JPS62296896A - 尿試料中の淋菌の存在を検知するための迅速な診断方法及びそれに用いる組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 ■１発明の分野 本発明は概して淋菌（Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）
の存在を判定するための１診断方法及び組成物に関する
。

特に、本発明は体液試料中の淋菌の迅速な検出に関する
。

ＩＩ　、用途 淋病（ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）の抑制は助界的関心事であ
る。１９７５年以来、年間症例件数は、米国だけでも約
１００万件が報告されている。しかしながら、実際の症
例数は１６０万〜２００万件と推定される。

現在の、淋病検知用試験方法が不十分であることについ
ての理由がいくつかある。まず、現在の養生習慣におい
ては、淋病の症候が発現しない限り試験が行われる可能
性はない。したがって、無症候の、ｐ渚、特に女性は早
期診断されることｌま稀である。感染した女性の約１５
％は病気が非常に進行するまで全く症候が現われず、ま
た進行した場合でも、総仁的症状は、全く異った治療が
必要な他の問題と誤解され得る。

第２に、現在用いられている殆どの方法を用いた場合、
その方法自体又は用いる試料が原因となって診断が遅く
なるという問題がある。診断の遅れは、この病気が伝染
力の強いものであるため、大勢の人々にとって由々しい
結果となり、また治療が行なわれなかった場合には患者
にとっても極めて厳しい結果となり得る。

２つの試験方法ニゲラム染色法、及び尿道の滲出液又は
頚部分泌物試料を培養した後の培養物確認法が現在広く
用いられている。ダラム染色法は、細胞内ダラム陰性双
球菌屈（ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｉ）の存在を確認し、それ
に男性のある特定の症状が伴えば、淋病の治療の開始を
設定するに十分であるとみなされる。ダラム染色によっ
て、症候のある男性の細胞内ダラム陰性双球菌属の存在
が証明されない場合は、ナイセリア属（ｇｅｆｆｉｕｓ
　Ｎ１５ｓｅｒｉａ）　（淋菌はその一種である）の生
長を特徴とする特別な培地で尿道滲出液を培養し、オキ
シダーゼ試験又はその他の一股に受は入れられた培養物
確認操作によりコロニー中の淋菌の存在を確１ツする方
法が用いられる。高いオキシダーゼ含有量を確認する試
験を、淋病を想定した試験として、直接、症候のある弾
性の尿道滲出液に対して用いる場合もある。頚部分泌液
のダラム染色では負の診断を示す症例数が高く、また正
常な、女性のフローラ（生理的寄生菌）の多くがその試
験ではオキシダーゼ陽性反応特性を示して淋病であるこ
とを推定的に表示するため、頚部分泌液の培養及びその
後のコロニーの確認が女性のために選ばれた方法である
。確認技術を用いる前に行う培養は約４８時間を要する
。

淋病の感染の可能性が判定されたならば、その症例は合
衆国保建省（Ｓｔａｔｅ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｄｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ）に報告しなければならず、更に病気管理セン
ター（ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏ
ｎｔｒｏｌ）に報告される。

更に、地方政府機関が、更に感染した人がいないかどう
か知るために感染した人々と面接する。疑わしい接触者
はすべて追跡される。試験には尿道滲出液は頚部分泌液
の試料が必要であるため、接触者を、発見されたその場
で試験することはできず、彼らは協力が義務づけられて
おり、また診療所又は医者に報告せねばならない。

接触者が発見されてから、報告が行なわれ試験されるま
での時間的遅れに加えて、女性の試験結果を得るには２
日は必要である。陽性であった場合、接触者は、治療を
行うと共にその者と接触した可能性のある人々を確認す
るためのカルテ（ｃａｓｅ　ｈｉｓｔｏｒ７）作成をす
るために召喚される。

対照的に、本発明の試験は極めて簡単であるため、試料
の採取、試験の実施及び結果の判断に熟練者を必要とし
ないばかりか、試験結果は１時間以内に得ることができ
る。これらの利点は、本試験方法を、無症候の、特に女
性の７ｗ者の選別のための手段として、また、淋病の陽
性患者との性的接触者として挙げられた人々を即座にそ
の場で試験するための手段として適切なものとしている
。

■、情報の開示 淋菌を想定した確認は、選択性培地で検体を培養するこ
とによって行なわれる６次に、淋菌の発現したコロニー
にオキシダーゼ活性を試験し、ダラム染色を行う、培養
固有の開題のため、負の誤診結果が、５０〜７０％にも
及ぶ、培養された検体から得られる。

