JPS62500643A - リポソ−ムのｉｎ−ｓｉｔｕ製造方法およびその持続放出性エアゾ−ル送出系としての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソームの１ｎ−ｓｉｔｕ　製造方法およびその持続放出性エアゾール送出系 としての使用本発明はリポソームの製造方法に関し、詳しくはフルオロクロロカ ーデン噴射剤を基にした加圧エアゾール装置を用いるリポソームの簡単、迅速な 形成法に関する。

加圧エアゾール装置による送出後に形成されたＩＪ　、Ｊノームは薬剤の持続放 出を与える。

リポソームは水性区画と交互する一連の同心層からなるリン脂質の人工小球体で ある。パンガム（Ｂａｎｇｈａｍ　）ほか〔・シャーナル・オブ・モレキュラル ・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｔ、）　、　／３ｃ／）２３ｇ−タ９ ．／９乙Ｓ〕が最初にそのような多重ラメラ脂質小胞の製造を記載し、そのとき から合成リポソームの製造について広範な方法が報告された。リポソームは初め に生物膜の性質を研究する入エモデルとして使用された。しかし、リポソームの 実用可能性は、それらが広範な物質、例えば薬物、を貧食しまたは閉込めてそれ を劣化から保護し、そして（または）それを特定器官に対し標的することができ ることである。

［物および他の分子は２つのプロセスによりカプセル化することができる。親水 性種は水相内に閉込められるが親油性部分は同心リン脂質二重層に結合する。従 って、す２ソームを製造する商業的に有効な方法の開発に著しい関心が存在する 。

リポソームの製造に対し多くの方法が提案された。リポソームはエーテル／脂質 ／水の分散系から揮発性溶媒を蒸発させることに基いた方法を用いて製造された 。超音波処理により親油性溶媒中水型の分散系を製造し、それから減圧下の蒸発 または混合物に窒素を通すことにより揮発性溶媒を除去した。超音波処理にエリ 生じた小さい単ラメラ小胞は小さい水性区画（直径２５ｎｍ）のみを有し、生物 活性分子の捕捉に低い効率を示した。改良法は減圧下に有機溶媒を除去して脂質 ｒルを生成させることに基き、それは過剰の水相を添加すると高い捕捉効率で巨 大分子を保持できる大容積の小胞を形成した。同様の大きい単ラメラ小胞はまた 脂質小胞中のカルシウム誘発構造変化を用いることてより製造された。しかしこ の方法は単一リン脂質（ホスファチジルセリン）に限定され、また比較的低いカ プセル化効率を有した。

有機相例えばエタノールまたはエーテル中に溶解した脂質の溶液の注入が単ラメ ラ小胞の製造に使用されたが、しかしまた低いカプセル化効率が認められた。脂 質／水／エーテル乳濁液の水相中への遠心分離が脂質小胞の製造方法として示唆 されたけれども、しかし高速遠心分離の必要は不利益である。また多量の脂質／ 水性乳濁液が界面をふさぎ低い物質閉込率を生ずる。液体小胞中の一定薬剤の閉 込は水性リン脂質分散系の凍結または凍結乾燥により達成された。

閉込めた分子を含むリポソームを製造する公知の方法の複雑さ、閉められなかっ た物質からのそのようなりポソームの分離並びに時間および金銭の両方に関する 高いコストがリポソームの有効商業生産を妨げた。さらに、重大な安定性の問題 が若干のプロセスの生成物に当面され、そのような生成物は使用直前に製造しな ければならず、それは必らずしも便宜ではなく、または特定条件下に例えば窒素 上低温で貯蔵しなければならない。

英国特許明細書第２．／弘５．／θ７Ａ号には、少くとも２つの別個の成分をと もに圧力下にするリポソームの製造方法が開示され、第１成分は水を含み第ユ成 分は脂質物質を含む、Ｊ次いで両成分を混合物として圧力下にノズルまたは他の 装置に通してリポソームを含むエアゾールスプレーを生成させる。さらに、第１ または第２成分の少くとも１つが、好ましくは別の活性物質例えば薬物分子を含 む。該明細書にはまた少くとも第１室および第２室を含むリポソームエアゾール の製造に使用する・ぞツクが開示され、／室が水を含む第１成分を含有し、他室 が脂質物質を含む第λ成分を含有し、／室または画室、および（または）第３室 が噴射剤物質を包含する。そのパックはまた噴射剤または剤類により発生された 圧力下にそのそれぞれの室から供給された第１および第２の成分の混合物をスプ レーとして分配する装置を含む。

本発明はリポソームを製造する他の方法を提供する。

本発明によれば、揮発性液体担体中の実質上純粋なリン脂質の極微小小滴を噴射 し、水性表面の上寸たけ下に衝突させそれによりリポソームを形成することを含 むすＩンームの製造方法が提供される。

本発明の好ましい態様において、極微小小滴は噴射剤を基にした加圧エアゾール 送出系を用いて発生され、液体担体は便宜にはフルオロクロロカーボンであるエ アゾール噴射剤を含む。この系は薬物を肺内の粘膜表面へ送出し、１ｎ−ｓｉｔ ｕ　に生成されるリポソームから持続放出を達成するのに用いることができる。

本発明の方法はリポソームを製造する簡単、迅速な方法を提供する。揮発性液体 担体中のリン脂質の、一般に０．３−Ｓ０ミクロンの範囲内の直径を有する別々 の極微小小滴が水性表面の上または下に噴射される。液体担体は蒸発し、生ずる 固体リン脂質と氷表面との接触が自然にリポソームを生成する。

