JPS6236355A - 新規ピロリン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は新規ピロリン化合物に関する。さらに詳細に
は、この発明は免疫調節剤または血糖降下剤として有用
な新規ピロリン化合物およびその塩類、その製造法なら
びにそれを含有する組成物に関する。

この発明の新規ピロリン化合物は、次の化学式％式％ ３−（Ｒ）−４−（Ｒ）−ジヒドロキシ−５−（Ｒ）−
゛　ヒドロキシメチル−１−ピロリンと命名される。

ピロリン化合物（Ｉ）は発酵法および化学的合成を含む
下記の方法により製造することができる。

（Ａ）発酵 ネクトリア（ｋｃｔｒｉａ　）属 に属する菌株 （Ｂ）合成 （ｉ）中間体の製造 またはその塩 いり （ＩＶ）　　　　　　　　　　　　（ＩＩＩ）（Ｉ） （ｉ）目的化合物の製造 （Ｉ［ａ）　　　　　　　　　　　（Ｉ）（式中、Ｒ％
Ｒ，ＲおよびＲはそれぞれ同じまたは興なるヒドロキシ
堡竺基を意味するかまたはＲ１およびＲは一緒になって
隣接するヒドロキシの保護基を形成し； Ｒはアく）保護基； Ｒ６は水素またはホルミル基を意味する）。

化合物（■）の好適な塩類は慣用の無毒性塩類であり、
マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン謙、酢酸、安息
香酸、塩酸、硫酸、硝酸、燐酸等のような有機酸または
無機酸との塩がその例として挙げられる。

化合物（１）はある条件下では水溶液中においては下記
のような平衡状態で存在し、 これらの二つの形は両方ともこの発明の範囲内に包含き
れるものとする。

この発明の目的化合物（Ｉ）の製造法を以下、さらに詳
細に説明する。

（Ａ）発酵法：ネクトリア属菌株→化合物（Ｉ）化合物
（Ｉ）はネクトリア属に属するピロリン化合物（１）を
産生しうる菌株の栄養培地中における発酵により産生ず
ることができる。その詳細を以下に説明する。

ピロリン化合物（りの産生に使用されうる菌はネクトリ
ア属に属するものであり、それらの中でネクトリア・ル
シダ（Ｎｅｃｔｒｉａ　Ｌｕｃｉｄａ　）　Ｆ　−４４
９０菌株がピロリン化合物（１）産生菌株の好適菌株と
して土壌試料から新たに分離された。この菌株はπ記の
形態学的特徴、培養上の特徴および生理学つ特徴を有す
る。

菌株ネクトリア・ルシダＦ　−４４９０は大阪府貝塚ゴ
で採取された土壌試料から最初に分離された。

千嚢果はフーンミール寒天またはオートミール１天上に
１ケ月後に発生し、菌糸のフニジオマは種々の培養培地
上に豊富に観察きれた。分生子形成様式は内田芽型のブ
イアロ型である。

子嚢果（子嚢殻）は表在性であり、球形ないし亜球形を
呈し、乳頭状であり、頂毛および倒毛がなく、褐色ない
し暗褐色であり、直径３２０〜５００Ｐである。子嚢殻
は厚壁の細胞よりなり、孔口１個を有する乳頭突起は直
径１２０〜１５０−であり、高き６０〜９０−である。

子嚢は一重壁子嚢で、円筒状ないしこん棒状で８個の胞
子を有し、長さ８０〜９５−１太さ７〜９−である。子
嚢胞子は斜め単列に並び、無色、平滑で２個の細胞より
なり、楕円形であり、末端が丸味を帯び、隔壁部でくび
れており、長さ１０〜１３Ｐａ、太８５．５〜７ｐｓで
ある。

分生子柄は無色、平滑で隔壁があり、単独で培地から直
立し、長き７〜２０−１太さ３〜４．５Ｐである。これ
らは単一であるかまたは数回分枝しており、各先端部は
ブイアライドになっている。

ブイアライドは無色、平滑であり、円筒状で、明瞭な末
端のカラーを有し、長さ１２〜１７−１太さ３〜４；で
ある。これらは、ブイアライドの先端部で分生子塊に集
合する、淡色の分生子を生じる。

分生子は平滑で円筒形かまたは頂点に向って湾曲してお
り、丸くなった先端を有し、典型的には３隔膜性で、長
さ５０〜６０（〜７ｏ）、ａ、太さ５．５〜７−である
。小分生子は無い。

栄養菌糸は隔膜があり、無色、平滑で、分枝している。

菌糸細胞は円筒形であり、太さ２〜６−である、菌糸体
にタラミドスボアは観察されないが、分生子の細胞中に
ほぼ球状のクラミドスボアが発生する。

麦芽抽出寒天上の集落は広く拡がり、２５℃、２週間後
に直径５．０ｃｍに達した。集落表面は隆起し℃羊毛状
、鈍い赤味を帯びた紫色ないし暗い赤味を帯びた紫色で
、淡いオリーブ色の菌糸で覆われている。分生子構造は
豊富である。裏面は赤味を帯びた褐色である。コーンミ
ール寒天上の培養物は同条件下で直径６ｃｌＴ＋に達す
る。これらは平担で、薄く、淡黄褐色である。裏面は同
色である。