ダラム染色法は単独で、症候ある男性に用いられること
が多い、しかしながら、女性や無症候の男性について負
の誤診の可能性は高い。

また、オキシダーゼ反応試験は、前段階の培養を行なわ
ない選別試験として発達した。同様の、男性の総体的症
状の第２番目に多い原因であるクラミジア（ｃｈ　ｌａ
ｍｙｄ　ｉａ）はオキシダーゼに対して反応性ではない
ため、オキシダーゼ試験はクラミジアの症候のある男性
について有効である。女性に関しては、オキシダーゼに
反応する、頚部分泌液中に見られる微生物の数が多すぎ
るためオキシダーゼ試験へ直接使用して診断することは
できない。

ダマト（Ｄ’Ａ＋＋＋ａｔｏ）等に与えられた米国特許
第４．２０８，４８０号は、選択性培地で培養された、
分離された検体から淋菌を差別測定するための方法及び
装置を示している。淋菌のものであると思われる１つの
大きいコロニーから分離したものを１次に、バレリアン
酸β−ナフチルもしくはβ−ナフチルアミドのようなβ
−ナフチルエステルと指示薬系とを含む試験組成物に加
える。次に上記分離系と組成物混合物とを約３５°Ｃで
５時間再びインキュベートし、そこで照合表と比較する
ことにより陽性反応か陰性反応かが判定される。

ダマト等が実質的に開示するものは培養物確認法である
。

メンネン（Ｍｅｎｎｅｎ）に与えられた米国特許第３．
８７６．５０３号及び第４，１０８，６５３号は淋菌用
の迅速な想定試験のための非培養法及び装置について記
・１配している。」二記試験は男性の尿道滲出液につい
て行なわれる。綿棒上の滲出液を、フェニレンジアミン
が含浸せしめられている、乾燥した多孔質の吸収性外科
用綿撒糸（プレジェット）と接触せしめる。試料と接触
せしめたプレジェットを生理食塩水の入っている、こわ
れやすいアンプルを収容する可撓性の側壁を有する透明
なプラスチック製チューブに挿入する。アンプルを破壊
して、プレジェットを食１１１水で湿潤せしめる。湿潤
後３０〜１２０秒で色変化が得られた場合は、淋病想定
試験が陽性であることを示す。メンネンに与えられた米
国特許第４．１０８，７２９号は千鳥状（食い違い状）
試験片（１つの試験片には試薬、好ましくはＮ。

Ｎ、Ｎ′、Ｎ′−テトラメチル−Ｐ−フェニレンジアミ
ンを含浸せしめである）から成る紙製ブックレットを開
示している。上記試験片を男性の尿道滲出液と接触せし
めれば淋病想定試験を行うことができると言われている
。いずれの試験も試料中のオキシダーゼの存在に対する
陽性の応答に基〈ものである。

■０発明のａ要 本発明は尿試料又はその他の体液中の淋菌の存在を検知
するための迅速な診断方法であって、（ａ）尿試料を、 Ｉ）淋菌の酵素活性によって分解して分解生成物を生成
し得る酵素基質と ｉｉ）試料と接触した際に合ｐＨを約６．５〜８．５に
し得る緩衝剤から成る試験Ｍ１成物と接触させ；更に （ｂ）検知可能な応答を発生せしめることにより、分解
生成物を測定する ことを特徴とする方法を提供する。

本方法は、検査室や熟練者を必要とせずに採取すること
ができる尿試料用の試験を提供する。上記方法は、症候
のある患者や無症候の患者（女性を含む）における淋菌
の存在の検知に用いることができる。また、好ましい光
学的応答、すなわち発色を与える試験組成物が提供され
る。

■１発明の詳細な説明 現在開示されている、淋菌の存在を判定するための方法
では、尿道滲出液又は分離用−次培地での体液試ネ４の
培養物から得た一つのコロニーから分離したものを用い
ることが必要である。培養は時間や手間がかかるが、確
認操作を行う前に淋菌のものであると思われるコロニー
を他の細菌から分離し、菌を増殖するためには必要であ
ると思われていた。

尿道滲出液の使用及び／又は体液試料の培養は、たとえ
女性や臨床的に無症候の男性であっても淋病感染の検知
には必要でないことが今や判明した。

本発明の方法を用いれば、尿試料が明確な結果を与える
に十分な量の淋菌バクテリアを含むことが判明した０口
中−咽頭液、頚部分泌液及び尿道滲出液をこの方法で試
験することもできる。この方法は、男性の滲出液を用い
ねばならない方法とは異り、症候のある男性に限られる
ことはない。