この方法を用いて所望化合物とリン脂質および脂質担体との簡単な混合によりリ ポソーム内に閉込めた分子例えば治療活性分子を製造することができる。薬物分 子は配合物中に溶解されねばならず、噴射剤を基にしたエアゾール送出系の場合 に、薬物は噴射剤単独中にまたは小割合の補助溶剤例えばアルコール類殊にエタ ノール、の存在下に溶解することができる。フルオロカービン噴射剤中の親水性 薬物分子の溶解度を高める他の方法は薬物分子とイオン対を形成する賦形剤を用 いることである。

そのような賦形剤の例にはリン酸・ゾセチル、塩化ベンザルコニウム、塩化セチ ルピリジニウムなどが含まれる。

本発明の方法は、組成物中に可溶化して薬物分子をリポソーム内に閉込めること ができる任意の薬物分子の閉込めに用いることができる。閉込められた薬物分子 はりポノームから徐々に放出され、従って、これを薬物分子の持続放出を得る方 法として用いることができる。薬物分子の放出速度は分子自体、閉込められた薬 物の量および用いた個々の配合物による。

噴射剤を基にした加圧エアゾール送出系の使用は、使用中または使用直前に自然 なリポソームの製造を可能にし、それにより長時間貯蔵における劣った安定性の 問題が回避される。さらに、エアゾール系を吸入療法に使用して肺の湿潤表面上 に治療活性分子を閉込めるリポソームをｉｎ　５ｉｔｕに形成することを可能に する。

本発明の方法は吸入療法に対する適用において、エアゾールスプレーの生成前に 水を脂質物質および薬物に接触させることにより製造されるリポソームに比べて 有意な利点を有する。加圧エアゾールスプレーのパルプオリフィスから流出する 小滴の平均粒度は典型的には３０−！；０Ｓ０ミクロン囲内にある。２〜７ミク ロンにおける粒子のみが肺の下方領域に達することができ、吸入療法に用１／− １ルエアゾールは小滴からのフルオロクロロカー＆　７　噴霧剤の急速蒸発に依 存し、吸入される小滴として２〜７ミクロンの範囲に粒度を低下させる。水、お よびフルオロクロロカービン噴射剤の沸点に比べて高い沸点を有する他の液体ビ ヒクルの存在は液体の蒸発によりその粒度を低下させる小滴の能力を有意に低下 し、従って、太きさが呼吸範囲内に十分に低下される小滴は非常に少ない。

本発明は主に配合物中に噴射剤を使用しそれにより呼吸可能な範囲内の小滴を生 成させることにより、リポソームは小滴が水性表面、例えば肺の湿潤表面に接触 したときにｉｎ　−５ｉｔｕに形成される。

さらに本発明の態様によれば、実質上純粋なリン脂質および治療活性物質の噴射 剤物質中に溶解した溶液を含有する単一の室を含むエアゾールの製造に用いる・ ２ツクが提供され、リン脂質と治療活性物質とのモル比は／：／より大きく、該 パックは噴射剤物質により発生される圧力下にスプレーとして前記溶液を分配す る装置を含む。

リン脂質と治療活性物質とのモル比は一般に少くとも５：／、通常１０：／〜２ ０：／の範囲内にある。好ましくは溶液は無水である。

本発明に用いるリン脂質は： ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）ホスファチジルグリセリン　（ＰＧ ） ホスファチノルセリン　（ＰＳ） ホスファチシン酸　（ＰＡ） ホスファチジルイノシトール　（Ｐｌ）ホスファチジルエタノールアミン　（Ｐ Ｅ）シックルミドイルホスファチゾルグリセリン　（ＤＰＰＧ）および ノアシルホスファチノルコリン　（ＤＡＰＣ）を含む広い範囲から選ぶことがで きる。

次の非リン脂質賦形剤の７種またはより多くを配合助剤として含ませてリン脂質 二重層の安定性を高め、または表面電荷を制御することができるニ リン酸ジセチル　（ＤＣＰ　） ステアリルアミン　（ＳＡ） スフィンゴミエリン　（ＳＭ） コレステロール　（Ｃ） 塩化ジステアリルジメチルアンモニウム。

リン脂質は均一なリポソーム形成を保証させるために実質上純粋でなければなら ない。好ましくはリン脂質は少くともｇＯチ純粋、エリ好ましくはｑＯ〜７００ チ純粋である。好ましいリン脂質は精製した卵ホスファチノルコリン（レシチン ）である。

揮発性液体担体は好ましくはリン脂質に対する溶媒である。便宜な担体はエアゾ ール噴射剤、殊にフルオロクロロカービン噴射剤例えばプロペラント（Ｐｒｏｐ ｅｌ　１ｅｎｔ　）／　／　（）　ＩＪジクロロノフルオロメタン）、プロペラ ント／２（ジクロロノフルオロメタン）、およびプロイラン）／／４（ジクロロ テトラフルオロエタン）である。加圧エアゾール送出系で使用に適する配合物は ７種またはより多くのフルオロクロロカービン噴射剤９０〜９９．９チおよび７ 種またはより多くのリン脂質と必要でられば配合助剤０／〜１０重量％を含む。

