【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はスペルミジンの定量方法に関する。詳
しくはスペルミジン含有溶液に電子受容体の存在
下スペルミジンデヒドロゲナーゼを作用させ、次
いで該溶液にSH基を有する化合物を添加した
後、該溶液中の１―ピロリンを比色分析すること
を特徴とするスペルミジンの定量方法である。本
発明の定量方法はスペルミジンとプトレシンを含
むポリアミン溶液からプトレシンを定量する方法
にも応用できる。
スペルミジンあるいはプトレシンのようなポリ
アミンは生体中に存在するが、生体中でポリアミ
ンは細胞増殖に関与しており、その濃度は核酸合
成に先行して上昇する。1971年ラツセル等の研究
〔キヤンサー・リサーチ31巻1555〜1558（1971）〕
により、癌患者の尿中のポリアミンの濃度は健康
人と比較して上昇していることが明らかにされて
以来、ポリアミンは癌との相関から注目を浴びる
様になつた。それ以後、癌とポリアミンの濃度と
の相関性が多くの研究者によつて調べられ、ラツ
セル等の研究の妥当性が確かめられつつある。
〔例えば、クリニカル・ケミストリー23巻22〜27
（1977）参照〕。
したがつて必要上、これまでに多くの研究者に
よつて生体中のポリアミンの定量がなされてはい
るが、いずれも煩雑で労力を要するのみならず、
分析定量に時間を要する。現在のところ再現性、
感度の点で最も信頼性のあるポリアミンの定量法
は高速液体クロマトグラフイーによる方法であ
る。しかしながらこの方法においても、１検体の
分析処理に約60分を要し、研究レベルでの方法と
しての域を脱しきれない。
最近、ポリアミンの迅速且つ簡便な定量法とし
て酵素法が注目されている。例えば、スペルミジ
ンの定量はセラチア・マルセセンスの凍結乾燥菌
体による菌体反応による方法〔ジヤーナル・バイ
オロジカル・ケミストリー238巻2098（1963）〕で
行われるが、この方法においては菌体中の他の成
分による酵素反応の阻害等の影響が不明であり、
また菌体中のスペルミジン等のポリアミンの酵素
反応に及ぼす影響が不明である。さらに検出感度
が0.05μmole以上と低いという欠点を有してい
る。
本発明は、酵素法によるスペルミジンの定量方
法に関するものであり、スペルミジンデヒドロゲ
ナーゼを用いて迅速、簡便に、且つ再現性良く定
量する方法を提供する。尚、スペルミジンデヒド
ロゲナーゼはセラチア・マルセセンスなる細菌か
ら見出された酵素である。即ち本発明は、スペル
ミジン含有溶液に電子受容体の存在下、スペルミ
ジンデヒドロゲナーゼを作用させ、次いで該溶液
にSH基を有する化合物を添加した後、該溶液中
の１―ピロリンを比色定量することを特徴とする
スペルミジンの定量方法である。
本発明において定量の対象となるスペルミジン
を含有する溶液としては、例えば人体の尿、組織
抽出液等が挙げられる。しかし酵素反応に供する
これらの対象溶液が着色しているときは公知の手
段で脱色して試料に供するのが好ましい。
以下に本発明を詳述するが、好適な例として人
体の尿を用いて説明する。人体の尿にはスペルミ
ジンの他プトレシン、スペルミン等のポリアミン
が含まれているので以下ポリアミン溶液と称す
る。本発明においては、先ずポリアミン溶液に予
め電子受溶体の存在下でスペルミジンデヒドロゲ
ナーゼを作用させることが必要である。電子受容
体としてはフエリシアン化カリウム、フエナジン
メトサルフエート、ｐ―クロルフエノールインド
フエノール等が用いられ、好ましくは、フエリシ
アン化カリウムが酵素反応速度が早い点で有利に
使用される。電子受容体の添加量は一般に最終濃
度が0.5〜２ミリモルとなるように添加すればよ
い。またスペルミジンデヒドロゲナーゼは一般に
0.1〜5.0酵素単位加え、10〜40℃で0.5〜５時間反
応を行わせる。かくしてポリアミン溶液中のスペ
ルミジンは、次のように反応して
１―ピロリンが生成される。
したがつて、この生成した１―ピロリンを比色
分析することによつて当初のポリアミン溶液中の
スペルミジンの量を求めることができる。しかし
ながら実際的には、反応溶液中に過剰に存在する
電子受容体の着色により１―ピロリンの比色分析
が妨害されるために、ひいてはポリアミン溶液中
のスペルミジンの量を求めることが不可能であ
る。
本発明においては上記１―ピロリンの比色分析
