a Soh I linker and cyclized after cleavage with 3ph I. Plasmid DAH51 characterized by -0.0 of plasmid pAH50. 15 mer from 4kb long pvuu fragment In the presence of oligonucleotide primer 5'TGTGACCTGCCTCAC After the transformation, it was extended with the Frenow fragment and the oligonucleotide complex was created. 5°AGCTTAAAGATG 3’A　T　T　CT　AC　AC I re-installed Hindlt18 and 13g! ! Flag obtained by cutting with If into the Hindnl/Bhgj'll cleavage site of plasmid pAH51. , Part 1: A protein characterized by containing a large fragment in place of a large fragment unique to lasmids. Partially cut with lasmid pAH51/2-ECORI and HindlI [ of plasmid parpER33. /1. 7kbJ% DNA fragment Inserting into the EcoRI/HindI [l cleavage site of plasmid pAT153] Expression plasmid parpΔTEER103-plasmid parp characterized by f(ir+dll/BamHI cleavage site of ATER103 has its own small f(ir+dll/BamHI cleavage site) 1. of plasmid pAH51/2 instead of the plasmid pAH51/2. Okb length Hi ndI [ Expression plasmid pAH characterized by inserting the [/BamHI fragment 52/2-Plasmid I) Hindn[15phIFJ plasmid pAH51/2 in place of its own small fragment at the J cleavage site. An expression platform characterized by inserting a Hindl [[15chl fragment] Sumido DAH52 -2 of pBR322. The 4kb long EcoR1/PvuTi fragment was was linearized and dephosphorylated with the pAH52 fragment. Plasma the 1kb long EcoRI/Sph I fragment with the Frenow fragment. An expression plasmid pA characterized in that it is ligated with a fragment that has been terminated at an end. H53 1. of one plasmid pR863. Okb long BCIII/BamHr fragment and the small F3QI II/BamH! specific to plasmid pA)-152/2. Hula plasmid 1) Expression characterized by insertion into AH52/2 Plasmid pAH55 - Plasmid 1) Cut AH60 with HIAI and create T4-D It is granulated with NA polymerase, combined with Sph I linker, and then) lin 1.85 kb long DNA fragment obtained by cutting with dl [and Sph I] plasmid parpATER103 Hiridl[l/SDhl cutoff a fragment that is inserted into the cut site in place of its own small fragment. Lasmid pAH61 Barr! of one plasmid pAH61! -11/Saj I. 1. M13mp9-, which is 3kb long and double digested with BamH1/SalN M131) AH61 characterized by ligating with phage DNA -15mer, pAH made double-stranded using S’GTGAACTATGACTTG The 61 fragment was treated with S1 nuclease to form an oligonucleotide complex. 5'^GCTT^8AG^TG 3'8TTTCTAC and cut with Hindllf and 5phI to create plasmid oarpAT. A small fragment unique to the plasmid is inserted into the Hindll[/Sphl cleavage site of ER103. Expression plasmid pAH62 characterized by insertion in place of fragment one oligonucleotide complex S’AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTA3’ATTTCTAC TCGAGTAGAAATTCGA plasmid E) ER103 11indI [Expression plasmid o RH10 characterized by being inserted into the cleavage site Coding Ca1FN-α1 into the Bam)IItU cleavage site of one plasmid pRH100. Plasmid pAH104 characterized in that it contains a sequence that - The sequence encoding mature CaI FN-α1 was added to the plasmid DAH104. An expression plasmid characterized by being inserted into a runt-terminated 3acl cleavage site. Do1) AH4/2 Hindll[/Barnl-117 fragment of plasmid pAH4/2] , 0. The 5 kb length was extracted from plasmid parPATER103 with HtndI[[/B Expression plasmid DAH4/3 characterized by being inserted into the amHl cleavage site Regarding. In addition, the above-mentioned plasmid production method knee plasmid pAH50 @t ndl[[Cut with 4. Add 3ph I linker to 2kb long fragment The resulting plasmid was ligated, cut with SphT, and circularized with DNA ligase. So big [5)-! B101 is transformed, cultured, and replicated. Lasmid E) Manufacturing method of AH51 One plasmid oA)-150 was cut with pvu[0. 4kb long fragment 15mer oligonucleotide primer 5°TGTGACCTGCCTCAC The primer bound to the -terminal strand was extended with the Flenow fragment. If there is a 3゛ overhang, remove it and make the oligonucleotide complex 5゛. GCTTAAAGATG 3’A　T　T　CT　AC　AC and the resulting DNA fragment was treated with Hindl and BOJm. After digestion with υ1 endonuclease, Hindl of plasmid pAH51 [[/804! Insert in place of the large fragment specific to the IIl cleavage site. The resulting plasmid was used to transform E. coli HBIOI for replication, and cultured! lsu A method for producing plasmid pAH51/2 characterized by -H1ndI[[] and EcoRl partially cut plasmid par 0. of pER33. The 47 kb long fragment was converted into EC0RI by ligase reaction. and Hindl [[Plasmid 1 linearized by restriction endonuclease digestion with E. coli HBIOI was inserted into AT153 and the generated plasmid was used for replication. Production of plasmid parpATER103, which can be transformed and cultured Manufacturing method - HindII/BamHI fragment of plasmid oAH51/2, 1. O kb length from Hindnl/BamHI cleavage site of plasmid parpTER103 The resulting plasmid was inserted in place of the position-specific small fragment and used in E. coli HB. 101 for 'a production (transformation and cultivation) Method for producing pAH52/2 - Plasmid pAH51/2 HindI [[/Sph I fragment] It is fixed at the HindI[[/Sphl cleavage site of lasmid parpATER103. The resulting plasmid was inserted in place of the small fragment of E. coli HB101. An expression plasmid pAH5 characterized in that it is transformed and cultured for replication. 2 manufacturing method -2,4 kb long ECORI/PVuI [7 fragments The end of the plant is dephosphorylated with Flenow fragment. EcoRI/Aph I fragment of plasmid pAH52, i, ikb and E. coli HB101 with the generated plasmid? ! Made for Method for producing expression plasmid pAH53, characterized by transforming and culturing BO,jT[/BamHI fragment of plasmid pRH63, 1. Okb The length is a small BgJ specific to plasmid pAH52/2! IF/BamHI flag Insert it in place of the plasmid and use the generated plasmid to grow E. coli HB101 for replication. A method for producing expression plasmid pAH55, which comprises transforming and culturing the expression plasmid pAH55. One plasmid pAH6 ([1-(ai A It'i), T4 DNA polymer Sph J linker was added, and then HindIII and HindIII were used. A 1.8 kb long DNA fragment obtained by cutting with Sph I was added to Hindll of Mid Darp A Ding ER103! /Sph l Small specific to the cleavage site Instead of the fragment, insert it into - and use the generated plasmid to infect E. i. Expression plasmid pAH61 characterized in that it is transformed and cultured for replication. Method for producing - 1. of plasmid DAH61. 31tb length 8amHI/Saj I The fragment was digested with BamHI/SaJI double-digested M13rnl)9-fragment. E. coli JM101 was transformed for replication and cultured. A method for producing M13pAH61, characterized by -M13pAH61 was cloned using 157-5'GTGAACT^TGACTTG. Full-stranded, treated with S1 nuclease, oligonucleotide complex 5’AGCTTAAAGATG 3′^TTTCT^C The fragment cut with Hindu and Sph I was added to the plasmid. I) art) ATER103 no Hi ndllll/SDh Il, IJ location E. coli HB10 with the generated plasmid inserted in place of the unique small fragment. An expression plasmid pAH characterized by transforming and culturing 1 for replication. 62 manufacturing method One plasmid 1) The SacIt7J cleavage site of AH104 is used as the plant end, and this A sequence encoding mature Ca I FN-C1 was inserted into the resulting plasmid. A platform characterized by transforming and culturing Escherichia coli HBIO1 for replication. Method for producing Sumid pAH4/2 - BamHI fragment of plasmid pAH4 0. 6kb oligonucleotide primer 5’ TGCCACCTGCCC GAC, synthesize the second strand using the Freneau fragment, and use the remaining The main strand was removed with S1 nuclease, the DNA was excised with pst■, and this was Sumid 1) Partially digest the Sac I fragment of AH104 with PStI and remove the sauce. 7 fragments of 4.3 kb length obtained as plant ends using polymerase A method for producing pAH4/2, characterized by ligating with One plasmid pER103 was linearized with HindI[IF and oligonucleotide complex 5'AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTT＾3′＾TTTCTAC Ligate with DingCGAGTAGAAAATTCGA and convert the ligase reaction into Sac The resulting plasmid was used to infect E. coli HB101 for replication. Production of expression plasmid pRH100, which is characterized in that it can be transformed and cultured Method One plasmid 1) AH4/2 0. 5kb long Ht ndn [/BamHI Fra HindUl/Barri of plasmid parpATERi03 The plasmid was inserted into the HI photopic site and the generated plasmid was used to infect E. coli HB i O1 for replication. Shape for? Expression plasmid ρΔH4/3 characterized in that it can be transformed and cultured. It also includes a manufacturing method. The invention also relates to a method for nA of the proteins of the invention. That is, a) the host organism, preferably a prokaryote; t) the Schiff is a eukaryote or mammalian cell; In particular, Escherichia coli or brewer's yeast is treated with EqlFN-α, -β, -ω or Ca. Genetic information encoding I FN-α, preferably encoding the protein of the present invention Plasmid pA H505pRH63, DRH82, pRH83, pRH6, 1, sequences from oRH60, pRH62, pΔH2 or pAH4 or this 85% or more, preferably 90% hybridization with the plasmid of Sequences showing the above homology, especially any of the sequences from formula 1 to ■ or this Transforming with degenerate mutants of these sequences. b) This coding sequence is used in an expression vector, preferably pAH52, pAH52/2 , pAH53, E) AH55, pAH62, pAH4/2 or pAH4/3 This information is contained in either FQIFN-α, -β, -ω or is expressed to produce CaXFN-a, and C) Interferon EqIFN-α, -β, -ω or CaI FN-α , preferably any of the interferons of formulas 1 to 2 is isolated and purified. A method for producing EqIFN-α, -β, -ω or CaIFN-α, characterized by I will provide a. The invention further provides for the use of the proteins of the invention in therapeutic treatments and for the use of these proteins in therapeutic treatments. The present invention relates to therapeutic treatment compositions containing an active ingredient and a pharmaceutical inert vehicle. Next, the present invention will be explained in detail with reference to the following working example, which does not limit the present invention. It's not. material Some of the starting materials were commercially available, and some were from EMBL (He1d elbero). E. coli JMIO1, pucs, pUC9, Ml 3rr+p8 and M13mp9 are Bethesda Re5earch La Obtained from boratories. E. coli strain with suppressor 11II prisoner 5upF For example, E. coli NM526. 538 and 539 and vector lambda EMBL3 Or 3A was obtained from EMBL, but some were obtained from 5tehelin (Ba5is). , Swtzland). ^) Isolation of Ma DNA Frozen tissue, such as horse liver, is ground into a fine powder in liquid nitrogen, and the 58 EDTA , 10mHTr 1s-HCj! 1) It8. 0. 0. 5% SDS, 0. IJI I! Incubate in F/d Protease K (20d/g tissue) for 3 hours at 55°C. I did it. The resulting viscous solution was subjected to phenol extraction and phenol/chloroform/infusion. Extract 3 times with soamyl alcohol (25/24/1 volume) to remove proteins and extract 5Q mHTr　i　5-HCj! 1) H8,011 (IHEDTA, 1011HNa The DNA was dialyzed with CJ and precipitated with 2 volumes of ethanol. completely dry in vacuum After that, TE the DNA at 4℃! ! ! i liquid (10aHTr 1s-HC1pH8 ,0,1s)IEDTA) for 62 hours at 20°C and 40,000 rpm. 1. per 11 d of solution. Centrifuged with 273 g esc, 1 (5 orv all 50 T i-rotors). The DNA-containing fractions were dialyzed against TE buffer by adding a C8C1 gradient and then The DNA was precipitated with 2 volumes of ethanol, washed with 70% ethanol, dried, It was again dissolved in 1 part of TEt (4°C). The final DNA preview contained no RNA and was >50 kb (0. 4 (measured by electrophoresis on a 5% agarose gel). 50 mcg of horse DNA was added twice to reaction medium (10 mHT r i s -HC j! I)87. 5. 10IllHMQCj), 11++H dithiothreitol ) 450mc1, 5au3A1. 6 units and incubated at 37°C. 15 ．． After 25 and 40 minutes, take a 150rnC7 aliquot of the reaction mixture and add 15mHEDT. The reaction was stopped by mixing with A and heating to 70°C for 10 minutes. 