JPS62244383A - 酵母における組換え蛋白の発現 - Google Patents
酵母における組換え蛋白の発現Info
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- JPS62244383A JPS62244383A JP62044151A JP4415187A JPS62244383A JP S62244383 A JPS62244383 A JP S62244383A JP 62044151 A JP62044151 A JP 62044151A JP 4415187 A JP4415187 A JP 4415187A JP S62244383 A JPS62244383 A JP S62244383A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
サツカロミセス セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）は、異種ポリペプチ
ドの発現のための宿主として有能であることが明らかに
なった。稲々の糧からの多数の異なる蛋白が、Ｓ．セレ
ビシエ中で全細胞蛋白のほぼ１０％以上にまで発現され
ている。典歴的には、発現は発現されるポリペプチドの
構造遺伝子を取り囲む酵母制御配列（転写プロモーター
およびターミネータ−）とともに、Ｓ。
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）は、異種ポリペプチ
ドの発現のための宿主として有能であることが明らかに
なった。稲々の糧からの多数の異なる蛋白が、Ｓ．セレ
ビシエ中で全細胞蛋白のほぼ１０％以上にまで発現され
ている。典歴的には、発現は発現されるポリペプチドの
構造遺伝子を取り囲む酵母制御配列（転写プロモーター
およびターミネータ−）とともに、Ｓ。
セレビシェおよびＥ、コリの両方の中で選択ならびに増
幅のために必要とされる他の配列を含むプラスミドによ
り仲介されている。
幅のために必要とされる他の配列を含むプラスミドによ
り仲介されている。
アルファ接合因子は、ＭＡＴαおよびＭＡＴａ細胞間の
接合に必要とされるＳ．セレビシエの性フェロモンであ
る。このトリデカペプチドは、粗面小胞体中に向けられ
、糖付加され、細胞から分泌される最終成熟形に蛋白分
解的にプロセスされるプレプロフェロモンとして発現さ
れる。この生化学的な過程は、異種ポリペプチドの発現
戦略に利用されてきた０アルファ接合因子遺伝子は分子
的にクローン化され、プレープローリーダー配列を伴う
プロモーターは種々のポリペプチドを発現し分泌するの
に利用されてきた。それらの粗面小胞体およびゴルジ器
官の横断から期待されるように、異種蛋白はＮ−および
〇−結結合付付加両反応を受は得る。
接合に必要とされるＳ．セレビシエの性フェロモンであ
る。このトリデカペプチドは、粗面小胞体中に向けられ
、糖付加され、細胞から分泌される最終成熟形に蛋白分
解的にプロセスされるプレプロフェロモンとして発現さ
れる。この生化学的な過程は、異種ポリペプチドの発現
戦略に利用されてきた０アルファ接合因子遺伝子は分子
的にクローン化され、プレープローリーダー配列を伴う
プロモーターは種々のポリペプチドを発現し分泌するの
に利用されてきた。それらの粗面小胞体およびゴルジ器
官の横断から期待されるように、異種蛋白はＮ−および
〇−結結合付付加両反応を受は得る。
該アルファ接合因子プロモーターは、表現形がαの細胞
中でのみ活性である。Ｓ．セレビシエ中には、他の通常
は発現していないａおよびα情報のコピーの抑制のため
に必要な蛋白を合成するＳＩＲとして知られる４遺伝子
座がある。この抑制反応を阻害する温度感受性（１，）
欠損が、少なくともこれら座位のひとつの遺伝子産
物中に存在する。この変異株では、３５℃での生育は抑
制をなくし、細胞は表現形質がａ／（Ｉｔとなりこの株
ではアルファ接合因子は不活性になる。２３℃へ温度を
移行するとプロモーターが活性となり、細胞は表現形質
がαに復帰する。ｔｓｓＩＲ欠損を伴う株の利用は、い
くつかの異種ポリペプチドの調節された発現に示されて
いる。
中でのみ活性である。Ｓ．セレビシエ中には、他の通常
は発現していないａおよびα情報のコピーの抑制のため
に必要な蛋白を合成するＳＩＲとして知られる４遺伝子
座がある。この抑制反応を阻害する温度感受性（１，）
欠損が、少なくともこれら座位のひとつの遺伝子産
物中に存在する。この変異株では、３５℃での生育は抑
制をなくし、細胞は表現形質がａ／（Ｉｔとなりこの株
ではアルファ接合因子は不活性になる。２３℃へ温度を
移行するとプロモーターが活性となり、細胞は表現形質
がαに復帰する。ｔｓｓＩＲ欠損を伴う株の利用は、い
くつかの異種ポリペプチドの調節された発現に示されて
いる。
種々の組換え微生物発現系において、多くの異なるポリ
ペプチドの合成が宿主細胞に有害であることが示されて
いる。その結果、そのような組換え培養の大規模化にお
いて、異種ポリペプチドを発現しないかまたは、培養が
該ポリペプチドの源として経済的に見合わない位の微量
量しか発現しないような細胞のみとなるような、該ポリ
ペプチドの発現に対抗する圧力がある。
ペプチドの合成が宿主細胞に有害であることが示されて
いる。その結果、そのような組換え培養の大規模化にお
いて、異種ポリペプチドを発現しないかまたは、培養が
該ポリペプチドの源として経済的に見合わない位の微量
量しか発現しないような細胞のみとなるような、該ポリ
ペプチドの発現に対抗する圧力がある。
本発明の目的は、第一次翻訳産物を粗面小胞体に向ける
酵母のプロモーターおよびリーダー配列を、その発現が
酵母中で不安定か有毒であるような異種糖蛋白の発現に
応用するための方法を与えることである。本発明の他の
目高は、そのようなベクターで形質転換された組換え酵
母細胞の生育を大規模化するための条件を、異種糖蛋白
の最大収率が大容量において到達されるように特定する
ことである。本発明のさらに他の目的は、エプスタイン
−パール ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｕｉ
ｒｕｓ）の膜抗原（ｇｐ ３５０ ／ ｇｐ ２２０
）を酵母において糖付加された（ ｇｌｙｃｏｓｙｌａ
ｔｅｄ ）形で発現させる方法を与えることである。本
発明のこれらおよび他の目的は、以下の記述より明かと
なろう。
酵母のプロモーターおよびリーダー配列を、その発現が
酵母中で不安定か有毒であるような異種糖蛋白の発現に
応用するための方法を与えることである。本発明の他の
目高は、そのようなベクターで形質転換された組換え酵
母細胞の生育を大規模化するための条件を、異種糖蛋白
の最大収率が大容量において到達されるように特定する
ことである。本発明のさらに他の目的は、エプスタイン
−パール ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｕｉ
ｒｕｓ）の膜抗原（ｇｐ ３５０ ／ ｇｐ ２２０