に先だつて反応溶液にSH基を有する化合物を添
加して過剰の電子受容体を還元せしめて無色にす
ることが、１―ピロリンを正確に比色分析するた
めに極めて重要な特徴である。即ち、反応溶液に
添加されるSH基を有する化合物は過剰の電子受
容体を還元するのみで１―ピロリンに対してもま
た比色定量に対しても何等の影響を及ぼさない。
かかるSH基を有する化合物としては、β―メル
カプトエタノール、ジチオスレイトール、システ
イン等があげられるが、好ましくはβ―メルカプ
トエタノール、ジチオスレイトールが還元力の点
で有利に使用できる。
１―ピロリンの定量は０―アミノベンズアルデ
ヒドとの非酵素的反応により生成する２，３―ト
リメチレン―１，２―ジハイドロキナゾリウムを
435nmにて比色分析する。この方法はジヤーナ
ル・バイオロジカル・ケミストリー238巻2098
（1963）に記載されている。他方、ポリアミン溶
液にスペルミジンデヒドロゲナーゼを作用させる
代りに水を用いた以外は前記と全く同一の条件、
操作を行つて比色分析を行う。かくして両者の比
色定量の結果、吸光度の差からポリアミン溶液中
のスペルミジンの量が算出される。
本発明においては上記したスペルミジンの定量
方法を利用して、更にスペルミジンおよびプトレ
シンが含有されているポリアミン溶液からプトレ
シンを迅速、簡便且つ再現性良く定量する方法が
提供される。
従来知られているプトレシンの酵素法による定
量は、Ｓ―アデノシル―Ｌ―メチオニン脱炭酸酵
素による〔１―14C〕Ｓ―アデノシルメチオニン
の脱炭酸反応のプトレシンによる活性化を利用
し、生成する14CO2の検出による方法〔バイオヒ
ミカ・バイオフイズイカ・アクタ、304巻753
（1973）〕である。しかしながら、この方法におい
ては、Ｓ―アデノシル―Ｌ―メチオニン脱炭酸酵
素が得難く、さらに放射性物質を取扱わなければ
ならないという欠点がある。
本発明においてはポリアミン溶液中のスペルミ
ジンおよびプトレシンのトータル量をプトレシン
オキシダーゼを用いて求め、それから前記した定
量方法によつて求めた同ポリアミン溶液中のスペ
ルミジン量を差し引いてプトレシンの量を求める
という方法である。即ち、本発明は、スペルミジ
ンおよびプトレシンを含有するポリアミン溶液か
らプトレシンを定量するに際し、該ポリアミン溶
液の一部に電子受容体の存在下スペルミジンデヒ
ドロゲナーゼを作用させ、次いで該溶液にSH基
を有する化合物を添加した後、該溶液中の１―ピ
ロリンを比色定量することによりスペルミジンの
量(A)を求め、またポリアミン溶液の他の一部にプ
トレシンオキシダーゼを作用させた後、該溶液中
の１―ピロリンまたは過酸化水素を比色定量して
スペルミジンおよびプトレシンのトータル量
（Ｘ）を求めて、Ｘ―Ａプトレシンの量を求める
ことを特徴とするプトレシンの定量方法である。
生体中でスペルミジンとプトレシンのうち、ど
ちらが生理的に重要な役割を果しているかは未だ
明確ではない。例えば、ガン患者の体液中に、ス
ペルミジンとプトレシンのどちらが健康人のそれ
に比較して多くなつているかは論議されている段
階である。しかるに、スペルミジンとプトレシン
をそれぞれ定量することは非常に意義深いことで
ある。
本発明においてポリアミン溶液のスペルミジン
とプトレシンとを定量するためには、該ポリアミ
ン溶液にプトレシンオキシダーゼを作用させるこ
とが必要である。尚、プトレシンオキシダーゼは
ミクロコツカス・ルーベンスなる細菌から見出さ
れた酵素である。プトレシンオキシダーゼはポリ
アミン溶液に一般に0.1〜5.0酵素単位加えられ、
10〜40℃で0.5〜5.0時間反応させる。かくして、
ポリアミン溶液中のスペルミジンおよびプトレシ
ンは次のように反応する。
尚、人体の尿には他のポリアミンとしてスペル
ミンも含まれているが、プトレシンオキシダーゼ
は、スペルミンには作用しない。したがつて、反
応溶液中の生成した１―ピロリンまたは過酸化水
素を比色分析することによつて、当初のポリアミ
ン溶液中のスペルミジンとプトレシンとを定量す
ることができる。なお過酸化水素の定量は該過酸
化水素をパーオキシダーゼ存在下でＯ―ジアニシ
ジンを酸化し、その酸化型Ｏ―ジアニシジンを
440nmの波長で比色分析して定量される。しかし
ながら過酸化水素の定量は１―ピロリンのそれに
比べ感度は約５倍位高いが、定量の再現性及び簡
便さから言えば１―ピロリンの定量の方が有利で