フルオロクロロカーボンを基にしたエアゾール配合物中のリン脂質の使用は公知 であり、英国特許明細書第コ、００／、３３４を号およびドイツ公開公報第、２ ｇ　３／　４１１９号に開示されている。水性リン脂質溶液からのエアゾールも また公知であり、米国特許明細書第３．５９グ１９７６号および第３．７７！； 、’１３２号に開示されている。しかし、これらの公知配合物はりホノームの製 造に使用されず、またリン脂質は配合物中に界面活性剤として、非常に少量で、 不純形態例えば１５チ純度で、薬物分散系の調製を促進するために、蒸発に対す る水性小滴の安定化のために、または治療のために与えられた。

不発明は次に次の実施例に関して例示される。

実施例／ フルオロクロロカービン噴射剤を基にしたエアゾール装置からのリポソームのｉ ｎ　５ｉｔｕ製造を示す１ｎｖｉｔｒ’ｏ証拠精製した卵ホスファチジルコリン （ＰＣ）をモデルリン脂質として用いた。９０チ卵ＰＣを含む粗卵レシチン〔ビ ーディーエッチ・ケミカルズ（ｓ　ｏ　ＨＣｈｅｍｉｃａｌｓ　＋Ｅｎｇｌａｎ ｄ　）製〕を出発物質として用いた。卵ＰＣを、パンガム（Ｂａｎｇｈａｍ　） ほか、メノーズ・イン・メンブラン０パイオロノー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍ ｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）　＋　：ｙ−ン（Ｅ、　Ｄ、にｏｒｎ　） 編、Ｌ、６ｇ頁、ゾレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　）　／　９７ 　’！、により記載されたように精製して再結晶し、グ℃でアセトン下に貯蔵し た。再結晶した卵ＰＣはクロロホルム／メタノール／水（／ＩＩ−／ｌ、／／） の溶媒系を用いてクロマトグラフで純粋であると示された。

リポソーム構成に配向させるリン脂質に対する先要条件は水性環境の存在である 。エアゾールサンプリング装置は従ってエアゾールを刺激できる湿潤条件を与え るように設計され、第１図に例示される。装置は既知量の水性レセプタ流体１０ で部分的に満たしたビーカーを入れた／ｌのろ過フラスコ１で構成した。吸気管 ２をその頚に通し／端３をレセプタ流体表面の直上に配置し、他端４に医療エア ゾール経ロアダプタ５およびエアゾール装置６を取付けた。レセプタ流体をサン プリングする装置を含ませた。

レセプタ流体は０２ミクロンのメンブランフィルタ−に通して濾過したガラス蒸 留水（ｐ）−１５，、！Ｎであった。フラスコ内に高い相対湿度および３７℃の 条件を達成するためにフラスコを側管の高さまで３７℃に維持した水浴γ中に浸 漬した。エアゾール化した用量の大部分のレセプタ流体中への送出を保証するた め装置を通る空気流を真空ポンプ〔スピーディパック（５ｐｅｅｄｉｖａｃ　） 　：］に連結した管８を経て達成した。！；Ｏ１／分の流量が流量計〔ギヤツブ 社（Ｇａｐ　Ｌｔｄ、　）製〕によりモニターした。リポソームの試料を得るた めにサンプリングスポイト９を備えた。空気を流れさせるためにエアゾールアダ プタは背面にオリフィス１１を有した。組立てた装置は空気の運ぶ粒子でレセプ タ流体が汚染されるのを避けるために予め平衡させた空気層流キャビネット中に 配置した。

５％Ｗ／Ｗ卵ＰＣを含む多くの配合物を視覚観察して第Ω図に示される室温にお けるプロ４ラント／／／プロペラント／２／プロペラント／／り混合物中の５’ ％Ｗ／Ｗ卯ＰＣの混和／非混和相図を構成した。この三角座標グラフを用いて特 定蒸気圧等値線上に位置する混和／不混和界面相より上の噴射剤混合物を選ぶこ とにより５チＷ／Ｗまでの卵ＰＣを含む特定蒸気圧のコ相エアゾールを配合した 。

３、　’Ｉ　３　Ｘ　／　０”　Ｎ／ｒｒ？および４７９　Ｘ　／　０”　Ｎ／ ｒｒ？　（５０お工び７（７ｐｓｉａ）（ｕ／’Ｃ）の蒸気圧で／％Ｗ／Ｗ卵Ｐ Ｃを含むエアゾールを試験した。レセプタ流体ｉｏｏｍｔをフラスコ中に分配し 装置を組立てた。十分な時間を置いて平衡させた。エアゾール装置を振とうし、 始動させ、経口アダプタ中に配置した。空気を装置から引出し、弁を７０秒間隔 で予定回数作動させた。最後の作動径空気流を止めてレセプタ流体の試料を取出 し、光子相関スペクトロスコピー〔モルパー７　（Ｍａｌｖｅｒｎ　）モデルＲ Ｒ／４’４　、モルパーン・インストルメント社（ｆ４ａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒ ｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｃｌ、　＋　Ｍａｌｖｅｒｎ　＋　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇ ｄｏｍ）製〕を用いて分析した。レセプタ流体内の粒子の大きさは時間に随伴し た。

第３図は／％ｗ／ｗ純卵ＰＣを含み、２／℃で３り３×１０５およびＩＡ　’７ ９　Ｘ　／　０”　Ｎ／ｒｒ？　（５０または９　ｏｐｓｉａ）の蒸気圧を有す るエアゾールから生じた粒子の粒度に及ぼす時間の影響を示し、各点は３１ｆｌ １１定の平均を標準誤差パーとともに示す。初期の粒度は蒸気圧に依存し、３． ’１３×７０″Ｎ／７Ｆ＋’　（３０ｐｓｉａ　）に対しｇｇ２ｎｍで弘７９× ／　０６Ｎ／ｉ　（７０ｐｓｉａ　）に対しぶる００ｍであった。それぞれの場 合に粒度は時間とともに減少し、約９０〜７００分で２５０〜２９０ｎｍの大き さで平衡した。

