JPS6223436A - 人口的微小区画化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は人工的微小区画化に関する。この用語により、
人工的構造物であってそれ自体が新規な形状であり、そ
の周辺膜が天然産生物学細胞の膜要素とのある種の類似
点をもつ人工的構造物が本発明によって提供されること
を知らせようとするものである。物質が微小区画中に閉
じ込められていてもよいそのような構造物の製法も本発
明によって提供される。

発明の背景 生物学細胞膜は、主として燐脂質、コレステロール及び
糖脂質で構成される脂質分子の連続二重層からなる。こ
の二重層はその中に埋め込まれた膜帯白質（糖蛋白質を
含む）のための溶剤と見なしてもよい。細胞膜の特殊な
機能は、細胞膜全体の約２５〜７５％を占めるかもしれ
ないこれらの蛋白質によって主として達成されることが
公知である。

（Ａｌｂｅｒｔｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｒｉｏｌｏ
ｇｙ　ｏｆ　ｄａ＋＋ｃｅｌｌ。

２５５頁以下の“Ｔｈｅ　Ｐｌａｓｍａ　Ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ”の項、Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　
Ｉｎｃ、　、１９８３）。

１９５６年にＣｈａｎｇは、球形の超薄重合体膜からな
り、溶血産物からのヘモグロビン及び酵素の微小液滴を
閉じ込めている“人工細胞”の研究を開始した。蛋白質
、その他の酵素及びその上の物質もその閉じ込めの中に
取り入れることができた。そのような人工細胞は欠陥の
ある細胞機能の可能な代用品又は補充品として用いられ
るかもしれないことが最初に意図されていた。例えば硝
酸セルロースポリマー、ナイロン又はナイロンで架橋さ
れた蛋白質で作ることのできた合成膜は油中水エマルジ
ョンの水性液滴の界面で形成された。（ＣｈａｎｇのＰ
ｕｂｌｎ、Ｎｏ、８２８．八ｍｅｒｉｃａｎ　Ｌｅｃｔ
ｕｒｅ　５ｅｒｉｅｓ中の”Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃ
ｅ１ｌｓ″、発行者Ｃｈａｒｌｅｓ　ＣｏＴｈｏｍａｓ
。

／’？’７．２．４４参照のこと）。

しかしながら、上記の“人工細胞”における膜は天然産
の生物学膜又はそれらの構成成分とは構造的にほとんど
似ていない。何故ならば、前者の場合には、その膜は界
面成層によって及び／又は共有結合によって一体に保持
された連続分子構造から実質的になるからである。また
、そのような“人工細胞”に関して、合成物質の使用で
遭遇する問題としては、身体がその使用された多くの物
質を生分解することができないこと及び微小循環を澄ま
せるように十分に小さいカプセルを作ることができない
こと、があることが８忍められてきている。（Ｐｉｔｔ
等、Ｒｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ
ｙ。

２２：３３５９．１９８３年）。

対照として、（例えば）生物学細胞膜の組み立ては、各
々の適した分子がその最も低い化学ポテンシャルの状態
を探索する熱力学プロセスとして起こり、そしてこのこ
とは疎水性効果に導く。このことが実際に意味すること
は、その適した分子中の疎水性部分が水性媒体によって
はじかれそしてむしろ比較的弱い結合を形成するように
相互に引き付けられることである。更に、表面と平行に
整列されている分子層から作られている合成膜とは違っ
て、生物学膜中の両親媒性腺状ポリマーの長軸は膜平面
に対して垂直に配置されている。それゆえに、前者では
、壁の幅は添加したポリマーの量に依存するが、生物学
膜の幅は定型的である。

疎水性効果は例えば洗剤分子からのミセルの生成の原因
となり、この場合に疎水性炭化水素鎖は水によってはじ
かれそして星状構造の中心で結び付き、その多くの突出
部は親水性の極性末端基によって表される。了解される
ように、本発明の細胞状構造は物質を閉じ込めてもよい
空洞をもつので、ミセルと同じではない。