）を酵母において糖付加された（ ｇｌｙｃｏｓｙｌａ
ｔｅｄ ）形で発現させる方法を与えることである。本
発明のこれらおよび他の目的は、以下の記述より明かと
なろう。
ある種の異種遺伝子、例えばエプスタイン−パール ウ
ィルス膜抗原（ｇ ｐ ３５０／ｇｐ２２０）遺伝子、
の発現は、毒性効果のために酵母中で逆選択される。酵
母リーダー配列を伴う蛋白、例えば牙−次翻訳産物を粗
面小胞体中に向けるアルファ接合因子、の制御された発
現をさせる遺伝的な発現系が記載されている。
ィルス膜抗原（ｇ ｐ ３５０／ｇｐ２２０）遺伝子、
の発現は、毒性効果のために酵母中で逆選択される。酵
母リーダー配列を伴う蛋白、例えば牙−次翻訳産物を粗
面小胞体中に向けるアルファ接合因子、の制御された発
現をさせる遺伝的な発現系が記載されている。
この系は、酵母中での細胞に対して毒性効果を示すある
いは逆選択される糖蛋白の発現に応用可能である。
いは逆選択される糖蛋白の発現に応用可能である。
本発明は、牙−次翻訳産物を粗面小胞体へ向ける、例え
ばアルファ接合因子プロモーター−リーダー ベクター
、をその発現が酵母において不安定か有毒である異種糖
蛋白の発現に応用するための方法に向けられている。
ばアルファ接合因子プロモーター−リーダー ベクター
、をその発現が酵母において不安定か有毒である異種糖
蛋白の発現に応用するための方法に向けられている。
より特定すると、制御ＳＩＲ蛋白の一つにｔｓ欠損を伴
う宿主中でのそのようなベクター系の使用に向けられて
いる。本発明はまた、そのようなベクター系を大量のエ
プスタイン−パール ウィルス膜抗原（ＥＭＢＡ）を酵
母中で糖付加形態で安定に発現させるために利用するこ
とにも向けられている。より特定すると、ＥＢＭＡを発
現する組み換え培養の大規模化へ向けられている。本分
野の熟練者にとって、発現が酵母にとって有害であるか
逆選択される他の異種糖蛋白遺伝子が、このベクター−
宿主系を利用することにより安定に大量に発現されるこ
とは自明であろう。該アルファ接合因子遺伝子はＳ．セ
レビシエ ゲノムＤＮＡよりプラスミド ベクター上に
クローンされた。このＤＮＡは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消
化され、自己連結され、プレープロ リーダー配列の３
′側に唯一のＨｉｎｄ Ｉ１１部位を伴う新たなプラス
ミドを形成する。次いで、全３種の読み取り枠において
翻訳終結シグナルを含むオリゴヌクレオチド アダプタ
ーが、その唯一のＨｉｎｄ■部位に、唯一の旧ｎｃｉｌ
ｌｌｌｒ 部位がオリゴヌクレオチド挿入体の５′側に
保持されるように挿入される。その結果できたプラスミ
ド（ｐＲＪ１７８）は旧ｎｄｌｌＪで消化され、ＤＮＡ
ポリメラーゼのクレノフ（Ｋｌｅｎｏｗ ）断片により
平滑末端化され、ＢａｍＨ■リンカーの存在下で自己連
結される。このプラスミドＤＮＡはｇｃｏＲＩで消化さ
れ、ＤＮＡポリメラーゼ■のケレノフ断片により平滑末
端化され、Ｂｃｌ ■リンカーと連結され、Ｂｃｔ Ｉ
で消化され、アルファ接合因子遺伝子を含む１，４キロ
塩基対（ｋｂｐ ）断片が単離される。Ｅ、コリーＳ．
セレビシエシャトル ベクターＰＣＩ／１がＢａｍＨＩ
で消化され、次いで上述の１．４ ｋｂｐ Ｂｃｌ
Ｉ断片と連結され再クローン化される。出来たプラス
ミドはＢａｍＨ■ で消化され、自己連結され新たな
アルファ接合因子発現プラスミドを創成する。このベク
ターの顕著な側面は： （１） Ｅ 。
う宿主中でのそのようなベクター系の使用に向けられて
いる。本発明はまた、そのようなベクター系を大量のエ
プスタイン−パール ウィルス膜抗原（ＥＭＢＡ）を酵
母中で糖付加形態で安定に発現させるために利用するこ
とにも向けられている。より特定すると、ＥＢＭＡを発
現する組み換え培養の大規模化へ向けられている。本分
野の熟練者にとって、発現が酵母にとって有害であるか
逆選択される他の異種糖蛋白遺伝子が、このベクター−
宿主系を利用することにより安定に大量に発現されるこ
とは自明であろう。該アルファ接合因子遺伝子はＳ．セ
レビシエ ゲノムＤＮＡよりプラスミド ベクター上に
クローンされた。このＤＮＡは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消
化され、自己連結され、プレープロ リーダー配列の３
′側に唯一のＨｉｎｄ Ｉ１１部位を伴う新たなプラス
ミドを形成する。次いで、全３種の読み取り枠において
翻訳終結シグナルを含むオリゴヌクレオチド アダプタ
ーが、その唯一のＨｉｎｄ■部位に、唯一の旧ｎｃｉｌ
ｌｌｌｒ 部位がオリゴヌクレオチド挿入体の５′側に
保持されるように挿入される。その結果できたプラスミ
ド（ｐＲＪ１７８）は旧ｎｄｌｌＪで消化され、ＤＮＡ
ポリメラーゼのクレノフ（Ｋｌｅｎｏｗ ）断片により
平滑末端化され、ＢａｍＨ■リンカーの存在下で自己連
結される。このプラスミドＤＮＡはｇｃｏＲＩで消化さ
れ、ＤＮＡポリメラーゼ■のケレノフ断片により平滑末
端化され、Ｂｃｌ ■リンカーと連結され、Ｂｃｔ Ｉ
で消化され、アルファ接合因子遺伝子を含む１，４キロ
塩基対（ｋｂｐ ）断片が単離される。Ｅ、コリーＳ．
セレビシエシャトル ベクターＰＣＩ／１がＢａｍＨＩ
で消化され、次いで上述の１．４ ｋｂｐ Ｂｃｌ
Ｉ断片と連結され再クローン化される。出来たプラス
ミドはＢａｍＨ■ で消化され、自己連結され新たな
アルファ接合因子発現プラスミドを創成する。このベク
ターの顕著な側面は： （１） Ｅ 。
コリー由来の選択（ｂｌａ ）およびＥ、コリ中でのプ
ラスミドの増幅（ａｒｔ ）のための配列。
ラスミドの増幅（ａｒｔ ）のための配列。
（２） Ｓ ．セレビシエ−由来の選択（ＬＥＵ２）お
よびＳ．セレビシエ中でのプラスミドの増幅（２ミクロ
ンＤＮＡ ’ ）のための配列、（３）酵母アルファ接
合因子プロモーター、（４）翻訳産物な粗面小胞体中へ
向けるための酵母アルファ接合因子プレーリーダー、（
５）Ｎ−グリコジル化シグナル配列をコードしＫＥＸ
２および５ＴＥ１３プロテアーゼ（遺伝子産物）Ｋより
解裂される酵母アルファ接合因子ブローリーダー、（６
）発現されるべき異種ペプチドまたはポリペプチドのク
ローニングのための唯一 ０”ｒ ＢａｍＨＩ部位、（
７）全３種の読み取り枠における翻訳終結シグナル、お
よび（８）酵母転写終結配列である。
よびＳ．セレビシエ中でのプラスミドの増幅（２ミクロ
ンＤＮＡ ’ ）のための配列、（３）酵母アルファ接
合因子プロモーター、（４）翻訳産物な粗面小胞体中へ
向けるための酵母アルファ接合因子プレーリーダー、（
５）Ｎ−グリコジル化シグナル配列をコードしＫＥＸ
２および５ＴＥ１３プロテアーゼ（遺伝子産物）Ｋより
解裂される酵母アルファ接合因子ブローリーダー、（６
）発現されるべき異種ペプチドまたはポリペプチドのク
ローニングのための唯一 ０”ｒ ＢａｍＨＩ部位、（
７）全３種の読み取り枠における翻訳終結シグナル、お
よび（８）酵母転写終結配列である。
ＥＥＭＡ蛋白はウィルスによりコードされる３５０．０