蒸発による噴射剤の喪失後に生じた２５０ｎｍの粒子は従来技術の種々の方法に より生成された多重ラメラ小胞と同様の粒度および構造特性を有した。

す４ソームの生成は、透過電子顕微鏡検査を用いてモリブテン酸アンモニウムで 陰性染色した後のレセプタ流体試料の試験により確認された。第９図は電子顕微 鏡写真であり、１５θ〜４ｔ００ｎｍの大きさ範囲の、しかし集合体で一団とし て７ミクロン以下の大きさに凝集した多重ラメラ小胞のクラスターを示す。

実施例コ サルブタモール半値酸塩およびサルブタモール塩基を薬物化合物として用い、調 合的に生成した、およびエアゾール送出装置を用いて自然に生成させた多重ラメ ラ小胞（ＭＬＶＳ）中への薬物分子の分配を調べた。

リポソームの調合製造 ＭＬＶｓの製造方法は広く発表された〔例えばジュリアノほか（Ｊｕｌｉａｎｏ 　＋　Ｒ，Ｌ、　、　Ｓｔａｍｐ　ｒ　Ｄ、　）　、ノぐイオケミカル・ファル マコロジ−（Ｂｉｏｃｈ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、）　＋２７：２／、／９ｇ／ 〕。純ＰＣを計量してＳｏ−フラスコに入れ少量の無水エタノールに溶解した。

有機溶媒をグ０℃で（除去を促進するため少量のアセトンを包含させて）回転蒸 発させると丸底フラスコの壁土に４い脂質膜が残った。いわゆる「ドライ」フィ ルムを窒素の噴流でフラッシュして溶媒の完全な除去を保証させた。水相の所要 量（１０ｒｎｔ）を加え、３７℃で穏やかに振とうすることにエリフィルムを水 和させてＨしＳを形成させた。用いた水相は（ａ）０／Ｍ水酸化す）　ＩＪウム でｐＨ’７．ｌＩに調整した０９チｗ　／　ｖ塩水、または（ｂ）　ｐＨ７，４ の生理的等８透圧リン酸塩緩衝塩水（ＰＥＳ）であった。エタノールに事実上不 溶性であるサルブタモール半硫酸塩を水相に加えた。サルブタモール塩基はエタ ノールに十分可溶性で水利前に脂質フィルム中への取入れが可能であった。脂質 の最終濃度は１０■／−お工び薬物／■／−であった。リポソーム／薬物懸濁液 を３７℃で、遠心分離によりリポソームを分離する前に平衡に十分な時間振とう し、ＨＰＬＣにより上澄み中の薬物含量について検定ＭＬＶｓの調合製造中にサ ルブタモール半硫酸塩を水相に加えたとき、薬物は３７℃でｐＨ７，４の等滲透 圧ＰＢＳ中に懸濁したＰＣリポソームに分配され、！ｆ；、ｇ３の見掛は分配係 数（Ｋａｐｐ　）でθ５５η／η・り°−セントの閉込みを与えた。脂質相また は水相に加えた薬物に対するす、ｔ？ソーム中のサルブタモール塩基で時間によ る分配係数の変化プロフィルが第５図に示され、初期リポソームの結合の程度は 薬物を脂質相に加えたときに最大であったけれども、急速に低下して約時間で平 衡した。低い閉込め効率はｐＨ’７．４で完全にイオン化した親水性種に予期さ れた順序であった〔サルブタモールの塩基成分のｐＫａは１０３である、ニュー トンほか（Ｎｅｗｔｏｎ　Ｄ、凱。

Ｋｌｕｚａ　ｌ　Ｒ，ｓ、　）　＋ドラグ・インテリジェンス・アンド・クリニ カル、ファ、ＩＩ／ｆシー（Ｄｒｕｇ　Ｉｎｔｅｌｌ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐｈａｒ ｒａ）。

／、２　：！１７６．７９７ｇ〕。サルブタモールの分配に対するコレステロー ルの低い効果は、サルブタモールかりＩソーム内の水性溝中へ分配し、脂質二重 層に結合しなかったことを示唆した。

疎水性種は一般に親水性種よりも高度にリポソーム中へ分配される。親油部分と のイオン対複合体の形成がサルブタモール分子に疎水性を与える方法を与えた。

リン酸ノセチル（ＤＣＰ　）はレシチン二重層中へ取込まれ、ワ、ｔｅソームに 負電荷を与えるために１０モルチ以下の濃度で普通に使用される〔シーカほか（ ５ｚｏｋａ　、　Ｆ、　。

Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ　、　Ｄ、　）　＋アム、レブ、バイオフイズ 、バイオエンノ、　Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　） 　ｒ　９　：’Ｉ乙７゜／ｑｇｏ〕。親油性イオン対複合体の形成に基＜　ＩＪ 　、４ソームのサルブタモールの吸収に及ぼす１０．２０および３０モルチにお けるＤＣＰの介在の３７℃における効果は第６図および第７図に示される。第６ 図は種々のＤＣＰ　４’５度について３７℃におけるＤ　（、Ｐ／Ｐ　Ｃリポソ ーム中のサルブタモール閉込み（ｍ９／〜％）の時間に対するプロットを示す。

