JPS62270789A - パルス電界ゲル電気泳動装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明〕 〈発明の技術分野〉 本発明はパルス電界電気泳動法及び装置に関する。

く背　景〉 最近、電気泳動装置により、ＤＮＡ高分子を分離できる
ようになってきた。この種の装置では、ＤＮＡ分子を含
有するゲルに与える電界の方向をくり返し切り換えるよ
うにしている。このような電界の方向の切換えにより分
子を分離できる理由は、分子量や長さくｃｏｎｔｏｕｒ
　ｌｅｎｇｔｈ）によって分子が向きを変えるのに要す
る時間が違うことによる。

〈発明の目的、構成〉 本発明の目的はパルス式電位勾配によるゲル電気泳動装
置において、すべての分離トラック（分離レーン、分離
バンド、ゲルレーンと呼ぶこともある）に同じ向きで強
さの電界を印加でき、容易に読み収れる分離トラックを
形成でき、分離される分子がリニアで正確な径路に沿っ
て動き、それぞれの分離トラック上の分子の分離度（ｒ
ｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）をよくすることができ、しかもこ
のようにして得られた分離トラックから分子を別のサブ
ストレートに転写（トランスファ、プロッティング）す
るのにも使用できるゲル電気泳動装置を提供することで
ある。

本発明によるパルス式電位勾配ゲル電気泳動装置ではゲ
ルとして自立ｉｌｌ造（ｆｒｅｅ　ｓｔａｎｄｉｎｇ）
のゲルを使用する。そして、ゲルの面と平行ではなく、
ゲルの面と交差し、ゲルの面を貫通する３次元の電界が
形成されるように電極のアレーを配置する。

さらに、これらの電極（分離用電極）によってつくられ
る２種類の電界を互いにほぼ直角に交じわらせることに
より、分子がゲル内をその両面の間でのこぎり歯のよう
な径路をたどって進むようにする。あるいは、２種類の
電界が成す角度を９０度より広くして自立ゲルの上端で
電界の強さが一番強くなるようにし、これにより分子の
分離度の向上を図ってもよい０分離後は、分子を効率よ
く収集するため、上記分離用電極の代わりに分子転写用
の電極（トランスファ電極）をセットし、分離のときと
同じ電源を使用して分子をゲルから別のサブストレート
上に移しかえる。

〈実施例〉 以下、図面を参照して本発明の詳細な説明する。

第１［２１と第２図において、電気泳動装置ｌＯはゲル
ボックス（ゲルハウジング）１２内に収容されておリ、
ゲルボックス１２の上部１４は容易に取り外すことがで
きるようになっている。装置１０はＭＷｆｌ液１５液溝
５され、ｗＩ街液の入口１６．１８とＭｆａ液の出口２
０．２２が設けられている０Ｍ衝液は両方の出口２０゜
２２からポンプ２４を通り冷却水槽の熱交換器２６に至
り、ここで冷却されたＨａ液１５が再びゲルボックス１
２に戻って循環するようになっている。

ゲル２８は自立構造であり、複数のウェル３０が形成さ
れている。ゲル２８はガラス板の間に挾んで型をとり、
冷却した後ガラス板を取り外し、しかる後、そのゲルを
ゲルボックス１２内に垂直に立てる。

第２図に示すように、ゲル２８はボックス１２の内面の
２本の柱３２の間にできたスロットにより支持される。

１％の寒天ゲルであれば、支持板がなくてもスロット内
でまっすぐに立つ。

２つの同様な白金線電極アレイ４０，４６と４２．４４
とにより、ゲル２８の面に対し鋭角で交わる２つの方向
の電界が交互に発生する。電極４０と４２はいずれも、
一本の白金線をくつひものように左右に通してむき出し
の４本の白金線が水平に張られるようにして形成する。