００および２２０，０００ダルトンの糖蛋白を表わす。
００および２２０，０００ダルトンの糖蛋白を表わす。
両蛋白の構造遺伝子は同一で、全てがＢａｍＨ■−Ｌゲ
ノム性ＤＮＡ断片中に含まれている。該ＥＢＭＡ遺伝子
断片はアルファ接合因子発現ベクター中にクローン化さ
れている。この組換えプラスミドはＳ．セレビシエに導
入され、形質転換クローンが選択され増幅される。溶菌
液が調製され、ポリアクリルアミド ゲル中で電気泳動
されニトロセルロースにウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ
）プロットされる。１７５，０００および３５０，０
００ダルトン糖蛋白は、それらが形質転換体にのみ存在
すること、エプスタイン−バール ウィルス回復期ヒト
血清および特異的モノクローナル抗体と反応すること、
および集積した陰性ヒト血清とは反応しないという点で
ＥＢＭＡに特異的であることが認められる。
ノム性ＤＮＡ断片中に含まれている。該ＥＢＭＡ遺伝子
断片はアルファ接合因子発現ベクター中にクローン化さ
れている。この組換えプラスミドはＳ．セレビシエに導
入され、形質転換クローンが選択され増幅される。溶菌
液が調製され、ポリアクリルアミド ゲル中で電気泳動
されニトロセルロースにウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ
）プロットされる。１７５，０００および３５０，０
００ダルトン糖蛋白は、それらが形質転換体にのみ存在
すること、エプスタイン−バール ウィルス回復期ヒト
血清および特異的モノクローナル抗体と反応すること、
および集積した陰性ヒト血清とは反応しないという点で
ＥＢＭＡに特異的であることが認められる。
形質転換体の生育が１０ミリリットル以上の体積で試み
られたどの場合においても、Ｅ１３ＭＡが発現されてい
る証拠はなくなる。細胞が液体培養の途中で平板に撒か
れると、非形質転換対照と同じ大きさの大集落の数が増
加していることが認められる。集落の大きさが大きいこ
とは、細胞の生育が小さな集落のものより早いことを反
映している。ウェスタンプロットが形質転換体の犬およ
び小集落についてなされるときは、大集落は常にＥＢＭ
Ａを発現しておらず小集落は常にＥＢＭＡを発現してい
る。連続的な生育の間平板に撒くと大集落の数が増加す
ることは、Ｓ．セレビシエに対するＥＢＭＡのネガチブ
な生理的効果を反映している。このネガチブな効果は、
発現に対して対抗する選択圧となり、その結果大容量で
は最終的にポリペプチドの発現が観察されなくなる。
られたどの場合においても、Ｅ１３ＭＡが発現されてい
る証拠はなくなる。細胞が液体培養の途中で平板に撒か
れると、非形質転換対照と同じ大きさの大集落の数が増
加していることが認められる。集落の大きさが大きいこ
とは、細胞の生育が小さな集落のものより早いことを反
映している。ウェスタンプロットが形質転換体の犬およ
び小集落についてなされるときは、大集落は常にＥＢＭ
Ａを発現しておらず小集落は常にＥＢＭＡを発現してい
る。連続的な生育の間平板に撒くと大集落の数が増加す
ることは、Ｓ．セレビシエに対するＥＢＭＡのネガチブ
な生理的効果を反映している。このネガチブな効果は、
発現に対して対抗する選択圧となり、その結果大容量で
は最終的にポリペプチドの発現が観察されなくなる。
アルファ接合因子プロモーターは表現形質がαである細
胞内でのみ活性となる。Ｓ．セレビシエには、接合型情
報の、他の通常発現していないａおよびαコピーを抑制
するのに必要な蛋白を合成する。ＳＩＲとして知られる
４遺伝子座位がある。ＪＲＹ第８８株（木様は、本発明
の属する技術の分野における通常の知識を有するものに
よく知られており容易に入手できる。）（ライン（Ｒｉ
ｎｅ）ほか、ジエネチツクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）第
９３巻：８７７頁（１９７９年））細胞は５ＩＲ３遺伝
子産物中にｔｓ 欠損を含む。その結果、３５℃で生
育したＪＲＹ第８８細胞は表現形質がａ／”でありアル
ファ接合因子は活性でない。他方、２３℃で生育した細
胞は表現形質がαであり、従って活性なアルファ接合因
子プロモーターを誘導することができる。ＥＢＭＡコー
ド配列に連結したアルファ接合因子プロモーターとプレ
ープローリーダーをともなう組換えプラスミドがＪＲＹ
第８８細胞中に導入され、形質転換クローンが選択され
増幅される。３５℃での細胞生育の結果、検出し得るＥ
ＢＭＡの合成は完全になくなる。細胞は３５℃で飽和す
るまで生育され、２３℃で発酵槽中１０リツトル容量中
に植菌され、こうして培養は対数増殖初期に希釈される
。ＥＢＭＡの合成は最初２３℃への温度移行後１２時間
以内に検出可能、２４−４８時間で最高、そして９６時
間までに消失する。本分野の熟練者にとって、最大収率
を得るための培養収穫時を至適化する目的でこの系にお
ける異種糖蛋白の発現を検定するために、例えばウェス
タンプロットまたはラジオイムノアッセイのような適当
な検定法が利用されるべきであることは自明である。
胞内でのみ活性となる。Ｓ．セレビシエには、接合型情
報の、他の通常発現していないａおよびαコピーを抑制
するのに必要な蛋白を合成する。ＳＩＲとして知られる
４遺伝子座位がある。ＪＲＹ第８８株（木様は、本発明
の属する技術の分野における通常の知識を有するものに
よく知られており容易に入手できる。）（ライン（Ｒｉ
ｎｅ）ほか、ジエネチツクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）第
９３巻：８７７頁（１９７９年））細胞は５ＩＲ３遺伝
子産物中にｔｓ 欠損を含む。その結果、３５℃で生
育したＪＲＹ第８８細胞は表現形質がａ／”でありアル
ファ接合因子は活性でない。他方、２３℃で生育した細
胞は表現形質がαであり、従って活性なアルファ接合因
子プロモーターを誘導することができる。ＥＢＭＡコー
ド配列に連結したアルファ接合因子プロモーターとプレ
ープローリーダーをともなう組換えプラスミドがＪＲＹ
第８８細胞中に導入され、形質転換クローンが選択され
増幅される。３５℃での細胞生育の結果、検出し得るＥ
ＢＭＡの合成は完全になくなる。細胞は３５℃で飽和す
るまで生育され、２３℃で発酵槽中１０リツトル容量中
に植菌され、こうして培養は対数増殖初期に希釈される
。ＥＢＭＡの合成は最初２３℃への温度移行後１２時間
以内に検出可能、２４−４８時間で最高、そして９６時
間までに消失する。本分野の熟練者にとって、最大収率
を得るための培養収穫時を至適化する目的でこの系にお
ける異種糖蛋白の発現を検定するために、例えばウェス
タンプロットまたはラジオイムノアッセイのような適当
な検定法が利用されるべきであることは自明である。
さらに、本分野の熟練者にとって、その発現が宿主に有
害である如何なる異種糖蛋白遺伝子でもアルファ接合因
子プロモーターにより発現させるために、ＳＩＲ遺伝子
産物のどれか一つに温度感受性または他の条件致死欠損