尿試料を用いて淋病感染の有無を検知する能力は、本方
法を選別方法として有用なものにしている。

一般に、本発明の方法は尿試料を用いることを基本とし
、結果を約１時間未満で得ることが可能である。尿試料
を、それと接触した際に、酵素活性に好適なｐＨをゲえ
得る緩衝剤と淋菌の酵素活性によって分解し得る基質と
から成る試験組成物と接触せしめる。−１−記基質の分
解により、分解生成物が生成され、これは、直接、又は
これと反応して検知可能な応答を示す成分を添加するこ
とにより間接的に検知することが可能である。検知の容
易さの点で、色素の生成が好ましい、生成された色シ＋
ミは、次に、試験様式（ｔｅｓｔ　ｆｏｒｍａｔ）によ
り、目視的に又は機械を用いて反射率又は吸光度により
Ｊｌｌｌ定される。

試験！ｌ成物中の酵素の活性にとって適正なｐＨを確保
するために緩衝剤が通常用いられる。緩衝剤は、尿試料
試験にとって特に重用である。なぜならば、かかる試料
はｐＨ範囲が大きく異なり、また酵素活性を良好にする
には酸性が強すぎる場合が多いからである。好ましいｐ
Ｈ＠ｉ囲はＰＨ６、５〜８．５である。包含せしめる１
１？剤は、試料と接触した際に、試験組成物のｐＨを上
記範囲とすることができるものでなければならない。適
当な緩衝剤としては、クエン酸」１１、リン酸塩、Ｎ−
トリス（ヒドロキンメトル）メチル−２−アニリノエタ
ンスルホン酸（ＴＢＳ）がある、しかしながら、最適な
緩衝剤成分を得ることは、本発明の開示によって示され
る技術の範囲に含まれる。

戊−１０え灸色 淋菌に関連する酵素の一つはプロリンイミノペプチダー
ゼであり、これはプロリンを含むジー及びトリペプチド
をアミノ末端部分で開裂せしめることができる。基質Ｌ
−プロリルーＰ−ニトロアニリド又はそれと同等のより
長いペプチド鎖を有するものを施すことにより、黄色の
化合物であるｐ−ニトロアニリンが淋菌の存在下に分解
生成物として生成される。この分解生成物の生成は目視
又は機械により、検知される。

１−皿坦λＬ 多くの分解可能な基質を、分解生成物と結合（カップリ
ング）ｒ＆分との相互作用により検知可能な応答が得ら
れるように調製することができる。

１、　カルボン酸エステル基質 下記の構造： Ｒ１−Ｃ−０−Ｒ２ ↑ のカルボン酸エステルは淋菌が関連するＳ！素活性によ
って分解し得る。上記基質はＡの部分で開裂して分解生
成部Ｒ２を形成し、これは結合成分と反応して色素を生
成することができる。有用な化合物としては、Ｒ１が炭
票原子数約１〜１０の脂肪族炭素鎖であり、Ｒ２がβ−
ナフチル、ピロール、フェニル又はチオフェン基である
ものが挙げられる。

Ｒ２がピロール又はチオフェン基であるカルボン酸エス
テル類が特に好ましい。β−ナフチルエステル類１例え
ばカプロン酸β−ナフチル、カプリル酸β−ナフチル、
プロピオン酸β−ナフチル、オレイン酸β−ナフチル、
バレリアン酸β−ナフチルを用いることもできる。β−
ナフチルカルボン酸エステル類の中でも、β−ナフチル
カプロン酸エステルが々ｆましい６置換されたβ−ナフ
チル基をＲ２基として用いることもでさる。

表１は、表示のＲ２基にどのような結合成分が有用であ
るかを示すものである。

表　　１ 一一且りｍ−−一ぶニー澄−−城一一分一一一β−ナフ
チル・・・・・・ジアゾニウム塩・・・・・・４−アミ
ノアンチピレン／フェリシアン化合物 フェニル　　・・・・・・ジアゾニウム廖ピロール　　
・・・・・・ジアゾニウム塩チオフェン　・・・・・・
ジアゾニウム塩４−アミノアンチピレンと共に用いるフ
ェリシアン化物はＭ／Ｉのアルカリ金属フェリシアン化
物、例えばフェリシアン化ナトリウ１、又はカリウムで
あってよい、上記指示薬系はいずれも淋菌を含む検体と
接触した際に、好ましい光学的応答。

すなわち色を示す。

適切なジアゾニウム塩を下記の表２に一般名又は略称と
共に列記した。しかしながら、この表に記したものにの
み制限されることはなく、多くのジアゾニウムＪｆ！が
入ｆ可能である。

表　　２ 好ましくは、また、活性剤をカルボン酸エステルとジア
ゾニウムｊ１４と共に試験組成物中に包含せしめる。石
川かび＋１＋、剖と１、でｌ＋イソザロパノール、メタ
／−ル、ヘキサノール、プロパツール、１．８−オクタ
ンジオール、デカノール及びエタノールのようなアルコ
ール類がある。アルコールは通常４ｍＭ〜２Ｍの濃度で
用いる。β−ナフチルカプロン酸エステル及びジアゾニ
ウムＪ１！を含む試験組成物においてはインプロパツー
ルが々ｆましい活性剤である。ジアゾ化合物の濃度は０
．１０〜２　ｍｇ／　ｍＬ、好ましくは０　、２〜０　
、５ｍｇ／ｍＬテある。