そしてそれらの間の部分は短いチューブで覆って絶縁を
とる。第１図に示すように、電極４０の面と電ｆ！４２
の面は互いにほぼ直角を成すとともに、それぞれ電極４
６と４４に対しても直角に配置されている。したがって
、電極４０と４６との間に電圧を印加することにより、
ゲル２８を貫通する矢印４８の向きの３次元電界が発生
する。同様にして電極４２と４４の間に電圧を印加する
ことにより、電界５０が発生し、ゲル２８内のすべての
ゲルレーンは等しい電界にさらされ、この結果、ウェル
３０内の試料はゲルレーンをまっすぐに下っていくこと
になる。

電源５０の正と負の出力線５２と５４は双極双投リレー
６２の可動片５８と６０に接続されている。可動片５８
゜６０の位置はリレー６２のコイルに接続された切替用
のタイマー６４により制御される。タイマー６４の出力
が発生するとリレーの可動片５８と６０は接点６６と６
８に接触し、このため、負と正の電圧が端子７２と７６
を介してそれぞれ電極４０と４６に印加される。一方、
タイマー６４の出力がなくなると、可動片５８と６０は
接点６７と６９に接触し、負と正の電圧が端子７５と７
０を介してそれぞれ電極４２と４４に印加される。

ゲル２８をボックス１２の真中に置いた状態で、２種類
の電極対により、等しい時間ずつ交互に電界パルスを与
えることにより、分離される試料はゲル２８の上部から
下方に動かされる。このような電界方向の切換をくり返
すことによりＤＮＡ高分子が分離（分画）されていく。

以上説明した装置は実際に製作され、良好に動作した。

製作した装置では以下の部品を使用した。

Ｉ　ＳＣＯモデル４９３電源、　Ｇｒａｙ　Ｌａｂモデ
ル６２５タイマー起動の双極双投リレー、ｍ新液循環冷
却システムの各部品として振動ポンプ（Ｃｏｌｄ−Ｐａ
ｒｓｅｒ）、冷却水槽（ＬａｕｄａモデルＲＭ６）、及
び径１八インチ（０，６３ｃｚ）長さ１２フイート（３
，６ｍ）のポリエチレンチューブの２本のループをコイ
ル状にして対向させ、水を満たした発泡スチロールボッ
クス内に浸して成る熱交換器０片方のループには水槽と
ボックスとの間で冷却剤を循環させ、他方のループには
熱交換器ボックスとゲルボックスとの間で［１１液を循
環させた。ゲルボックスはＩへインチ（０，８３ＣＩ）
厚の透明なプレクシグラスシートで構成し、その内側寸
法は６インチ×３インチ×６．５インチ（１５，２ｘ　
７．６２ｘ　１６．５ｃｍ）とした、寒天ゲルの寸法は
幅７．６ｃｚ、高さ１０ｃｚ、厚さ０．６４ｃｘとした
。１％ゲルを使用した。白金線は線番２８゜ 従来技術ではゲル面内を電界が通るようにしているのに
対し、本発明ではゲルの厚みを電界が貫通するようにし
ている。したがって、各ゲルレーンに等しい強さの電界
を与えることができ、分離される分子の動きを完全にゲ
ルレーンの内部に制御できる。電界方向の切換周波数は
分析対象である分子の大きさや種類で決まる。２００キ
ロから２００キロの塩基をもつ試料に対しては、４０〜
６０秒のパルス時間を使用した。

分離レーンに沿う電界強度分布を変えるため、電極４０
．４２に凹または凸の曲率をもたせることにより、試料
がゲル中を下降するのにつれて除去に強度の弱い電界領
域に入るようにしてもよい０図ではＴ！ｌ極４極上０２
は定位値に置かれているが、両電極による電界相互間の
交差角度が変えられるような可動構成にしてもよい、ま
た、ゲル２８は自立構造として示されているが、ゲルボ
ックス内を移動可能なケース内にゲル２Ｂを収容し、分
離工程の各ステップごとに電極に対するゲルの位置を変
えるようにしてもよい、また、ゲルの限られた選択領域
のみにｉ′Ｉｆ１４０と４２からの電界をフォーカスさ
せる一方で可変速の駆動＠構により、ゲルを縦方向に移
動させることにより、電界にさらされるゲルの選択領域
が順次シフトされるようにしてもよい（印加電圧の範囲
、パルス時間、駆動速度を選択することにより、分離を
最適化することができる）。