分生子は少ない。子嚢殻はこの培地上に２５℃、４週間
後に形成きれる。

Ｆ　−４４９０菌株は５〜３０℃の温度範囲で生育する
ことができ、至適生育範囲は２４〜２６℃である。これ
らの温度試験結果は、温度勾配培養機（東洋科学産業社
製）を使用して、ポテト・デキストロース寒天上で測定
した。この菌株はｐＨ３〜９の範囲で生育することがで
き、生育至適ｐＨはＹＭプロス培地（ディフコ）中５〜
７である。

ネクトリア属の分類学上の規準によれば、菌株Ｆ　−４
４９０はネクトリア・ルシダ・ヒョーネル（Ｈ６ｈｎｅ
ｌ　）に酷似している。また、この菌株のアナモルフは
シリンドロカーボン会ルシドウム・ブース（江旦７１ｕ
ｃｉｄｕｍ　Ｂｏｏｔｈ　）　（ネクトリア・ルシダの
アナモルフ）であると考えられる。また、上記の特徴は
例外なくブースの記載（１９６６年）と一致する。従っ
て菌株Ｆ　−４４９０はネクトリア・ルシダの一つの菌
株であると同定され、ネクトリア・ルシダＦ−４４９０
と命名された［シー・ブース１ザ・ジーナス・シリンド
ロカーボン」マイコロジカル・ペーパーズ、　（Ｃ，Ｂ
ｏｏｔｈ”Ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｃ１ｉｎｄｒｏｃａｒ
　ｏｎ、”　　ＭｙｃｏｌｏｇｉＡａｌＰａｐｅｒｓ　
）第１０４号、２１頁、１９６６年］。

ネクトリア・ルシダＦ　−４４９０はジ・アメリカン・
タイプ・カルチャー・フレクション（ｔｈｅＡｍｅｒｉ
ｃａｎ　ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ）の永久保存培養物収集に寄託番号ＡＴＣＣ２０７
２２として寄託され、加えられている。

ピロリン化合物（Ｉ）の産生においては、この発明は単
に説明のためにのみこの明細書に記載された特殊な菌の
使用に限定されるものではない。この発明にはまた、こ
の菌株の自然変異によって産生される自然変異菌株はも
ちろんのこと、ｘｗ＆照射、紫外線照射、ナイトロジェ
ンマスタード油処理等のような常法により上記菌より産
生されうる人為変異菌株を含めて、ピロリン化合物＜Ｉ
）を産生しうるいかなる変異菌株の使用も包含される。

この発明のピロリン化合物（Ｉ）は、ネクトリア属に属
するピロリン化合物（り一度生菌株、例えばネクトリア
・ルシダＦ　−４４９０を、同化可能な炭素源および窒
素源を含む栄養培地中、例えば振とう培養、深部培養等
の好気条件下に生育せしめる場合に産生される。

栄養培地中の好ましい炭素源はグルコース、フラクトー
ス、グリセリン、スターチ等のような炭水化物である。

さらにそれらの中に含めてもよい省の他の炭素源はラク
トース、アラビノース、キシロース、デキストリン、糖
蜜等である。

好ましい窒素源はイーストφエキストラクト、ペプトン
、グルテン粉、綿実油、大豆粉、コーン・ステイープ・
リカー、乾燥イースト、小麦胚芽等、ならびに例えば硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウム
等のアンモニウム塩類、深索、アミノ酸等のような無機
窒素化合物および有機窒素化合物である。

炭素源および窒素源は組合わせて使用すると有利ではあ
るが、純度の低い物質も痕跡程度の生育因子とかなりの
量の無機栄養素を含んでおり、使用に適しているので、
炭素源および窒素源はそれらを純粋な形で使用する必要
はない、所望に応じて、上記培地に炭酸カルシウム、燐
酸ナトリウムまたは燐酸カリウム、塩化ナトリウムまた
は塩化カリウム、マグネシウム塩類、銅塩類等のような
無機塩類を加えてもよい。必要であれば、とりわけ培養
培地が激しく発泡する場合には、液状パラフィン、脂肪
油、植物油、鉱物油またはシリコンのような消泡剤を加
えてもよい。

他の発酵生産物の大量生産に使用される好ましい方法の
場合と同様に、深部好気培養条件がピロリン化合物（１
）の大量生産には好ましい、さらにまた、生育が大型タ
ンク内で行われる場合には、ピロリン化合物（Ｉ）の生
産工程における菌の生育遅延を回避するために、生菌を
使用して生産タンク内に接種するのが好ましい、すなわ
ち、まず比較的少量の培養培地に菌の胞子または菌糸を
接種してそれらを培養することにより生菌接種体を生産
し、次いで培養した生菌接種体を無菌状態で大型タンク
に移し換えるのが望ましい、生菌接種体を生産する培地
は、ピロリン化合物（Ｉ）の生産に使用する培地と同じ
であるかまたは異なる。

培養混合物の攪拌および通気は種々の方法で行われる。

攪拌はプロペラまたは類似の攪拌装置によるか、発酵器
の回転または振とうによるか、種々のポンプ装置による
かまたは滅菌空気を培地中を通過させることにより行え
ばよい０通気は滅菌空気を発酵混合物中を通過させるこ
とにより行えばよい。