β−ナフチルカプロン酸エステル、４−ベンゾイルアミ
ノ−２，５−ジメトキシアニリン及びインプロパツール
を含む好ましい試験組成物を、臨床的尿試料中の淋菌の
存在を判定するために溶液様式で用いた。結果は、試料
の培養が必要とされていた以前の方法を用いた場合には
２［１ががるのに比べて、１０分未満で得られた。形成
された色素を試料ブランクのものとｉｔ較して色差を１
１視又は５１８ナノメータにおける吸光度を分光光度計
で評価することができる０本研究において、試ネ゛１ブ
ランク（基質を含まない）との傅育゛度単位の差が０．
０８５であれば試験溶液は陽性であることを示す、この
組成物は、存在し得る尿夾雑物である、エステラーゼ活
性を示すことが知られる白血球や大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ）の存在に応答しない。

２、　β−ナフチルアミド Ｌ−プロリン又はＬ−ヒドロキシプロリンのβ−ナフチ
ルアミドは淋菌のプロリンイミノペプチダーゼ活性又は
ヒドロキシプロリンアミノペプチダーゼ活性によって分
解し得る。前記表に列記したようなジアゾニウムｔＢを
、発色せしめるために試験組成物に加えると色素が形成
される。

３、フロリンチオベンジルエステル プロリンチオベンジルエステルは淋菌のプロリンイミノ
ペプチダーゼ活性によって分解する。

５．５′−ジチオビス−２−二トロ安息香酸を結合成分
として試験組成物に加えると、ｔり色比合物の３−カル
ボキシ−４−二トロチオフエノキシトを検知することが
できる。

以−茎立栽分土ヱ」戎虚 もう一つ別の検出方法は、更なる酵素成分を、結合成分
と緩衝剤と共に用いて検知可能な応答を与えるものであ
る。したがって試験組成物は（ａ）淋菌の酵素活性によ
って分解し得る基質；（ｂ）緩衝剤；　（ｃ）分解生成
物と反応し得る結合成分；及び（ｄ）酵素成分から成る
９本明細書の前の部分で述べられたような活性剤を包含
せしめるのが好ましい。最終結果は色素によるのが好ま
しい。

この種の反応の例を下記に示す。

■　。

［分解生成物］ ［結合成分］ ＴＩ　　。

［基質］　　　イミノペプチダーゼ　［分解生成物］テ
トラゾリウム塩 ［結合成分］ 検知経路ＩＩでは、還元されたニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を３４０ナノメーターにお
ける分光分析（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）
により測定するか又はメルトラブル−やテトラゾリウム
塩のような結合成分を加えて発色せしめてもよい。入手
し得るテトラゾリウム塩は数多く、それらの使用につい
ては占業者に公知である。

見−」いし吐犬物 酵素基質、緩衝剤並びに、場合により結合成分、活性剤
及びＰＩｌ素成分を含む試験組成物を用い、これを尿試
料に加えることにより溶液を形成することができる。前
記に挙げた試験成分以外にも、出業者周知のその他の成
分、例えば安定剤又は防腐剤を加えることができる。上
記試薬は「キット」の様式、例えば上記成分の１種以上
を、溶液又は予備混合された粉末もしくは単一使用液と
して用いるために再構成され得る凍結乾燥粉末の形で含
む一連のボトルの形で提供することができる。

」二記成分は圧縮又は成形錠剤又は乾燥試薬試験片のよ
うな乾燥体に包含せしめることができる。

圧縮又は成形錠剤は通常、充填剤又は増量剤を、試験組
成物以外にも含んでおり、上記錠剤は通常、容易に溶解
して試薬溶液が形成される。乾燥試薬試験片は当業界周
知である。

乾燥試薬試験片を形成するには、キャリヤーマトリック
スに試験成分を含浸せしめる。場合により、その他の成
分、例えば刈滑剤、増粘剤を加えることができる。湿？
！！１剤は、キャリヤーの表面への検体の均一な展開を
容易にする。増粘剤を含浸液に加えて、キャリヤーによ
って吸収される溶液の！、）を増加させる場合もある。

キャリヤーマトリックスは、試験組成物に対して実質的
に不活性で、多孔性及び／又は試験される水性試料に対
して吸収性を有するものである限り、試験ＭＩＪ＆物の
成分を包含せしめることができるものであればどのよう
な物質で構成されていてもよい。「キャリヤーマトリッ
クス」という表現は２フイルムフオーマツトをはじめと
する、木又は生理的液体と接触した際に不溶でその構造
的一体性を維持し得る、吸収性又は非吸収性マトリック
スのことである。