ある。
以上の結果からＸ―Ａによつてプトレシンの量
が算出される。
以下、本発明のスペルミジンおよびプトレシン
の定量方法を実施する代表的な操作手順によつて
説明する。本発明はこれに限られるものではな
く、用いる試薬その量等は適宜の変更および応用
が加えられることは言うまでもない。
(1) スペルミジンの定量
ポリアミン水溶液サンプル 0.1ml
緩衝液（PH7.2）：0.1mole リン酸、
2mmoleフエリシアン化カリウム
Ｏ―アミノベンズアルデヒド：0.1％
（Ｗ／Ｖ）水溶液 0.1ml
スペルミジンデヒドロゲナーゼ：
1.0unit、比活性350 0.01ml
β―メルカプトエタノール：0.5％（Ｖ／
Ｖ）水溶液 0.1ml
上記試薬〜を試験管に入れ、30分間37℃
で振とうして反応させる。反応後のβ―メル
カプトエタノール水溶液を加え、37℃30分間振
とうする。他方、比較としての酵素水溶液の
代わりに水を用いたものを同様に処理する。各
処理液の435nmの吸光度を測定し、その差を△
ODとする。尚２，３―トリメチレン―１，２
―ジハイドロキナゾリウムの分子吸光係数は、
2.1×10-3M-1cm-1と報告されている（ジヤーナ
ル・バイオロジカル・ケミストリー234巻2145
（1959）〕
この△ODからスペルミジン含量(A)は、次の
ようにして計算される。
Ａ＝△OD・０．８１／２．１（μmole）
本発明の定量方法について、その正確性および
実用性を確かめる目的で既知量のスペルミジンと
プトレシンを含有するポリアミン溶液を用いて定
量を行つた。結果は、第１表の通りであつた。
The present invention relates to a method for quantifying spermidine. Specifically, spermidine is produced by allowing spermidine dehydrogenase to act on a spermidine-containing solution in the presence of an electron acceptor, then adding a compound having an SH group to the solution, and then colorimetrically analyzing 1-pyrroline in the solution. This is a quantitative method. The quantitative method of the present invention can also be applied to a method for quantifying putrescine from a polyamine solution containing spermidine and putrescine. Polyamines such as spermidine or putrescine exist in living organisms. In living organisms, polyamines are involved in cell proliferation, and their concentration increases prior to nucleic acid synthesis. 1971 Research by Ratsell et al. [Cancer Research Vol. 31, 1555-1558 (1971)]
Since it was revealed that the concentration of polyamines in the urine of cancer patients was increased compared to healthy people, polyamines have attracted attention due to their correlation with cancer. Since then, many researchers have investigated the correlation between cancer and polyamine concentrations, and the validity of Ratsell et al.'s research is being confirmed.