0. 3M1M S1-ri After adding UmDH6,0, the DNA was 2. Precipitation was performed with 5 volumes of ethanol. again After dissolving in TEF2IU solution, 0. On 45% agarose gel, TBE! ! I liquid <10. 8g/JTris, 5. 5g/l boric acid, 0. 93g/I Na2ED D) Electrophoresis was performed overnight using approximately 1 volume/ctti, and the DNA was separated by size. separated. Size marker (lambda DNA with ECOR) double with lindl [ 10-23kb of DNA was digested using HindI [lF digestion]. The DNA was electroeluted from the gel for 3 hours at 300 volumes (buffer 0. Dialyze against elut+p-D column (5chleicher & 5ehill) according to the product instructions and then precipitated with ethanol. I set it. On the one hand, it leads to artificial hybrids of horse DNA sequences, and on the other hand, it is too large to lead to lambduff. equine DNA resulting in the generation of DNA fragments that cannot be loaded into the phage. Size-fractionated equine DNA fragments were used to prevent self-ligation of the fragments. The fragment was dephosphorylated. For this, the DNA was mixed with a reaction medium (50 mHTris-HCJ! pH 9° 5. 1,0111t(M　OC12゜0,1111M vinegar 1 nitrile 1. 111IH Special Lumidine) 30 min with 5 units of bovine intestinal phosphatase at 37°C in 140 mCI. Incubate for 30 minutes, then add 5 units of enzyme and incubate the entire reaction for 30 minutes. It was incubated. After adding EDTA to a final concentration of 25rsH, the DNA was diluted with phenol/ Once with chloroform/isoamyl alcohol (24/24/1 volume), extracted twice with lum/isoamyl alcohol (24/1 volume) and three times with diethyl ether. then precipitated with ethanol, dried, and 0. Dissolved in 1XTE buffer. C) Dephosphorylation of 10 to 23 kb length of the 81-year-old Mage-DI'JA library The encoded horse DNA fragment is inserted into a lambda vector, e.g., inside a phage DNA. Lamb with G-A-T-C @ end obtained by removing BamHI fragment It was turned on with Dar-EMBL3 or 3A (3). This vector is used in an E. coli strain carrying the suppressor 5upF, such as E. coli NM526. 538 or 539 (3) with 5iHMO8O4 in LB medium (20). The mixture was grown in 100% polyethylene glycol and precipitated with polyethylene glycol to produce 2 replicates. TE! lI solution After dialyzing the phage DNA twice with phenol/chloroform/isoamyl Alcohol (25/24/11), 2 times chloroform/isoamyl alcohol Proteins were removed by extraction with (24/1 volume), precipitated with ethanol, and condensed. To obtain the terminal fragment of EMBL3A, incubate 50mco of phage DNA. Omedium (10++HTris-HCI pH7,5,10iHMaCJ, BamHI in 450 mCJ for 2 hours at 37°C. for 10 minutes with 45 iHEDTA, then 70 The reaction was stopped at °C and the DNA was precipitated with ethanol. To prevent re-ligation, cut the intermediate fragment again with EcoRI. Then, the dropped oligonucleotides were removed by isopropanol precipitation. 3αmHI digested lambda DNA was added to 10+HTris-HCI pH 7,5,1 00nHNaC! , iQ+++8MgC12 in 450 mcl for 2 hours at 37°C. , completely digested with ECORI, added 15iHEDTA and heated to 70°C for 10 minutes. The reaction was stopped by heating. Add sodium acetate to a final concentration of 0. After adding it to a concentration of 3M, it was heated to 0.0℃ at 0℃. 6 volumes Add isopropanol and add 15 volumes to precipitate the large DNA fragment of 3) I. Let, 0. 45HIf Sodium Acid 10. Twice with 6 volumes of isopropanol, 0. 38FF sodium acid/2. Wash once with 5 volumes of ethanol, O, IXTE! l opposition Liquid 15mc! dissolved in it. During this operation, the BamHI/EcoRI linker is remains in the liquid. Approximately 5 mcg of 10-23 kb horse EMBL3A fragment (8 mCg) Combine the DNA and 10 units of 74-DNA ligase (NEN) and perform ligation. Medium (661nHTris-HCIDH7,2,0,1M NaCl,10a +HMOC! , 1iHEDTA, 5m. Dithiothreitol, 0. 5n+HATP) in 50 mCI at 14°C overnight at 4°C. The cells were incubated for 1 day. The ligated DNA mixture was incubated in VitrO. It was loaded into mature lambda phage particles using the waste loading system (27). The components of this system are ultrasonic extract (SE), freeze-thaw lysate (FT). L), warm solutions M and A were [1] according to the literature (27). ligated DNA A portion of the mixture, 10rnCj, was thawed from ice for 30 minutes in the same manner as FTL, and then Incubate with E25mci for 2 minutes at room temperature, then FTLroomc j was added and the mixture was incubated again for 60 minutes at room temperature. filling mixture oram diluted solution (100018Trts-HCJ pH7,5,10iHMgSO4, 1iHEDTA) was diluted with 150 mCJ and stored at 4°C. A small amount of loaded lambda phage was spread onto E. coli strain NM528supF. This person The method produced approximately 1 x 10 independent equine DNA pairs. of filling material The rest is NM528, LB/MgSO4 Agar board 13. 30 per 5α. 00 The cells were plated and grown at a concentration of 0 plastic forming units (pfu). To identify recombinant phage containing the canine interferon gene, a radiolabeled Nucleotide homologs of the 1-IFN-α gene and the 1-IFN-α gene shown by the Southern method (17) G was used. Completely digest 10rncg of high molecular weight horse DNA with ECORI or Hindl. , 0. Electrophoresed on 8% agarose gel and nitrocellulose filter. I moved it to the tar. Originating from the R current plasmid pER33 (14), the mature human interferon 845bl) Hindl fragment containing the entire protein coding region of eron α2ARG. P32-, identification DNA fragment was prepared from the fragment by a conventional method (25). did. To screen for the equine β-interferon gene, proceed as described above. , cDNA clone PIF12 encoding human β-interferon (15) 363bpPs tI-Boj! Radiolabeled DNA from II fragment The probe was WMed. This probe is the amino acid 48 of mature β-interferon. Code ~166. The nitrocellulose filter is 5XSSPE (0,98NaCj!, 50mH Na)-12PO4,! MHEDTASp87. 4), 5X Denhardt♂ solution ( 0.1% Ficoll, 0. 1% polyvinylpyrrolidone, 0. 1% bovine serum albumen Min) 0. Pre-incubate in 1% SDS, 20 IPJ/d salmon sperm DNA at 65°C for 7 hours. hybridize and then label in the same solution but without salmon sperm DNA. Hybridized with probe 13×10 6 cpm. After overnight incubation at 65°C, filters were washed with 3X SSC (0,4,5). I NaC; 1. 45 mH sodium citrate), 0. 1 at 65°C in 1% SDS ~1. After washing 4 times for 5 hours, using Kodak Regicollar intensifying film, Kodak Exposure to ak X-ornat S-X-ray film for 7 days (Figure 1). several The appearance of the band is similar to that previously detected in cattle, pigs, and humans. It was suggested that the interferon was from the Zushi family. Therefore, screening for interferon genes in equine DNA libraries The same hybridization conditions were used for the analysis. 600. 000 recombinant lambda phage on E. B. NM528 at 30,000p. fu/flat plate 13. Plated at a density of 5 cm. From each plate, 5 enton and D 4f8 nitrocellulose replica using the method described by aviS (19). was prepared. After heating to 80°C for 2 hours, the filter was heated to 1HNaCl, 10mHTris- HCj! pua, o. 1.021% SDS at 65°C. Cleaned for 5 hours and prefabricated overnight as described above. Perform hybridization to generate two filter replicas from each plate in one frame. 1. per ilter. 5x106 cpm radioactive α-interferon probe or or 1X106cprnβ-interferon probe. After repeating the screening three times, a positive hybridization signal was detected. 8 equine α-interferon clones and 6 equine β-interferon clones with Feronkron Nagai Ko. Seven recombinants hybridized with human α-IFN and human β-IFN. Phage DNA was prepared from the three hybridized recombinants. EC0R DNA I. BamHI, HindI [[, PSt I, BQj! II, Sa1■ and S Digested with aml, 0. The cells were resolved by constant electrophoresis in an 8% agarose gel. hive The size of the redized fragment was determined by the Southern method. Control inside the lambda insert The restriction site was created from lambda DNA using the method described by Rackwitz et al. (4). Partial restriction digestion, synthesis of P32-labeled oligonucleotides with right or left attached end of lambda technique A recognition by Otide, and 0. Determined by electrophoresis in a 45% agarose gel. Ta. The obtained clones Eq-α1, EQ-α16, EQ-α20J3 and E(1 The restriction enzyme map of -β6 is shown in FIGS. 2, 3 and 9. ■Bunten Ennol: Queron-α selection child 1 pomelo 23-nta Clone Eq-α1 hybridized with human α-interferon marker Multiple restriction enzyme cloning of restriction fragments into pBR322 derivative pLIC9 The site was subcloned. Insertion of foreign DNA fragments 1acz312 gene of Dase, and therefore transformation with this plasmid The phenotype of the transformed E. coli strain JM101 changes from 1ac+ to 1aC-. Due to the lack of β-galactosidase function, isopropylthiogalactoside (I) JM 101 II (PTG) is a colorless substrate analog 5-bromo-4-chloro Decomposes rho-3-indolyl-β-D-galactoside (BCIG) to produce blue dye. I couldn't give it. Therefore, bacterial colonies of the 1aC-phenotype ・Can be recognized by the white color of the ridges. 3. of clone Eq-α1. 2kb)lindm75gment is agarose gel eluted from ELU, purified with ELU D column, cleaved with Saml, and dephosphorylated. 940 ng of pUc was ligated with approximately 10 times molar filtration, and Transform IOI and transform with 0. 21114F15ffBc IG. 0. 17Ing/at! IPTG and 0. Contains 1111ff/d ampicillin Poured into LB Totsubua Girl, 0. 1WJ/IIIj! Contains ampicillin White colonies were grown overnight at 37°C in 5 d of L8 medium containing plasmid minib. Insert fragments were screened by the leveraging method (25). write The resulting plasmid was named pAH50. Moxibustion 1 z 4 尤, 22 king mi η-29-1 go [ray and guar 9-ni ying, spear 1 nee z ≦1p gene DNA sequence pA) 450 3. 2kb HindlII insert (E, 3°2 of q-rxl ki) lindllJ fragment subclone, Fig. 3), shotgun The sequence was determined by the dideoxy method described by Sanger (23) using Ta. I > AH50 plasmid DNA 60mcO was completely digested with Htncim for 1 hour. , 3. The 2 kb fragment was isolated from a 1% agarose gel and purified as described above. Then, ti1g was produced. 15 mcg of this fragment was added to a ligase containing 14 units of 74-DNA ligase. John medium in 100 mC1 at 14°C overnight and then at 4°C for 4 days as per se. The gate was closed. This ligated DNA was measured in a water bath using a 20-second pulse of ultrasound. Divide into small pieces for 100-140 seconds. The ends of the DNA are processed by E. coli polymerase. 15 units of large fragment (Flenow fragment) and reaction medium (50 mH Tris-) 1cJ pH 7, 5, 10d bovine serum albumin; 0. 1aHd ATP. dGTP, dCTP, dTTP) 250rncj! Cure at 14°C for 2 hours. Ta. After concentrating by ethanol precipitation, the DNA pretreated in this way was reduced to 1% Valve heads on Aga O-Suguru, size range 0. 35-1. 