この疎水性効果は水中の燐脂質のリポソーム構造の原因
ともなり、この場合に球形細胞状形状の燐脂質の同心二
重層が形成され、燐脂質の内側層中の極性基は内部水性
媒体に向かって突出しそして燐脂質の外側層中の極性基
は水性媒体本体に向かって外向きに突出し、一方各々の
分子中の非極性の疎水性部分は球形環として相互に向か
い合って配置される。（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００：１０
１２〜１０１Ｂ、１９７８年中のＴａｎｆｏｒｄの報文
“Ｔｈｅ　）ｌｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　　Ｅｆｆｅｃｔ
ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌ
ｉｖｉｎｇ　Ｍａｔｔｅｒ”、及び前記のへ１ｂｅｒｔ
ｓ等の報文）。リポソームは比較的こわれやすい構造で
あることが注目されるであろう。例えば、それらは温和
な洗剤によって又はある種の血しょう成分にさらすこと
によってさえも破壊されることができ（Ｇｒｅｇｏｒｄ
ｉａｄｉｓ　　及びＡｌ１１ｓｏｎ　Ｑ、Ｊｏｈｎ　Ｗ
ｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　、１９８０年発行の“Ｌ
ｉｐｏｓｏｍｅ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ　”、　１７９〜２０９頁を参照のこと）、こ
れに対して本発明の微小区画の膜はこれらの条件下でも
安定である。

米国特許第４，２８５，８６２号には、均質な両親媒性
゛蛋白質部分からなる蛋白質ミセル水性分散液を沈降さ
せることによって調製された、実質的に本性が変えられ
ておらずそして脂質のない無定型蛋白質単離物が記載さ
れており、この場合に、その分散液は（主として）　　
ＮａＣ１、Ｎ　ａ　Ｃ１２□またはＮａＨ，ＰＯ４を用
いて、塩溶及び希釈析出法によって、普通には植物源の
蛋白質から得られたものである。

本発明の微小区画は、分子構造に基づくだけではなく特
性によっても、公知の産業的マイクロカプセルからも区
別される。後者に関して、（Ｊ、Ｖａｎ−ｄｅｇａｅｒ
ｖ４、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９７４年発行の
Ｍｉｃｒｏｅｎ−ｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｃｅ
ｓｓｅｓ　　ａｎｄ　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’　
　、　９５頁に）“総ての場合に、これらのマイクロカ
プセルの閉じ込め壁は外部及び内部の分子に対して可能
な限り不透過性に作られており、そしてその閉じ込めら
れている物質は、そのマイクロカプセル壁が破裂されて
その閉じ込められている物質を解放する時にのみ作用す
ることができる”ことが述べられている。

膜研究における多数の有機溶剤の有用性は文献に講評さ
れてきている。ｎ−ブタノールは、良好な抽出剤であり
そしてその抽出された蛋白質に対して最も少ないｔ貴書
を及ぼすことの両方について、一連のアルコールよりも
優っているが、それにもかかわらずそれは抽出された蛋
白質のそのすぐ後の伏集についての困難に導くことが特
に言及された。この講評はまた両親媒性バイオポリマー
及び特に膜蛋白質の分離及び単離法の無いことを特に言
及した。（Ｚａｈｌｅｒ及びＮ１ｇｇ１ｉ　編、Ｐｌｅ
ｎｕｍＰｒｅｓｓ　、　１９７７年発行のＭｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏ−１ｏｇｙ、第８
巻、１〜５０頁の“Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｏｒｇａ−
ｎｉｃ　５ｏｌｖｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ”）　ｅこの文脈において、リポ蛋白
質複合体からの酵素及びその他の蛋白質のための特に有
用な溶剤抽出剤であるｎ−ブタノールは、温度と反比例
して変化する水への溶解度をもつことが特に言及されて
もよい。