を含むサツカロミセス属の種の株がｉする宿主であるこ
とは自明である。さらに、本分野の熟練者にとっては、
その発現がＳ．セレビシエに有害である異種糖蛋白をア
ルファ接合因子プロモーターにより発現させるために、
ＳＩＲ遺伝子のひとつの発現が生理的に制御され得るサ
ツカロミセス属の種の如何なる株も適した宿主になるこ
とは自明である。
害である如何なる異種糖蛋白遺伝子でもアルファ接合因
子プロモーターにより発現させるために、ＳＩＲ遺伝子
産物のどれか一つに温度感受性または他の条件致死欠損
を含むサツカロミセス属の種の株がｉする宿主であるこ
とは自明である。さらに、本分野の熟練者にとっては、
その発現がＳ．セレビシエに有害である異種糖蛋白をア
ルファ接合因子プロモーターにより発現させるために、
ＳＩＲ遺伝子のひとつの発現が生理的に制御され得るサ
ツカロミセス属の種の如何なる株も適した宿主になるこ
とは自明である。
サツカロミセス属は種々の種からなっている。種々の異
種ポリペプチドの組換えＤＮＡに仲介される発現のため
の宿主として最も普通に利用されるのはサツカロミセス
セレビシェまたはパン酵母である。しかしサツカロミ
セス属の他の種の間の区別は常に明確であるとは限らな
い。これら種の多くは、Ｓ．セレビシエと交配すること
が可能であり、したがってＳ．セレビシエＳＩＲ遺伝子
と類似の５ＩＲ−型制御遺伝子を有するようである。そ
れゆえ本分野の熟練者にとって、アルファ接合因子プロ
モーターを制御するために温度感受性５ＩＲ−型遺伝子
または生理的に制御される５ＩＲ−型遺伝子を用いると
いう考えが、カルスヘルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇ
ｅｎｓｉａ ）、ノルヘンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ
）、ジアスタチヵス（＋Ｈａｓｔａｔｉｃｕｓ ） 、
オビフォルミス（ｏｖｉｆ。
種ポリペプチドの組換えＤＮＡに仲介される発現のため
の宿主として最も普通に利用されるのはサツカロミセス
セレビシェまたはパン酵母である。しかしサツカロミ
セス属の他の種の間の区別は常に明確であるとは限らな
い。これら種の多くは、Ｓ．セレビシエと交配すること
が可能であり、したがってＳ．セレビシエＳＩＲ遺伝子
と類似の５ＩＲ−型制御遺伝子を有するようである。そ
れゆえ本分野の熟練者にとって、アルファ接合因子プロ
モーターを制御するために温度感受性５ＩＲ−型遺伝子
または生理的に制御される５ＩＲ−型遺伝子を用いると
いう考えが、カルスヘルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇ
ｅｎｓｉａ ）、ノルヘンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ
）、ジアスタチヵス（＋Ｈａｓｔａｔｉｃｕｓ ） 、
オビフォルミス（ｏｖｉｆ。
ｒｍｉｓ）、ウバルム（ｕｖａｒｕｍ ）、ルクシ（ｒ
ｏｕｘｉｉ ）、モンタナス（ｍｏｎｔａｎｕｓ ）
、クルベリ（１（ｌｕｙｖｅｒｉ ）、およびエロン
ギスポラス（ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ ） を含み
それに限定されない他の種にまで拡張されることは自明
である。
ｏｕｘｉｉ ）、モンタナス（ｍｏｎｔａｎｕｓ ）
、クルベリ（１（ｌｕｙｖｅｒｉ ）、およびエロン
ギスポラス（ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ ） を含み
それに限定されない他の種にまで拡張されることは自明
である。
ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ） 、カンヂダ（Ｃ
ａｂｄｉｄａ ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉ
ｓ ）およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ ）のようないくつ
かの酵母域は、生育のためにメタノ−Ｌ（唯一炭素源と
して利用するための同様な代謝系を含むことが示されて
いる。この代謝系に関与する酵素の一つであるアルコー
ル オキシダーゼの遺伝子は、ピキア パストリス（Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）から単離されている
。Ｐ、バストリスのアルコール オキシダーゼ プロモ
ーターが単離され、誘導がメタノール感受性であること
が示された。このプロモーターは発現ベクター上に置か
れ、そこでその近傍にクローンされた異種遺伝子の発現
を促進することが示された。そのような誘導可能なプロ
モーターは、ＥＢＭＡのような発現が逆選択されるペプ
チドまたはポリペプチドの酵母中での発現のために有用
である。アルファ接合因子のプレープローリーダー配列
は、Ｓ．セレビシエ中のリーダー配列の一例に過ぎない
。第一次翻訳産物を糖付加系の横断のための粗面小胞体
中へ向けるそのようなリーダー配列は、全ての研究され
た真核細胞中に認められている。Ｅｆ１ＭＡ遺伝子の翻
訳産物がウィルス感染した細胞中および組換え酵母中で
糖付加されるのは、プレーリーダー配列の存在によるも
のである。
ａｂｄｉｄａ ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉ
ｓ ）およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ ）のようないくつ
かの酵母域は、生育のためにメタノ−Ｌ（唯一炭素源と
して利用するための同様な代謝系を含むことが示されて
いる。この代謝系に関与する酵素の一つであるアルコー
ル オキシダーゼの遺伝子は、ピキア パストリス（Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）から単離されている
。Ｐ、バストリスのアルコール オキシダーゼ プロモ
ーターが単離され、誘導がメタノール感受性であること
が示された。このプロモーターは発現ベクター上に置か
れ、そこでその近傍にクローンされた異種遺伝子の発現
を促進することが示された。そのような誘導可能なプロ
モーターは、ＥＢＭＡのような発現が逆選択されるペプ
チドまたはポリペプチドの酵母中での発現のために有用
である。アルファ接合因子のプレープローリーダー配列
は、Ｓ．セレビシエ中のリーダー配列の一例に過ぎない
。第一次翻訳産物を糖付加系の横断のための粗面小胞体
中へ向けるそのようなリーダー配列は、全ての研究され
た真核細胞中に認められている。Ｅｆ１ＭＡ遺伝子の翻
訳産物がウィルス感染した細胞中および組換え酵母中で
糖付加されるのは、プレーリーダー配列の存在によるも
のである。
ブローリーダー配列は、牙−次翻訳産物を粗面小胞体中
に向けるのに必要とされない。本分野の熟練者にとって
自明であるように、この配列は適当な制限エンドヌクレ