試験片は、吸収性マトリックス、例えばか紙に上記成分
を含浸せしめて乾煙し、乾燥した含浸マトリックスを支
持部材に取り付けることによって製造される場合が多い
。乾燥は、含浸せしめた組成物に悪影響を及ぼさない手
段、通常エアオーブンによって行なわれる０次に、乾燥
した紙を切断し、支持部材、例えば硬質又は半硬質ポリ
スチレン製フィルム片の一端上に載置する。上記紙のフ
ィルト片への取り付けは、両面接着テープ、例えばミネ
ソタ州、セントボールのスリーエム社（３Ｍ　Ｇｏ、）
から市販されているものを用いて行なう。

試薬片試験具は、試験試料中に瞬間的に浸漬するか、又
は試験試料をキャリヤーマトリックス上に施すことによ
って用いるのが右利であり、それにより、淋菌生物が存
在する場合に、検知可能な変化（例えば色変化）が得ら
れる。試験組成物の種類及び温度等の条件によって異な
るが、結果は約１０分以内、好ましくは５分以内で得ら
れる。試＃１を用意して選別試験を行うには最も有益な
条件であると思われるため、室温での試験を慣例的に行
った。しかしながら、必要な装置が入手可能であればよ
り高い温度を用いることもでＳる。

その他のフォーマットもまた有用である０例えば、試薬
組成物の一部分をキャリヤーマトリックス又は錠剤に導
入し、一部分を試験管に入れることができる。試験管は
通常少くとも基質成分を含む。次に、試料を試験管に加
え、溶液を形成し、約１時間以下インキュベートし、錠
剤を加えるか、試験片を溶液に浸漬する。

−ｍ−３ 本明細書中で便宜上下記の略称を用いた。

ジアゾニウム ＡＩＤ　　　　　　　　　　　アルコールデヒドロゲナ
ーゼ アニリン 堅牢ブルーＢ　　　　　　Ｏ−ジアニシジン（テトラア
ゾ化） ゾニウム トルイジンジアゾニラ ム 知られる） ンズアニリド 名を参照 ベンゼン ニルアミド フェニルエーテル ＤＭＦ　　　　　　　　　　ジメチルホルムアミドＮＡ
Ｄ“　　　　　　　イオン化された形のＡＤＨ オチド ルホン酸 ｖ　／　ｖ　　　　　　　　　　容量／容量：木文中で
ｍＬ／　ｌ　ＯＯｌｌＬとする 月Ｌ　　　　　　　　　　マイクロリットル＋１１Ｌ　
　　　　　　　　　　　ミリリットルＢ／ｍＬ　　　　
　　　　　　ミリグラム／ミリリットル コＮ　　　　　　　　　　　　ミリモル濃度Ｍ　　　　
　　　　　　　モル濃度 ℃　　　　　　　　　　　摂氏温度 本発明を下記の実施例により説明するが、これにより本
発明を制限するものではない。

［実施例］ 紅庭■ｊ亘ｍ 淋菌の分離系（ｉｓｏｌａｔｅｓ）を地方公共衛生クリ
ニック（ｌｏｃａｌ　ｐｕｂｌｉｃ　ｈｅａｌｔｈ　ｃ
ｌｉｎｉｃ）から入手し、タイヤーーマーチ７　（Ｔｈ
ａｙｅｒ−Ｍａｒｔｉｎ）選択性寒天ＪＢＢＬ社製、ツ
ー／キースピル（Ｇｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ）、マリー
ランド］上で再培養し、保存培養物（ｓｔｏｃｋｃｕｌ
ｔｕｒｅ）を製造した。培養物を採取し、１５％グリセ
ロールを含む３％ｊ・リプチカーゼ（Ｔｒｙｐｔｉｃａ
ｓｅ＠　）大豆ブロス（ＢＢＬ）の０．５〜１．ＯｍＬ
アリコート中、−７０℃に保持した。

試験に用いるための細胞懸濁液を、保存培養物の７リコ
ートを融解せしめ、遠心沈降させて細胞ペレットを形成
し、上ずみ液を除去してからベレットを０．１５Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２５）ｌｌＬ中に再懸濁
せしめることにより調製した。」二足懸濁液を用いて、
種々の試験組成物の淋菌に関わる酵素との反応性を確認
した。