0kb DNA fragment The substance was isolated and purified. This fragment was cut with Saml and dephosphorylated. ligation using a 10-fold excess of the replicative form of tabatateriophage M13mp8 (22). Then, Escherichia coli JM101 was transformed. The single-stranded DNA of the recombinant phage thus obtained was isolated and synthesized with synthetic oligonucleotides. After binding the compound, the synthesis of the second strand is carried out by E. coli DNA polymerase. Each of the four reactions was carried out with the fragment. The sequences of the inserts of various recombinant phage were 5t modified by C. Pieler. The entire sequence was determined using the computer program Aden (24). This is shown in FIG. 14 degrees ±-/>9-7xo>m negative j” Raw! LLku p-,=nk Horse β-i identified in lambda clone EQ-βθ]/Tarfelon Road Gene For subcloning, the same procedure as in F) was used. h1-β-interf The 4°5kb PrulI fragment hybridized with the Elon probe was [, purified and ligated into the Sam restriction site of plasmid pUc9 with the plant end. Gated and transformed E. coli JM101 with the desired insert (pAH6o). The properties of this plasmid were further confirmed by Southern analysis. I looked into it for sure. The obtained v1 restriction enzyme map is shown in FIG. 2,5kb HindI ! The I fragment was sequenced using Sanger's dideoxy method in the same manner as G). Ta. The entire 2.5kb sequence shown in Figure 8 was composed of 52 individual sequences. . Dead cloves hybridized with human α-IFN marker (e.g., see E) 3. from EQ-α16. The 3kb long EcoRI restriction fragment was added to the plasmid. It was subcloned into the ECoR1 site of pUC8. The resulting plasmid is pR It was named H63. Using the created restriction enzyme area (Figure 9), υ1 was clarified. The limited fragment was subcloned into Mi3 phage in a controlled manner and the DN The A sequence was determined by the Sanger method (Figure 10). J) Sacronin of main interferon from clone EQ-α20. Umuda clone EQ-α2 weakly hybridized with human α-IFN probe 0 of 2. The 2kb Ecoll fragment was inserted into the ECoRI region of plasmid pUC9. subcloned into position. The obtained clone was named pR)-161 (No. 9), 2. The entire 2kb EcoRI insert was arrayed in a single row and shotgun was prepared using the Southern method. The DNA sequence was determined using the following procedure (Example G) (Figure 12). K) Production of expression plasmid parpATER103 Expression plasmid parpER 33 and provides high stability of the plasmid in the large intestine. #Sequence and tryptophan promoter operator sequence as artificial liposome binding part into the plasmid vector pAT153 (Aiersham) along with the Ta. pAT153 is a truncated derivative of plasmid pBR322, which is required for DNA movement. It lacks essential parts (36). The manufacturing procedure for plasmid parpATER103 is shown in FIG. plasmid p arpER33 was completely cleaved with Hincjm and partially with ECORI to generate A 0.47 kb long DNA fragment was isolated from an agarose gel and generated. , ligated with pAT153 double cut with ECORI and Hindll [. Obtained after transformation of E. coli HB101 and determined by digestion with each restriction enzyme The plasmid with the desired structure was named parpATER103. L EQ-IFN 2nd Ribe jS” art style li! , Satsuma 11 expression plasmid pAH5 2, pA) 152/2 and pAH53 and their preliminary steps are shown in Figure 14. show. Plasmid I) 20mcg of AH50 (Example F) was added to 30 units of Hindm ( Boehrink+er Hannheim) and total EQ-IFN-α A 4°2 kb long DNA fragment containing one gene was extracted from an agarose gel. It was isolated and purified using E81 filter paper (IJhatean). For this purpose, Cut a slot before and after the DNA band to be isolated and insert DE81 into this slot. A piece of filter M was inserted. All desired DNA fragments are ligated in front of the DE81 piece. Continue electrophoresis until The rear DE'81 piece contains large DNA fragments. prevent. DE81 filter paper with bound DNA fragments at low temperature! 1!1 1 (0,2HNaC1,25mHTris-HCj! pH8,0,1aHE DTA) Wash twice for 5 minutes in 400 mcJ, then remove high salt glue from DE81 filter paper. Solution (114NaC125m) lTr 1s-H (jpH8,0,1aHEDT A) Elution was carried out twice at 200 mcJj for 10 minutes and precipitated with ethanol 1- . A Sph linker was attached to the end of the Hindll fragment. For this, the Sph I linker (Wortlington) 0. 2mc o to reaction medium (70IHTris-HCI pH 7, 6, 10m) l MO CJ2. 110) I ATP. 5mM dithiothreitol) 10rnc! 2 units of polyamide at 37°C for 45 min. Incubated with nucleotide kinase. Kinase-treated Sph I phosphorus The Car and HindI fragments were treated with 8 units of T4-DNA ligase for 2 hours at 4°C. It was opened at 0 hours. Then, the enzyme was inactivated at 70°C, and the DNA was synthesized into ffi1. Digested with 130 units of Sph in 00mcj and extracted with phenol and chloroform. , precipitated with ethanol. This DNA was cyclized with ligase and transformed into E. coli HB101. Transformed with The plasmid with the desired structure was named pAH51. This is E( 1-IFN-α1 gene, truncated 3′ untranslated region, and one additional Sph I cut fg Contains the i site. Promoting the DNA sequence of mature horse α-interferon at the correct distance within the final structure To bind to the vector sequence, plasmid pAH5020mcO was cut with pvumt'. A 0.4 kb long DNA fragment that was cut and isolated was used as a starting material. Distribution Synthetic 15-mer oligonucleotide 1 of column 5'-TGTGACCTGCCTCAC nmol was phosphorylated with polynucleotide kinase. This is clone pAH5 contains the sequence encoding the first five amino acids of mature EQ-IFN-α1 from 0 to have Approximately 7 pmol of 0.15-mer mixed with 4kb PvulI fragment , total 34rnl! The DNA duplexes were denatured by boiling for 5 minutes in a vacuum. After cooling, The oligonucleotide primer bound to one vessel was added to the reaction medium (50 IHT). ris-HC1! pH7,2,10IHM QS O4,0, 1mM dithio Thretol, 50rnco/aN bovine serum albumin, dATP, dGTP, dCTP and dTTP each 1m14) 70mCj! Medium, 3 hours at 37℃, 30 units It was extended by treatment with Flenow fragment. of the remaining 3′ overhang. To ensure removal, the DNA was then added to the reaction medium <33 mHTris. -Acetate pH 7,9,66a)l KAC,iQoi)1MQ (AC)2. 0 ．． 5mM dithiothreitol, 0. 11!97d bovine serum albumin, dATP , dGTP. dCTP and dTTP each 1mH) 120rncj! medium, 20 minutes at 37°C. It was incubated with T4 DNA polymerase at position 1611. generated plant DNA with ends was extracted with phenol and chloroform, and 0. 45N sodium acetate Um and 2-Proper Tools 0. 6. Added the old proverb and left it at 0℃ for 15 minutes to precipitate it. . Two phosphorylated oligonucleotides complementary to each other, i.e. 12-mer 5° -AGCTTAAAGATG and 87-5° -CΔTCTTT^, When ligated to the above DNA fragment, this mixture position and the translation initiation codon ATG is generated. 1 nmol of 2 oligonucleotides The batch was incubated with DNA Flag in 2Qmci with 14 units of glue gauze for 40 hours at 4°C. After treatment with Mento and ligut and inactivation of the enzyme at 70°C, the obtained 80 units of HindII in 100 mCJ of A! and BaIIt at about 20m. The approximately 190 bEJ-length DNA fragment was digested with DE from a 2% agarose gel. 81v1 paper and purified. The generated DNA fragment was 1) About 50t+o of AH51 vector double-cut with BgJIr and BgJIr and transformed E. coli HB101. Among the 65 colonies obtained, 4 plasmids with the desired υ1 restriction pattern were isolated. We isolated the Hindl[I/BarnH1 DNA fragment from When the sequence of the target was determined using the Sanger method, two components with exactly the desired sequence were found. Ronnie got it. This plasmid was named pAI-151/2. this is, The sequence of mature EqIFNα1 and its preceding translation initiation codons ATG and H!　 ndIl [contains the cleavage site. U double do double double ≧-≦≧CZ4-upper mi once Ato] 5-15≧danj (to-”Gei 1- / Kii2, Go-Sen3” J theft Plasmid pAH51/220meg was double cut with SphI and H1ndI. The resulting 1°Okb long DNA fragment was isolated on an agarose gel. , 4゜O9 HindI[[ and SphI 21131,73 plasmid ParpATER103 (Example K) is gate 1. Transforming E. coli HB101 The resulting plasmid with the desired groove structure was named pAH52. This is mature EQ Contains all information essential for inducible expression of IFN-α1. Similarly, plasmid 1) AH52/2 is DAH5 double-cleaved with l-4indll and BamHI. Made from parpATER103 cut with 1/2]→1ndl/BarnHI was created. This expression plasmid is approximately 0.0% smaller than pAH52. 2kb longer and 1 more It has a 3arntlN cleavage site. Plasmid pAH5 main y1 tryptophan promoter, interferon gene, ampicillin resistance gene Mature E (I) INF-α1 is produced on a large plantation where the genes and replication sources are aligned in one direction. Substantially small expression plasmids for From pBR322! Iij was created. pΔH52 of lQmcg was expressed as Sph I and The enzyme was inactivated at 70°C, and the enzyme was cleaved with E and C'ORI. 15d dATP , dGTP. After treatment with dCTP and dTTP for 1 hour at 22°C, The end was made into a plant using a fragment. The DNA fragments were fractionated by size on an agarose gel, and the promoter and A 1,1kb long fragment containing the interferon and interferon genes was isolated. pBR322 plasmid 1101c was cloned with EC0RI, tJJ: and PvuTI. After heavy digestion, the ends were made into plants with L-Nnow fragments as described above, and then Sharp with bovine small intestine phosphatase! J was oxidized. 2. 4kb DNA fragment 1- was isolated from an agarose gel. The two DNA fragments thus obtained The vector was ligated with T4 DNA ligase and transformed into E. coli HB101. 2 This plasmid in which [:coRI recognition sites were created was named pAH53 ΔN 1 EqlFN-α1 gene (pAH50) and EqlFN-α2 gene (pRH 63, Fig. 11), the expression plasmid of EQTFN-α2 (Figure 15) shows expression plasmid pAH52/2 (example) and lambda subclonal pR) 163. pRH63 plasmid 20 tubes Cut twice with f3G and 8arnHI to obtain 64 amino acids of EQIFN-α2. The generated 1, Okb-long DNA fragment containing the sequence encoding: isolated from a gel. 10mco plasmid PAH52/2 is also BQI II and [31mHI, and the ends were dephosphorylated with bovine intestinal phosphatase to generate The larger of the two DNA fragments was obtained from an agarose gel. This DN The A fragment contains plasmid vector components, promoter and mature interface. Contains a sequence encoding the first 63 amino acids of the eron. The two mentioned above The DNA fragment was ligated with ligase and transformed into E. coli HB101. . Contain the insert in the correct direction ('B amHI a,): and BOj! II The resulting plasmid was named pΔto155. This plasmid is Allows expression of mature EQIFN-α2 in E. coli. ! LL7JiE, Q j-King-N-=z,, B (7) J3 q7 i3. , ,E,H,,cp,AH (22) production The operation is shown diagrammatically in Figure 16. p　A　H60 plasmid 30mcg to 150 In mc7 volume ■, HOiAI was cut in units of 3O. Enzyme was inactivated at 70°C Afterwards, the three prime overhang DNA ends were combined with 7 units of T4. 　D　N　 A polymerase (dATP, dGTP of each 111H. dCTP and dTTP addition) at 37° C. for 30 minutes to smooth the surface. Sph I linker is ligated to the plant end (see example), the generated DNA was cut with sphI and Hinchill. The resulting 1°85 kb long D IJi! NA fragment from agarose gel! and Hindl[[and S 50na plasmid parpATER103 double-cleaved with phI and ligated (Example K). The clone carrying the desired plasmid obtained after transformation of E. coli HBIOI was p It was named AH61. This plasmid serves as an intermediate step in the construction of future expression plasmids. It is made up of floors. Plasmid DAH61 of 2011CO was transformed into 31mHI and Cut the DNA twice with SaJI, and the generated 1.3 kb long DNA fragment was injected into agaro. M13 isolated from a 50% gel, purified and double digested with BarnHI/SaJ 1119 phage DNA. After transformation of E. m. JM101, Il Single-stranded phage DNA could be obtained from M13-phage (M1 3pAH61). This one DNA is 2QmHTris-HCJpH8,o , phosphorylated 15mer oligonucleotide in 50racl of 10mHMOCJ2 Mixed with 33 gmol of 5'G Ding GAACTATGACTTG and then heated to 95℃ and gradually cooled to room temperature. The oligonucleotide is a mature β-interface. Connect accurately from the first ff11 of the eron array. 157-Starting from the primer The synthesis of the second strand based on a whole single strand is performed using dATP of 3 mH each in 10011 C1 volume ω. , dGTP. After addition of dCTP and dTTP and 15 units of Flenow fragment, 22 It was carried out for 1 hour at ℃. After adding 201H EDTA, the DNA was phenol-treated. and chloroform, and precipitated with ethanol. The remaining single-stranded DNA fragment was added to the reaction mixture (4m) lZn (AC)2. 3 0mH NaAc, 250mH NaCO, 5% glycerin, pH 4,6) 400r 150 units of 81 nuclease (Si well) in nc1 for 2 hours at 14°C. Digested. The reaction was stopped by adding EDTA and extracted with phenol and chloroform. , DNA was precipitated with ethanol. 