[For example, Clinical Chemistry 23 Volume 22-27
(1977)]. Therefore, many researchers have attempted to quantify polyamines in living organisms due to necessity, but these methods are not only complicated and labor-intensive;
Analysis and quantification takes time. At present, reproducibility
The most reliable method for quantifying polyamines in terms of sensitivity is high performance liquid chromatography. However, even with this method, it takes about 60 minutes to analyze one sample, so it is still a research-level method. Recently, enzymatic methods have attracted attention as a rapid and simple method for quantifying polyamines. For example, spermidine is quantified by a bacterial reaction method using freeze-dried cells of Serratia marcescens [Journal Biological Chemistry, Vol. 238, 2098 (1963)]; The effects of inhibition of enzymatic reactions, etc. due to
Furthermore, the effect of polyamines such as spermidine in bacterial cells on enzymatic reactions is unknown. Furthermore, it has the disadvantage of a low detection sensitivity of 0.05 μmole or more. The present invention relates to a method for quantifying spermidine using an enzymatic method, and provides a method for quantifying spermidine quickly, easily, and with good reproducibility using spermidine dehydrogenase. Incidentally, spermidine dehydrogenase is an enzyme discovered from the bacterium Serratia marcescens. That is, the present invention involves allowing spermidine dehydrogenase to act on a spermidine-containing solution in the presence of an electron acceptor, then adding a compound having an SH group to the solution, and then colorimetrically quantifying 1-pyrroline in the solution. This is a characteristic method for quantifying spermidine. Examples of spermidine-containing solutions to be quantified in the present invention include human urine and tissue extracts. However, if the target solution to be subjected to the enzymatic reaction is colored, it is preferable to decolorize it by a known method before applying it to the sample. The present invention will be described in detail below, using human urine as a preferred example. Since human urine contains polyamines such as putrescine and spermine in addition to spermidine, it is hereinafter referred to as a polyamine solution. In the present invention, it is first necessary to allow spermidine dehydrogenase to act on the polyamine solution in the presence of an electron acceptor. As the electron acceptor, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, p-chlorophenol indophenol, etc. are used, and potassium ferricyanide is preferably used since it has a fast enzyme reaction rate. The amount of electron acceptor to be added is generally such that the final concentration is 0.5 to 2 mmol. Also, spermidine dehydrogenase is generally
Add 0.1 to 5.0 enzyme units and carry out the reaction at 10 to 40°C for 0.5 to 5 hours. Thus, spermidine in the polyamine solution reacts as follows: 1-pyrroline is produced. Therefore, the amount of spermidine in the original polyamine solution can be determined by colorimetrically analyzing the produced 1-pyrroline. However, in practice, it is impossible to determine the amount of spermidine in the polyamine solution since the colorimetric analysis of 1-pyrroline is interfered with by the coloring of electron acceptors present in excess in the reaction solution. . In the present invention, prior to the above-mentioned colorimetric analysis of 1-pyrroline, adding a compound having an SH group to the reaction solution to reduce excess electron acceptors and making it colorless allows accurate colorimetric analysis of 1-pyrroline. This is an extremely important feature for analysis. That is, the compound having an SH group added to the reaction solution only reduces excess electron acceptors and has no effect on 1-pyrroline or colorimetric determination.
Examples of such compounds having an SH group include β-mercaptoethanol, dithiothreitol, cysteine, etc., and β-mercaptoethanol and dithiothreitol are preferably used from the viewpoint of reducing power. For the determination of 1-pyrroline, 2,3-trimethylene-1,2-dihydroquinazolium, which is produced by a non-enzymatic reaction with 0-aminobenzaldehyde, is used.
Perform colorimetric analysis at 435nm. This method is published in Journal of Biological Chemistry, Volume 238, 2098.
(1963). On the other hand, the conditions were exactly the same as above, except that water was used instead of allowing spermidine dehydrogenase to act on the polyamine solution.