χ上皇ユ 淋菌エステラーゼのβ−ナフチルエステル基質に対する
活性を下記の試験溶液を用いて試験した。

ト　リ　ト　ン　（Ｔｒｉｔｏｎ＠　　）　　Ｘ　−１
００。

ｌＯ％Ｖ／Ｖ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
０ｇＬβ−ナフチルエステル、　５０ｍＭ ＤＭＦＩＪ　　　　　　　　　　　　　７５ｇＬリン酸
塩緩衝液、　ｐＨ７，２５゜ ０．３Ｍ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
００用し堅牢ブルーＲＲ、１，２ｍｇ／　ｍＬ ＤＭＦ中　　　　　　　　　　　　５００１ＬＬ蒸留水
　　　　　　　　　　　　　１３２５　、　Ｌ細胞懸濁
液２０ＰＬを加えるとにより反応を開始させた。室温に
て３０分間のインキュベージョンの後、５１８ｎｍ（ナ
ノメーター）での吸光度を試料ブランクを基準として測
定したところ、下記の結果が得られた。

盃−Ｊ　　　　　　　Ａ　５１８ バレリアン酸β−ナフチル　　　　０．０４１カプロン
酸β−ナフチル　　　　　０．０８０保存培養物を試料
として用いた場合、正の吸光度の読みは淋菌の存在の試
験手段となるに十分な酵票活性を示すものである。した
がって、どちらの基質も試験に用いることができる。

文崖土」 鎖長の異るβ−ナフチルエステルス（質を用いて淋菌体
のエステラーゼ活性を試験した。試験溶液はアルコール
活性剤を含み、下記のものから調製した。

細胞懸濁液（２０ｇＬ）を試験管にそれぞれ入れて、室
温にて３０分間のインキュベーションを行った後、５１
８ｎｍでの吸光度をポシュ・ロム（Ｂｏｕｓｃｈ　ａｎ
ｄ　Ｌａｍｂ）のスペクトロニツタ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎ
ｉｃ）　４００分光光度計で読んだ、得られた結果を下
記に示す。

五−一一コ　　　　　　Ａ３１８ プロピオン酸β−ナフチル　　　　０．０１０バレリア
ン酸β−ナフチル　　　　０．０８１カプロン酸β−ナ
フチル　　　　　０．１１３カプリル酸β−ナフチル　
　　　　０．０４３結論：実験により、エステルの酸の
部分の長さが反応性に影響することが示された。炭素原
子数６のカプロン酸エステルの反応性が最も良好であっ
た。炭素原子数６個の炭素鎖に更に１個を加えるか、又
は１個除去すると活性が約４０％低下する。

丸施遣」 種々のジアゾニウム塩の、β−ナフチルカルボン酸エス
テルの酵素による分解に対する指示薬としての有用性を
、室温にて４分間のインキュベーションの後に目視判読
した。溶液は下記のものから調製した。

ＤＭＦ中 インプロパツール　　　　　　　　　０．３００ｍＬ蒸
留水　　　　　　　　　　　　　　１．３２５ｍＬ細胞
懸角液（２０ルし）を各試験管に加え、これを室温にて
４分間インキュベートした。このインキュベーション時
間の終りに、試験管に色変化が生じたか否かを目視的に
調へた。結果は下記の通りである。

一堪一　　　　　　　　−伍斐進一 堅牢ブルーＲＲ＋ 堅牢ブルーＢ　　　　　　　　　　　＋堅牢グリーンＦ
ＣＦ　　　　　　　　　−堅牢レッドＢ　　　　　　　
　　　　＋堅牢ガーネットＧＢＣ塩　　　　　　−ＣＩ
　　３７２１０ 堅牢レッドＴＲ＋ 堅牢レッドＩＴＲ− ジアゾレッドＲＣ＋ （堅牢レッドＲＣ） 堅牢ブルーＢＢ　　　　　　　　　　　＋堅牢レッド３
ＧＬ　　　　　　　　　　−用化２−メトキシー４−モ
ルホ　　　−リノーベンゼンジアゾニウム 試験に用いた条件は４分間のインキュベーションのみで
あった。このインキュベーション時間で、分解生成物の
β−ナフトールと結合することが予期されるジアゾニウ
ム塩は、目視判読に十分な発色を示さないものもあった
。しかしながら、他のものはこの非常に短い試験期間で
良好な視認可能な結果を与えた。

Ｌ上層」 種々のエステラーゼ反応の求核性活性剤となり得る物質
の影響を調べた。試験溶液は下記のものから調製した。

活性剤　　　　　　　　　　　　（表を参照）細胞懸濁
液２０．Ｌを加えることにより反応を開始させた。室温
にて６０分間のインキュベーションの後、５１９ｎｍで
の吸光度ヲホシュ・ロム社のスペクトロニック４００分
光光度計でＪ１１定した。求核性物質又は活性剤の存在
による酵素反応の活性化を下記のようにして算出した：
ｆｉｌられた結果を下記表に示した。