12-mer and 8-mer oligonucleotides 5’-AGCTTAAAGAT and 5’-CATCTTTA The compound is ligated onto the DNA, and the ends are made into plants by this treatment as in Example H. The generated DNA was cut with H+ndl and Sl:lhI. Desired 1. 1k The DNA fragment of b was isolated from a 7 galose gel and was It was ligated with plasmid parpΔTERI03 which had been double cut with I. Escherichia coli After transformation of HBIOI, 54 colonies were obtained. 9 separated by ψ from it Regarding the plasmid DNA of EcoRI/SaJ I 1. 3kb long fragment were isolated and sequenced using the Sanger method. with the desired sequence obtained from this The resulting plasmid was named 1) AH62. According to this plasmid, in E. coli This allows for efficient expression of mature EQIFN-β protein. mature β-IFN The plasmid with the deletion of the first base G of the gene is pA　H62deletaG　1 It was named. This plasmid has the following ATG (corresponding to amino acid 19 of mature β-IFN): β-IFN with its amino terminus truncated is expressed by initiation of translation. This protein is , surprisingly exhibits antiviral activity, although weaker than the untruncated protein ( Example O). While shaking vigorously at 37°C, the bacterial culture 100- The following tryptophan-free media are used until an optical density of 0.00 nil is achieved. Dium [r1#, in medium 11: (NH4)2 PO410g, 3. 5g KH2PO4 (pH 7.3 with Na01-1), N a CJO159, Casamino acidic acid hydrolysis) 21g, glufus 11! 7. MgSO4111 DL CaC1,, O, imp, thiamine hydrochloride iRg, L-cysteine 20W l, 3-β-indole acrylic M (IAΔ, indole of the tryptophan operon) ) 201r1g, ampicillin 50-100 as needed! Il! ! ]During Incubate with Then for 5 minutes4. Centrifuge at 000 rpm to remove bacteria. Make a pellet shape and add 1/10 of the culture volume to ice-cold 50mTris-HC1p. H8,0,30n+)t Suspended in NaCl, ice-cold Shinakara, ultrasonic probe ( It was destroyed twice for 30 seconds using 20kHz, 100watt). cell layer Centrifuge for 10 minutes at 10,0 OOrrllll (4°C) to remove the residue. After bacterial filtration, vesicular stomatitis virus (VSV) or encephalomyocarditis virus (E Interferon activity was measured using the standard n method to measure the cytopathic effect (CPE) of MCV. test. Test system: NBL-6 cells (ATCCCCCL57. superficial cells from horse skin)/V SV, and A349 (ATCCCCCL185, human lung cancer cell line)/MCV Standardization of titers against A549 to international units using human interferon standards did. H8101 interferon activity Transformation 0D6oon1. l (medium/I! Culture liquid) 75 Sumi F NBL-6/V SV A349/EMVE, /J IE/j! pAH524,21,8x1065. 2x10’pAH52/2 6°02. 0 XIO7,6X10'pAH535,71□8X10 6,2X1041)AH 555,71,2X109. 0 cut O4pAH623, 01, 1 cut O<103 1) AH62delta G1 2. 1 4. 5Xi05<103H812(H u IFN-α2C standard>5. 2X1022. 6-cut 04 brosmid code The collected proteins can be labeled in vivo using Maxi-m cell labeling (37). colon Bacterium C3R603 was transformed with the expression plasmid by a conventional method, and the transformed bacteria were selected on Agar plates containing ampicillin. Manufacture of maxi cells and labeling of proteins are as described in A, 5anaer (37). Therefore, it was practical. Cells were grown on 15 indole acrylic acid-free media (e.g. O Reference), grow at 37°C until reaching OD -0.5, and grow this culture at 00 nm. The nutrient solution 10- was placed in a vetri dish and heated to 5 oα using an ultraviolet germicidal lamp (15 watts). Irradiate from a distance for 5 seconds without shaking and continue incubation at 37°C for 1 hour. I got it. The culture solution was mixed with D-cycloserine 100a+eg/at! 37℃ After incubation for 14 hours, the bacteria were harvested by centrifugation. Thin The cells were washed twice with 5 ml of Harshey's salt solution and 20 mcg/I Suspended in Verge Aimedium 5- with indole acrylic acid of d and heated at 37°C. and incubated for 2 hours. 358-methionine 5μCi/rd for each culture solution (100 Ci/i not) was added, and the mixture was shaken at 37°C for 1 hour. harvest the cells , in electrophoresis probe buffer containing SDS and 2-mercaptoethanol. Bacteria were lysed and proteins were separated in a 15% polyacrylamide gel. Bergey salt solution (in 11): 5. 4g NaC! 3. 0 g KCl 1. 1gNH4Cz 15ryCaC1-2820 0°2IIgM (jcl ・6th 20 0, 2HgF e C1・6 H20 87qKH2PO4 12, 1g Tris + HCA' pH 7, 4 Virgie medium (Vergei salt solution) (in 100d solution): 2d 20% glucose 0. 5d2% threonine 1. 0d1% leucine 1. 0d2% proline 1. 0d2% arginine 0. 1m! 0. 1% thiamin Figure 17 shows odac 1. ariex -Regular FIJe8 Fi onto DuPont Cronex X-M film for 2 days at -80°C. This is an o-radiogram of the dried gel after exposure for a period of time. As a molecular inversion standard used a 14C-methylated protein mixture (A+++ersham). use Control is a plasmid containing only the promoter and no interferon gene. pER103, and a plus containing two copies of the human IFN-α2ar03m gene. It was named mid pER21/1. The protein band at approximately 18 kd is associated with the plasmid. Therefore, it is an expressed interferon. Interferon genes of classes IFN-α, IFN-β and IFN-ω To detect the total number of sequences in the horse genome that have significant homology, we used the following procedure. . High-polymer vDNA (Example A) 30meg in reaction volume f1300mCI and I Completely digest with the corresponding υj restriction enzyme 100 kyu, and add this cut DNA to each trace. Take 10e+cg and 0. 8% agarose gel 2. Divided by size. After transferring Southern 11 onto a nitrocellulose filter, denature and fix the DNA. Each filter was injected with approximately 6 x 106 CpIl of nick translation probe. (17 hours at 65°C, 5X SSPE, 5X Denhardt solution) liquid, 0. 1% SOS, denatured salmon sperm DNA 20mco/ae), EQ IFN The probe used for -a was 1.1 from plasmid pAH52. Okb length Ht ndl Ii15phI fragment, the probe used for EqlFN-β was plasmid p i, 1 itb length) 1irld11115phI fragment from AH62 Ta. Both contain sequences encoding the entire mature interferon. EQTFN The probe used for −ω is a 2°1 kb EcoRI insert from plasmid DRH61. It was considered as a body. The filter was then cross-hybridized between the three interferon sequences. Under strict conditions that do not cause dization, 0. 3XSSCC45mHN aG! ,4. 5 mH sodium citrate), 0. 1% SDS at 65°C Washed 4 times for 45 minutes. Autoradiography is performed using Odak Lanex -Using Regular intensifying film, DuPont C "ONEX X-ray It was exposed on a film for 7 days at -80°C. In Figure 18, M shown above the column is a size marker (lambda indI[), E-EcoRI. H-Hindl, Ba-BamHI%P-Pstl. B=BOj! It is n. 1) Isolation of dog DNA A frozen tissue, such as a dog's liver, is ground into a fine powder in liquid nitrogen, and the 5M EDTA , 10aHTris-HCj! pH 8, 0, 0, 5% sos, o. 1η/jd Incubate in Protease K (20fd/tissue) for 3 hours at 55°C. The resulting viscous solution was extracted with phenol, phenol/chloroform/isoamyl Extract 3 times with alcohol (25/24/1 volume) to remove protein, 50 a+H Tris-HC1 pH8,0,10aHEDTA, 10n+HNaC! Dialyzed with , DNA was precipitated with 2 volumes of ethanol. After completely drying in vacuum, D NA was added to TEffl rain solution (10d Tris-HC:;J!pt (3° 0. 1118EDTA) and heated at 20°C for 40. Melt at 00 rpm for 62 hours. Centrifugation was performed with 273 g of C3CI per solution (5 orvall 50 T i-rotor)0CsCj! Drop the gradient one drop to collect the DNA. The fractions were dialyzed against TE buffer, and the DNA was then precipitated with 2 volumes of 1 ethanol and It was washed with 0% ethanol, dried, and dissolved again in TE buffer (4°C). The final DNAΔb1 noparation contained no RNA and was over 50 kb (0. (measured by electrophoresis on a 45% agarose gel). Dog DNA 5011C! + twice, reaction medium (10118Tris-HCJ pH 7, 5, 10m14 M (JCj, 1118 dithiothreitol) 450 Incubated with 1°6 units of 5au3A in mcO at 37°C. 15. 25 o After 40 minutes, take 150 mc1 of the reaction solution and mix it with 151 NED block A.

【ノ、７０℃に１０分間加熱して反応を停止した。０．３Ｍ酢酸す］・リウムｐＨ６，０を添加後、ＤＮＡを２．５倍容のエタノールで沈殿させた。再びＴＥ緩衝液に溶解したのち、０．４５％アガロースゲル上、ＴＢＥ緩衝液（１０，８ｇ／ｊ！　Ｔｒｔｓ、５．５９／ｌホウ酸、０．９３　ｇ／Ｊ　Ｎａ２ＥＤＴＡ）約１容／αを用いて一夜電気泳動に付し、ＤＮＡをサイズによって分離した。サイズマーカー（ラムダＤＮＡをＥｃｏＲＩとｌ−１ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで二重消化し、＠　ｉ　ｎｄＩＩＩテ消化）を用いて、ＤＮＡ１０〜２ａｋｂ長のゲルフラグメントを切出し、ＤＮＡをゲルから電気泳動で溶出し、３時間３００容（緩衝液０．１ｘＴＢＥ）で透析し、ｅｌｕｔｉｐ−［）カラム（Ｓｃｈｌｅｉｅｈｅｒ　＆　５ｅｈｉｉｌｌ）上で製品の指示書に従って精製し、ついでエタノールで沈殿させた。ひとつにはイヌＤＮＡ配列の人工バイブリッドを招き、他方大きすぎてラムダファージ中に充填できないＤＮＡフラグメントを生成させることになるイヌＤＮＡフラグメントの自己リゲーションを防止するため、サイズ分画したイヌＤＮＡフラグメントは脱リン酸化した。このためには、ＤＮＡを反応メジウム（５０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣＪｐＨ９，５，１，ＯｍＨＭＱＣｊ！　、０．１＋Ｈ酢酸亜鉛、１１１ＩＮスペルミジン）１４０ｍｃＡ中、３７℃で５単位のウシ小腸ホスファターゼと３０分間インキュベートし、さらに５単位の酵素を追加して全反応液を３０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを最終濃度２５ＩＩＩＨになるように加えたのち、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／２４／１容）で１回、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４、／　１容）で２回、ジエチルニーデルで３０抽出し、ついでエタノールで沈殿させ、乾燥し、０．１ｘＴＥ！！田液に溶解ｉノだ。３）　イヌゲノム−、Ｄ　Ｎ　Ａ之イ１ｊリノ、二遭え至１０〜２３ｋｂ長の脱り〕ｌＲ化イヌｉ：）　Ｎ　Ａフラグメントをラムダベクター、たとえば、ファージＤＮＡの内部３ａｒｎｌ−１［フラグメントを除去して（７られたＧ−Ａ− Ｔ−Ｃ付着端を有するラムダ−ＥＭＢＬ３または３Ａ（３）にクローン化した。このベクターを抑制因子５ＬＪＣＩＦを右する大腸菌株たとえば大腸菌ＮＭ５２６．５３８または５３９　（３）内で、ＬＢ培地（２０）中、５１１８　ＭＱＳＯ４とともに生育させ、ポリエチレングリコールで沈殿させ、２回Ｃ３Ｃｊ！漠度勾配遠心分頭（溶液１　ｍｌあたり０．７１ｇｅｓｃ！、４０時間、４．５０Ｏｒｐｍ　、２０℃）により精製した。ＴＥ［ｌｉ液で透析したのち、ファージＤＮＡを２回フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１容）、２回クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／１容）で抽出して蛋白質を除去し、エタノールで沈殿させて濃縮した。ＥＭＢＬ３Ａの末端フラグメントを（ｑるには、ファージＤ　Ｎ　Ａ　５０　ｆｆ１ｃＱを反応メジウム（１０１１１８ＴｒｉＳ　−１−ＩＣＪｐＨ７，５、’ ＩＯｍＨＭｇＣ１，１ｍ）ｌジチオスレイトール＞４５０１ＱＣＩ中、３７℃で２時間、ＢａｍＨＩによって完全に消°化し、ついで１５ｎＨＥＤＴＡを加えて７０℃に１０分間加熱して反応を停止させ、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。再すゲーションを防止するためには、中間フラグメントを再びＥＣ０ＲＩで切断し、脱落したオリゴヌクレオチドをイソプロパツール沈殿で除去した。ＢａｍＨＩ消化ラムダ−ＤＮＡを、１０１１８　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩＨ７，５，１００ｎＨＮａＣ１，１０ＩＩＩＮ■により完全に消化し、１５＋ｓＨＥＤＴＡを加え１０分間７０℃に加熱することにより反応を停止した。酢酸ナトリウムを最終濃度０．３Ｍになるように加えたのち、０℃で０．６容のイソプロパツールを加えて１５分間装いて３）１の大ＤＮＡフラグメントを沈殿させ、０．４５Ｍ酢酸ナトリウム１０．６容イソプロパツールで２回、０．３Ｍ酢酸ナトリウム／２．５容エタノールで１回洗浄し、Ｏ，ＩＸＴＥ緩面液１５ｍｃＪ中に溶解した。この操作時にＢａｍＨＩ／ＥＣＯＲＩリンカ−は溶液中に残る。ＥＭＢＬ３Ａフラグメント（８１１Ｃす）を約５　ｍｃｇの１０〜２３ｋｂイヌＤＮＡおよび１０単位の７４−ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＮ）と合し、リグ−ジョンメジウム（６６ＩｌｌＨＴｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐＨ７，２，０，ＩＭ　ＮａＣｊ！、１Ｏ１１ＨＭＱＣ１，１１１ＩＨＥＤＴＡ、５ｍＨジチオスレイトール、０．５ＩＢＨＡＴＰ）５０Ｉ！ｅｊ！中、１４℃で１夜、４℃で１日インキュベー１−シた。リゲートしたＤＮＡＣ合物をｉｎ　ｖｉｔｒｏでラムダ充填システム（２７）を用い成熟ラムダファージ粒子中に充填、シた。このシステムの成分、すなわち超音波抽出物（ＳＥ）、凍結−解凍分解物（ＦＴＬ）、綴衝液ＭおよびＡは文献（２７）に従って調製した。リゲートしたＤＮＡ混合物の一部１０１Ｃｊ！！を、ＦＴＬと同様に氷から３０分間解凍しておいて５Ｅ２５１１１ＣＪとともに常温で２分間インキュベートし、ついでＦＴＬ１００ｍｅｊ！を加え、混合物を常温で６０分間再びインキュベー１−シた。充填混合物をラムダ希釈液（１００ｎＨＴｒｉｓ　−ＨＣｊ！　１）Ｈ７，５，１０ｍＨＭｏｎｏ４．１ｍＨＥＤＴＡ）１５０ａ＋ｅＩで希釈し、４℃に保存した。充填ラムダファージの少量を大股菌株ＮＭ５２８ｓｕｐＦ上に散布した。この方法では大体、約１×１０６の独立したイヌＤＮＡ組換体を生成した。充填材料の残りをＮＭ５２８上、ＬＢ／ＭＱＳ０，７ｊｊ−ル板１３．５ａＲＳたり３０．０００プラ一り形成単位（ｐｆｕ）の濃度で平板培養し、増殖させた。４）イヌ遺伝　ライブタＩＪ　ｆｙｙβ−（７）、／スターフエロン遺伝子のスクリーニングイヌインターフェロン遺伝子を含む！ｌｔ！Ａえファージを同定するためには、放射標識ヒトＩＦＮ−α遺伝子とのサザン法（１７）で示されたヌクレオチドホモロジーを用いた。高分子イヌＤＮＡ１０ｎ＋ｃｏをＥＣＯＲＩまたは）（ｉｎｄＩ［Ｉで完全に消化し、０．８％アガロースゲル上電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターに移した。発現プラスミドｐＥＲ３３（１４）起源で、成熟ヒトインターフェロンα２ＡＲＧの蛋白質コード領域すべてを含む８４５ｂｐ　ＨｉｎｄＩ［［フラグメントから、常法（２５）により、ｐ３２−標識ＤＮＡフラグメントを調製した。ニトロセルロースフィルターは、５ＸＳＳＰＥ（０，９Ｍ　ＮａＣ１，５０ｎＨＮａＨＰＯ４，５ｍＨＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）　、５ｘデンハルト溶液（０，１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）０．１％ＳＤＳ、２０＋ｌｌ！Ｆ／−サケ諸子ＤＮＡ中、６５℃で７時間、予めハイブリダイズし、ついでサケ蹟子ＤＮＡを含まないほかは同じ溶液中で標識プローブ１３Ｘ１０６ｃｐｉとハイブリダイズした。１夜６５℃でインキュベートしたのち、フィルターを３×５ＳＧ（０，４５Ｍ　ＮａＣ１，４５ｍＮクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中６５℃で１〜１．５時間、４回洗浄し、Ｋｏｄａｋレギュラー増感フィルムを用い、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ｏｉａｔ　５−ＸｔａＶイルムに７日間露出した（第２１図）。数個のバンドの出現は、以前にウシ、ブタおよびヒトに検知されたと同じ、イヌのα−インターフェロン遺伝子の一族であることを示唆した。したがって、イヌＤＮＡライブラリー中のインターフェロン遺伝子のスクリーニングにも同じハイブリダイゼーション条件を用いた。ｉ、ｏｏｏ、ｏｏｏの組換えラムダファージを大腸菌ＮＭ５２８上、３０，０ＯＯｐｆｕ　／平板１３．５ｚ（７）９度で平板培養した。各平板から、Ｂ（！ｎｔＯｎとＤａｖｉｓ　（１９）の記載した方法を用いて２倍のニトロセルロースレプリカを調製した。８０℃に２時間加熱したのち、フィルターを１ＭＮａＣｊ！、１０ｄ　Ｔｒｉｓ　−Ｈｃｊ！　ｐＨ８，０，０，１％ＳＤＳ中６５℃で１．５時間洗浄し、上述したと同様にして１夜ブレハイブリダイゼーシヨンを行い、各フィルターあたり１．５Ｘ１０６ｃｐＩｍの放射性α−インターフェロンプローブと２４時間ハイブリダイゼーションを行った。スクリーニングを３回くり返したのちに、９ｇＡのイヌα−インターフェロンクローンが得られ、これらは陽性のハイブリダイゼーションシグナルを与えた。