アーゼの利用そして／またはプレリーダー配列だけのオ
リゴヌクレオチド合成により欠失され得る。
に向けるのに必要とされない。本分野の熟練者にとって
自明であるように、この配列は適当な制限エンドヌクレ
アーゼの利用そして／またはプレリーダー配列だけのオ
リゴヌクレオチド合成により欠失され得る。
従って、本分野の熟練者にとって、ＥＢＭＡの発現およ
び糖付加のために適当なプロモーターおよびプレーリー
ダー配列を利用するという考えが、適当な酵母宿主域と
してピキア、カンヂダ、ハンセヌラ、トルロプシス、ク
ルベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ） 、お
よびサツカロミコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐ
ｓｉｓ ）属からの種を含みそれに限定されないサツカ
ロミセス科およびクリプトコカス科からの酵母種にまで
拡張することは自明である。
び糖付加のために適当なプロモーターおよびプレーリー
ダー配列を利用するという考えが、適当な酵母宿主域と
してピキア、カンヂダ、ハンセヌラ、トルロプシス、ク
ルベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ） 、お
よびサツカロミコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐ
ｓｉｓ ）属からの種を含みそれに限定されないサツカ
ロミセス科およびクリプトコカス科からの酵母種にまで
拡張することは自明である。
以下の実施例は、本発明を説明するがそれだけに限定す
るものではない。以下の例示中に指摘されている各参照
の開示は、ここに参考として取り入れられている。
るものではない。以下の例示中に指摘されている各参照
の開示は、ここに参考として取り入れられている。
実施例 １
アルファ接合因子遺伝子ＭＦα１がＳ．セレビシエゲノ
ムＤＮＡからプラスミド上にクローンされているプラス
ミドｐＫＨ２はカージャン（Ｋｕｒｊａｎ ）ほか（セ
ル（Ｃｅｌｌ）牙３０巻：９３３頁（１９８２年））お
よびサイン（Ｓｔｎｇｈ ）はか（ヌクレイツク アシ
ッド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｔｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ ）牙１１巻：４０４９頁（１９８３年））
の方法に従って調製される。プラスミドｐＫＨ２がＥｃ
ｏＲＩで消化され、アルファ接合因子遺伝子を運んでい
る１、 ７ ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳
動により精製された（牙１図上段）。プラスミドｐＲＪ
１４８ （Ｈｉｎｄ ＩＩＩ を欠いた修飾ＰＢＲ３
２２）がＥｃｏＲＩ で消化され、その１．７Ｋｂｐ
断月と連結されてプラスミドｐＲＪ １５９を与えた（
１１図中段）。このＤＮＡはＨｉｎｄ ｍで消化され自
己連結されプラスミドｐＲＪ１６７を形成した。これは
今や唯一のＨｉｎｄＩ［ｒ部位を有する（牙１図、下段
）。プラスミドｐＲＪ１６７はＨｉｎｄ Ｉ［ｒで消化
され、合成オリゴヌクレオチド アダプターの挿入によ
り修飾され、プロモーターおよびプレープローリーダー
の３′側でかつ全３種の読み取り枠での翻訳終結シグナ
ルの５′側に唯一のＨｉｎｄｍ部位を含んでいる新プラ
スミド（ｐＲＪ１７８ ）を与える（第１図、下段）。
ムＤＮＡからプラスミド上にクローンされているプラス
ミドｐＫＨ２はカージャン（Ｋｕｒｊａｎ ）ほか（セ
ル（Ｃｅｌｌ）牙３０巻：９３３頁（１９８２年））お
よびサイン（Ｓｔｎｇｈ ）はか（ヌクレイツク アシ
ッド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｔｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ ）牙１１巻：４０４９頁（１９８３年））
の方法に従って調製される。プラスミドｐＫＨ２がＥｃ
ｏＲＩで消化され、アルファ接合因子遺伝子を運んでい
る１、 ７ ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳
動により精製された（牙１図上段）。プラスミドｐＲＪ
１４８ （Ｈｉｎｄ ＩＩＩ を欠いた修飾ＰＢＲ３
２２）がＥｃｏＲＩ で消化され、その１．７Ｋｂｐ
断月と連結されてプラスミドｐＲＪ １５９を与えた（
１１図中段）。このＤＮＡはＨｉｎｄ ｍで消化され自
己連結されプラスミドｐＲＪ１６７を形成した。これは
今や唯一のＨｉｎｄＩ［ｒ部位を有する（牙１図、下段
）。プラスミドｐＲＪ１６７はＨｉｎｄ Ｉ［ｒで消化
され、合成オリゴヌクレオチド アダプターの挿入によ
り修飾され、プロモーターおよびプレープローリーダー
の３′側でかつ全３種の読み取り枠での翻訳終結シグナ
ルの５′側に唯一のＨｉｎｄｍ部位を含んでいる新プラ
スミド（ｐＲＪ１７８ ）を与える（第１図、下段）。
そのＨｉｎｄ ｌｌＪ 部位は、１１ｉｎｄ ＩＩＩ
による消化、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノフ断片によ
る平滑末端化、ＢａｍＨＩリンカ−の添加および自己連
結でプラスミドｐＪＣ１９３を形成することによってｇ
ａｍＨＩ 部位に変換された（第２図、上段）。このプ
ラスミドはＥｃｏＲＩ で消化され、ＤＮＡポリメラー
ゼ■のクレノフ断片により平滑末端化され、Ｂｃｌ■
リンカ−の添加により修飾され、Ｂｃｌ■により消化さ
れ、アルファ接合因子遺伝子を運ぶ１．４ ｋｂｐ断片
が調製用ゲル電気泳動により単離された（第２図、中段
）。こうして出来たＢｃｌ Ｉ断片は次いでＩ）ＣＩ／
１の唯一のＢａｍＨＩ 部位中に挿入されその過程で元
来のＢａｍＨＩ 部位を破壊した（プラスミドｐＪｃ１
９４：第２図、下段）。このＤＮＡはＢａｍＨＩで消化
され、過剰なりａｍＨＩリンカ−を除くために自己連結
された（第２図、下段）。その結果、以下の顕著な性質
を有する新たなアルファ接合因子発現プラスミド（１）
ＪＣ１９７） が創られた： （１） Ｅ 、コリ中
でのプラスミドの選択（ｂｌａ遺伝子）および増幅（ｏ
ｒｉ）のためのＥ、コリ由来の配列、（２） Ｓ ．セ
レビシエ中でのプラスミドの選択（ＬＥＵ２）および増
幅（２−ミクロンＤＮＡ ）のためのＳ．セレビシエ由
来の配列、（３）酵母アルファ接合因子プロモーター、
（４）翻訳産物を粗面小胞体中へ向ける酵母アルファ接
合因子プレーリーダー、（５）Ｎ−グリコジル化シグナ
ル配列をコードし、ＫＥＸ ２および５ＴＥ１３プロテ
アーゼ（遺伝子産物）により解裂される酵母アルファ因
子ブローリーダー（シュリアス（Ｊｕｌｉｕｓ ）ほか
、セル第３２巻：８３９頁（１９８３年）；シュリアス
ほか、セル、１′７３７巻：１０７５頁（１９８４年月
、（６）発現されるべき墨種ポリペプチドのクローン化
のための唯一のａａｍＨＩ部位、（７）全３種の読み取