第７図はリポソーム（ＤＣＰ／ＰＣ）中のサルブタモールについての分配係数の モル比ＤＣＰ／サルブタモールに対するプロットを示す。３０％ＤＣＰの介在が ／グから、２．４ｔ５■／＋Ｎｉ％へ、閉込みの／７５多の増加を生じた。

より複雑な多段階液体インビンツヤ−（ＭＬＩ）の使用が記載され〔ベルほか（ Ｂｅ１ｌ　ｌ　Ｊ、　Ｈ，ｌ　Ｂｒｏｗｎ　ｌ　Ｋ、　ＩＧｌａｓｂｙ　、　Ｊ 、　）　、ジャーナル・オブ・ファルマシー・アンド・ファ／Ｌ／　マ：＋　ｏ ノー（Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　、　）　＋　２５：３２Ｐ、 ／９７３”Ｊ、その粒度分布によりエアゾール曇りが確認された。第５図はガラ ス分離板８２により９区画（段階／〜ｑ）に分割され、各区画が導管８４を経て 隣接区画に連結されたガラス容器８０を含む多段階液体インピーダンスを示す。

加圧エアゾール容器８６が装置のスロート８８に配置されている。半融ガラス捕 集板８９が各分離板上に配置される。予めヂ過した（００５ミクロン）水の一定 量（／θ−）を各段階に加えて湿潤半融ガラス表面が導管８４を通る空気流に与 えられることを保証させた。フィルター９２を経てポンプに連絡させるため段階 グに出口９０が設けられている。実際にポンプにより空気が装置を通して引かれ 、ろＯ１／分でスロート８８に入る。

ＭＬＩは、回転円板エアゾール発生機を用いて０５％エタノール溶液から生じた メチレンブルー粒子のエアゾ−ル曇りをモニターすることにより有効カットオフ 直径に関して校正された。粒子は、校正したｇ段インノククター〔アンダー七ン ・サングラーズ社（Ａｎｄｅｒｓｅｎ　Ｓａｍｐ　−１ｅｒｓ　ｌ　Ｉｎｃ、　 ＋　Ｇｅｏｒｇｉａ　ｌ　Ｕ−Ｓ−Ａ、）製〕中へ、またはＭＬＩ中へ、サンプ リング装置の下流に配置した真空により発生された空気流により進ませた。一定 範囲の蒸気圧およびＰＣ含量において加圧エアゾールで行なったＨＬ１測定から のデータが表／に示される。

表　／ 多段階液体インビンジャー装置中で２７℃において、３、　’Ｉ　３または１Ａ ７９×１０５Ｎ／ｄｃ３０または７０ｐｓｉａ）で卵ＰＣを含む加圧パックから 放出されたエアゾールの析出。

各結果（全エアゾールの保持チとして表わした）は３測定の平均である。

有効カットオフ直径はガラススロートに対して２０ミクロンと仮定し〔ホルワー スほか（Ｈａｌｌｗｏｒｔｈ　ｌＧ、　ｗ、　＋Ａｎｄｒｅｗｓ　＋　Ｇ、　） 　＋ジャーナル・オプ・ファルマシー・アンド・ファルマコロノー（Ｊ、　Ｐｈ ａｒｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　、　）　＋２ｇ：ざ９ｇ　、／９７乙〕、段階 ／に対し７０９７ミクロン、段階二に対しり５ｌミクロン、段階３に対し３．５ ９ミクロン、段階グに対し７２３ミクロンと測定された。

Ｖ、Ｐ、　’Ａ７９　り７９　’Ａ７９　３グ３３．グ３卵ＰＣ％Ｗ／Ｖ０．３ 　／　２　２　３アダプター　、２２．３！；　２１１／　２ｇ、、２３　／Ｉ ７３　／ム３ろ、ス　ロ　−　ト　グ、ζ４’５　４とろ６　５θ０９　７１０ ユ　７ｊグる段階／／３グ　ユ、１０　Ｉ３０　２．／ｌｌ／７９段階２　左７ ９　よ？／　、３．Ｉ３　’ＡＡｃ１ユ０グ段階３　／／７７　ｇ’ｌ’ｌ　汐 ｇｇ　り０９２．λ２段階ｌｌ／θろｑ／ｌ’４’　９．ｇ２　３．＝６　２． ５ｇフィルター　コ、０２　１／’ｌ　θ乙コ　θ／／　θ／７１　ＶＰは２！ ℃における噴射剤混合物の蒸気圧を示す、Ｘ　／　０５Ｎ／ｒｒ？０ リホノーム形成に対する可能性に関し、２！℃で’Ａ７９×／θ５　Ｎ　／ｍｉ における混合物中に卵ＰＣを含む圧力・ぐツクから呼吸可能範囲（く５ミクロン ）内で送出されたＰＣの実際のａが第７図に示される。呼吸可能範囲内のＰＣの 最大送出に対する最適処方は２ＬＩＩＷ／ＷＰＣを含むであろう。