−充二コＬ〜剋−ｊＬＪＪＬ　盾図コヒ靴がインプロパ
ツール　　　　　　１．５７Ｍ　　　　８４メタノール
　　　　　　　　　３．９５Ｍ　　　　５６．８ギニン
ヒドロクロリド　　　　４．ＯｍＭ　　　　５１．８［
シグマ社（Ｓｉｇｍａ）］ ヘキサ／−ル　　　　　　　８．３６ｍＭ　　　　４３
．１プロパツール　　　　　　　１．８　Ｍ　　　　４
２．３プロピレンゲ１ノコール　　　　１．８３Ｍ　　
　　４１デカノール　　　　　　　　　２．１　ｍＭ　
　　　３７．２エタノール　　　　　　　　　１．７１
Ｍ　　　　３７１．１０−フェナントロリン　　　２．
０　ｍＭ　　　　２２．１（シグマ社） （アルドリッチ） １．１０−デカンジオール　　　　４．０　ｍＷ　　　
　１５．４（アルドリッチ） キヌクリジノール　　　　　　０．９　ｍＭ　　　　９
第１〜９番目までの−に配化合物が、カプロン酸β−ナ
フチルを基質として用いた場合、最適なアルコール活性
剤であった。溶液試験の場合、インプロパツールが好ま
しい活性剤であった。しかしながら、デカノールのよう
な不揮発性アルコールが薬試験片の様式においては好ま
しい。

支立刻」 ピロール基質の下記の構造： ヲ有スる３−カプロイルオキシ−５−フェニル−ピロー
ルを未発りＪの方法に用いた。

試験Ｍｌ成物を調製した。

ピロールエステル　　　　　　　　　　　４ｍＭト　リ
　ト　ンＸ−１００１％ インプロパツール　　　　　　　　　　１０％クエンＭ
ＩＩ口＆ｆ１種ｉ蓚−Ｊ　ＲＦｉ　　　　　　　　ｇｎ
−ｍ上記組成物を一連の試験管に入れ、淋菌細胞懸濁液
５０　ｐｔを各試験管に加えた。室温にて１分間インキ
ュベーションの後に、堅牢フルーＲＲ４ａ＋ｇ／ｄＬを
加えた。得られた混合物を室温にて１〜５分間インキュ
ベートし、次に試薬ブランクを基準として５５０ｎｍで
の吸光度を読んだ、結果は下記の通りである。

時−御一同　　　　Ａ３５０ １分　　　　０．０４０ ５分　　　　０．０９３ 上記ピロール基質は、５分後に淋菌の存在が識別される
検知可１おな応答を与えた。

火上惣Ｊ チオフェン酵素基質を用いて試験溶液を調製した： ＴＥＳ緩衝剤、　ｐｔｌ　８　　　　　　　　５０＋ａ
Ｍト　リ　ト　ンＸ−１００２，５％ ｔ−ブチルアルコール　　　　　　　１５％Ｍ　Ｍ　Ｂ
　Ｄ　　　　　　　　　　　　　　０．３＋＊Ｎ３−カ
プロイルオキシ−５−４ｏＭ フェニルチオフェン 細胞懸濁液　　　　　　　　　　　５０ルし用いられた
チオフェン酵素！＆質の構造を下記に示す、： ５４５ｒｖでの吸光度を監視した。室温で２分間の後の
吸光度は０．３２１であり、この試験系は長時間のイン
キュベーションを行わずに淋菌の存在を有効に検知する
ことが示された。

Ｘ呈Ａ１ 本発明方法の臨床的確認を、下記の実験によりず）た、
地方公衆衛生１りこツクに通院する患者から採取したば
かりの尿試料についてエステラーゼ試験を行った。対照
試料（１３８件）（採取したばかりのもの又は冷凍した
もの）を研究室の研究員、泌尿器化医院に通院する。す
者又は一般に内科医院に通院する患者から採取した。ク
リニックからの試料を下記のように処理した： 女性からの試ネさ１は自動的に培養し；症候のある男性
からの滲出液試料はダラム染色し；もしダラム染色の結
果が陰性又は不確かな場合は、その試料を培養した。対
照試料はエステラーゼ試験のみで検査した。

用いた試験条件は下記の通りである。

インプロパツール　　　　　　　　　Ｑ、３ＱＱｔｍＬ
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　１．０２５ｍＬ堅
牢ブルーＲフルー、　　１．２ｍｇ／　ｍＬ。

場合により、未確認の尿成分がジアゾニウム１月と反応
して発色してしまう、したがって、尿ブランクを各試料
について試験した。ここでは、カプロン酸β−ナフチル
の代わりに０．０７５ｍＬのＤＭＦを用いた以外は−１
−記のものと同じ条件が用いられた。