５）組換えファージの特性ヒトα−ＩＦＮとハイブリダイゼーションさせた９個の組換体からファージＤＮＡを調製した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＬ　Ｈｉ　ｎｄｍ、ＰＳｔｌ、ｓａｚｍ、Ｓａｔ　ＩおよびＳａｍｌＴ”消化し、Ｏｌ、８％アガロースゲル中電気泳動によって分割した。ハイブリダイズしたフラグメントのサイズはサザン法で決定した。ラムダ挿入体内のｆｉ１１ｍ部位は、Ｒａｃｋｗｉｔｚホか（４）の記載した方法を用い、ラムダＤＮＡの部分制限消化、ラムダ枝の右端または左端付Ｍ　Ｎの合成ｐ３２標識オリゴヌクレオチドによる標識、および０．４５％アガロースゲル中電気泳動によってその位置を決定した。クローンＣａ−α−１１−２の得られた制限酵素地図を第２２図ヒトα−インターフェロンマーカーとハイブリダイズしたクローンＣａ−α１１−２の２個のυｊ限フラグメントをｏＢＲ３２２誘導体ｐＵＣ９の多重制限酵素クローニング部位にサブクローン化した。外来性ＤＮＡフラグメントの挿入はβ−ガラクトシダーゼのｊ！ａｃＺ３ｍ伝子に障害を生じ、したがってこのプラスミドで形質転換された大腸菌株ＪＭ１０１の表現型は１８Ｃ＋からＪａＣ−に変化する。β−ガラクトシダーゼの機能を欠くためにイソプロピルチオガラクトシド°（Ｉ　ＰＴＧ）で誘導されたＪＭｌｏｌは無色の基質類縁体５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド＜ＢＣＩＧ）を分解して青色染料を与えることはできなかった。したがって、１ａＣ−表現型のバクテリアコロニーはその白色によって認識できる。すＤ−ンＥＱ−α１の３．７ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌ［７ラグメントはアガロースゲルから溶出し、ｅｌｕＮｐ−Ｑカラム上でｍ　？Ｊし、Ｓａｍｌで切断して脱リン酸化した１１１）ＬＩＣ９４０ｎＯと約１０倍モル過剰でリゲー１−させ、ついで大腸菌ＪＭ１０１を形質転換し、０．２ｊｌｌＦＩ／ｄ　ＢＣＩＧ、０、１７１Ｒｇ／ｌｄ　Ｉ　ＰＴＧおよび０．１η／〆アンビシリンを含むＬ　Ｂ　トツブアガールに注いだ、Ｏ８１■／ｄのアンピシリンを含むＬ８培地５７中、３７℃で１夜、白色コロニーを生育させ、プラスミドミニブレバレージョン法（２５）により挿入フラグメントをスクリーニングした。かくして得られたプラスミドをｐＡ）１２と命名した。同様に、同じラムダクローンからの２．４ｋｂ＄ａｒｎｌフラグメントをｐｌＪＣ９にサブクローニングした。得られたプラスミドはｐＡｌ（４と命名した。１）ＡＨ５０の１．７ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体（Ｃａ−ａ−１１−２の３．２ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩ［７ラグメントサフクローン、第２３図）を、ショットガン法を用い、５ａｎｅｅｒ（２３）の記載したジデオキシ法によって配列決定した。１）ＡＨ２プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　６０　ｉｃｇをＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、１．７ｋｂフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、上述したと同様にして精製した。このフラグメントｉ５ｍｅｇを、１４単位の７４−ＤＮＡリガーゼを含むリゲーションメジウム１０．Ｏｍｃｊ中、１４℃で１夜、さらに４℃で４日、それ自体とリゲートさせた。このリゲートしたＤＮＡを水浴中、２０秒パルスの超音波で計１００〜１４０秒間、小片に分割した。ＤＮＡ末端は、大腸菌ポリメラーゼ■ の大フラグメント（フレノウフラグメント）１５単位と、反応メジウム　（５０ｒａＨＴｒｉｓ　−ト１ｃｊ！　ｐＨ７。　５、１０ｍＭＭａＣ１２，１ｍＭジチオスレイトール、０．５％／ｌｄのウシ血清アルブミン：０．１ｎ＋Ｐｔ　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。ｄＣＴＰＳｄＴＴＰ）２５０ｍｃｊ！中、１４℃で２時間、修復した。エタノール沈殿によって濃縮したのち、この方法で前処理したＤＮＡを１％アガロースゲル上で分離し、サイズ範囲０．３５〜１．ＯｋｂのＤＮＡフラグメントを単離し、ｔｉｔＪした。このフラグメントを、３夜ｍ！で切断し脱リン酸化したバクテリオファージＭ１３ｍｐ８の複製型（２２）と１０倍過剰用いてリゲート（）、ついで大腸菌ＪＭＩＯＩを形質転換した。かくして得られた組換えファージの一本鎖ＤＮＡを単離し、合成オリゴヌクレオヂドを結合したのち、第二鎖の合成は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメントと４秤の各反応で実施した。各種組換えファージの挿入体の配列を、Ｃ，Ｐｉｅｌｅｒにより改良された５ｔａｄｅｎ　（２４）のコンピュータープＬ】グラムを用いて組合せ、全配列をめた。これを第２４図に示す。全く同様にしてプラスミドＤＡＨ４（Ｃａ−α１１−２からの２°４ｋｂ　５ａｒＴｉｌザブクローン、第２３図）の配列を決定した（Ｍ２Ｓ図）。８）発現プラスミドｐＲＨ１００の構築すでの１５１ｉＩＡ反応は、製造者が特定した条件下に実施した。７　ｉｃｇのプラスミドｐＥＲ１０３［Ｅｖａ　Ｄｗｏｒｋｉｒｉ　−Ｒａｓｔｌほか：Ｇｅｎｅ　２１（１９８３）２３７−２４８、ＥＰ−Ａ−０，１１５− ６１３］を５（ｌｅｌの反応メジウム中、υ１限エンドヌクレアーゼト（ｉｎｄＩ［［で線状化した。３７℃で１時間インキュベーションしたのち、５０ｒＡｃ１の２ＸＣＩＰ！ＩＩ衝液を加えた（２ＸＧ；ＩＰ緩ｉＰｊ液−２０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ９、２，０，２ｍＨＥＤＴＡ）、２単位のウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を加えたのち、５′末端リン酸残基を除去した。インキュベーションは４５℃で３０分間行った。４１ＣＪの０．５ＥＤＴＡ溶液を加えて反応を停止させ、Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐｉｔ８°０溶液ｉｏｍｃ、ｔ’を加えた。蛋白質をフェノールで２０、フェノール／クロロボルムで１回抽出して除去した。０．１容の３Ｍ酢酸ナトトリム溶液ｐｔ１５°５および２５０ｒＡＣ１のエタノールを加えて水相からＤＮＡを沈殿させ、ＤＮＡの沈殿を遠心分離したのち、７０％エタノール溶液で１回洗浄した。ＤＮＡを乾燥（）、このベレットを２０ｒａｃｌ！の＋Ｅ駿ｔｉ液（１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ８、Ｏ１１ｍＨＥＤＴＡ）に溶解した。合成的に製造したオリゴヌクレオヂド、ｄ　（ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴ）およびｄ（ＣへＴＣＴ丁■＾）のバッチ１ｍｃｇを反応溶液１ｒＤＣ１中、１０単位のＴ４−ＰＮＫ（ポリヌクレオチドキナーゼ）および１　ｍＨｒ　Ａ　Ｔ　Ｐを加えてリン酸化した。反応は３７℃で起こり、４５分間続けた。７０℃ に１０分間加熱して反応を停止させた。プラスミド溶液５ｍｃＩとリン酸化オリゴヌクレオチドをたがいに渥合し、７０ ℃に５分間加熱した。次に溶液を０℃に冷却し、２ｍｃ１の１０×リガーゼ緩衝液（５００ｒａＨＴｒｉｓ　、　ｐ）１７．５）　、１００１ＨＭｇＣｊ！　、２００ＩＨＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１ｍＨｒＡＴＰ。５００ｍｃｇ　／ｄ　ＢＡＳ　（ウシ血清アルブミン）および２１１ＣＪの水と１０単位の７４−ＤＮＡリガーゼを添加した。反応は４℃で４０Ｒ間続けた。７０”Ｃに１０分間加熱して反応を停止した。このリガーゼ反応液２ｒａｃ１を計３０１１Ｃｊ！の溶液中、１０単位の制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）により、３７℃で３時間消化した。７０℃に１０分間加熱して反応を停止させた。この反応混合物５ｍＣＵを計３０ｍＣ１中、１０単位の７４−ＰＮＫを加え、１４℃で１６時ラリす一トした。コンピテントな大腸菌Ｈｂ１０１の２００１ＣＪ！をこのリガーゼ反応液１０ｍｃＪ！と混合した。バクテリアを４５分間氷上に保ち、ついで２分間４２℃に加熱してＤＮＡを取込ませた。次にバクテリア懸濁液を０℃で１０分間、再びインキュベートした。最後に、形質転換したバクテリアを、アンピシリン５（ＭＣＩＩＩ／ｄ含有ＬＢアガール上に散布した。生成したバクテリアコロニーから、１２個を無作為に選択１）、それらからの１ −）ス”ミドｅ＜　Ｊｉ　’５１鏡的スクー・ルで単離した［Ｂｉｒｎｔ＋ｏｉｍ　＆　Ｄｏｌｙ：Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　１１ｅｓ、　７　（１９７９）１５１３・−１５２３］　ａ生成したＤＮＡを制限１ンドメクレアーゼ３　ａ　ｃ　ＩでＩＪＪ断し、ＤＮＡをアガロースゲル（１％、Ｉ　ＸＴＢＥ状＠液）Ｊ、で分離した。直線分子として約４．４００ｂｐ、：ｍｌ定されたＤＮＡの移動から３８　Ｃｌ認識部位がプラスミドに挿入されたことが確認された。ご４れらのプラスミドから１個を無作為に選択した。連携したーミ―フレバレーシコンからのＤＮＡで大腸菌ＨＢＩＯＩを再び形質転換ｌノだ１．生成しｌ二゛形質転換バクテリアから１個のコ［１：：一を選択１）、大規模に生育さぜた。それから１１１されたブラ゛スミドを制限エンドメクレアーゼＥｃｏＲＩおよび３　ａ　ｍ　ｌ−Ｉ　Ｎ　Ｆ切断し、ＤＮＡを１％アガ［Ｊ〜スゲ／＋／　、、にで分離し、小フラグメントをゲルから電気法的によって重陀した。このＥＣｏＲｌ−ＢａｍＨＮ　ＤＮＡ７ラグメント、約４６０１）Ｉｌ長を、Ｓａｎｇｅｒ　［Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒほか：　Ｐｌ’ＯＣ，Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　（１９７７）５４６３〜５４６７］に従って配列決定した。この方法で解析したプラスミドをｏ　ＲＨ１００と命名した。成熟ＣａＩＦＮ−α１の発現プラスミドｐＡｔ−１４／２の構築操作は第２８図に図式的に示す。５１１ＣＣＩのプラスミドｐＲＨ１００をＩＩＪ限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで完全に切断し、ついで５′末端リン醇残基をウシ小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で除去した。プラスミドｐＡ）１４　（例６参照）３０１ｃｏをＢａｍＨＩで消化した。ＤＮＡをアガロースゲル上、電気泳動で分離したのち、Ｃａ１ＦＮ−Ｃ１の全暗号配列を含有する０、６ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲルから分離し、精製した。これらの０．６ｋｂ　ＤＮＡフラグメント約ｉ　ｎ＋ｅｇを、切断ｐＲＨ１００ベクターＤＮＡ２５ｎｇと、リゲーションメジウム（６６吐Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ　ｐＨ７，２，０，１Ｍ　ＮａＣ１，１，０ｄ　Ｍ　Ｑ　Ｃ１，１ｍＨＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　。５ｍＮジチオスレイドール、０．５ｍ）Ｉ　ＡＴＰ）１０ｍｃｊ！中、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い、１４℃で２４時間リグートした。コンピテントな大腸菌ＨＢＩＯＩをこのリガーゼ反応液５１１ＩＣＩで形質転換し、アンピシリン５１１Ｃ！１／−を含有するＬ８アガール上に散布した。生成したバクテリアコロニーから、プラスミドを顕微鏡的スケールで単離し、各Ｎ酵素による制限解析でその特性を調べた。インターフェロン遺伝子およびトリプトファンプロモーターを同一方向に含有するプラスミドをｐＡｔ−１１０４と命名したく第２８回）。このプラスミドは、成ａｃａ　Ｉ　ＦＮ−Ｃ１の最終発現プラスミドの製造の中間段階を構成するものである。発現プラスミドｐＡｔｈｉ、Ａノ２−（７）　”Ａ　ＲプラスミドｐＡＨ４の０．６ｋｂ長３ａｒｎＨＩ７ラグメント約７０１ａ０１を、５′末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸基を付した合成オリボデ号キシヌクレオチドｄ　（ＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣ）　１　ｎ　ｍｏｌと混合し、水で総容厘を３４．２ＣＩとした。１５マーオリゴヌクレオチドは成熟イヌα−インターフェロンのＮ末端の５個のアミノ酸の暗号配列を含有する。ＤＮＡ溶液を１００℃に５分間加熱し、ついで冷却すると、この間に大過剰に存在するオリゴヌクレオチドがＤＮＡ−末鎖の相補的位置に結合する。第二鎖は、結合オリゴヌクレオチドブライマーに出発し、反応メジウム（５０１８Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐＨ７，５゜１０ｍＨＭｏｃｌ　、１畦ジチオスレイトール、０．５ｎ／メウシ血清アルブミン、各１ｍＨのｄΔＴＰ。ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ’丁Ｐ）７０１ｅＪ中、３５単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメントと２２℃で９０分間反応させて合成した。２０ｍＨのＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、蛋白質をフェノール／クロロホルム抽出によって除去した。０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ６を添加したのち、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、７０％エタ、ノー・ルで洗浄した。残った一本鎖ＤＮＡフラグメントはＳ１ヌクレアーゼで除去した。これは、乾燥ＤＮＡべ１ノツトを３１反応緩百液［４ｍＨＺｎ　（Ａｃ）　、３０ｍＨＮａＡｃ、２５０ａ＋ＨＮａｃＪ、５％グリセリンＤＨ４，６）３００ｍｌ中に溶解し、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ　）　１５０１１１位と１４℃で２時間インキュベートすることにより行った。２０＋ａＨＥＤＴＡを添加し、反応を停止させた。蛋白質をフェノールとクロロホルムで抽出して除去した。３Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．１５容および０．６容のイソプロパツールを加えたのち、０℃て水相からＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで洗浄した。得られたＤＮＡを６０単位のＰｓｔｌにより、３７℃で２．５時間消化し、ついで２％アガロースゲル中電気泳動によって分離した。約３００　ｂｐ長のＤＮＡフラグメントを単離し、Ｍ製した。プラスミド１）ＡＨ１０４の３０ｍｃｏを５ａＣＩ５０単位により３７℃で２時間消化し、７０℃に１０分間加熱して酵素を不活性化した。４種の全デツキジヌクレオチド０．５ｎＭと３０単位のタレノウポリメラーゼを添加したのち、混合物を常温で６０分間インキュベートして、ＤＮＡの末端をプラントにした。蛋白質をフェノールとクロロホルムで抽出して除去し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。得られたＤＮＡを２０単位のＰＳｔｌと３７℃で４０分間反応させて部分切断し、２Ｏｎ＋ＨＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。ＤＮＡをアガロースゲル中で電気ｖＸ＃Ｊによって分離し、４．３ｋｂ長の７ラグメントを単離し、Ｎ製した。得られたＤＮＡを上述した０、３ｋｂ長のＤＮＡフラグメントと、１０ｍＣｊ！のリグ−ジョンメジウム中、１０単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて１４℃で２０分間すす一トさせた。このリガーゼ反応液で大腸菌Ｈ８１０１を形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ培地上で平板培養した。産生じたバクテリアコロニーを新鮮なアガール板に移し、アガール板上に置いたニトロセルロースフィルターに二重に遷移させた。３７℃でインキュベートしたのち、バクテリアをａｒｕｎｓｔｅｉｎとＨｏｇｎｅｓｓ　［８，Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　＆Ｄ、ｌｌｏｇｎｅｓｓ：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｅａｄ、ｓｃｔ、ＵＳＡ　（１９７５）Ｌユ、３９６１〜　）の記載した方法に従って溶菌し、変性後、ＤＮＡをニトロセルロースに結合させた。細胞屑は、前洗浄溶液（’ＩＭ　ＮａＣ１，５０ｎ）ｌ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐ１１８．０．１ｍＨＥＤＴＡ、００１％ＳＯ８＞中６５℃で１６時間インキュベー１−シて除去した。ついでフィルターを、ハイブリダイゼーション溶液［０，９Ｍ　ＮａＣ１，９０ｍＨＴｒｉｓ　−ＨＣｊ！　ｐＨ７，５，５ａ＋ＨＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、　０．１ｎｅｇ　／ｄ、Ｕ）人ｒＱ菌ｔ　ＲＮＡ　（Ｓｉｏｍａ　）　］　１０ｄ中、２　Ｘ　１０７ｅｐｍ　”’Ｐ　−標識オリゴデソキシヌクレオチドｄ　（ＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣ）と４７℃で３時間ハイブリダイズした。オリゴヌクレオチド１ｓｐｎ＋ｏ１を［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｌ　１０１、ＡＩｅｒ３ｈａｌｌｌ）　１　ｓｐ　ｍｏＪと、リン酸化緩衝液（７Ｃ）＋ＨＴｙｔｓ　−ＨＣｊ！　ｐＨ７，６，１０ｍＨＭＯＣｉ’２、５ｍｏ　ジチオスレイトール）２０＋ａｃＩ中、１０単位のＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼとともに、３７℃で４５分間インキュベートした。２５ｍＨのＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、導入されなかった放ｏ４能は１１１ｄｌのＢｉｏｇｅｌ　Ｐ　６−　Ｄ　Ｇ　（Ｂｉｏｒａｄ）カラム上排除クロマトグラフィーによって除去した。フィルターを４７℃で３０分間、４回洗浄した。洗液はｔＲＮＡを含まないほかはハイブリダイゼーション溶液と同じとした。フィルターをＫｏｄａｋ　Ｘ　− ｏｍａｔレギュラー増感フィルムを用い、−８０℃でにｏｄａｋ　Ｘ　−０１１１ａｔＳ　Ｘ−線フイルムに露出した。オートラジオグラムで陽性ハイブリダイゼーションシグナルを生じたバクテリアコロニーからミニプレバレージョン操作でプラスミドＤＮＡをｉ離した。このプラスミドを）（ｉｎｄＩ［Ｉと３８ｍＨＩで完全に切断した。アガロースゲル中で電気泳動により分離したのち、０．５ｋｂ長の制限フラグメントを単離し、Ｓａｎｇｅｒに従って配列解析を実施した。所望の構造を有するプラスミドを１）ＡＨ４／２と命名した。これは成熟Ｃａ１ＦＮ−Ｃ１の大腸菌内発現を可能にする。す１ｌ−ＬＬ先主上ＪｄＬ先乙Ｊ且）１Ｃａ　Ｉ　ＦＮ−Ｃ１のバクテリア発現のために操作したプラスミドＤＡＨ４／２　（例９）からの遺伝子を、ＩＪＩＩあたりのコピー数が多く、プラスミドの安定性が高い改良プラスミドベクターｐａ　ｒ　ｐＡＴＥＲ１０３（例Ｋ）にサブクローニングした。ｐＡＨ４／２のＨｉ　ｎｄｌｌ［／Ｂａｍ１−１１７ラグメント、０．５ｋｂ長（例９）約０，５ｎｅｇを、予めｆ（ｆ　ｎ　ｄ　■とＢａｒＴＩＨＩで切断し、ゲルＩ！したプラスミドベクターｐａｒｐＡＴＥＲ１０３の２５ｎｏと、１０ｍｅＪ＋７＞ＩＪゲ−ジョンメジウム中５Ｉｉ位のＴ４−ＤＮＡリガーゼとともに、２２℃で３時間インキュベ・−トした。コンビ−テントな大腸ＶＪＨＢＩＯＩを上記リガーぜ反応液５１１Ｃ１で形質転換し、アンピシリン５０ｍｃｇ／ａ＋ｆ！含右ＬＢアガール上で平板培養した。産生したバクテリアコロニーから、６個を無作為に選択し、それからプラスミドを顕微鏡的スケールで単離した。各ＦＪ！ＩＪＩエンドヌクレアーゼによる制限解析により所望の構造を示したプラスミドｐ　Ａ　ｌ−１４／　３と命名した。バクテリア培養液１００ｄを３７℃で激しく振虐しながら、１ス下に特定する６００ｎ口での光学密度が達成されるまで以下のトリプトファンを含まないメジウム［ｍはメジウム１ｉ中：　（ＮＨ４）２Ｐ０４１０ｇ、３．５ｇＫＨ２ＰＯ４（ＮａＯＨｒｐｉ１７．３１．、する）、ＮａＣｊ！０°５ｇ、カサミノ酸（酸性加水分解）２１ｇ、グルコース１１ｇ、ＭＯ８Ｏ１ｍＬ　ｃａｃ１２０°１　ｍＮ、チアミン塩Ｒ塩１η、Ｌ−システィン２０す、３−β−・インドールアクリルＭ（ＩＡＡ、）−リブトファンオベロンのインダクター）２０ｍ９、必要に応じてアンピシリン５０〜１００１！！！Ｊ］中でインキュベートした。ついで５分間４．０００ｒｐｌＩｌで遠心分離してバクテリアをベレット状にし、培養容ωの１／１０の氷冷５０ＩＤ）ｌＴｒｉｓ　−ＨＣｊ！　ｐｕｓ、　０．３０ｍＨＮａＣ１に７濁し、氷冷しながら、超音波ブＯ−へ（２０ｋＨｚ　：　１００ｗａｔｔ）を用いて３０秒間、２回破壊した。細胞層をｉｏ、ｏ。０ｒｐｉ（４℃）で１０分間遠心分離して除去し、残留物を滅菌′ｔｉ過したのち、上澄液について、水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）の細胞変性作用（ＣＰＥ）を測定する定石法でインターフェロン活性を調べた。試験系：Ａ−７２（ＡＴＣＣＣＲＬ１５４２）イヌ腫瘍／水泡性口内炎ウィルスプラスミド　０Ｄ６ｏｏ、ｌ　ＩＦＮ単位／１細菌培養液ｐＡＨ４／２　４．２　３．２Ｘ１０５ｐＡＨ４／３　３．２　３．０ｘ１０５クラスＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−ωのインターフェロン遺伝子と高いホモロジーを有するイヌゲノム中の配列の総数を検知するには、次の操作を用いた。高分子岳イヌＤＮＡ　（例１）２０ｍｃｏを反応容５１２０ＱＩｌｆＪと１ノで相当づるｉ！、ＩＪ限酵素６０単荀で完全に消化し、各トレースにこの切断ＤＮＡ１０＋１１Ｃ！］を取って０．８％アガロースゲル上、サイズにより分割した。Ｖサン法によってニトロセル［コースフィルター上に遷移させたのち、ＤＮＡを変性、固定し、各フィルターを約６Ｘ１０６Ｃｐ１ｍのニック１−ランスレージョンＤＮＡブロー１とハイブリダイズした（６５℃で１７時間、５ＸＳＳＰＥ、５×デンハル１−溶液、０°１％ＳＤＳ、変性サケ精子ＤＮＡ　２０１１！（４］　、’ｔｒＪ、例４参照）、Ｃａ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−αの場合、プローブにはインターフェロンの全暗号配列４：含有づるプラスミドＤＡＨ４の０．６ｋｂ長３ａｍｌｌ！フラグメントを使用した。ＥＱＩＦＮ−ωの場合はプラスミドｐ　Ｒ＋１６１からの２，１ｋｂＥＣＯＲ１挿人体をプローブに使用した。Ｃａ１ＦＮ−Ｃ１とハイブリダイズしたフィルターをついで、緊縮条件）、０．３ＸＳＳＣ（４５０ＨＮａＣ１，４，５ｍＨクエン酸ナトリウム）、０．１％Ｘ５ＤＳにより、６５℃で４５分間、４回洗浄した。ＥＱＩＦＮ−ωとハ・イブリダ・イヌ１７だフィルターは、６５℃で２ｘＳＳＣ（０，３Ｍ　ＮａＣ１，３（ＩＨクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳにより、６５℃で４５分間４回０．３ＸＳＳＣ（４５ｍＨＮａＣ１，４，５１１１Ｈクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳにより洗浄した。ＥＱＩＦＮ−ωとハイブリダイズしたフィルターは６５℃で２ｘＳＳＣ（０，３Ｍ　ＮａＣ１，３０１１ＩＨクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳにより洗浄した。オートラジオグラフィーはにｏｄａｋ　Ｌａｒｉｅｘ−Ｒｅｇｕｌａｒ　！ｉ感フィルムを用いＤｕＰｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　Ｘ−線フイルム上に、−８０℃で７日間実路した。オートラジオグラム（第２９図）は、他の秒におけるインターフェロンクラス内にもみられるようなＣａ１ＦＮ−Ｃ１と類似の高いホモロジーを有するイヌゲノムには、同一性α−インターフェロンをコードする２本鎖のほかに他の配列は検出できない。ウマω−インターフェロン遺伝子のＤＮＡの場合には、むしろもつと弱い緊縮条件下で、少なくとも１個の、上述のイヌのα−インターフェロンとは異なる遺伝子が検出できる。ニングおよび配列決定ヒトα−ＩＦＮプローブ（例り、Ｅ）に弱くハイブリダイズしたラムダ−クローンＥＱ−α１６の５．５ｋｂＥｃｏＲＩ制限フラグメント（第３０図参照）をプラスミドｐＬＪｃ８のＥＣＯＲ１部位にサブクローニングした。大腸菌ＪＭ１０１をリゲーション混合物で形質転換した。正しい挿入体を含む、待られたプラスミドをｐ　ＲＨ６２と命名した。プラスミドｐ　Ｒｌ（６２のＥＣ０ＲＩ挿入体を７ガロースゲルから単離し、例Ｇに記載したショットガン法を用いてＭ１３ｍｐ８中にサブクローニングした・大腸菌ＭＪＩＯＩの形質転換後に得られたファージブラーりをＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓ（１９）＋７）方法＆’：　、Ｊ：　リ二ｌ−Ｏｔ　Ａ／ロース膜上に移した（例り参照）。ＥＱＩＦＮ−Ｃ１の全暗号領域を含有するプラスミドｐＲＨ６１の１，０ｋｂＨｉ　ｎｄＩｆｆフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションシグブルを生成する組換えＭ１３ファージを−・本ｆｉｌＩＤＮＡの単離用に選択し、Ｓａｎｇｅｒの方法で配列を決定した。ヒトα−ＩＦＮプローブ（例り、Ｅ）にハイブリダイズしたラムダクローンＥＱ −α２４の３．２ｋｂｔ−ｉｉｎｄｍυ】限フラグメントをプラスミドｐＵＣ８のＨ＋ｎｄ１１部位にサブクローニングした。大腸菌ＪＭＩ０１の形質転換後に得られた、正１ノい挿入体をもつプラスミドをＤＲＨ８３と命名（）た。同様にｊノで、ラムダクローンＥＱ−α９の２．８ｋｂ　Ｈｉ　ｎｄｌｌｒ！ＩＪ限７５グメントをｐＵｃ８にりＤ−ン化し、１７られた組換えプラスミドをｐＲＨ８２と命名した。これらのプラスミドのＨｉ　ｎｄｌｌＩ挿人体を上人体ショットガン法を用いてＭ１３ｍｐ８にサブクローニングした。