電極４０，４２，４４．４６の方を動かし、ゲル２８の
方を固定した構成によって電界にさらされるゲルの部分
を順次ずらすようにしてもよい。

第３図かつ第８図に別の実施例を示しである。

図示のように、ゲルボックス８０は両側面８２）両端面
８４、底面８６を有する長方体の形状を成している。

各側面８２からは対応する位置に対を成す内柱８７が突
設されており（第７図、第８図参照）、上述した第１図
と第２図の場合と同様に、この内柱８７間のスロットに
自立ゲルＺ８が支持される。さらに、両側面８２からは
対を成す外柱８８が対応する位置に突設されている。外
柱８８は内柱８７よりやや短かく、トランスファ（ゲル
転写）工程の際に利用される。

ゲルボックス（ゲルハウジング）８０は上端が開口して
おり、両側面８２間には！！街液液循環用多孔チューブ
９０（上側）９１（下ｒｓ）が渡されており上記柱８７
゜８８の両側に対称に位置している。第３図と第４図に
示すように、ｗＩ街液液入口９２上側ボート９０とつな
がっており、下側の緩衝液出口９４は下側ボート９１と
つながっている。第１図、第２図と同様に、冷却水槽の
熱交換器がこのＩ！街液液入口９１出口９４につながっ
ていて循環系統を形成し、ゲルボックス８０内にｗｔ衝
液を循環供給し、ゲルボックス８０内のＩ！街液液温度
一定に保つようにしている。ゲル２８に交互にパルス電
界を与えるために、２つの分離間インサート装置９６が
共通ハウジング８０に着脱自由に組み込まれる（第７図
参照）、各インサート装置はハウジング８０と組み合わ
せられるように、上面９８、上面９８より下方へ延びる
両側面９９、両側面９９間を渡る２本の横棒１００を備
えている。すなわち、両側面９９はハウジング８０に組
み込んだ際にハウジングの両側面８２の間に無理なく収
まる間隔になっている。また、各側面９９には、組み込
んだ際にハウジングの端面８４に沿う、下方に延びた脚
部１０２が形成されるとともに、下側循環用チューブ９
１より上方に位置する段部１０４が形成され、また上側
循環用チューブ９０を包み込む逆Ｕ字状の凹部１０６が
形成されている。さらに各インサート装置９６は上方電
極線１０８と下方＠、径線１１２を備える。

すなわち、上方電極線１０８は各側面９９の前縁１１０
の切り込み１０９の間を通され、下方電極線１１２は脚
部１０２の切り込み１１４の間を通されている。インサ
ート装置の上面９８はハウジング８０の上縁を覆う寸法
であり、組み込み後は両者は突き合わされた状態となり
、インサート装置の脚部１０２はハウジング８０の端面
８４に寄りかかった状態になる。第３図に示すように各
上方電極線１０８はインサート装置上面９８の負端子１
１５または１１５′に電気接続されている。下方電極線
１１２の方は上面９８の正端子１１６または１１６′に
電気接続されている。

第３図かられかるように、２つの上方ｚｖＭｉｏｓはゲ
ル２８の中心線から等距離に位置し、かつゲル２８のウ
ェルもしくは上端より少し高い位置にある。

一方、２つの下方電極１１２はゲル２８の中心線から等
距離にあり、ゲルの下端もしくはハウジング８０の底面
８６より上方において互いに水平方向に隔てられている
。各電極１０８，１１２は一本の白金線で構成するのが
よく、その両端を上述したように切り込み１０９と１１
４内に挿入し、必要なところ、例えば接続端や、各端子
１１５，１１５’　、１１６，１１６′から切り込みま
での間はシールドする。第３図と第４図にあっては、電
極線同士は水平方向に隔たっており、垂直の自立ゲル２
８に対して並行に配置されている。