尿試料０．０５仄しを加えることにより反応を開始させ
た。室温にて１０分間のインキュベーションの後、５Ｌ
８ｎＩＩ＋での吸光度をＪｌｌｌ定した。

試料のブランクに対する吸光度の読みの変化が０．０８
５以上の場合、」１記試験は淋菌に対して陽性であると
みなした０、１．！！者及び対照の試料について得られ
た結果を下記の表に示した。

公衆衛生クリニック尿試料 ３４％（４３）　参照方法及びエステラーゼ試験で共に
陽性 ４３％（５５）　参照方法では陰性であるが、エステラ
ーゼ試験では陽性 １３％（１７）　参照方υ；及びエステラーゼ試験で共
に陰性 １０％（１３）　参照方法では陽性であるが、エステラ
ーゼ試験では陰性 対照試料 １２％（１６）　エステラーゼ試験で陽性対照群中の１
２％の陰性試料は、一定人口についての低い罹患率とし
て予期される罹病率のレベルとほぼ一致する。対照群で
得られたこの低い陽性レベルは、本発明方法の結果が正
の誤診を示すものであるというよりは、クリニックの試
料で得られた４３％の見掛けの負の診断が、参照方法が
失敗であることを示すものであることを示していると言
える。

淋病の思渚から得たすべての尿試料はまた、数多くのエ
ステル分解酵素を有する種々の多形細胞の白血球（ＰＭ
Ｎ）を含むため、上記試験を妨害し得るｅ　ｊＮ養によ
り淋菌は陰性であると判断されたがＰＭＮを含む種々の
尿試料を上記方法で試験したところ、結果は陰性であり
、妨害はないことが示された。低比重の試料は、おそら
〈生物の含有量が低いため、信頼し得る結果を与えなか
った。

組成においては、修正ないし変形が、本発明の精神及び
範囲から逸脱することなく種々に行うことができる。

手続補正書 昭和６２年　７月　１日 特許庁長官　　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第１２７２７３号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付　　自発 （１）明細害第２６頁３行目に記載の「試料を用意して
選別試験を行うには」を「選別試験を簡単に行うには」
に補正する。

（２）明細書第４３頁下から２行目に記載の「負の診断
」を「正の誤診」に補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、尿試料中の淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の
   存在を検知するための迅速な診断方法であって、（ａ）
   尿試料を試験組成物と接触させて試験混合物を形成し、
   上記試験組成物が ｉ）淋菌の酵素活性によって分解して分解 生成物を生成し得る酵素基質と ｉｉ）試験混合物のｐＨを約６．５〜８．５にし得る緩
   衝剤とを含み；更に （ｂ）分解生成物を用いて光学的応答を発生せしめるこ
   とにより 淋菌の存在を検知することを特徴とする方法。 ２、検知可能な光学的応答が色である特許請求の範囲第
   １項記載の迅速な診断方法。 ３、試験組成物が更にカップリング成分を含む特許請求
   の範囲第２項記載の迅速な診断方法。 ４、カップリング成分が、分解生成物と相互作用して発
   色応答を示し得るジアゾニウム塩である特許請求の範囲
   第３項記載の迅速な診断方法。 ５、酵素基質がβ−ナフチルカルボン酸エステル類、ピ
   ロールカルボン酸エステル類及びチオフェンカルボン酸
   エステル類から成る群より選ばれる特許請求の範囲第４
   項記載の迅速な診断方法。 ６、試験組成物が更にアルコール活性剤を含む特許請求
   の範囲第５項記載の迅速な診断方法。 ７、試験組成物が更に酵素成分を含む特許請求の範囲第
   ３項記載の迅速な診断方法。 ８、尿試料中の淋菌の存在を検知するための迅速な診断
   方法であって、 （ａ）尿試料を試験組成物と接触させて試験混合物を形
   成し、上記試験組成物が ｉ）淋菌の酵素活性によって分解して分解 生成物を生成し得る酵素基質と ｉｉ）試験混合物のｐＨを約６．５〜８．５にし得る緩
   衝剤とを含み； （ｂ）試験混合物を１時間未満インキュベートし；更に （ｃ）分解生成物を用いて光学的応答を発生せしめるこ
   とにより 淋菌の存在を検知することを特徴とする方法。 ９、（ａ）淋菌の酵素活性によって分解して分解生成物
   を生成することができ、かつカプロン 酸チオフェン、カプロン酸ピロール及びカ プロン酸β−ナフチルから成る群より選ば れる酵素基質； （ｂ）ｐＨを約６．５〜８．５の範囲にし得る緩衝剤： （ｃ）分解生成物と結合して発色応答を与え得るジアゾ
   ニウム塩；及び （ｄ）活性剤 から成ることを特徴とする体液試料中の淋菌の存在を迅
   速に診断するための試験組成物。 １０、活性剤がアルコールである特許請求の範囲第９項
   記載の試験組成物。