り枠における翻訳終結配列、（８）酵母転写終結配列。
による消化、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノフ断片によ
る平滑末端化、ＢａｍＨＩリンカ−の添加および自己連
結でプラスミドｐＪＣ１９３を形成することによってｇ
ａｍＨＩ 部位に変換された（第２図、上段）。このプ
ラスミドはＥｃｏＲＩ で消化され、ＤＮＡポリメラー
ゼ■のクレノフ断片により平滑末端化され、Ｂｃｌ■
リンカ−の添加により修飾され、Ｂｃｌ■により消化さ
れ、アルファ接合因子遺伝子を運ぶ１．４ ｋｂｐ断片
が調製用ゲル電気泳動により単離された（第２図、中段
）。こうして出来たＢｃｌ Ｉ断片は次いでＩ）ＣＩ／
１の唯一のＢａｍＨＩ 部位中に挿入されその過程で元
来のＢａｍＨＩ 部位を破壊した（プラスミドｐＪｃ１
９４：第２図、下段）。このＤＮＡはＢａｍＨＩで消化
され、過剰なりａｍＨＩリンカ−を除くために自己連結
された（第２図、下段）。その結果、以下の顕著な性質
を有する新たなアルファ接合因子発現プラスミド（１）
ＪＣ１９７） が創られた： （１） Ｅ 、コリ中
でのプラスミドの選択（ｂｌａ遺伝子）および増幅（ｏ
ｒｉ）のためのＥ、コリ由来の配列、（２） Ｓ ．セ
レビシエ中でのプラスミドの選択（ＬＥＵ２）および増
幅（２−ミクロンＤＮＡ ）のためのＳ．セレビシエ由
来の配列、（３）酵母アルファ接合因子プロモーター、
（４）翻訳産物を粗面小胞体中へ向ける酵母アルファ接
合因子プレーリーダー、（５）Ｎ−グリコジル化シグナ
ル配列をコードし、ＫＥＸ ２および５ＴＥ１３プロテ
アーゼ（遺伝子産物）により解裂される酵母アルファ因
子ブローリーダー（シュリアス（Ｊｕｌｉｕｓ ）ほか
、セル第３２巻：８３９頁（１９８３年）；シュリアス
ほか、セル、１′７３７巻：１０７５頁（１９８４年月
、（６）発現されるべき墨種ポリペプチドのクローン化
のための唯一のａａｍＨＩ部位、（７）全３種の読み取
り枠における翻訳終結配列、（８）酵母転写終結配列。
実施例 ２
該ＥＢＭＡ蛋白は、ウィルスによりコードされる３５０
，０００ダルトンおよび２２０，０００ダルトンの糖蛋
白を表す（クオリテール（Ｑｕａｌｔｉｅｒｅ ）ほか
、ピロロシー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ）牙１０２巻：３６
０頁（１９８４年））。両蛋白の構造遺伝子は同一で、
ＢａｍＨ（−Ｌゲノム性ＤＮＡ断片中に総て含まれてい
る（ハメル（Ｈｕｒｒｍｅｌ ）ほか、ジャーナル オ
ブ ピロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ ）牙４９巻＝４１３
頁（１９８４年））。そのＢａｍＨＩ−Ｌ断片を運ぶＢ
−６８’プラスミドはＸｈｏ［および５ｃａｉで消化さ
れ、ＥＢＭＡ構造遺伝子配列を含む２．５ｋｂｐ断片は
ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノフ断片により平滑末端化
され、調製用アガロースゲル電気泳動により精製された
（矛３図、上段）。アルファ接合因子ベクターｐＪＣ１
９７はＢａｍＨＩ で消化され、ＤＮＡポリメラーゼ■
のクレノフ断片により平滑末端化された。該ＥＢＭＡ断
片はベクターに平滑末端連結された（矛３図、下段）。
，０００ダルトンおよび２２０，０００ダルトンの糖蛋
白を表す（クオリテール（Ｑｕａｌｔｉｅｒｅ ）ほか
、ピロロシー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ）牙１０２巻：３６
０頁（１９８４年））。両蛋白の構造遺伝子は同一で、
ＢａｍＨ（−Ｌゲノム性ＤＮＡ断片中に総て含まれてい
る（ハメル（Ｈｕｒｒｍｅｌ ）ほか、ジャーナル オ
ブ ピロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ ）牙４９巻＝４１３
頁（１９８４年））。そのＢａｍＨＩ−Ｌ断片を運ぶＢ
−６８’プラスミドはＸｈｏ［および５ｃａｉで消化さ
れ、ＥＢＭＡ構造遺伝子配列を含む２．５ｋｂｐ断片は
ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノフ断片により平滑末端化
され、調製用アガロースゲル電気泳動により精製された
（矛３図、上段）。アルファ接合因子ベクターｐＪＣ１
９７はＢａｍＨＩ で消化され、ＤＮＡポリメラーゼ■
のクレノフ断片により平滑末端化された。該ＥＢＭＡ断
片はベクターに平滑末端連結された（矛３図、下段）。
この組換えプラスミド（ｐＹＥＢＶ−１）はＳ．セレビ
シエＩＨ８６８株（木様は、本発明の属する技術の分野
における通常の知識を有する者によく知られており、容
易に入手できる）（ＤＣ６（ＭＡＴα、 １ｅｕ２．
ｈｉｓ４． ｃａｎｌ、 ｇａ１２ ）とも呼ばれる；
カージャンはか、同）に導入され、形質転換クローンが
選択され増幅された。
シエＩＨ８６８株（木様は、本発明の属する技術の分野
における通常の知識を有する者によく知られており、容
易に入手できる）（ＤＣ６（ＭＡＴα、 １ｅｕ２．
ｈｉｓ４． ｃａｎｌ、 ｇａ１２ ）とも呼ばれる；
カージャンはか、同）に導入され、形質転換クローンが
選択され増幅された。
溶菌液が調製され、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳
動されニトロセルロースにウェスタンプロットされた。
動されニトロセルロースにウェスタンプロットされた。
１７５，０００および３５０．０００ダルトン糖蛋白は
、それらが形質転換体にのみ存在すること、それらがエ
プスタイン−バール ウィルス 回復期ヒト血清および
ＥＢＭＡ−特異的モツクローナル抗体（クオリテールほ
か、プロシーヂングス オフ ザ ナショナル アカデ
ミ−オフ サイエンス ＵＳＡ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
、それらが形質転換体にのみ存在すること、それらがエ
プスタイン−バール ウィルス 回復期ヒト血清および
ＥＢＭＡ−特異的モツクローナル抗体（クオリテールほ
か、プロシーヂングス オフ ザ ナショナル アカデ
ミ−オフ サイエンス ＵＳＡ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ）オフ９巻：６１６頁（１９８２年））と反応す
ること、および集積した陰性ヒト血清と反応しないこと
、からＥＢＭＡに特異的であると認められた。
ること、および集積した陰性ヒト血清と反応しないこと
、からＥＢＭＡに特異的であると認められた。
実施例 ３
ＥＢＭＡ糖蛋白の発現はＳ．セレビシエに有毒である
ｐＹＥＢＶ−１形質転換体の生育が１０ミリリットル以
上の体積で試みられたどの場合においても、ＥＢＭＡの
発現は検出されなかった。初期には選択培地平板に撒か
れると培養は基本的に小集落のみを与えたが、細胞が液
体培養における生育の間に平板に撒かれると、非形質転