したがって、ゲル２８の片側にある各員電［１０８と反
対側にある各正Ｔ、極１１２との間に電圧な交互に印加
することにより、電界が発生し、そのうちでゲルの上端
近くと交差するところの電界１２０，１２２が最大の強
度となる。この最大電界１２０と１２２はゲル厚を鋭角
で貫通し、電界同士の成す角度は直角より広くなる。

電界間の角度が広くなったことにより、先の例より分解
度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を高くすることができる。

すなわち２００〜２５０Ｖの印加電圧条件でより大きな
分子を分離できる。印加電圧は高くなるが、電流は少な
くてよく、それでいてゲル内のより大きな分子を分離で
きる６例えば、第３図の場合、最大電界１２０と１２２
の成す内角１２３は１１０度から１２０度のオーダーで
ある。この構成の場合、発生する全電界はゲルの全長に
わたりゲルを貫通する。しかし、その強度はゲルの下方
に進み、最大電界１２０，１２２から離れるほど弱くな
っていく。

第１図、第２図の例と同様に、第３図、第４図の場合も
、電源５０′の負と正の線５２’　、５４′が双極双投
リレー６２′の可動片５８’　、８０’にそれぞれ接続
される。リレー６２のコイルにはタイマー６４′が接続
され、タイマー６４′の出力があるときはリレーの可動
片５８′と６０’はそれぞれ接点６６′と６８′に接触
し、端子１１５と１１６３介して電Ｍｉ、！！１０８と
１１２にそれぞれ負と正の電圧が加えられて電界１２０
が発生する。一方、タイマー６４′の出力がないときに
は可動片５８′と６０′は接点６７′と６９′側に切り
換わり、端子１１５′と１１６′を介して電圧が供給さ
れ、電界１２２が発生する。同じく、ゲル２８は電極ア
レーの中心に位置しており、各電極対に同じ時間ずつ交
互にパルスを与えて電界１２０と１２２を代わる代わる
発生させることにより、ＤＮＡ分子はゲルの頂部から底
部へとレーンに沿って蛇行しながら下降していく。

電気泳動による分離工程完了後、インサート装置９６を
取り外し、ＤＮＡ分子を膜ないしフィルタにブロッティ
ングするプロッティング（トランスファ）工程の前処理
のために、ゲルボックス８０がらゲル２８をいったん取
り出す、この前処理では、ゲルを臭化エチジウムにより
着色してＤＮＡ分子が紫外線のもとて蛍光を出すように
する０次に、ゲルを水酸化ナトリウム溶液に漬けてＤＮ
Ａ分子を変性しＤＮＡの２重鎖をほどく、ついで、中和
してｐＨを下げ、残っている塩や水酸化ナトリウムを除
去する０次にゲルを２つの面（一方は膜ないしフィルタ
１３０）の間にサンドウィッチ化する。

ゲルの裏面にバックプレート１３２を設け、このように
して組み立てたゲルをゲルハウジング８０の外柱８８の
間に配置する。

第８図に示すように、対をなすトランスファ用インサー
ト装置１３４はゲルハウジング８０の外柱８８の両側に
配置される。各インサート装置１３４の両側面１３６は
ほぼ長方形を成していて、ほぼ長方形の上面１３８の下
側から延びている０両側面１３６間の隔たりは上面１３
８の幅より狭く、かつゲルハウジング８０に組み込んだ
場合にはハウジングの両側面８２の間に無理なく収まる
ようになっている。さらに、各側面１３６は上面１３８
の外側の端１４０からは遠くて内側の端１３９寄りに設
けられている。また、両側面１３６間の補強材として、
両側面をつなぐ２本の補強棒１４２が、各側壁１３６の
内面に傾斜して設けられた電極支持リブくホルダー）１
４４の上端と下端の近くに設けられている。第５図に示
すように、各電極アレー１４６は一本の導線から成り、
この一本の導線を各電極ホルダー１４４の上端と下端の
間において、水平方向に複数回前後させて張設している
。電極ホルダー１４４には切り込みがあり、ここに電［
ｉ　ａの斜行部を収容してシールドを図っている。イン
サート装置１３４が確実に装着できるようにするため、
側面１３６をハウジングに挿入したとき上面１３８がゲ
ルハウジング８０の上縁をぴったりと覆い、側面１３６
の後縁が柱８８がら隔たり、上方のｆ＝１ｔｉＰｒ液循
環ボート９０の手前に位置するように構成されている。