発酵は通常、約５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の
間の温度範囲で、約５０〜１００時間行われる。

ピロリン化合物＜１）は他の公知の発酵生産物の回収に
共通して使用される常法で、培養培地から回収すること
ができる。

一般的には、このようにして生産きれるピロリン化合物
（１）は細胞内または細胞外または両方に存在し、これ
らは使用する菌株の種類によって変化する。ピロリン化
合物（１）が細胞外に産生される場合には、培養プロス
を濾過するかまたは遠心分離し、次いで化合物（１，）
を濾液または上澄液から減圧濃縮、凍結乾燥、ｐＨ１ｌ
ｌ！、例えば陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂
、非イオン吸着樹脂等の樹脂処理、例えば活性炭、ケイ
酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等の吸着剤処理
、結晶化、再結晶等のような常法により分離することが
できる。

ピロリン化合物（Ｉ）が細胞内に産生される場合には、
菌糸を濾過または遠心分離により得て、然る後に化合物
（■）を菌糸から、例えばアセトン、トルエン等の有機
溶媒による菌糸の抽出、例えば凍結、−解凍、超音波処
理等による菌糸の破壊、前記分離法等のような常法によ
って分離することができる。

（Ｂ）合成 この明細書で述べる種々の定義の詳細および好ましい例
を以下説明する。

この明細書で使用する「低級」とは、特に指示がなけれ
ば、炭素原子１〜６個を有する基を意味するものとする
。

Ｒ，Ｒ，ＲおよびＲ５の好適なｒヒドロキシ保護基とし
ては、後述のアシル基、例えばメチル、エチル、イソプ
ロピル、第三級ブチル、ヘキシル等の低級アルキル基、
例えばベンジル、ベンスヒドリノ呟　トリチル等のアル
（低級）アルキル基等のような慣用の保護基が挙げられ
る。

ＲおよびＲ２の「隣接するヒドロキシ基の保護基」とし
ては、例えば、インプロピリデン、シクロへキンリデン
等のアルキリデン、例えばベンジリデン等のアル（低級
）アルキリデン等のような慣用の保護基が挙げられる。

Ｒ４の好適な「アミノ保護基」としては後述のアシル基
のような慣用の保護基が挙げられるが、それらの中で好
ましい保護基は塩基による加水分解で脱離されうるもの
である。

アシル基の好ましい例としては、例えばアセチル、プロ
ピオニル、第三級ブチリル、トリフルオロアセチル、ト
リクロロアセチル、アセトアセチル等の任意に置換され
た低級アルカノイル基、例えばメトキシカルボニル、エ
トキシカルボニル等の低級アルフキジカルボニル基、例
えばベンゾイル等のアロイル基、例えば１．１−ジメチ
ル−２−シアンエチルカーバメート等のカーバメート等
が挙げられる。

繋３！１ｍｌ 化合物（ＶＩ）またはその塩は、化合物（■）をアミノ
基の導入反応に付すことにより製造することができる。

化合物（Ｖｌ）の好適な塩類としては、化合物（Ｉ）に
ついて例示したものが挙げられる。

反応はカルボニル部分の位置にアミノ基を導入するのに
適用きれる慣用の方法、例えば化合物（■）をヒドロキ
シルアミンと反応させ、生成する化合物を次いで還元す
ることにより行うことができる。

反応は通常、アルコーノ呟エーテル等のような溶媒中、
好ましくは室温または加温下または加熱下に行われる。

製造法２ 化合物（Ｖ）は化合物（ＶＩ＞またはその塩を、アミン
保護基の導入反応に付すことにより製造することができ
る。

反応は、例えば、化合物（ＶＩ）をアシル化剤と反応さ
せることにより行うことができる。

この製造法で使用されるアシル化剤としては、有機カル
ボン酸および有機スルホン酸のような有機酸、およびそ
れらの反応性誘導体が挙げられる。

反応性誘導体としては、酸ハロゲン化物、酸無水物、活
性アミド、活性エステル等が挙げられる。これらの反応
性誘導体は使用する酸の種類によって選択される。

遊離酸をアシル化剤として使用する場合には、慣用の縮
合剤の存在下にこの反応を行うのが好ましい。

反応は通常、ジメチルスルホキシド、塩化メチレン、テ
トラヒドロフラン、ピリジン、クロロホルム、ジクロロ
エタン、ジメチルホルムアミド等のような溶媒中で行わ
れる。

反応は、アシル化反応に常用きれる有機塩基または無機
塩基の存在下に、水冷下、常温または加温下のような若
干温和な条件下に行うのが好ましい。

鳳ＩＬ互 化合物（ＩＶ）は化合物（Ｖ）をヒドロキシ保護基の脱
離反応に付すことにより製造することができる。

この製造法の脱離反応は加水分解、還元等の常法によっ
て行うことができる。

加水分解は酸または塩基の存在下に行うのが好ましい、
酸の好ましい例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫
酸等の無機酸、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、
プロピオン酷、ペンゼルスルホン酸、ｐ−トルエンスル
ホン酸等の有機酸等が挙げられる。