コ配合物、ザルブタモールとイオン対を形成するＤＣＰを含むもの（Ｆ２）、Ｄ ＣＰを含まないもの（Ｆ／）、を調製して１−ＩＬＩで評価ｔ７た。

配合物Ｅ／およびＦ２は次表に示される：含　量　ｙ／１００ゴ充てん容積 Ｆ／（Ｐ）　Ｆ、２（Ｐ） サルブタモール　Ｏ０弘　θθケ 卵ホスファチノルコリン　０．２’ｌ’ｌ　Ｏ，／９３７リン酸ノセチル　０． ０！；９７ エタノール　１ｇ３　１０２ トリクロロフルオロメタン（Ｐ／／）　Ｉ９２　２．２９ノクロロノフルオロメ タン（Ｐ／、２）ｇ、、２０　１乙合　計　Ｉ２．２３　Ｉ２．７１゜ 液体混合物の密度（η−）　７２２　１２ｇ２５℃における１１．３２　Ｘ　／ 　０５Ｎ／ｒｒ？　（乙Ｊｐｓｉｇ）を示すＰ／／／Ｐ／２／エタノール混合物 を有する加圧・にツクから放出された配合物Ｆ２に対するＭＬＩデータが第７０ 図に例示される。同様の結果は配合物Ｆ／に対してＭＬｌで試、験したときに得 られた。

配合物Ｆ／およびＦ２から生じた析出エアゾールに対する１４Ｌ１の段階３およ びグで形成されたリポソーム中のザルブタモールに対する３７℃における平衡分 配データを評価した。Ｆ／に対する無視できる閉込めが明らかでおったが、しか し脂質成分が３０モル％ＤＣＰを含有したＦ２についてはリポソーム中へのサル ブタモールの分配が認められた。閉込効率は段階３に対し２．６７±０６９〜／ 〜チ、段階グに対しユ、乙５±θ７ｇ■／■チと計算された。これは予め形成し たリポソームを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　’）　ｓ’！ソーム分配試ｊ検に対し て前に記載したものに非常に類似する。エアゾール生成リポソームで認められた 分配特性が調合製造リポソームを用いて認められたものに匹敵すると結論される 。

実施例３ 常法により製造したリポソーム（多重ラメラ小胞、間ＬＶｓ）による研究は疎水 性薬剤が親水性部分よりも高度にリポソーム中に取込まれることが示された〔ジ ュリアノほか（Ｊｕｌｉａｎｏ　、　Ｒ，Ｌ、　、　Ｓｔａｍｐ　、　Ｄ、　） 　、バイオケミカル・ファルマコロノー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏ ｌ、　）　＋２７：、２／、／９７乙〕。例えば、ステロイドエステルのリポソ ーム取込度は２／−アシル鎖長を延長することにより増大し、脂質相は非常に有 利な分配係数を生ずることができる〔ショーほか（Ｓｈａｗ　ｌ　Ｉ　、　Ｈ， ｌ　Ｋｎｉｇｈｔ　ＩＶ、　Ｇ、　、　Ｄｉｎｇｌｅ　ｌ　、Ｊ、　Ｔ、　）　 ＋バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）　、　／　５　ｇ 　：　’Ｉ　７３　、　／　９７乙；アロウスミスほか（Ａｒｒｏｗｓｍｉ　ｔ ｈ　＋　Ｍ　、ｒ　Ｈａｃｌｇｒａｆ　ｊ　＋　Ｊ　、＋にｅｌｌａｗａｙ　、 　１．　Ｗ、　）　＋インタナショナル・ジャーナル・オブ・ファルマシューテ ィンクス（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　）　１／４　：　／９／　、７９Ｉ ３〕。ヒドロコルチゾンオクタン酸エステルはそのような疎水性化合物の例とし て選ばれた。放射性標識化合物〔アマ−ジャム・インタナショナル（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　＋　ＬＪ、に、）製；比活性ｇ３Ｃ１／ ミリモル〕を用い、加圧エアゾール送出系を用いてｉｎ　−５ｉｔｕに生成した リポソームからの薬剤流出速度の測定を可能にした。

リポソームの調合製造 卵ＦＣＣ２３■）とステロイドエステル（三重水素化エステルθｇ３μＣｉでス ／４’イクした、θ１０′ｑ）との混合フィルムを５０−丸底フラスコ中に、回 転蒸発器上でクロロホルム溶液をｌ７０℃で減圧下に蒸発させて調製した。各フ ィルムに無菌θ９％ｗ　／　ｖ塩水７．５−を加え、フィルムを９０℃で水和し てＭＬＶ懸濁液を形成させた。

比活性／／、２ｍＣ１／ミリモルのＬ−α−ホスファチツルコリン、ジ（／−Ｉ ４Ｃ″ｌパルミトイ＃（：１４Ｃ−Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ）〔アマ−ジャム・インタナ ショナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒ−ｎａｔｉｏｎａｌ　、　Ｕ、　Ｋ、 　）製〕をこの実施例に用いた。

／％Ｗ／Ｗ卵Ｐ　Ｃ（１５９μｃｉ　１４Ｃ−ＤＰＰＣでスハイクした）および ヒドロコルチゾン２／−アクタン酸エステル（三重水素化ステロイドエステル４ １５μＱｉテスｙ＃イクした）をＰ　／　／／Ｐ　／コ、２３／７７混合物中に 含む圧力／４’ツク（＃７ｍ／）を製造した。振とうし、始動させた後、圧力・ ぐツクを経口アダブタ−中に逆位置で固定し、ｌＬｔ、θ回Ｓ秒間隔で作動させ た。放出されたエアゾールを、各段階に無菌θヲ％　ｗ　／　ｖ塩水１０ｍ１を 含有する実施例２記載のように校正した多段階液体インビンジャー中へガラスス ロートを経て６０ｔ／分で進めた。ガラススロート、アクチュエーター、および フィルター上に析出したエアゾール粒子をエタノールのアリコートで取出し、そ れぞれ２３．１０および１０ｒｄにした。各段階上の液体を７０−メスフラスコ に移して容積にした。薬物および脂質濃度を液体シンチレーション計数により測 定した。