Perform colorimetric analysis. As a result of colorimetric determination, the amount of spermidine in the polyamine solution can be calculated from the difference in absorbance. The present invention utilizes the method for quantifying spermidine described above, and further provides a method for rapidly, simply, and reproducibly quantifying putrescine from a polyamine solution containing spermidine and putrescine. The conventionally known enzymatic method for quantifying putrescine utilizes putrescine's activation of the decarboxylation reaction of [ 1-14C ]S-adenosylmethionine by S-adenosyl-L-methionine decarboxylase. 14 Method by detection of CO 2 [Biohimika Biohuizika Acta, Vol. 304, 753
(1973)]. However, this method has disadvantages in that S-adenosyl-L-methionine decarboxylase is difficult to obtain and furthermore, radioactive substances must be handled. In the present invention, the total amount of spermidine and putrescine in a polyamine solution is determined using putrescine oxidase, and then the amount of spermidine in the polyamine solution determined by the above-mentioned quantitative method is subtracted to determine the amount of putrescine. be. That is, in the present invention, when quantifying putrescine from a polyamine solution containing spermidine and putrescine, a portion of the polyamine solution is treated with spermidine dehydrogenase in the presence of an electron acceptor, and then a compound having an SH group is added to the solution. After addition, the amount of spermidine (A) is determined by colorimetrically quantifying 1-pyrroline in the solution, and after allowing putrescine oxidase to act on another part of the polyamine solution, 1-pyrroline in the solution is This is a method for quantifying putrescine, which is characterized in that the total amount (X) of spermidine and putrescine is determined by colorimetrically quantifying pyrroline or hydrogen peroxide, and the amount of X-A putrescine is determined. It is still unclear which of spermidine and putrescine plays a physiologically important role in living organisms. For example, it is under debate whether spermidine or putrescine is more abundant in the body fluids of cancer patients than in healthy individuals. However, it is very significant to quantify spermidine and putrescine individually. In order to quantify spermidine and putrescine in a polyamine solution in the present invention, it is necessary to allow putrescine oxidase to act on the polyamine solution. Incidentally, putrescine oxidase is an enzyme discovered from the bacterium Micrococcus rubens. Putrescine oxidase is generally added between 0.1 and 5.0 enzyme units to the polyamine solution;
React at 10-40°C for 0.5-5.0 hours. Thus,
Spermidine and putrescine in a polyamine solution react as follows. Although human urine also contains spermine as another polyamine, putrescine oxidase does not act on spermine. Therefore, spermidine and putrescine in the initial polyamine solution can be quantified by colorimetrically analyzing the produced 1-pyrroline or hydrogen peroxide in the reaction solution. For quantitative determination of hydrogen peroxide, O-dianisidine is oxidized with the hydrogen peroxide in the presence of peroxidase, and the oxidized O-dianisidine is converted to O-dianisidine.
It is quantified by colorimetric analysis at a wavelength of 440 nm. However, although the sensitivity of hydrogen peroxide determination is about five times higher than that of 1-pyrroline, the determination of 1-pyrroline is more advantageous in terms of reproducibility and ease of determination. From the above results, the amount of putrescine is calculated by X-A. Hereinafter, a typical operating procedure for carrying out the method for quantifying spermidine and putrescine of the present invention will be explained. It goes without saying that the present invention is not limited to this, and the amounts of reagents used may be changed and applied as appropriate. (1) Quantification of spermidine Polyamine aqueous solution sample 0.1ml Buffer solution (PH7.2): 0.1mole phosphoric acid,
2mmole potassium ferricyanide O-aminobenzaldehyde: 0.1%
(W/V) Aqueous solution 0.1ml spermidine dehydrogenase:
1.0 unit, specific activity 350 0.01ml β-mercaptoethanol: 0.5% (V/
V) Aqueous solution 0.1ml Put the above reagent ~ into a test tube and hold it at 37°C for 30 minutes.