第５図と第６図において、各導線１４８の上端は端子１
５０または１５０′に接続され、端子１５０は電源５０
′の負側に接続され、端子１５０′は電源５０′の正側
に接続これている０図示のように、各インサート装置１
３４の電極アレーは一番上の水平線がら離れるにつれ斜
め下方に広がって配置されており、ハウジング８０内に
収容した伏君では、ゲルの中心線から等距離にある。し
たがって負アレーがら正アレーに向って水平方向に進む
３次元電界１５２が形成されることになる。電極アレー
１４６がゲルの上端から下端に向けて、次第に広がって
配置されていることには意味がある。すなわち、この配
置構成によれば、ゲルの上端にある大きいＤＮＡ分子を
トランスファできる。また、電極アレーとゲルとの距疏
は下方はど離れているのでゲル２８の厚みに加わる電圧
も下方に進むにつれ次第に小さくなる。

トランスファ工程では、電界はゲルの厚みを貫通する２
つの方向のうち１つの方向だけを使用し、この片方向電
界印加によりＤＮＡ分子をゲルから膜ないしサブストレ
ート１３０に転写する。なお、膜１３０は負の電極とは
反対側のゲル面に沿って配置する。

１１１Ｆｒ　Ｗをｍ環させてゲルハウジング内を恒温に
保ち、電源５０′によりゲルの両側に電圧を印加する０
代表的な印加電圧は１２０■程度であり、ＤＮＡ分子を
完全にトランスファするため約２時間印加する。インサ
ート装置９６と１３４は交換可能であるので共通のゲル
ハウジング８０が使用できるとともに、各工程（分離と
トランスファ工程）における電極間の成す角度を最適に
できる。なお、例えば、第１図と第２Ｕ２で述べた電極
間の角度と同様の所望角度をもたせながら、電極ホルダ
ー１４４をゲルハウジング８０の側面に直接取り付ける
ことにより、Ｚ＆と導線を別のハウジングに設けるよう
にしてもよい、また、負電極として一本の電極線１０８
（第３図、第４図参照）を使用する電ｆ！構成は第１図
や第２図に示す電極アレーの構成に比べ、電界間の成す
角度の選択に関してより自由で制約が少ない、すなわち
、ゲルが電極間の中央に位置し、全電界がゲルの全長（
全長）にわたってゲルを貫通する条件が満足される限り
、負の電ｆｉ１０８あるいは正の電極１１２をシフトす
ることにより、電界１２０と１２２の成す角度を変化さ
せることができる。電界角度１２３ト小さくすると、ゲ
ルボックス８０の高さを高くし、正電極１１２をゲルの
下端近くに配置して全電界がゲルの全長にわたって作用
するようにしなければならない、また、最大電界１２０
と１２２がＤＮＡ分子を含むレーンないしバンドの上端
で交差していることも、ＤＮＡ分子を下方に移動させ、
各レーン（バンド）に沿う分子の分離をよくする上で重
要なポイントになっている。電界角度１２３を９０°よ
り広くし、１１０°〜１２０°程度にすることにより、
２，０００，０００個のオーダーの塩基をもつ非常に大
きな分子を動かし、分離させることができる。