段階３およびグ上に生じたリポソーム懸濁液を、薬物閉込めおよび放出について 調べるためにコニカルフラスコに移した。

全試料（／−）をカクテ）Ｉｉ　（Ｃｏｃｋｔａｉｌ）　Ｔ　（Ｂ　Ｄ　Ｈ。

Ｕ、に、製）７０ｍｌ中へ混合した後Ｌ　Ｋ　Ｂ　／　２　／　７　ＲａｃｋＢ ｅｔａ　液体シンチレーションカウンター中で７０分間計数した。外部標定を用 いて１４　Ｃおよび３Ｈにクエンチ補正を行ない＋４Ｃに対し９０％　３Ｈに対 し３０〜３５チの計数効率が生じた。

ヒドロコルチゾン２／−オクタン酸エステルの卵ＰＣと水との間の分配を、従来 の系並びに１−ＩＬＩの段階３およびグで生じた系について３７℃で平衡（Ｉｌ 、ｇ時間）した後、リポソーム懸濁液、および／９３．０００？で７時間３−試 料を超遠心分離することにより得られた上澄みの重複アリコートのシンチレーシ ョン計数により測定した。

卵ホスファチノルコリン（ＰＣ）およびヒドロコルチゾンａ／−オクタン酸エス テルを含有する加圧エアゾールからのｔ’ｌＬｌ中に生じた析出のパターンは第 １／図にヒストグラムとして示される。卵ＰＣおよびヒドロコルチゾン、２／− オクタン酸エステルの析出間に有意差が生ぜず、・ぐツクが均一系を構成したこ とが確認された。卵ＰＣおよびステロイドエステルの回収はく９０％であった。

エアゾール曇りの各成分の呼吸可能な部分（すなわち、段階３およびグ並びにフ ィルター上に析出したもの）は卯ＰＣに対しコθ９／±２．ｇ２％およびステロ イドエステルに対し２０．　／　ｇ　ｆ　２．４７％と計算された。これは伝統 的懸濁型吸入エアゾールで得られた値と有利に比較される。

表２は３７℃における卵ＰＣリポソームと水との間のヒドロコルチゾン２／−オ クタン酸エステルの分配を示す。

段階　３　’ＩＳＯ 段階　ｌＩ　左６ｇ 従来法　夕５０ 表λから、従来の、およびエアゾール化した系に対する卵Ｐ　Ｃ’Ｊ　、ｔＰソ ーム／水分配係数（Ｋ）が等価であることが明らかである。このデータはｉｎ　 −５ｉｔｕ形成リポソームが調合生成したものと同様に薬物を閉込めたことを示 す。さらにＫは、リポソーム系がインビンジャーのＩＧ階３または段階グで生じ たかに関係しなかった。

実施例弘 ＭＬＩの段階３およびグに達するリン脂質の量が少ないため、加圧エアゾール装 置を用いて生じたリポソームからのサルブタモールの流出を調査することができ なかった。代りに、調合生成したリポソームにおける流出速度を実施例／記載の 方法を用いて調べた。平衡におけるリポソーム／薬物懸濁液（約１５−）をｐｏ ｏｍｔ限外と過セル中で濾過し、リポソーム残留物を３７℃に維持した新等滲透 圧ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７，グ、中にもとの容積に再懸濁した。振とうし、振とう 浴に移した後、流出物を限外濾過〔１Ｍ１０膜、グイアフロ（Ｄｉａｆｌｏ　） 　＋アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　、　Ｕ、に、）製〕を用いてリポソームから水相 を分離し、ＨＰＬＣ（検定の感度の下限は／μ２／−サルブタモールでろった） により遊離薬物について検定することによりモニターした。ｌＩ■／−のサルブ タモール卵ＰＣおよび種々の量のＤＣＰを含有する配合物を試験し、結果は第７ ２図に示され、それは３７℃で７０．２０および３０モルチのＤＣＰを含有する 配合物に対する時間に対する薬物保持率のプロットである。

リポソームからのサルブタモールの流出はＤＣＰ！度に依存した（第７２図）。

放出は７０モル％ＤＣＰに比べてλ０モル％ＤＣＰを含有するリポソームから一 層速やかであった。、２０および３０モル％ＤＣＰを含有するリポソームからの サルブタモールの流出に対して類似の速度論が認められた。０〜７０時間にわた って収集したデータに対する概算半減期は： ＤＣＰ含量（モルチ）　半減期（時間）３０　ム弓 でちった。

このデータに基くと、サルブタモール塩基およびＤＣＰを含有するフルオロカー ボンを基にした加圧エアゾール系は有意な持続放出特性を示すであろう。

（ｂ）　ヒドロコルチゾン２／−オクタン、酸エステル−放射性標識したヒドロ コルチゾン２／−オクタン酸エステルを用いると、加圧エアゾール装置を用いた 多段階液体インビンジャーの段階３およびグ上に生じたリポソームからの薬物の 流出の測定が可能でめった。ｉｎ　−Ｖｉｔｒｏ流出速度試験法はサルブタモー ルに対して実施例３に記載したとおりであった。用いた配合物は実施例３におい てヒドロコルチゾン＝／−オクタン酸エステルとともに用いたものであった。第 ７３図は希釈した従来の、またはエアゾール化した（段階り）リポソーム標不か らのステロイドエステルの放出を示す。両系において、薬物の初期の速やかな放 出が明らかであった。希釈２時間後の線形回帰はエアゾール系に対してダｇ３時 間、捷だ従来系に対して５０２時間の流出半減期を生じた。