Shake to react. Add the β-mercaptoethanol aqueous solution after the reaction and shake at 37°C for 30 minutes. On the other hand, for comparison, a sample using water instead of the enzyme aqueous solution was treated in the same manner. Measure the absorbance of each treatment solution at 435 nm and calculate the difference
OD. 2,3-trimethylene-1,2
-The molecular extinction coefficient of dihydroquinazolium is
2.1×10 -3 M -1 cm -1 (Journal Biological Chemistry Vol. 234 2145
(1959)] From this ΔOD, the spermidine content (A) is calculated as follows. A=△OD・0.81/2.1 (μmole) In order to confirm the accuracy and practicality of the quantitative method of the present invention, quantitative determination was performed using a polyamine solution containing known amounts of spermidine and putrescine. . The results were as shown in Table 1.
【表】
以上の結果から定量値が実濃度と誤差範囲内
で良く一致していることがわかる。
(2) スペルミジンとプトレシンのトータル量の定
量
ポリアミン水溶液サンプル： 0.1ml
緩衝液：0.1mole リン酸緩衝液（PH7.2）
0.5ml
Ｏ―アミノベンズアルデヒド：0.1％
（Ｗ／Ｖ）水溶液 0.1ml
プトレシンオキシダーゼ：1.0unit比活性
30 0.04ml
上記試薬〜を試験管に入れ、５分間37℃
で振とうする。次いでの酵素液を加え、37℃
で２時間振とうして反応させる。比較として
の酵素溶液の代わりに水を用いたものを同様に
処理する。各処理液435nmの吸光度を測定し、
その差を△ODとする。△ODからスペルミジン
とプトレシンのトータル量（Ｘ）は次のように
して計算される。
Ｘ＝△OD・０．７４／２．１（μmole）
ポリアミン水溶液として種々の既知濃度のスペ
ルミジンとプトレシンを含有する溶液を使つて、
本発明の定量方法について正確性と実用性を検討
した。結果は第２表に示す通りであつた。[Table] From the above results, it can be seen that the quantitative values agree well with the actual concentrations within the error range. (2) Quantification of the total amount of spermidine and putrescine Polyamine aqueous solution sample: 0.1ml Buffer: 0.1mole phosphate buffer (PH7.2)
0.5ml O-aminobenzaldehyde: 0.1%
(W/V) Aqueous solution 0.1ml Putrescine oxidase: 1.0unit specific activity
30 Put 0.04ml of the above reagent ~ into a test tube and incubate at 37°C for 5 minutes.
Shake. Add the next enzyme solution and heat at 37°C.
Shake for 2 hours to react. As a comparison, a sample using water instead of the enzyme solution was treated in the same manner. Measure the absorbance of each treatment solution at 435 nm,
Let the difference be △OD. The total amount of spermidine and putrescine (X) is calculated from ΔOD as follows. X=△OD・0.74/2.1 (μmole) Using solutions containing various known concentrations of spermidine and putrescine as polyamine aqueous solutions,
The accuracy and practicality of the quantitative method of the present invention were examined. The results were as shown in Table 2.
【表】
以上の結果から定量値が実濃度と誤差範囲内
で良く一致していることがわかる。
(3) プトレシンの含量
(1)で得られたスペルミジンの量……Ａ
(2)で得られたスペルミジンとプトレシンのトー
タル量……Ｘ
とすれば、プトレシン含量(B)は次の式から算出さ
れる。
Ｂ＝Ｘ−Ａ（μmole）
実施例 １
（） プトレシンとスペルミジンのトータル量
の定量
(イ) 用いる試薬
(1) 被検液ポリアミン含有水溶液（プトレシ
ン、スペルミジン含有量未知） 0.1ml
(2) 緩衝液0.1Mリン酸緩衝液（PH7.2） 0.5ml
(3) 0.1％（Ｗ／Ｖ）Ｏ―アミノベンズアルデ
ヒド水溶液 0.1ml
(4) プトレシンオキシダーゼ（1.0unit、比活
性30） 0.04ml
(ロ) 操作
上記試薬(1)−(3)を試験管に入れ、５分間37℃
でよく振とうする。次いで酵素液を加えた後、
37℃で２時間振とう反応させる。一方、コント
ロールとして酵素溶液の代りに水を入れたもの
を同様に処理する。被検液の435nmでの吸光度
を求め、コントロールとの差、△ODは0.350で
あつた。計算に依つて被検液中のプトレシンと
スペルミジン含量は、0.123μmoleと分析され
た。
（） スペルミジン量の定量
(イ) 用いる試薬
(1) 被検液ポリアミン含有水溶液（プトレシ
ン、スペルミジン含有量未知） 0.1ml