大１１ＪＭＩＯＩの形質転換後に得られたファージをａｅｎｔｏｎとＤａＶｉＳの方法を用いてハイブリダイズした。成熟ＥＱＩＦＮ−α１をコードする配列を含有するプラスミドｐＡｌ−１５２／２の１、Ｏｋｂ　ＨｉｎｄｌｌＩ−ＢａｒｎＨＩフラグメントを一本鎮ＤＮＡの単離に使用し、Ｓａｎｇｅｒの方法で配列を解析した。百勢− フ・０−ノ、、−ＨｕｌＦＮｃ、２　）−（ｕｌＦＮ１３ＦＩＧ、２゜ λεｑｃｔ１ＡＨ５０ＦＩＧ、３゜ λＥｑβ６ＡＨ６０＃　Ｍ　Ｎ＃　０１７１　ｃｌ）！’−１７）　＋６　１０　ｅ　％６　１５％Ｄ　’ａ　ψ　ψ　叩　ｈリーマ肖〜−００口ｈ１いマｈ１／Ｔ　Ｆ−Ｆ＋　ｎｏＩＸ）　％１３　スル口ａ＞　ｗ　ｗ　−０’＋へ１−−１０−−：　ｌ＋１１”’１寸ＶいＯトヘψう００胛〜肖−ザＦＩＧ、　７３゜ＦＩＧ、　７５゜ＥＱＩＦＮ−（メ１１′−中ｌ′Ｎ、＋、、＋　「ｑｌＦＮ−ｐつυ　−リ　ＣＬＩＪ　：ｌ（５１−リ　ｔｐｉ　”−リ　つＩ−Ｌ＋じ　−＋ｔ、ｅ、リ　− 鴫くり　＞　１．：３１−１＋　リｔｐ　ｗ＜　リυフリ　α１−ｒ−ｕｌ″Ｊく　呻Ｃゆり　−く　ぃくａ＋ヒ　Ｍ＜１０←　−ベ　−リ　（ｔっ　−リ　嶌く、＋Ｊリ　＜　＋５　＞　＋５　＋５リ　ベリ　クク＜リ　−くＵｎ＜ａｌｌ −ｎｕ：ｆｆＬＪ−ＵＣ＜ｃ＋ｓ＜ｏ＋（５Ｌ−（ｅ　＋−＋＞　＜　−−−１ −−＝ｔ、　ｙ　＜　Ｉ−Ｌｌｌｌ　Ｌ　ｕ＜ｆｔ　偽１−Ｊ＜ｔ５Ｌ：ｌ　リＣ］　叱ρす・　情り　くべビｑｒＦＮ−ｃｃ３ＴＧＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＡＣＡＴＧ　ＡＧＧ　ＡＧＡＴＴＴ　ＧＧＡ　ＴＴＣすｒｏ　Ｇｉｎ　ＡｌａＣＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＣｒｌｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　１ＡＴＣＣＡＡ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＴｌＣＣＡＣＣＴＣＴＴＣＧｌｎ　Ｇ１ｒ＋　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　１−ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ｃＶａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｔｒ　丁ｈｒ　ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｈｅｔ　ＡｓｎＧＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＣＣＣＣＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＣｈｒ　ＡＳｎ　ＬｅｕＣＡ　ＡＡＣＴＴＧＡ丁Ｃ丁ＣＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴ−ＧＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＧＡＣＧＧＣ１１ｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　）（１ｓ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＡＴＣＴＧＴ　ＧＣＧ　ＧＴＣＣＡＴ　ＧＡＧ　ＡＣＧＡＧＣＡＣＡ　ＧＡＣＧＧ（丁ＣＧ　丁ＣＴ　ＧＣＴＧｌ（Ｊ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＶａｔＧＡＧ’ＧＡＣＴＣＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ１３０　’　１３５Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　１ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＴＡＡ（ｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　）（１ｓＴＧＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＡＣＡＳｎ　Ｇｌｒｖ　ｐｎｅ　Ａｒ９　ＬｙｓＡＡＣＣＡＧ　ＴＴＣＣＧＧ　ＡＡＧ１１ｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　１１ｅ　ｐｈｅＡＴＣＣＡＡ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＴＣＡｌａ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　５ｅｒＧＣＣＴＧＧ　ＧＡＣＧＡＧ　ＡＧＣＧｌｎ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌ（ＪＶａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒ。ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＣＣＣＡｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＧｉｎＡＧＧ　ＡＧＡ　ＴＡＣＴＴＣＣＡＡＳｅｒ　Ｐｎｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　５ｅｒＴＣＣＴＴＣＴＣ丁　ＴＣＡ　ＴＣＣｌｏ　１５１　Ｐｒｏ　Ｇｌｒｉ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａ−１−８１５Ｇｌｕ　Ｔ１１ｒ；　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＣＡＴＣ丁ＣＣＧＣＧ　ＧＴＣＣＡＴ　ＧＡＧ　ＡＣＧｌ　８５　９０Ｌｅｕ　ＨｅＴ：　Ａｓｒｉ、Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＶａＩＣＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＣＧＡＧ、ＧＡＣＴＣＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ１３０　ｉ３５】６０Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｒｉ　Ｓｅｒ　＝ＡＣＡ　ＡＡＣＴＴＧ　ＣＣＧ　ＣＡＡ　ＡＧＴ　ＴＡＡＨ：　Ｈｉｎｄエエエ、Ｓ：　５ａｅ１国際！＋１葺報告シ−ｈ−−１Ｎ−丸ｔｉｅｗａ、＋’ｗｓｍｕｓ、Ｎ：Ｔ、１ＥＰ８５／（８１ η６ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　τＨＥ　ＩＮＴＥＲＲＩＡＴ’ｒＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＪ（ＲＥＦＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲざ八Ｔて０ＮＡＬ　八Ｉ’ＰＬＩＣＡＴＩ○ ＮＮＯ，ＰＣＴ／ｉ球　奢３５１００７１６　（ＳＡ　１１６９６）ｅｐｏｒｔＷＯ−Ａ−ｆｌｏ０２３７ｓ　１３／１１／８０　ＥＰ−Ａ−００２７７９３０６１０５／１３１ＵＳ−人−４２６２０９０１４１０４／８１　Ｎｏｎ＠ [The reaction was stopped by heating to 70°C for 10 minutes. After adding 0.3 M acetate pH 6.0, the DNA was precipitated with 2.5 volumes of ethanol. After dissolving in TE buffer again, apply on a 0.45% agarose gel with TBE buffer (10.8 g/j!Trts, 5.59/l boric acid, 0.93 g/J Na2EDTA) about 1 volume/α. The DNA was subjected to overnight electrophoresis using a microcomputer, and the DNA was separated by size. rhinoceros Using a gel marker (lambda DNA double digested with EcoRI and lndIII, and digested with @indIII), DNA of 10 to 2 akb length was extracted into a gel fraction. The DNA was electrophoretically eluted from the gel, dialyzed against 300 volumes (buffer 0.1x TBE) for 3 hours, and purified on an elutip-[) column (Schleieher & 5ehill) according to the manufacturer's instructions. It was then precipitated with ethanol. On the one hand, it leads to artificial hybridization of dog DNA sequences, and on the other hand, it leads to too large and lambduff Size-fractionated canine DNA fragments were used to prevent self-ligation of canine DNA fragments, which would result in DNA fragments that could not be loaded into the phage. The fragment was dephosphorylated. For this, the DNA was incubated with 5 units of bovine small intestinal phosphatase for 30 min at 37°C in a reaction medium (50 mHTris-HCJ pH 9,5,1, OmHMQCj!, 0.1+H zinc acetate, 111IN spermidine) at 140 mcA. An additional 5 units of enzyme were added and the entire reaction was incubated for 30 minutes. After adding EDTA to a final concentration of 25IIIH, the DNA was chloroformed once with phenol/chloroform/isoamyl alcohol (24/24/1 volume). Extracted twice with lum/isoamyl alcohol (24,/1 volume) and 30 times with diethyl needle, then precipitated with ethanol, dried and 0.1xTE! ! It is dissolved in rice liquid. 3) In the dog genome, DNA fragments of 10 to 23 kb in length were transferred to lambda vectors, e.g. The internal 3arnl-1 [fragment of the target DNA was removed (7) and cloned into lambda-EMBL3 or 3A (3) with a G-A-TC cohesive end. E. coli strains such as E. coli NM52 6.538 or 539 (3) were grown in LB medium (20) with 5118 MQS O4, precipitated with polyethylene glycol, and subjected to two C3Cj! vague gradient centrifugation fractions (solution 1 0.71 gesc! per ml, 40 hours, 4.50 Orpm, 20°C). After dialysis against TE [li solution, the phage DNA was purified twice with phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25/24/ Proteins were extracted twice with chloroform/isoamyl alcohol (24/1 volume). White matter was removed, precipitated with ethanol, and concentrated. To prepare the terminal fragment of EMBL3A (q), phage DNA 50fflcQ was incubated with BamHI in reaction medium (101118TriS-1-ICJpH7,5,'IOmHMgC1,1m)l dithiothreitol>4501QCI for 2 h at 37°C. The reaction was then stopped by adding 15 n HEDTA and heating to 70°C for 10 minutes, and the DNA was precipitated with ethanol. To prevent re-ligation, the intermediate fragment was cut again with EC0RI. The dropped oligonucleotides were removed by isopropanol precipitation. The BamHI-digested lambda DNA was completely digested with 10118 Tris-HCIH7,5, 100 nH NaC1,10IIIN, and 15+sHEDTA was added and heated to 70°C for 10 minutes. The reaction was stopped. After adding sodium acetate to a final concentration of 0.3 M, 0.6 volume of isopropanol was added at 0°C for 15 minutes to precipitate the large DNA fragment of 3) 1. It was washed twice with 10.6 volumes of 0.45 M sodium acetate isopropanol and once with 0.3 M sodium acetate/2.5 volumes of ethanol, and dissolved in 15 mcJ of O,IXTE mild surface solution. The BamHI/ECORI linker remains in solution during this operation. The EMBL3A fragment (811C) was combined with approximately 5 mcg of 10-23 kb canine DNA and 10 units of 74-DNA ligase (NEN) and added to ligation medium (66IllHTris-HCl pH 7,2,0, IM NaCj!, 1O11HMQC1 , 111IHEDTA, 5mH dithiothreitol, 0.5IBHATP) 50I! ej! Incubate overnight at 14°C and 1 day at 4°C. The ligated DNAC compounds were loaded into mature lambda phage particles in vitro using the lambda loading system (27). The components of this system, namely ultrasound extract (SE), freeze-thaw lysate (FT L), binding solutions M and A, were prepared according to the literature (27). Part of the ligated DNA mixture 101Cj! ! was thawed from ice for 30 minutes in the same way as FTL, incubated with 5E25111CJ for 2 minutes at room temperature, and then FTL100mej! was added and the mixture was incubated again for 60 minutes at room temperature. Filling mixture The compound was diluted with lambda diluent (100nHTris-HCj!1)H7,5,10mHMono4.1mHEDTA)150a+eI and stored at 4°C. A small amount of loaded lambda phage was spread onto the Ohta strain NM528supF. This person The method produced approximately 1 x 10 6 independent canine DNA recombinants. The remainder of the filler material was plated and grown on NM528 at a concentration of 30,000 plastic forming units (pfu) per LB/MQS0,7jj-le plate 13.5aRS. 4) Canine genetics Liveta IJ fyyβ-(7), / star feron gene sequence Cleaning Contains the canine interferon gene! lt! To identify the Ae phage, the nucleotide molecule shown by the Southern method (17) was combined with the radiolabeled human IFN-α gene. I used Morology. Polymeric canine DNA 10n+co was completely erased with ECORI or ) (indI[I). separated by electrophoresis on a 0.8% agarose gel, and separated by nitrocellulose film. Moved to filter. Originating from the expression plasmid pER33 (14), the mature human A p32-labeled DNA fragment was prepared from the 845 bp HindI fragment containing the entire protein coding region of feron α2ARG by a standard method (25). The nitrocellulose filter was made of 5X SSPE (0,9M NaCl, 50nH NaHPO4, 5mHEDTA, pH 7,4), 5X Denhardt's solution (0,1% Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% bovine serum albumin) 0.1 %SDS, 20+ll! Pre-hybridize in F/- salmon roe DNA at 65°C for 7 hours, then add the labeled protein in the same solution except without salmon roe DNA. Hybridized with Lobe 13 x 106 cpi. After overnight incubation at 65°C, filters were washed 4 times for 1-1.5 hours at 65°C in 3 x 5SG (0.45M NaCl, 45mN sodium citrate), 0.1% SDS and treated with Kodak regular. A sensitized film was used and exposed to Kodak X-oiat 5-XtaV illum for 7 days (Figure 21). The appearance of several bands has previously been observed in cattle and cattle. It was suggested that this is the same family of canine α-interferon genes that has been detected in dogs and humans. Therefore, screening for interferon genes in canine DNA libraries The same hybridization conditions were used for the analysis. Recombinant lambda phages of i, ooo, ooo were plated on E. coli NM528 at 30,00 Opfu/plate 13.5z(7)9 degrees. Two-fold nitrocellulose replicas were prepared from each plate using the method described by B(!n tOn and Davis (19)). After heating to 80°C for 2 h, the filters were injected with 1M NaCj!, 10d Tris-Hcj! The filters were washed for 1.5 hours at 65°C in pH 8, 0.0, 1% SDS, subjected to overnight hybridization as described above, and each filter was treated with 1.5 x 106 cpIm of radioactive α-interferon probe and 24 Time hybridization was performed. After repeating the screening three times, the 9gA canine α-interferon loans were obtained and these gave a positive hybridization signal. 5) Characteristics of recombinant phage Phage DNA was prepared from nine recombinants hybridized with human α-IFN. The DNA was digested with EcoRI, BamHL Hindm, PStl, Sazm, Sat I and SamlT, and run on an 8% agarose gel in Ol. It was separated by pneumophoresis. The size of hybridized fragments was determined by the Southern method. The fi11m site within the lambda insertion body is the one described by Rackwitz (4). Using a partial restriction digestion of lambda DNA, labeling of the right or left end of the lambda branch with synthetic p32-labeled oligonucleotides, and 0.45% agarose gel. Its position was determined by electrophoresis in a single cell. Obtaining clone Ca-α-11-2 The restriction enzyme map obtained was hybridized with the human α-interferon marker in Figure 22. Two υj-limited fragments of clone Ca-α11-2 were induced by oBR322. The conductor was subcloned into the multiple restriction enzyme cloning site of pUC9. Insertion of the foreign DNA fragment is carried out by β-galactosidase j! The acZ3m gene is impaired, and the phenotype of E. coli strain JM101 transformed with this plasmid therefore changes from 18C+ to JaC-. Because it lacks β-galactosidase function, JMlol induced with isopropylthiogalactoside (IPTG) degrades the colorless substrate analog 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside <BCIG). It was not possible to give a blue dye. Therefore, bacterial colonies of the 1 aC-phenotype can be recognized by their white color. 