アシル、２／−置換基の延長はＤ　Ｐ　Ｐ　ＣＩＪボソーム／水素中のコルチゾ ン誘導体の分配挙動に大きい効果を有することが示され、約３　Ｘ　／　０３の Ｃ，エステルに対する分配係数（脂質／水性、３７℃）が得られた〔アロウスミ スほか（Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈ　、　Ｍ、　＋　Ｈａｄｇｒａｆｔ　、　Ｊ、　 、　Ｋｅｌｌａｗａｙ　。

１、Ｗ、）、インタナショナル・ジャーナル・オブ・ファルマシューテイツクス （Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｈａｒ、　）　、　／’Ｉ：／９／。

１９ｇ３”Ｊ。同様の分配挙動が卵ＰＣリポソーム／水系中ノヒドロコルチゾン λ／−オクタン酸エステルに対するこの研究で示された。従来およびエアゾール 化リポソーム標本中で同様のステロイド分配が明らかであったので、おそら＜Ｎ ＩＬ中の溶液エアゾールから生じたリポソームが従来製造されたリポソームと同 様の構造配座で形成されるであろう。さらに、インピンツヤ−の段階３およびグ で形成されたりボンーム中の同様のステロイド分配はこれが種々の大きさのエア ゾール粒子の木表面上の衝撃後に生ずることを示唆する。一般に、リポソームが リン脂質と水性媒質が生ずる水和形態の相転移温度より高い温度で混合されたと きにのみ形成されることが容認される。従って、これが衝撃媒質エリ低い転移温 度のリン脂質でのみ生ずるということは妥当な仮定である。

平衡したリポソーム標本の希釈後、リポソームからの薬物流出が平衡分配係数の 回復を生じた。初期の速やかな放出後、従来およびエアゾール化したリポソーム 標本両方のプロットの直線性は、放出が／久遠度論により進行することを示す。

これらの結果は薬物の持続放出がエアゾール系から生じたリポソームから達成で き、流出半減期により示されるように、従来製造されたリポソームと同様の速度 論を生ずることを示す。従って、この１ｎｓｉｔｕ　ＩＪポノーム製造の方法は 薬剤の持続放出を与えるのに有用である。

ム　３０　モｌし％ ブρ圧バック中のｇｒｐＰｃ、４％　・％イ子ノく１ ％　イ拓Ｊぜｒ 時俣（ｈｌ ・　工′？ン゛二Ｊし ０７逆末５友 昭和　年　月　日

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．実質上純粋なリン脂質を揮発性液体担体中に含む組成物の極微小小滴を噴射 して水性表面の上または下に衝突させ、それにより前記表面でリポソームを形成 させることを含むリボソームの製造方法。
2. ２．極微小小滴が加圧エアゾール装置により発生される、請求の範囲第１項記載 の方法。
3. ３．液体担体がフルオロクロロカーボン噴射剤を含む、請求の範囲第２項記載の 方法。
4. ４．フルオロクロロカーボン噴射剤がトリクロロモノフルオロメタン、ジクロロ ジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびそれらの混合物から 選ばれる、請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．エアゾール装置中の配合物が０．１〜１０重量％のリン脂質を溶解した９０ 〜９９．９％の噴射剤を含む、請求の範囲第２項ないし第４項のいずれか一項に 記載の方法。
6. ６．リン脂質が少くとも８０％純粋である、請求の範囲第１項〜第５項のいずれ か一項に記載の方法。
7. ７．リン脂質が９０〜１００％純粋である、請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．リン脂質がホスフアチジルコリンである、請求の範囲第１項〜第７項のいず れか一項に記載の方法。
9. ９．極微小小滴が０．５〜５０ミクロンの範囲内の粒度を有する、請求の範囲第 １項〜第８項のいずれか一項に記載の方法。
10. １０．組成物がさらに、リポソーム形成でリポソーム内に閉込められる治療活性 物質を含む、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか一項に記載の方法。
11. １１．治療活性物質が揮発性液体担体中に、場合により補助溶媒の存在下に溶解 される、請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．リン脂質と治療活性物質とのモル比が少くとも５：１である、請求の範囲 第１項〜第１１項のいずれか一項に記載の方法。
13. １３．実質上純粋なリン脂質および治療活性物質の噴射剤物質中に溶解した溶液 を含有する単一の室を含むエアゾールの製造に使用するパツクであつて、リン脂 質と治療活性物質とのモル比が１：１より大きく、パツクが前記溶液をスプレー として噴射剤物質により発生される圧力下に分配する装置を含むパツク。
14. １４．リン脂質と治療活性物質とのモル比が少くとも５：１である、請求の範囲 第１３項記載のパツク。
15. １５．リン脂質と治療活性物質とのモル比が１０：１〜２０：１の範囲内にある 、請求の範囲第１３項または第１４項記載のパツク。
16. １６．さらに治療活性物質に対する補助溶媒を含む、請求の範囲第１３項〜第１ ５項のいずれか一項記載のパツク。
17. １７．溶液が無水である、請求の範囲第１３項〜第１６項のいずれか一項に記載 のパツク。