塩基の好ましい例としては、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸
水素ナトリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ金属ま
たはアルカリ土類金属水酸化物または対応する次酸塩ま
たは炭酸水素塩、水酸化アンモニウム等のような無機塩
基；例えばナトリウムエトキシド、ナトリウムメトキシ
ド等の前記金属のアルコキシドまたはフェノキシト、例
えばメチルアミン、エチルアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−
１，３−プロパンジアミン、トリメチルアミン、トリエ
チルアミン等のモノ−、ジーまたはトリアルキルアミン
等のような有機塩基が挙げられる。

加水分解は冷却下、常温または加温下のような若干温和
な条件下に、水、例えばメタノール、エタノール、プロ
パツール等のアルコール、ジメチルスルホキシド、塩化
メチレン、テトラヒドロフラン等のような反応に悪影響
を及ぼさない溶媒中で行うのが好ましい。酸または塩基
が液体であれば、それを溶媒として使用することもでき
る。

還元は化学的還元および接触還元を含めて、常法で行う
ことができる。

化学的還元で使用きれる還元剤の好ましい例は、例えば
スズ、亜鉛、鉄等の金属、またはそのような金属および
／または例えば塩化第ニクロム、酢酸第ニクロム、パラ
ジウム黒等の金属化合物と例えばギ酸、酢酸、／ロピオ
ン酸、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、塩
酸等の有機酸または無機酸との組合わせである。

接触還元に使用される触媒の好ましい例は、例えば白金
板、白金海綿、白金黒、コロイド白金、酸化白金等の白
金触媒、例えばパラジウム海綿、パラジウム黒、酸化パ
ラジウム、パラジウム−炭素、コロイドパラジウム等の
パラジウム触媒等である。

還元は通常、水、例えばメタノール、エタノール等のア
ルコール、テトラヒドロフラン等のような溶媒中、好ま
しくは冷却下、常温または加温下のような若干温和な条
件下に行われる。

反応方式は脱離すべき保護基によって、上記方法の中か
ら選択される。

１産亘１ 化合物帽）は化合物（ＩＶ）をグリフール部分の酸化的
開裂反応に付すことにより製造することができる。

反応は、グリフールの酸化的開裂に適用きれる常法、例
えばメタ、過沃素酸ナトリウム、四酢酸鉛、過マンガン
酸カリウム、三酸化クロム等のような酸化剤を使用する
方法によって行うことがで、きる。

この反応は通常、水、テトラヒドロフラン、エーテルの
ような溶媒中で行われるが、反応に悪影響を及ぼきない
溶媒であれば、その他のいかなる溶媒中でも反応を行う
ことができる。

反応温度は特に限定されないが、冷却下、常温−または
加温下に反応を行うのが好ましい。

毀盟羞１ 化合物（Ｉ）は化合物（Ｉ［）をヒドロキシ保護基の脱
離反応に付すことにより製造することができる。

この反応は実質的に鼠産迭１と同様にして行うことがで
きる。

製ｉｌｌ互 化合物（Ｉ）は化合物（ＩＩａ）をアミノ保護基の脱離
反応に付すことにより製造することができる。

３位のヒドロキシ基にホルミル基を有する化合物（Ｉ［
ａ）を使用する場合、このホルミル基も反応の過程で脱
離されるが、そのような場合もこの製造法に含まれる。

反応は実質的にＩＪＪｊ−と同様にして行うことができ
る。　　・ 新規ピロリン化合物ＣＩ）およびその塩類は、免疫調節
活、性およびα−グルフシダーゼの作用を阻止する力の
ような種々の生物学的活性を有することが見出され、従
って免疫活性の低下によって起る疾患の薬物療法のため
の免疫調節剤、および糖尿病等のような高血糖症の結果
として起る疾患または障害の薬物療法のための血糖低下
剤として有用である。

化合物（Ｉ）の有用性を示すために、その薬理試験結果
を以下に示す。

１）担癌マウス血清からの免疫抑制因子の調製マウス：
生後８選的のＩＣＲ／ＪＣＬ系雌マウスを浜松市静岡実
験動物農業協同組合より入手した。

腫瘍ｎ　ＩＣＲ系マウスの生体内に腹水癌の形で維持き
れたザルコーマ肉腫１８０（Ｓ　−１８０）細胞をこの
実験に使用した。

免疫抑制因子の調製： ＩＣＲ系マウスにＳ−１８０懸Ａ液（細胞数５×１０６
個／　ｍＱ　）　０．２ｍＱを腹腔内接種した。移植後
７〜９日の間に、Ｓ−１８０拒癌マウスの心臓からエー
テル麻酔下、滅菌シリンジで採血し、血清を採取した。

Ｓ　−１８０担癌マウス血清からセ・キュン・オー（Ｓ
Ｅ−ＫＹＵＮＧ　ＯＨ’）およびエフ・エル・ムールト
ウン（Ｆ、　Ｌ、　ＭＯＯＬＴＥＮ　）　［ジ・７−ナ
ル・才ブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）第
１２７巻２３００〜２３０７頁、１９８１年コに記載さ
れている方法により、免疫抑制因子を部分精製した。