3.7kb Hindll [7 fragments of D-NEQ-α1 are agarose gel m? on the eluNp-Q column. J, cut with Saml and remove the Ligated with oxidized 111) LIC940nO at about a 10-fold molar excess. E. coli JM101 was transformed with L White colonies were grown overnight at 37° C. in L8 medium 57 containing O81/d ampicillin poured into Tubuagar, and inserted fragments were screened by the plasmid minibreamination method (25). The thus obtained plasmid The pA) was named pA)12. Similarly, the 2.4 kb $a rnl fragment from the same lambda clone was subcloned into plJC9. The resulting plasmid was named pAl(4).1) The 1.7 kb HindIII insert of AH50 (3.2 kb HindII of Ca-a-11-2 [7-ragment suffu clone, Fig. 23) was inserted into a shotgun. The sequence was determined using the dideoxy method described by 5aneer (23). Ta. 1) 60 icg of AH2 plasmid DNA was completely digested with HindIII and the 1.7 kb fragment was isolated from a 1% agarose gel and purified as described above. This fragment i5meg was added to a ligase containing 14 units of 74-DNA ligase. Shonmedium 10. It was ligated with itself in Omcj overnight at 14°C and then for 4 days at 4°C. The ligated DNA was fragmented into small pieces with 20 second pulses of ultrasound in a water bath for a total of 100-140 seconds. The DNA ends were treated with 15 units of the large fragment of E. coli polymerase (Flenow fragment) and reaction medium (50 raHTris-1cj! pH 7.5, 10mM MaC12, 1mM Distillate). Thiothreitol, 0.5%/ld bovine serum albumin: 0.1n+Pt d ATP, dGTP. dCTPSdTTP)250mcj! It was cured for 2 hours at 14°C. ethanol After concentration by gel precipitation, the DNA pretreated in this way was placed on a 1% agarose gel. size range 0.35-1. The Okb DNA fragment was isolated and titJed. This fragment, 3 nights! bacterium cleaved and dephosphorylated with A 10-fold excess of the replicative form of lyophage M13mp8 (22) was used to ligate () and then transform E. coli JMIOI. After isolation of the single-stranded DNA of the recombinant phage thus obtained and ligation of synthetic oligonucleotides, the synthesis of the second strand was carried out in four separate reactions with the Flenow fragment of E. coli DNA polymerase. Ta. The sequences of the inserts of various recombinant phages were combined using the computer program of 5taden (24) improved by C. Pieler to obtain the entire sequence. This is shown in FIG. In exactly the same manner, the sequence of plasmid DAH4 (2°4kb 5a rTil subclone from Ca-α11-2, Fig. 23) was determined (M2S Fig.). 8) Construction of expression plasmid pRH100 The previous 151iIA reaction was The test was carried out under specified conditions. Plasmid pER103 [Eva Dworkiri-Rast et al.: Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0,115-613] of 7 icg was incubated with υ1 limited endonuclease (ind I [ After incubation for 1 hour at 37°C, 50 rAc 1 of 2X CIP!II buffer was added (2XG; IP buffered iPj solution - 20 mHTris pH 9, 2,0,2 mHEDTA), 2 units of bovine small intestine. alkaline phosphata After adding enzyme (CIP), the 5' terminal phosphate residue was removed. Incubusi The reaction was carried out at 45°C for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 0.5 EDTA solution of 41CJ, and IM Tris, pit 8°0 solution iomc, t' was added. egg White matter was removed by extraction with phenol 20 times and phenol/chloroborum once. 0.1 volume of 3M sodium acetate solution pt15°5 and 250rACl of ethano The DNA was precipitated from the aqueous phase by adding water, and the DNA precipitate was centrifuged and washed once with a 70% ethanol solution. Dry the DNA () and add this pellet to 20 r acl! It was dissolved in +E Shunti solution (10mH Tris pH 8, O11mHEDTA). A batch of 1 mcg of the synthetically produced oligonucleotides, d (AGCTTAAAGATGAGCT) and d (TCT to C), was mixed with 10 units of T4-PNK (polynucleotide kinase) and 1 mHr AT in a reaction solution of 1 rDC1. Phosphorylation was performed by adding P. The reaction took place at 37°C and lasted for 45 minutes. The reaction was stopped by heating to 70°C for 10 minutes. The plasmid solution 5mcI and the phosphorylated oligonucleotide were combined and heated to 70°C for 5 minutes. The solution was then cooled to 0 °C and added with 2mc1 of 10x ligase buffer (500raHTris, p) 17.5), 1001HMgCj! , 200 IHDTT (dithiothreitol), 1 mHrATP. 500 mcg/d BAS (bovine serum albumin) and 211 CJ of water and 10 units of 74-DNA ligase were added. The reaction continued for 40R at 4°C. The reaction was stopped by heating to 70"C for 10 minutes. 2rac1 of this ligase reaction solution was added to 10 units of restriction enzyme in a total of 3011Cj! The cells were digested with endonuclease SacI (New England Biolabs) for 3 hours at 37°C. The reaction was stopped by heating to 70°C for 10 minutes. 10 units of 74-PNK was added to 5 mCU of this reaction mixture in a total of 30 mC1, and the mixture was stirred at 14°C for 16 hours. 2001CJ of competent E. coli Hb101! This ligase reaction solution is 10m cJ! mixed with. The bacteria were kept on ice for 45 minutes and then heated to 42°C for 2 minutes. It was heated to incorporate DNA. The bacterial suspension was then reincubated at 0°C for 10 min. Cubated. Finally, the transformed bacteria were sprayed on LB agar containing ampicillin 5 (MCI II/d). From the generated bacterial colonies, 12 were randomly selected 1) and 1-) <Isolated at Ji '51 mirror school [Birnt+oi m & Doly: Nucl, Ac1ds 11es, 7 (1979) 1 513·-1523] a The generated DNA was digested with IJJ restriction enzyme 3 a c I, and the DNA was separated on an agarose gel (1%, IXTBE solution). About 4.400 bp as a linear molecule: Is the movement of DNA determined by ml? It was confirmed that the 38 Cl recognition site was inserted into the plasmid. One of the four plasmids was randomly selected. Transform E. coli HBIOI again with the DNA from the linked me-flavored silicone.1. Generate two transformed viruses. One koteria [1::1 selected 1) from Cacteria was grown on a large scale. The 111-celled brosmids were then digested with restriction endomecleases EcoRI and 3aml-INF, the DNA was separated on 1% agar [J~Suge/+/,,,,,, and small fragments were removed from the gel. It was imposed by the Electricity Law. This ECoRl-Ba mHN DNA7 fragment, approximately 4601) Il long, was sequenced according to Sanger [F, Sanger et al.: Pl'OC, Order Na, Acad, Set, (1977) 5463-5467]. The plasmid analyzed by this method was named oRH100. The construction procedure for the expression plasmid pAt-14/2 for mature CaIFN-α1 is schematically shown in FIG. Plasmid pRH100 of 511CCI was completely cut with the IIJ restriction endonuclease BamH I, and the 5'-terminal phosphorus residue was then removed with calf intestinal phosphatase (CIP). Plasmid pA)14 (see Example 6) 301co was digested with BamHI. After separating the DNA by electrophoresis on an agarose gel, the entire coding sequence of Ca1FN-C1 was isolated. A 0.6 kb DNA fragment containing the sequence was separated from the gel and purified. These 0.6 kb DNA fragments, approximately in + eg, were mixed with 25 ng of cut pRH100 vector DNA and ligation medium (66 mL Tris-HCj pH 7, 2, 0, 1 M NaCl, 1,0 d MQ C1, 1 m HE D T A , 5 m N dithiodine). Sley Doll, 0.5m) I ATP) 10mcj! The mixture was ligated at 14°C for 24 hours using 10 units of T4 DNA ligase. Competent E. coli HBIOI was transformed with this ligase reaction solution 511ICI, and ampicillary N511C! Sprayed on L8 agar containing 1/-. Plasmids were isolated on a microscopic scale from the resulting bacterial colonies and characterized by restriction analysis using each N enzyme. interferon genes and avian The plasmid containing the putophane promoters in the same direction was named pAt-1104 (No. 28). This plasmid is the final source of adult aca I FN-C1. It constitutes an intermediate step in the production of the current plasmid. Expression plasmid pAthi, Ano2-(7)'' The 0.6 kb long 3arnHI7 fragment of AR plasmid pAH4, approximately 701a01, was combined with a T4 polynucleotide at the 5' end. It was mixed with 1 nmol of synthetic oligonucleotide d (TGCCACCTGCCCGAC) to which a phosphate group was attached using nucleotide kinase, and the total volume was made up to 34.2 CI with water. The 15-mer oligonucleotide is a mature canine α-interferronucleotide. Contains the coding sequence of the N-terminal five amino acids of the protein. The DNA solution is heated to 100° C. for 5 minutes and then cooled, during which time the oligonucleotide present in large excess binds to complementary positions on the DNA-terminal strand. The second strand starts with a bound oligonucleotide primer and reacts with a reaction medium (501 8Tris-HCl pH 7,5°10 mHMocl, 1 molar dithiothretate). dΔTP, 0.5n/bovine serum albumin, 1 mH each. dGTP, dCTP, dT'DingP) 701eJ, 35 units of E. coli DNA poly It was synthesized by reacting with the Flenow fragment of E. melaseae at 22°C for 90 minutes. The reaction was stopped by adding 20 mH EDTA and the proteins were removed by phenol/chloroform extraction. 0.1 volume of 3M sodium acetate solution pH 6 was added. First, the DNA was precipitated with ethanol and washed with 70% ethanol and 70% ethanol. The remaining single-stranded DNA fragments were removed with S1 nuclease. This was done by dissolving 1 knot of dried DNA in 300 ml of 31 reaction solution [4 mHZn (Ac), 30 mH NaAc, 250a+HNacJ, 5% glycerin DH4,6], adding S1 nuclease (Sigma) to position 150111 and 2 at 14°C. time ink This was done by cubating. 20+aHEDTA was added to stop the reaction. protein with phenol and chloro It was removed by extraction with form. After adding 0.15 volume of 3M sodium acetate solution and 0.6 volume of isopropanol, the DNA was precipitated from the aqueous phase at 0°C and diluted with 70% ethanol. Washed with tanol. The resulting DNA was digested with 60 units of Pstl at 37°C for 2.5 hours, and then The cells were separated by electrophoresis in a 2% agarose gel. A DNA fragment approximately 300 bp in length was isolated and made into M. Plasmid 1) 30 mco of AH104 was incubated with 50 units of 5aCI at 37°C for 2 hours. The enzyme was inactivated by heating to 70° C. for 10 minutes. All 4 types of Detsukijinu After adding 0.5 nM of cleotide and 30 units of Talenow polymerase, mix. The material was incubated at room temperature for 60 minutes to plant the ends of the DNA. protein DNA was removed by extraction with phenol and chloroform, and the DNA was precipitated with ethanol. I set it. The resulting DNA was partially cleaved by reacting with 20 units of PStl at 37°C for 40 minutes, and the reaction was stopped by adding 2On+HEDTA. DNA into agarose gel 7 fragments of 4.3 kb length were isolated and produced in N. The obtained DNA was combined with the above-mentioned 0.3kb long DNA fragment and 10mCj! ligation medium with 10 units of T4-DNA ligase at 14°C for 20 minutes. Escherichia coli H8101 was transformed with this ligase reaction solution and plated on LB medium containing ampicillin. The resulting bacterial colonies were transferred to fresh Agar plates and double transferred to nitrocellulose filters placed on the Agar plates. After incubation at 37°C, the bacteria were lysed and denatured according to the method described by Arunstein and Hogness [8, Grunstein & D. After sexing, the DNA was bound to nitrocellulose. Cell debris was removed by incubation at 65° C. for 16 hours in a pre-wash solution ('IM NaCl, 50nm) Tris-HCl p118.0.1 mHEDTA, 001% SO8. The filter was then washed with hybridization solution [0,9M NaCl, 90mHT ris-HCj! pH7,5,5a+HEDTA, 0.1% SDS, 0. 