動物組織からの酵素の抽出についての早期の文献には（
Ｍｏｒｔｏｎ　、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　ｓ　１　：２５〜４１．１９５５）、多数
の興味のある特色が一言されている。本発明の主題の背
景に関する限りにおいては、これらは、蛋白質の水性抽
出に対して種々の塩の注目に値する“塩溶”効果がある
ことであり、陰イオンの溶剤力は中性又はアルカリ性ｐ
ｌ！ではＰｚＯ５＞８４０７＞　ＰＯ４＞　ｓ＋、Ｎ＞
Ｈｃｏ３＞　ｒ　＞ＣＩ！の順序でそして酸性ｐＨでは
クエン酸イオン〉酢酸イオンの順序で小さくなる。

Ｈａ　ｔｅｆ　ｉ及びＨａｎｓｔｅｉｎは（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　　Ｓ、　　６２　：　１１２９〜３６．１９６９
）　、水への非極性基の移動を助けるカオトロピックイ
オンは膜及び多成分酵素を分解するのに並びに粒状蛋白
質及び非電解質の水への溶解度を増加させるのに有効で
あることを見出だしている。この効果は当該イオンが水
の構造を非常に無秩序な方向に変えることに起因すると
言われた。チオシアネートイオンは種々のバイオポリマ
ーに対して最も大きな解離及び可溶化効果をもつことが
見出だされてきており、一方硫酸イオン、弗化物イオン
及び酢酸イオンは殆ど効果をもたない。同じ著者は更に
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ＸＸＸ
Ｉニア７０〜９０．１９７４においてカオトロピックイ
オンによる膜の不安定化を解説している。彼等はほとん
どの場合における有効性の減少順序を次のように見出だ
した：ＣＢｒ３ＣＯＯ＞ＣＣＩ　５ｃＯＯ＞ＳＣＮ＞グ
アジニウム＞　Ｔ　＞　ＣＩ　Ｏａ〉Ｃｔ＋ＣＩ２２Ｃ
Ｑ（１＞　ＮＯ３＞　Ｂ　ｒ　＞ＣＦ、ＣＯＯ＞ＣＨ２
ＣｌＣＯＯ、又彼等は、（とりわけ）カオトロープは強
力な本性変性剤であり、その上に膜脂質自動酸化を開始
させ、この自動酸化は巨大な破壊的ポテンシャルをもつ
（何故ならば蛋白質は自動酸化生成物例えばマロンアル
デヒドによって変成されるからである）ことを指摘した
。

本発明の目的は、木質においてはＴａｎｆｏｒｄの疎水
性効果の概念と一致するが、文献に今までに記載された
両親媒性構造のいずれからも構造的に完全に異なってい
る有用で新規な物質を提供することである。

この点で、Ａｌｂｅｒｔｓ等は（上記引用文中、１２７
〜８頁）、高分子自己組み立ての範囲についての解説の
終わりで、“細胞中の総ての構造物が、たとえそれらが
構成部分に解離されているとしても、自発的に再組み立
てできるとはかぎらない”と述べていることが特に言及
される。

しかしながら、本発明のその上の目的は、上記の見解に
よりこの可能性でキャストされていると考えられる不確
かさにもかかわらずに、天然産生物学細胞膜の高分子成
分の大部分が微小区画の周辺膜Ｍｉ織を形成するように
再構成されている微小区画を提供することである。

本発明の更にその上の目的は、微小区画であってその膜
が（産業的マイクロカプセルとは違って）半透性であり
、高分子単位（多くの場合に蛋白質）で構成されており
、（蛋白質が合成ポリマーで架橋されているか又は合成
ポリマーの表面上に吸着されていなければならない“人
工細胞°とは違って）非共有結合によって一体に保持さ
れており、そして（中心空洞をもたないミセルとは違っ
て）中心空洞内に種々の物質を閉じ込める能力をもつ、
微小区画を提供することである。

本発明の更にその上の目的は、新規な物質、即ち微小区
画であるが、しかしながらそのＭｉ織物質が蛋白質又は
その他の天然産物質に限定されるものではない微小区画
の調製法を提供することである。

本発明の更にその上の目的は、後記されているように、
後記で定義されるような適した高分子物質を、所定の特
性をもつ有機溶剤とカオトロピックイオンとの混合物と
反応させることによる、本発明の微小区画の調製法を提
供することである。