要約すると、血清（５０１１１Ｑ）を４％燐タングステ
ン酸１／１０容および２Ｍ塩化マグネシウム１／４０容
で脱脂質し、６０００ｘ　ｃで１０分間遠心分離した。

過剰の燐タングステン酸およびマグネシウムイオンを、
燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ　：　０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムおよび０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐＨ７，４）に対
する透析により除去した。次いで部分膜脂質血清を硫酸
アンモニウム５０％飽和により沈殿させた。上澄液を２
０．０００Ｘ　Ｇで３０分間遠心分離して除いた。沈殿
を少量の水に再溶解し、ＰＢＳに対して４℃で一夜透析
した。透析溶液を、　ＰＢＳを用いてセファデックス（
５ｅｐｂａｄｅｘ　）Ｇ　−２００（商標：ファルマシ
ア・ファイン・ケミカルズ社製）を充填したカラムに付
した。各溶出液（１５ｍＱ　）の抑制活性について検定
した。

２）免疫抑制活性の検定法 免疫抑制活性をマイトジェン誘起マウス牌細胞増殖の抑
制度合の検定により測定した。

３）マイトジェン誘起マウス牌細胞増殖の抑制および試
験管内における（　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）ビロリン化合
物（Ｉ）によるその回復 試験管内におけるマウス牌細胞のマイトジェン活性： ａ）マウス：生後８週齢のＢａ１ｂ／Ｃ系雌マウスを使
用した。

ｂ）ｍ織培養培地：使用した組織培養培地は、ロズウェ
ル・パーク・メモリアル金インステイテユ　−　ト　［
Ｒｏｓｗｅｌｌ　　ｐａｒｋ　　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　　
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）　ｌ−１６４０であっ
た。使用した培地はすべてペニシリンＧ１００単位／　
ｍｌ　、ストレプトマイ・シン・硫酸塩ｔｏｏ＜／ｍ！
１およびウシ胎児血清５％を含むものであった。

Ｃ〉牌細胞調ｔ：牌臓を滅菌条件下に切除してハンクス
溶液で洗浄し、次いで培養培地中ですりつぶした。細胞
数５×１０５個／　ｍＱが含まれるように、細胞を組織
培養培地に懸濁した。

ｄ）培養条件：微量滴定板［ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ
）３０４０号（商標：ファルコン社製）コの各−穴に上
記細胞懸濁液Ｑ、１ｍＡおよび規定濃度の化合物溶液０
．１ｍＱおよび／または下記免疫抑制因子を添加した。

細胞刺戟のためにフンカナバリンＡｔ＜／ｍＢ炭酸ガス
培養器最終濃度）を利用した。培養物を１サンプル３回
繰返しで検定し、（空気９５％、００２５％）中、３７
℃で４８時間インキュベートした。

ｅ）マイトジェン誘起マウス牌細胞増殖の検定マイトン
エン誘起マウス牌細胞増殖を三重水素化チミジン（３Ｈ
−チミジン）とり込みにより検定した。すべての試験で
１０マイクロキユーリー（μＣｉ）／ｍＨの３Ｈ−チミ
ジン２０種を各穴に加えて４８時間培養した。

さらに２４時間インキュベート後、培養を終了した。細
胞培養液をワットマンＣＦ３３（商標二ワットマン社製
）の濾紙で濾過し、順次食塩水および５％トリクロル酢
酸で洗浄した。濾紙を乾燥してシンチレータ−［ｐ−ビ
ス（５−フェニルオキサゾール）ベンゼン０．１ｇおよ
び２．５−ジフェニルオキサゾール４ｇを含むトルエン
１２］中に置き、ＤＮＡ中にとり込まれた３Ｈ−チミジ
ンを測定した。

結果 牌佃胞のマイトジェン活性に対する免疫抑制因子の抑制
効果およびビロリン化合物（Ｉ）によるその回復を表１
に示す。

担癌マウス血清から得た免疫抑制因子は、マウス牌細胞
による３Ｈ−チミジンとり込みのマイトジェン誘起刺戟
を強く抑制した（表１参照）。この抑制は投与量によっ
て変化する。

免疫抑制因子を含む培養物にピロリン化合物（１）を加
えた結果、抑制は解除きれた。この結果は、ピロリン化
合物がマウス牌細胞のマイトジェン応答の免疫抑制因子
による低下を回復する能力を有することを示している。

表１．フンカナバリンＡ誘起マウス牌細胞増殖の免疫抑
制因子による抑制およびピロリン化合物（１）によるそ
の回復 ＊：平均＋標準誤差（ｎ＝４） α−グルフシダーゼ（イーストより得たもの、ＩＶＷ）
をシグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　（米国）より入手した。

α−グルコシダーゼ阻止の検定方式は次のとおりである
。

αグルフシダーゼ溶液（１／１５ＭＫ−燐酸塩緩衛液中
１（ｉｔ／ｍＪｌ、ｐＨ６，８）　２５０Ｐｄ１および
試験溶液または水２５０４よりなる混合物を３０℃で５
分間インキュベートし、この溶液にｐ−ニトロフェニル
−α−Ｄグルフピラノシド（１／１５ＭＫ−燐酸塩緩衛
液中５　ｍＭ、　ｐＨ６，８）を加えた。これを３０”
Ｃ，で１０分間インキュベートし、次いで０．４Ｍグリ
シン−ＮａＯＨｔｉｋ衡液（ｐＨ１０，９）　２１１１
１１．１ｍ（７）溶液に加えて反応を停止させた。溶液
の光学濃度を　−４００＊で測定した。