２．０００，０００個以上の塩基をもつ分子の移動ない
し分離は、電圧やパルス時間を調整しつつ電界角度１２
３を１２０°より広くすることにより可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の断面図、 第２図は第１図の線Ａ−Ａに沿う断面図、第３図は別の
実施例の断面図、 第一１図は第３図の線Ｂ−Ｈに沿う断面図、第５図はさ
らに別の実施例の断面図、 第６図は第５図の線Ｃ−Ｃに沿う断面図、第７図はタル
ハウジングとゲル分離用インサート装置の斜視図、 第８図はゲルハウジングとゲルトランスファ用インサー
ト装置の斜視図である。 １２ニゲルハウジング　　　２８ニゲル３２：柱（ゲル
支持用）３０：試料ウェル４０．４２，４４，４６：電
極（分離用）　　　４８，５０：電界８０ニゲルハウジ
ング（共通ハウジング）８７．８８：柱　　　　９６：
分離用インサート装置１０８．１１２：電極（分離用）
　　１２０，１２２＋最大電界１３４：トランスファ用
インサート装置１４４：電極（トランスファ用）　　　
１５２：電界（外５名）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）（イ）分離すべき高分子を支持するゲル媒体と、 （ロ）上記媒体は対向する２つの平面が面間の距離、す
   なわち媒体の厚みに比べて大きな寸法になつていること
   と、 （ハ）上記媒体は１つ以上の分離トラックを有すること
   と、 （ニ）上記媒体のまわりに配置され、動作時には上記分
   離トラックに対して第１電界を印加する第１電極手段と
   、 （ホ）上記第１電界の方向は上記２つの平面のいずれと
   も交差し、かつ第１の平面に対して鋭角を成す方向であ
   ることと、 （ヘ）上記媒体のまわりに配置され、動作時には上記分
   離トラックに対して第２電界を印加する第２電極手段と
   、 （ト）上記第２電界の方向は上記２つの平面のいずれと
   も交差し、かつ第２の平面に対して鋭角を成す方向であ
   ることと、 （チ）上記第１電極手段と上記第２電極手段とを交互に
   くり返し作動する手段と、 から成る電気泳動分離装置。
2. （２）特許請求の範囲第１項記載の装置において、上記
   第１電界と上記第２電界とが成す角度は少なくとも９０
   度あることを特徴とする装置。
3. （３）特許請求の範囲第２項記載の装置において、上記
   第１と第２の電極手段のそれぞれは、２つの部分から成
   り、第１部分は上記媒体の一方の平面と対向しており、
   第２部分は上記媒体の他方の平面と対向しており、かつ
   上記第１部分はすべての分離トラックの全長にわたる３
   次元電界を発生するグリッド導体から成ることを特徴と
   する装置。
4. （４）特許請求の範囲第１項記載の装置において、上記
   媒体は上記高分子が移動可能なゲル状の平らなものでで
   きており、かつ自立するのに十分な物理的強度を有して
   おり、上記電極手段は、上記媒体の一方の平面の隣りに
   配置され、ほぼ平らなアレイを形成する複数の導体と、
   上記媒体の他方の平面の側に配置される逆極性の電極と
   から構成されることを特徴とする装置。
5. （５）特許請求の範囲第１項記載の装置において、上記
   第１電極手段が発生する最大電界と上記第２電極手段が
   発生する最大電界とが互いに９０度から１２０度の範囲
   の角度で交差することを特徴とする装置。
6. （６）特許請求の範囲第１項記載の装置において、上記
   第１と第２の電界は上記分離トラックの両端の間におい
   て、上記媒体の厚みを斜め下方向に貫通し、上記負と正
   の電極手段のそれぞれは、上記媒体と平行で水平に延び
   る少なくとも一本の導線から成ることを特徴とする装置
   。
7. （７）特許請求の範囲第１項記載の装置において、該装
   置は、上記負と正の電極間の対称な位置に上記媒体を取
   外し自由に支持する媒体支持手段を備える共通ハウジン
   グと、上記負と正の電極を上記共通ハウジング内に取外
   し自由に支持する電極支持手段と、上記媒体を貫通する
   片方向の電界を発生するためのトランスファ電極手段を
   上記共通ハウジング内に取外し自由に支持するトランス
   ファ電極支持手段とから成り、上記トランスファ電極手
   段は動作時に、上記媒体の一端から他端に進むにつれ次
   第に小さくなる電圧を上記媒体の厚みに加えることを特
   徴とする装置。
8. （８）特許請求の範囲第７項記載の装置において、上記
   トランスファ電極手段の正と負の電極のそれぞれが、下
   方に進むにつれ上記媒体の対向面から遠ざかる方向に広
   がつた多数導体アレイで構成されることを特徴とする装
   置。