1neg/d, U) Human rQ bacterial tRNA (Sioma)] Hybridized with 2×107epm P-labeled oligodesoxynucleotide d (TGCCACCTGCCCGAC) at 47°C for 3 hours in [γ32P] ] ATP (3000Ci/l 101, AIer3hall) 1 sp moJ and phosphorylation buffer (7C) + HTyts -HCj! pH7,6,10mHMOCi'2,5mo di Thiothreitol) 10 units of T4-polynucleotide kinase in 20+acI for 45 minutes at 37°C. The reaction was stopped by adding 25 mH EDTA, and unintroduced O4 activity was removed by exclusion chromatography on a 111 dl Biogel P6-DG (Biorad) column. I left. Filters were washed four times for 30 minutes at 47°C. The washing solution was the same as the hybridization solution except that it did not contain tRNA. The filters were exposed to Odak X-011 1atS X-ray film at -80°C using Kodak X-omat regular intensifying film. Positive hybridization on autoradiogram Plasmid DNA was isolated from the bacterial colony that produced the lysis signal using a miniprevention operation. This plasmid was completely cut with ) (indI[I and 38mH I). After electrophoretic separation in an agarose gel, a 0.5 kb long restriction fragment was isolated and sequence analysis was performed according to Sanger. The plasmid having the structure was named 1) AH4/2. This allows expression of mature Ca1 FN-C1 in E. coli. The gene from plasmid DAH4/2 (Example 9), which was engineered for bacterial expression of FN-C1, was added to the plasmid with a high copy number per IJII and stable plasmid. It was subcloned into the improved plasmid vector par pATER103 (Example K) with high compatibility. Hindll[/Bam1-117 fragment of pAH4/2, 0.5 kb length (Example 9) Approximately 0.5 neg was pre-cleaved with f(fnd and BarTIHI) and gelled with 25no of plasmid vector parpATER103. 10 meJ+7>IJ with T4-DNA ligase at position 5Ii in the gesion medium. Then, the cells were incubated at 22°C for 3 hours. Competent large intestine VJHBIO I was transformed with the above ligase reaction solution 511C1, and ampicillin 50 mcg/a + f! Plated on right-containing LB agar. From the produced bacterial colonies, six were randomly selected from which plasmids were isolated on a microscopic scale. Each FJ! Restriction analysis using IJI endonuclease showed the desired structure, and the plasmid was named pA1-14/3. 100 d of bacterial culture was incubated with tryptophan-free amethyst at 37°C with vigorous shaking until an optical density of 600 nm specified below 1 s was achieved. m in medium 1i: (NH4)2P0410g, 3.5gKH2PO4 (NaOHrpi17.31., do), NaCj! 0°5g, casamino acids (acid hydrolysis) 21g, glucose 11g, MO8O 1mL cac 120°1 mN, thiamine salt R salt 1η, L-cysteine 20s, 3-β-indoleac Ril M (IAA, ) - Ributophane Oberon's inductor) 20m9, ampicillin 50-1001 as needed! ! ! J]. Then, the bacteria were pelleted by centrifugation for 5 minutes at 4,000 rplIl, and the culture volume was 1/10 of the culture volume ω, ice-cold 50 ID)lTris-HCj! pus, 0. The suspension was suspended in 30 mH NaCl and disrupted twice for 30 seconds using an ultrasonic wave (20 kHz: 100 watts) while cooling on ice. Cell layer io, o. It was removed by centrifugation at 0 rpm (4°C) for 10 minutes, and the residue was sterilized. First, the interferon activity of the supernatant was examined using a standard method for measuring the cytopathic effect (CPE) of vesicular stomatitis virus (VSV). Test system: A-72 (ATCC CRL1542) Canine tumor/vesicular stomatitis virus Plasmid 0D6oo, l IFN unit/1 bacterial culture pAH4/2 4.2 3.2X105pAH4/3 3.2 3.0x105 Class IFN-α or used the following procedure to detect the total number of sequences in the canine genome that have high homology with the IFN-ω interferon gene. Polymer Dake Dog DNA (Example 1) 20mco in reaction volume 5120QIlfJ and 1 NO is equivalent! , completely digested with 60 single tubes of IJ restriction enzyme, and each trace contains this cut DNA A10+11C! ] and divided them according to size on a 0.8% agarose gel. After transferring the DNA onto a Nitrocell [coarse filter] using the V-san method, the DNA was denatured and fixed, and each filter was hybridized with approximately 6×106 Cp1m of Nick1-Lansrayion DNA Blow 1 (17 hours at 65°C, 5X SSPE, 5 x Denhal 1-Solution, 0°1% SDS, Denatured Salmon Sperm DNA 2011! (4), 'trJ, see Example 4), In the case of Ca I F N-α, the probe contains the entire coding sequence of interferon 4: A 0.6 kb long 3 amll! fragment of plasmid DAH4 was used. In the case of EQIFN-ω, a 2.1 kb ECOR1 insert from plasmid pR+161 was used as a probe. Filters hybridized with Ca1FN-C1 were then subjected to stringent conditions. ), 0.3X SSC (450H NaCl, 4,5mH Sodium Citrate), 0.1%X 5DS for 45 minutes at 65°C, washed 4 times. EQIFN-ω and Ha. 45mHNaC1,4,5111H Sodium enoate) and 0.1% SDS. EQIFN-ω and Hive The redized filter was washed at 65°C with 2xSSC (0.3M NaCl, 3011 IH sodium citrate), 0.1% SDS. Autoradiography is done using Lariex-Regular! The i-sensitivity film was tested on DuPont Cronex X-ray film at -80°C for 7 days. The autoradiogram (Figure 29) shows a canine genome with similar high homology to Ca1FN-C1 as also found within the interferon class in other seconds. In addition to the duplex encoding the identical α-interferon, the system contains no other sequences to be detected. I can't get it out. In the case of the horse ω-interferon gene DNA, at least one gene different from the above-mentioned canine α-interferon can be detected under rather weak stringent conditions. Lambda clones weakly hybridized to human α-IFN probe (e.g., E). The 5.5 kb EcoRI restriction fragment of EQ-α16 (see Figure 30) was cloned. It was subcloned into the ECOR1 site of lasmid pLJc8. E. coli JM101 was transformed with the ligation mixture. The expected plasmid containing the correct insert was named pRH62. Plasmi The EC0RI insert of 62 was isolated from a 7 galose gel and subcloned into M13mp8 using the shotgun method described in Example G. The phage clone obtained after transformation of E. coli MJIOI was described by Benton and Davis. (19)+7) Method &': , J: Transferred onto Rinyl-Ot A/loose membrane (see example). The 1,0 kb HindIff fragment of plasmid pRH61 containing the entire coding region of EQIFN-C1 was used as a hybridization probe. It was used as A recombinant M13 phage producing hybridization Sigbull was selected for isolation of the present filI DNA and sequenced by Sanger's method. Ta. A 3.2 kbt-iindmυ fragment of lambda clone EQ-α24 that hybridized to the human α-IFN probe (eg, E) was subcloned into the H+nd11 site of plasmid pUC8. The plasmid with a positive insert obtained after transformation of E. coli JMI01 was named DRH83. Similarly, in j, 2.8kb Hindllr of Lambda clone EQ-α9! The IJ restriction 75 fragment was transformed into pUc8, and the resulting recombinant plasmid was named pRH82. HindllI inserts of these plasmids were subcloned into M13mp8 using the human shotgun method. The phage obtained after transformation of the large 11JMIOI was hybridized using the aenton and DaViS method. The Okb HindllI-BarnHI fragment of plasmid pAl-152/2 containing the sequence encoding mature EQIFN-α1 was used for isolation of single-strand DNA and the sequence was analyzed by Sanger's method. 100 Se-F・0-ノ,,-HulFNc,2)-(ulFN13FIG, 2° λεqct1 AH50 FIG, 3° λEqβ6 AH60 #M N# 0171 cl)! '-17) +6 10 e %6 15% D 'a ψ ψ hit h reamer ~ -00 mouth h1 mah1/T F-F+ no IX) %13 through mouth a> w w -0'+to1 --10--: l+1 1"'1 inch -p tsuυ -ri C LIJ :l(51-ri tpi ”-ritsu I-L+ji -+t, e, li-shikuri > 1.:31-1+ litp w< ri υfuri α1-r- ul''J Ku moan C Yuri - Kuiku a+hi M<10← -be -ri (ttsu -ri ku, +Jri < +5 > +5 +5ri Beri Kuku<liku Un<all -nu:ffLJ -UC<c+s<o+(5L-(e +-+> <---1 --=t, y < I-Lllll Lu<ft False 1-J<t5L:l ri C] Reprimand/Sentiment RikubebiqrFN-cc3 TGT GACCTG CCT CACATG AGG AGA TTT GGA TTC Sro Gin Ala CCT CAA GCC rle Gln Gln Ile Phe 1ATCCAA CAG ATG TlC CACCTCTTCGln G1r+ Leu Thr Glu 1-C AG CAG CTG ACT GAG cVat Glu Gltr Dinghr pro Leu Het AsnGTG GAA GAG ACG CCCC TG ATG AAChr ASn Leu CA AACTTG A Ding C DingCCCCCTTCTCCT-GCCTGCCCAG GAG GTG TTT GACGGC11e Ser Ala Val )(1s Glu ThrATCTGT GCG GTCCAT GAG ACGAGCACA G ACGG(Ding CG Ding CT GCTGl(J Asp Ser Leu Leu Ala VatGAG'GACTCCCTG CTG GCT GTG130 ' 135 Pro Gln Ser 1 CCG CAG AGT TAA (ys Asp Leu Pro) (1sTGT GACCTG CCT C ACASn Glrv pne Ar9 LysAACCAG TTCCGG AAG 11e Gln Gln 11e pheATCCAA CAG ATCTTC Ala Trp Asp Glu 5erGCCTGG GACGAG AGC Gln Gln Leu Thr Gl (JVat Glu Glu Thr Pr. GTG GAA GAG ACG CCCArg Arg Tyr Phe G inAGG AGA TACTTCCAA Ser Pne Ser Ser 5erTCCTTCTC ding TCA TCC lo 15 1 Pro Glri Ala Ile Se r Ala Va-1-815G lu T11r; CCT CAA GCCATC CCGCG GTCCAT GAG ACGl 85 90 Leu HeT: Asri, Glu Asp Ser Leu Leu Al a VaICTG ATG AACGAG, GACTCCCTG CTG GC T GTG130 i35 ]60 Thr Asn Leu Pro Glri Ser =ACA AACTTG CC G CAA AGT TAAH: Hindeeee, S: 5ae1 international! +1 report Sea-h--1N-maru tiewa, +'wsmus, N:T, 1EP85/(81 η6ANNEX To τHE INTERRIAT'rONAL 5EARC J(REFORT 0NINTERzahachiTte0NAL 8I'PLICATI○ NNO, PCT/ i ball 35100716 (SA 11696) eport WO-A-flo0237s 13/11/80 EP-A-00277930 6105/131US-person-426209014104/81 Non@

Claims

[Claims] (1) Containing a sequence encoding EqIFN-α, -β, -ω or CaIFN-α A recombinant DNA molecule characterized by having (2) Plasmids PAH50, pRH63, PRH82, pRH83, PRH6 1, pRH62, pAH60, pAH62 or pAH4 Recombinant DNA molecules described in section (3) Array [There is an array], [There is an array], [There is an array], [There is an array], [There is an array], [There is an array], [There is an array] or [There is an array] or a recombinant DNA according to claim 1 containing degenerate variants of these sequences. A molecule (4) 85% or more, preferably 90% or more of the code sequence according to claim 1. Plasmids pAH50, pRH63, pRH8 under stringent conditions indicating homology. 2, pRH83, pRH61, pRH62, pAH60, pAH2 or pAH A recombinant DNA molecule characterized in that it hybridizes with an insert of 4. (5) The sequence encoding EqIFN-α, -β, -ω or CaIFN-α is Capable of replicating in microorganisms, preferably prokaryotes or eukaryotes or mammalian cells expression vector, preferably expression plasmid pAH52, pAH52/2, pA Contained in H53, pAH55, pAH62, pAH4/2 or pAH4/3 The recombinant DNA according to any one of claims 1, 3, or 4 A molecule (6) Containing a sequence encoding EqIFN-α, -β, -ω or CaIFN-α (7) A transformed host organism having a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably E. coli ( E. coli) or brewer's yeast (Saccharomyces cerevi) The transformed host organism according to claim 6, which is a mammalian cell. thing (8) The gene sequence is in a vector capable of expressing and replicating the protein in the host organism. , preferably contained in any of the plasmids according to claim 5. Transformed host organism according to claim 6 or 7. (9) E that is substantially free of other proteins of animal origin and exists in a substantially pure form Interferon that is qIFN-α, -β or -ω or CaIFN-α (10) The interferon according to claim 9, which does not have natural glycosylation. hmm (11) Amino acid sequence [There is an array], [There is an array], [There is an array], [There is an array], [There is an array] * [There is an array] or [There are sequences] [There are sequences] or biologically active sequences of these sequences. The interface according to any one of claims 9 or 10, which contains a variant. Felon (12)a) a host organism, preferably any of claims 6 to 8; host organisms described in EqIFN-α, -β or -ω or CaIFN-α Genetic information encoding, preferably any of claims 1 to 5 b) The coding sequence is an expression vector. -, preferably contained in any of the expression vectors according to claim 5, This information is transferred to EqIFN-α, -β or -ω or CalF within its host organism. and c) interferon EqIF. N-α, -β or -ω or CaIFN-α, preferably claim 11 EqIFN characterized by isolating and purifying the interferon described in -α, -β or -ω or method for producing CaIFN-α (13) Claim No. Eq1FN-α, -β or -ω or CaIFN that can be produced according to Section 12 -α(14) Any of claims 9 to 11 and 13. Use of Interferon for Therapeutic Treatment (15) A pharmaceutical inert carrier and claims 9 to 11 and 13. A treatment characterized by containing an effective amount of interferon according to any of paragraphs DETAILED DESCRIPTION OF THE COMPOSITION INVENTION FOR THERAPEUTIC TREATMENT