阻止活性を次式による阻止（Ｉ＞百分率で表わした。

Ａは阻止剤のない場合の光学濃度、Ｂは阻止剤の存在下
における光学濃度を意味する。

α−グルコシダーゼ活性の５０％阻止（ＩＣ５ｏ）に必
要なピロリン化合物（Ｉ）の濃度は０．０１＋４：／ｍ
ｌ）であった。

この発明のピロリン化合物（Ｉ＞およびその塩類は、例
えばこの発明の有効物質を外用、内用または非経口適用
に適した有機もしくは無機担体もしくは賦形剤と混合し
て含有する固体状、半固体状または液状の慣用の医薬製
剤の形で使用することができる。有効成分は、例えば、
錠剤、ペレット、カプセル、上側、溶液、エマルジョン
、懸濁液およびその他使用に適したあらゆる剤形用の、
通常の無毒性の医薬として許容されうる担体と混合すれ
ばよい、使用されうる担体は水、グルコース、乳糖、ア
ラビアゴム、ゼラチン、マンニラトール、スターチ・ペ
ースト、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーン
・スターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ポテト・スタ
ーチ、深索およびその他の固体状、半固体状または液状
の製剤製造における使用に適した担体であり、さらにま
た助剤、安定剤、濃厚化剤および着色剤ならびに芳香剤
を使用してもよい、医薬組成物はまた、有効成分を所望
の製剤中、その活性を安定に維持せしめるために保存剤
または静菌剤を含有していてもよい。有効な目的化合物
は、疾患の過稈と条件とに応して所望の治療効果を発揮
するのに十分な量を医薬組成物中に含有せしめる。

この発明の目的化合物（Ｉ＞の投与量または治療有効量
は、治療すべき各個々の患者の年齢と条件とによって変
化するが、一般的には有効成分的０．１〜１００ｍｇ／
　ｋｇが１日当りの投与量として治療のために投与きれ
、１日平均１回投与量約５０ｍｇ。

１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇが通常投与される
。

以下実施例によってこの発明を説明する。

可溶性スターチ１％、グルコース１％、乾燥イースト０
．５％、綿実粉０．５％およびコーン・ステイープ・リ
カー０．５％を含む種培地（ｐＨ６，０）（ｓｏｍｎ　
）を２５０ｍＱのエーレンマイヤーフラスコ２０本にそ
れぞれ加え、１２０℃、３０分間滅菌する。ネクトリア
・ルシダＦ　−４４９０（ＡＴＣＣ２０７２２）の斜面
培養物１白金耳を各培地に接種し、ロータリー・シェー
カー上、行程３インチ、２００ｒｐｍで２５℃、７２時
間培養する。

種培養物１６ＱＯｍＱを、予め１２０°Ｃ１３０分間滅
菌しておいた２００！のジャー発酵槽中の、種培地と同
組成の生産培地に接種し、１６０ｆｆｉ／分の通気下、
３００ｒｐｍ、の攪拌下に２５℃、７２時間培養する。

このようにして得られる培養プロスをケイ藻土（４ｋｇ
）を用いて濾過する。ケイ藻土と共に得られる菌糸に脱
イオン水１００１２を加えて１０分間攪拌し、ドライア
イス−アセトン法により凍結−融解する。破砕した菌糸
とケイ藻土とを含む懸濁液を濾過する。濾液をイオン交
換樹脂ダウエックス５０Ｗ−Ｘ２（商標、ダウケミカル
社製、Ｈ＋型、１４１２）のカラムに通す。そのカラム
を脱イオン水６０ででｆｃ冷し、活性成分を１，５％ア
ンモニア水（６０１）で溶出する。溶出液を減圧濃縮し
て７．５ρ容とし、次いでＣＭ−セファデックスＣ−２
５（商標、ファルマシア・ファイン・ケミカルス社ａ、
ＮＨ；型、３０２）を充填したカラムに適用する。

イオン交換樹脂０量−セファデックスＣ−２５のカラム
を脱イオン水３０１２で洗浄し、１．５％アンモニア水
１０１２で溶出する。有効成分を含む溶出液を減圧濃縮
して３００Ｉｄ容とし、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−
２５（商ｍ、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製
、ＯＨ″″型、２．５ｉを充填したカラムに適用する。

カラムを脱イオン水３りで洗浄し、１．５％アンモニア
水３２で溶出する。有効成分を含む画分を減圧濃縮して
３０ｍ１１容とし、凍結乾燥して、３−（Ｒ）−４−（
Ｒ）−ジヒドロキシ−５−（Ｒ）−ヒドロキシメチル−
１−ピロリン（２５０ｍｇ）を無色の粉末として得る。