換対照と同じ大きさの大集落の数が相対的に増加するこ
とが認められた。集落の大きさが大きいことは、細胞の
生育が小集落のものより早いことを反映していた。ウェ
スタンプロットが形質転換体の犬および小集落について
なされたところ、大集落は常にｇＢＭＡを発現しておら
ず小集落は常にＥＢＭＡを発現していた。連続的な生育
の間平板に撒くと大集落の数が増加することは、Ｓ．セ
レビシエに対するＥＢＭＡのネガチブな生理的効果を反
映していた。このネガチブな効果は、発現に対して対抗
する選択圧となり、その結果１０ミリリットル以上の容
量で最終的にポリペプチドの発現が観察されなくなる。
上の体積で試みられたどの場合においても、ＥＢＭＡの
発現は検出されなかった。初期には選択培地平板に撒か
れると培養は基本的に小集落のみを与えたが、細胞が液
体培養における生育の間に平板に撒かれると、非形質転
換対照と同じ大きさの大集落の数が相対的に増加するこ
とが認められた。集落の大きさが大きいことは、細胞の
生育が小集落のものより早いことを反映していた。ウェ
スタンプロットが形質転換体の犬および小集落について
なされたところ、大集落は常にｇＢＭＡを発現しておら
ず小集落は常にＥＢＭＡを発現していた。連続的な生育
の間平板に撒くと大集落の数が増加することは、Ｓ．セ
レビシエに対するＥＢＭＡのネガチブな生理的効果を反
映していた。このネガチブな効果は、発現に対して対抗
する選択圧となり、その結果１０ミリリットル以上の容
量で最終的にポリペプチドの発現が観察されなくなる。
実施例 ４
アルファ接合因子プロモーターは、表現形質がαである
細胞中でのみ活性である（ブレイク（Ｂｒａｋｅ ）ほ
か、モレキュラー アンドセルラー バイオロジー（Ｍ
ｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ）矛３巻：１４４
０頁（１９８３年））。
細胞中でのみ活性である（ブレイク（Ｂｒａｋｅ ）ほ
か、モレキュラー アンドセルラー バイオロジー（Ｍ
ｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ）矛３巻：１４４
０頁（１９８３年））。
Ｓ．セレビシエ中には、他の通常は発現していないａお
よびα情報のコピーの抑制のために必要な蛋白を合成す
る。ＳＩＲとして知られる４遺伝子座がある（ライン（
Ｒｉｎｅ ）他、前出）。ＪＲＹｌ ８８株細胞（ＭＡ
Ｔα、 ５ｉｒ３−８゜１ｅｕ２−３．１ｅｕ２１１２
． ｔｒｐｌ、 ｕｒａ３−５２． ｈｉｓ４）は５Ｉ
Ｒ３遺伝子産物中にｔｓ欠損を含む。その結果、３５℃
で生育したＪＲＹＩ ８８細胞は表現形質がａ／α で
ありアルファ接合因子は活性でない；他方、２３℃で生
育した細胞は表現形質がαであり、従ってアルファ接合
因子プロモーターによって指示される発現を誘導するこ
とができる（ブレイクはか、プロシーヂングス オフ
ザ ナショナル アカデミ−オフ サイエンス ＵＳＡ
第８１巻：４６４２頁（１９８４年））。組換えプ
ラスミドｐＹＥＢＶ−１（牙３図）がＪＲＹ第８８株細
胞中に導入され、形質転換クローンが選択され増幅され
た。３５℃で細胞が生育すると検出可能なＥｉＢＭＡの
合成が完全になくなった。細胞は最初に１リツトルシエ
ークフラスコ中で３５℃で飽和まで生育させられた。こ
の培養は次いで２３℃に平衡化された培地を含む１０リ
ットル発酵槽に、初期開始細胞密度がＡ６ｏｏ”” ０
．１−０．７となるように植えるのに用いられた。酵母
細胞溶菌液のウェスタンプロットにより明らかにされた
膜抗原の合成は、先ず２３℃への温度移行後１２時間以
内で１０−リットル発酵槽中に検出可能となり、２４−
４８時間で最大となり、９６時間までに大きく減少した
。
よびα情報のコピーの抑制のために必要な蛋白を合成す
る。ＳＩＲとして知られる４遺伝子座がある（ライン（
Ｒｉｎｅ ）他、前出）。ＪＲＹｌ ８８株細胞（ＭＡ
Ｔα、 ５ｉｒ３−８゜１ｅｕ２−３．１ｅｕ２１１２
． ｔｒｐｌ、 ｕｒａ３−５２． ｈｉｓ４）は５Ｉ
Ｒ３遺伝子産物中にｔｓ欠損を含む。その結果、３５℃
で生育したＪＲＹＩ ８８細胞は表現形質がａ／α で
ありアルファ接合因子は活性でない；他方、２３℃で生
育した細胞は表現形質がαであり、従ってアルファ接合
因子プロモーターによって指示される発現を誘導するこ
とができる（ブレイクはか、プロシーヂングス オフ
ザ ナショナル アカデミ−オフ サイエンス ＵＳＡ
第８１巻：４６４２頁（１９８４年））。組換えプ
ラスミドｐＹＥＢＶ−１（牙３図）がＪＲＹ第８８株細
胞中に導入され、形質転換クローンが選択され増幅され
た。３５℃で細胞が生育すると検出可能なＥｉＢＭＡの
合成が完全になくなった。細胞は最初に１リツトルシエ
ークフラスコ中で３５℃で飽和まで生育させられた。こ
の培養は次いで２３℃に平衡化された培地を含む１０リ
ットル発酵槽に、初期開始細胞密度がＡ６ｏｏ”” ０
．１−０．７となるように植えるのに用いられた。酵母
細胞溶菌液のウェスタンプロットにより明らかにされた
膜抗原の合成は、先ず２３℃への温度移行後１２時間以
内で１０−リットル発酵槽中に検出可能となり、２４−
４８時間で最大となり、９６時間までに大きく減少した
。
第１図は、プラスミドｐＲＪ１７８の構築を説・明する
模式図である。 第２図は、プラスミドｐＪｃ１９７の構築を説明する模
式図である。 矛３図は、プラスミドｐＹＥＢＶ−１の構築を説明する
模式図である。 図面の１ｙ訂（内容に変更なし） ″ 日日口１ 囮ロロ １１ ｆ 日日口 １口■貝ｌ 手続補正書 １唱和６２年４月２３日 特許庁長官 黒Ｆｎ ０１１雄殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第４４１５１号２
、発明の名称 酵母における組換え蛋白の発現３、補
正をする者 ■件との関係 特許出願人 インコーホレーテッド （２）「図面」
模式図である。 第２図は、プラスミドｐＪｃ１９７の構築を説明する模
式図である。 矛３図は、プラスミドｐＹＥＢＶ−１の構築を説明する
模式図である。 図面の１ｙ訂（内容に変更なし） ″ 日日口１ 囮ロロ １１ ｆ 日日口 １口■貝ｌ 手続補正書 １唱和６２年４月２３日 特許庁長官 黒Ｆｎ ０１１雄殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第４４１５１号２
、発明の名称 酵母における組換え蛋白の発現３、補
正をする者 ■件との関係 特許出願人 インコーホレーテッド （２）「図面」
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、Ｅ．コリ中での選択および増殖のため のＥ．コリ由来の配列、およびクリプトコカス属または
サッカロミセス属の種の中でのプラスミドの選択および
増殖のための酵母由来ＤＮＡの配列、酵母の制御可能な
プロモーターＤＮＡ配列、酵母プレーまたはプレープロ
ーリーダー配列、少なくとも一つの読み取り枠にたいす
る翻訳終結配列、酵母転写終結配列、発現されたときに