(2) 緩衝液：0.1Mリン酸、2mMフエリシアン
化カリウム（PH7.2） 0.5ml
(3) Ｏ―アミノベンズアルデヒド：0.1％水溶
液 0.1ml
(4) スペルミジンデヒドロゲナーゼ：1.0unit
比活性350 0.01ml
(5) β―メルカプトエタノール：0.5％（Ｖ／
Ｖ）水溶液 0.1ml
(ロ) 操作
上記試薬(1)−(4)を試験管に入れ、37℃で30分
間振とうし反応させる。反応後(5)のβ―メルカ
プトエタノール水溶液を加え、37℃30分間振と
うする。コントロールとして(1)の酵素溶液の代
りに水を入れたものを同様に処理する。被検液
の435nmでの吸光度を求め、コントロールとの
差△ODは0.185であつた。計算から被検液中の
スペルミジン量は0.071μmoleである。さらに
第１図の検量線より実スペルミジン量は0.079
μmoleと分析された。
（） プトレシン量の算出
従つて被検液中のプトレシン量は0.123−
0.079＝0.044μmoleと計算される。[Table] From the above results, it can be seen that the quantitative values agree well with the actual concentrations within the error range. (3) Content of putrescine Amount of spermidine obtained in (1)... A Total amount of spermidine and putrescine obtained in (2)... If X, putrescine content (B) is calculated from the following formula. be done. B=X-A (μmole) Example 1 () Determination of the total amount of putrescine and spermidine (a) Reagents used (1) Test solution polyamine-containing aqueous solution (putrescine and spermidine content unknown) 0.1 ml (2) Buffer solution 0.1M phosphate buffer (PH7.2) 0.5ml (3) 0.1% (W/V) O-aminobenzaldehyde aqueous solution 0.1ml (4) Putrescine oxidase (1.0 unit, specific activity 30) 0.04ml (b) Procedure above Put reagents (1)-(3) into test tubes and incubate at 37℃ for 5 minutes.
Shake well. Then, after adding the enzyme solution,
Incubate with shaking at 37°C for 2 hours. On the other hand, as a control, water was added instead of the enzyme solution and treated in the same manner. The absorbance of the test solution at 435 nm was determined, and the difference from the control, ΔOD, was 0.350. Based on calculations, the putrescine and spermidine contents in the test solution were determined to be 0.123 μmole. () Quantification of the amount of spermidine (a) Reagents used (1) Test solution Polyamine-containing aqueous solution (putrescine, spermidine content unknown) 0.1ml (2) Buffer: 0.1M phosphoric acid, 2mM potassium ferricyanide (PH7.2) 0.5 ml (3) O-aminobenzaldehyde: 0.1% aqueous solution 0.1ml (4) Spermidine dehydrogenase: 1.0unit
Specific activity 350 0.01ml (5) β-mercaptoethanol: 0.5% (V/
V) Aqueous solution 0.1ml (b) Procedure Place the above reagents (1) to (4) in a test tube and shake at 37°C for 30 minutes to react. After the reaction, add the aqueous β-mercaptoethanol solution from (5) and shake at 37°C for 30 minutes. As a control, water was added instead of the enzyme solution in (1) and treated in the same manner. The absorbance of the test solution at 435 nm was determined, and the difference ΔOD from the control was 0.185. From the calculation, the amount of spermidine in the test solution is 0.071 μmole. Furthermore, from the calibration curve in Figure 1, the actual spermidine amount is 0.079.
It was analyzed as μmole. () Calculation of the amount of putrescine Therefore, the amount of putrescine in the test solution is 0.123−
It is calculated as 0.079=0.044 μmole.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図はスペルミジン量の検量線を示す。
FIG. 1 shows a calibration curve for the amount of spermidine.