元素分析　Ｃ３Ｈ９Ｎ０３として、 計算値：　Ｃ４５，８０；　Ｈ６，９２ｉ　Ｎ　１０．
６ｇ実測値：　Ｃ＋ｓ、ｏａ；　Ｈ６，５７；　Ｎ　１
０．１６［α　コニ３＋　２２＠　（Ｃ＝０．５５　　
、Ｈ２Ｏ）ＣＤＣθ］　　’　＋５２００　（２４３ｎ
ｍ＞、　　−３００（３００ｎｍ）ＩＨ−聞Ｒ（Ｄ２０
．８）　：　７．７　（ＬＨ）、　４．１−３　（５Ｈ
，ｍ）１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２０．δ）　：　１７１．０
　（ｄ）、　８３．９　（ｄ）。

７８．８　（ｄ）、　　７７．４　（ｄ）、　　６１．
８　（ｔ）ＵＶ、　：末端吸収 ＦＡＢ　ＭＳ　　：　　１３１ 衷」０１又 ２−１）３−０−ベンジル−１，２−０−インプロピリ
デン−６−０−トリフェニルメチル−α−り一キシロー
５−へキソスルホフラノース（１５，０ｇ）、炭酸水素
カリウム（１０，０ｇ　）、ヒドロキシルアミ　ン・塩
酸塩（７，２ｇ）のメチルアルコール（ｚｇｓｍａ　）
中温合物を、攪拌下、２５分間加熱、還流する０反応混
合物を室温まで冷却して濾過する。

沈殿をメチルアルコール（３００戚）で洗浄する。

濾液と洗液とを合わせ、１０ｍ１１容まで濃縮する。残
渣（１０ｍ１１）をクロロホルム（２５０ｍ１　）と四
塩化次素（２５０＋１１１１　）との混合物に溶解する
。溶液を３回水（各２５０ｍ１１　）洗して、硫酸ナト
リウムで乾燥する。溶媒を減圧下に留去して、３−０−
ベンジル−１，２−０−インプロピリデン−６−０−ト
リフェニルメチル−α−Ｄ−キシロー５−へキンスルホ
フラノース−５−オキシム（１５，０ｇ）を白色無定形
粉末として得る。この粉末（１，０ｇ　）を乾燥ジエチ
ルエーテル（ｓｏｍＲ）に溶解する。溶液を水素化アル
ミニウムリチウム（８００ｍｇ　）の乾燥ジエチルエー
テル（１ｏｏｍＱ）中懸濁液に窒素ガス雰囲気中、室温
で攪拌下、２時間かけて滴下する。

反応混合物を窒素−ガス雰囲気中、室温で茜らに１時間
攪拌する。次いで、ジエチルエーテルを飽和させた水（
１００１ｎｌｌ　）を氷−水浴中、攪拌下に反応混合物
に加える０反応混合物をセライトを通して濾過し、沈殿
をクロロホルム（３００ｍ１！　）で洗浄する。濾液と
洗液とを合わせて炭酸カリウムで乾燥する。溶媒を留去
して、５−アミノ−５−デオキシ−３−０−ベンジル−
１，２−０−イソプロピリチン−６−０−トリフェニル
メチル−α−り一グルコフラノース（８９４ｍｇ）を白
色無定形粉末として得る。

２−２）　５−アミノ−５−デオキシ−３−０−ベンジ
ル−１，２−０−イソプロピリデン−６−０−トリフェ
ニルメチル−α−Ｄ−グルフフラノース（８９４ｍｇ　
）の粉末を乾燥ジクロロメタン（２７ｍＱ　）に溶解し
、この溶液にトリエチルアミン（０，２８ｍ１１　）を
加える。この溶液に無水トリフルオロ酢酸（０，ｚｓｍ
Ｑ）の乾燥ジクロロメタン（９ｍＱ）溶液を、氷−水浴
冷却下、窒素ガス雰囲気中で、滴下する。次いで反応混
合物を窒素ガス雰囲気中、水−水浴冷却下にさらに１時
間攪拌する。次いで反応混合物を水（ｓｏｍａ　）洗し
、硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧下に留去し
て残渣（１，０１ｇ）を得る。残渣をベンゼン（２ｍＱ
）に溶解する。この溶液をシリカゲル（５０ｇ）を使用
するカラムクロマトグラフィーに付し、ベンゼン（３０
０ｍＱ）、次いでベンゼンとアセトンとの混合物（４０
０：１〜２００：１）で溶出する。目的化合物を含む両
分を合わせ、減圧濃縮して、３−０−ベンジル−１，２
−０−インプロピリデン−５−トリフルオロアセトアミ
ド−５−デオキシ−６−０−トリフェニルメチル−α−
Ｄ−グルコフラノース（６２６ｍｇ）を白色無定形粉末
として得る。

ＩＲ（ＣＨＣＩ　）　：　３４００．３０００．１７２
２　ｃｍ−’’ＨＮＭＲ（ＣＨＣＩ３．８）　：　１．
３１　（３Ｈ，ｓ）、　１．５２　（３Ｈ。

ｓ）、　２．９７　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、
　３．５３　（１）１゜ｄ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、　
３．８２　（ＬＨ，ｄ、ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ）。