宿主に有害となる既に決定されているペプチドまたはポ
リペプチド配列をコードするＤＮＡの配列を挿入するた
めの特定の制限エンドヌクレアーゼクロー ン化部位を含むプラスミド発現ベクター。 ２、既に決定されているペプチドまたはポ リペプチド配列が、サッカロミセス属またはクリプトコ
カス属の種である宿主細胞中で発現されると有害である
、特許請求の範囲第１項によるプラスミド発現ベクター
。 ３、既に決定されているポリペプチドが、 エプスタイン−バールウイルス膜抗原 （ｇｐ３５０／ｇｐ２２０）である特許請求の範囲第２
項によるプラスミド発現ベクター。 ４、プレーリーダーまたはプレープローリ ーダー配列がアルファ接合因子遺伝子から由来する、特
許請求の範囲第２項によるプラスミド発現ベクター。 ５、特許請求の範囲第２項によるプラスミ ド発現ベクターにより形質転換されたサッカロミセス属
またはクリプトコカス属の種。 ６、特許請求の範囲第２項によるプラスミ ド発現ベクターにより形質転換された、ＳＩＲ遺伝子の
一つの遺伝子産物中にｔｓ欠損を含むサッカロミセス属
またはクリプトコカス属の種。 ７、特許請求の範囲第２項によるプラスミ ド発現ベクターにより形質転換された、少なくともＳＩ
Ｒ遺伝子の一つの発現が生理的に制御可能なサッカロミ
セスまたはクリプトコカス属の種。 ８、（１）該属の種細胞を特許請求の範囲第２項による
プラスミドで形質転換する、（２）形質転換した細胞を
培養する、（３）培養した細胞から蛋白を回収する、こ
とからなるサッカロミセス属またはクリプトコカス属の
種である宿主中で発現されると有害である既に決定され
ているペプチドまたはポリペプチドを得る方法。 ９、種がサッカロミセス属からのものであ る特許請求の範囲第８項による方法。 １０、種がＳ．セレビシエである特許請求の範囲第８項
による方法。 １１、該既に決定されているペプチドまたはポリペプチ
ド配列が、エプスタイン−バールウイルス膜抗原（ｇｐ
３５０／ｇｐ２２０）である、特許請求の範囲第８項に
よる方法。 １２、該既に決定されているペプチドまたはポリペプチ
ド配列が、エプスタイン−バールウイルス膜抗原（ｇｐ
３５０／ｇｐ２２０）である、特許請求の範囲第９項に
よる方法。 １３、種がＳ．セレビシエである特許請求の範囲第１２
項による方法。 １４、プラスミドが、糖付加形でのエプスタイン−バー
ルウイルス膜抗原の発現を指示 する特許請求の範囲第８項による方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83508886A | 1986-02-28 | 1986-02-28 | |
| XX835088 | 1986-02-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62244383A true JPS62244383A (ja) | 1987-10-24 |
Family
ID=25268545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62044151A Pending JPS62244383A (ja) | 1986-02-28 | 1987-02-28 | 酵母における組換え蛋白の発現 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0234862A3 (ja) |
| JP (1) | JPS62244383A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0234871A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-12 | Merck & Co. Inc. | Regulatable expression of recombinant proteins in yeast |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3382547D1 (de) * | 1983-01-12 | 1992-05-27 | Chiron Corp | Sekretorische expression in eukaryoten. |
| WO1984004330A1 (en) * | 1983-04-22 | 1984-11-08 | Amgen | Secretion of exogenous polypeptides from yeast |
| EP0561137B1 (en) * | 1983-04-25 | 2002-07-03 | Chiron Corporation | Hybrid DNA Synthesis of Mature Insulin-like Growth Factors |
| US4588684A (en) * | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
| JPS59227899A (ja) * | 1983-05-25 | 1984-12-21 | チロン・コ−ポレイシヨン | 成長ホルモン放出因子の製造方法 |
| US4707358A (en) * | 1984-01-30 | 1987-11-17 | The University Of Chicago | Vaccine against Epstein-Barr Virus |
| EP0173254B1 (en) * | 1984-08-23 | 1991-07-24 | Hans Joachim Wolf | Dna sequences of the ebv genome, recombinant dna molecules, processes for producing ebv-related antigens, diagnostic compositions and pharmaceutical compositions containing said antigens |
| EP0234871A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-12 | Merck & Co. Inc. | Regulatable expression of recombinant proteins in yeast |
-
1987
- 1987-02-19 EP EP87301417A patent/EP0234862A3/en not_active Withdrawn
- 1987-02-28 JP JP62044151A patent/JPS62244383A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0234862A2 (en) | 1987-09-02 |
| EP0234862A3 (en) | 1988-10-05 |
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