４．０３　（ＩＨ，ＡＢｑ、Ｊ＝１０Ｈｚ）、　　４．
４４　（ＩＨ，ＡＢｑ。

Ｊ＝１０Ｈｚ）、　　５．９４　（ｄ、Ｊ＝４．５Ｈｚ
）ＥＩ　ＭＳ　（Ｍ／Ｚ）　：　６４７（Ｍ”）２−３
＞３−〇−ベンジルー１．２−０−イソプロピリデン−
５−トリフルオロアセトアミド−５−デオキシ−６−０
−トリフェニルメチル−α−Ｄ′−クルコフラノース（
５’８５ｍｇ　）を、トリフルオロ酢酸７５％水溶液（
２賊）に溶解した溶液を、室温で４０分間攪拌する。溶
媒誉減圧下に留去゛する。残渣をクロロホルム（１＋１
１１１）に溶解する。溶液をシリカゲル（３０ｇ）をイ
吏爾するカラムクロマトグラフィーに付し、ｎ−ヘキサ
ンと酢酸エチルとの混合物（１１１〜１：５）で溶出す
る。目的化合物を含む画分を合わせ（１０（ｌｉｎＱ　
）、減圧濃縮して、３−０−ベンジル−５−トリフルオ
ロアセトアミド−５−デオキシ−Ｄ−グルフフラノース
（２７０ｍｇ）を無色シロップ妖物として得る。

’ＨＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ、δ）　：　５．２３　（０，
４Ｈ，ｓ）、　５．４２（０，６Ｈ，ｄ、Ｊ：４Ｈｚ）
、　　７．３４　　（５Ｈ，５）ＩＲ（スジミール）　
　：　　３４００．　１６７６ｃｍ″″１２−４）　メ
タ過沃素酸ナトリウム（２８１ｍｇ）の水（８鍼）溶液
に、３−０−ベンジル−５−トリフルオロアセトアミド
−５−デオキシ−Ｄ−グルフフラノース（２４０ｍｇ　
）のテトラヒドロフラン（８−）および水（０，２１１
１９）混合物溶液を氷−水浴中、３０分間かけて滴下す
る０反応混合物を氷−水浴中、３０分間攪拌して塩化ナ
トリウム飽和水溶液（５０１１１１１）中に注ぐ、水溶
液を酢酸エチル（各８０ｍｍ）で３回抽出する。抽出液
を合わせて硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧下
に留去して、２−０−ベンジル−３−〇−ホルミルー４
−トリフルオロアセトアミド−４−デオキシ−Ｄ−アラ
ビノース（２３６ｍｇ）を白色無定形粉末として得る。

ＩＲ（スジ３−ル）　　：　　３３３５．　３２００．
　３０９０．　１７１４ｃｍ−１２−５）２−０−ベン
ジル−３−０−ホルミル−４−トリフルオロアセトアミ
ド−４−デオキシ−〇−アラビノース（３６ｍｇ）の粉
末を、ギ酸の４．４％メチルアルコール溶液（３戚）に
溶解し、溶液をパラジウム黒（４０ｍｇ）とギ酸の４．
４％メチルアルコール溶液（２ｍＱ）との混合物に加え
る。混合物を窒素雰囲気中室温で１時間攪拌する。次い
でパラジウム黒をセルロース粉末で濾去し、メチルアル
コール（５ｏｍｎ　）で洗浄する。濾液と洗液とを合わ
せ、減圧濃縮して、３−０−ホルミル−４−トリフルオ
ロアセトアミド−４−デオキシ−Ｄ−アラビノース（３
０ｍｇ）を白色無定形粉末として得る。

ＩＲ（ＫＢｒ）　’　３２００．１６７０．１６４０ｃ
ｍ−１’ＨＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ）　：　８．１７　（Ｌ
Ｈ，Ｓ）、　５．０４−５．４３（２Ｈ）、　４．８０
−４．６０　（ＩＨ）、　４．３６−３．５４　（４）
１）ＳＩ　ＭＳ　（Ｍ／Ｚ）　：　２７４（Ｍ”＋１）
２−６＞３−０−ホルミル−４−トリフルオロアセトア
ミド−４−デオキシ−Ｄ〜アラビノース（１３４ｍｇ）
の粉末に、水酸化ナトリウムＩＮ水溶液（１，５ｍｌ１
）を加え、反応混合物を室温で３０分間攪拌する。次い
で、水（２，０１ｎ１１）を反応混合物に加え、混合物
を室温で１０分間攪拌する。反応混合物のｐＨ値を氷−
水浴中酢酸で４に調整する。反応混合物を水（１ｏｏｌ
ｕＱ　）で希釈する。溶液をＣＭ−セファデックス、ア
ンモニウム型（１ｏｏ眠）を使用するカラムクロマトグ
ラフィーに付し、水（４００ｍＱ　）、次いで２％アン
モニア水（５００ｍＱ　）で溶出する。目的化合物を含
む画分を合わせて減圧濃縮する。残渣を水（５ｍＱ）に
溶解し、凍結乾燥して、３−（Ｒ）−４−（Ｒ）−レヒ
ドロキジ−５−（Ｒ）−ヒドロキシメチル−１−ビロリ
ン（６２ｍｇ　）を褐色無定形粉末として得る。

上記で得られる化合物の物理化学的性質は、実施例１の
化合物と同定される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される新規ピロリン化合物およびその塩類。