本発明のその他の目的は、高分子物質を上記したような
有機溶剤とカオトロピックイオンとの混合物の作用に会
わせることによる高分子物質の可溶化法を提供すること
である。

疎水性効果に従って公知なこと及び上記した細胞高分子
再組み立てにたいする明らかな制限を考慮し、そして更
に水性媒体中での両親媒性分子の構造について文献で公
知なこと、即ちそれらは特にリポソームに関してミセル
又は二重層のいずれかを形成することが公知であること
も考慮すると、配向された細胞状構造物を本発明に従っ
て得ることができたとこは驚きと見なされなければなら
ない。このことは、米国特許第４，２８５，８６２号に
おいては実質的に脂質を含まない蛋白質の順序だてて配
置された構造が沈降の前にはミセルの構造であったこと
をはっきりと理解する時に、一層の驚きでさえある。

カオトロピックイオンと有機溶剤との混合物を利用する
こともまた、文献で公知である事項から実質的に逸脱し
ている。何故ならば、蛋白質及び酵素の単離法は多年に
ねたうて研究されてきているが、このような組み合わせ
が実行可能な計画として示唆されてきていないからであ
る。実際、チオシアネートイオンとｎ−ブタノールとの
好ましい混合物に関しては、別々に取り上げられた各々
の方法は、上記したように、ある種の有用性の分野に加
えて、相殺する破壊的不都合をもつ限りにおいて、文献
はそのような組み合わせの可能性を教示しているとは考
えられない。

本発明のその上の目的、利益、及び有用な用途は以下の
記載から明らかであろう。

発明の要旨 従って、本発明は、蛋白質物質の再組み立てによって人
工的に調製されそして実質的に高分子の層から成る周辺
膜によって境界が定められている半透性微小区画であっ
て、その各々の高分子が比較的現水性の部分及び比較的
疎水性の部分を含み、又その膜を形成している上記の高
分子の大部分が、それらの比較的親水性の部分がその微
小区画から外側に向けられそしてそれらの比較的疎水性
の部分が１数十区画の内部に向かって内側に向けられた
状態で配置されている、半透性微小区画を提供する。言
い換えれば、両親媒性線状ポリマーの長軸は膜表面に対
して垂直に配置されており、それ故に、膜の幅は定型的
である。微小区画を後記の方法によって調製する時には
、膜層中の実質的に総ての高分子が、それらの比較的親
水性の部分及び比較的疎水性の部分が上記のように配向
された状態で配置されることがしばしば見出だされてい
る。

本発明の方法の過程において、微小区画が組織されつつ
ある過程にある時には、微小区画は一般的に球形７′あ
り、疎水性媒体がその中心空洞を占めている。もしもそ
の媒体がその他の比較的不溶性の懸濁物質、又はその他
の溶解物質さえも含存しているならば、これらもまたそ
の球形空洞中に溶解及び／又は懸濁して存在することが
見出だされる。例えば透析によるようにして、疎水性媒
体が除去されるにつれて、その上の懸濁物質又は溶解物
質が存在するかどうかに拘わらずに、その球形は漸進的
に陥没するかもしれない。しかしながら、そのようなそ
の上の物質が空洞中に存在するならば、それらはもとの
微小区画よりも小さい容積中に濃縮され、それでそのよ
うな微小区画の形状は環状円盤の中心空間に挿入されて
適合している球形の形状になるという結果になる。何故
ならば、環状円盤は概して球形のもとの周辺の外縁（こ
のような外縁は媒体中にもともと懸濁され及び／又は溶
解されていたその他の物質を閉じ込めない）の陥没によ
って形成されるからである。

本発明の微小区画は特異な特性をもち、そして特にそれ
らは安定で半透性であり、そしてすでに暗示されている
ように、それらはその他の分子を閉じ込めるという興味
深くて有用な能力をもっことが見出だされている。リポ
ソームとは違って、本発明の微小区画は非常に安定であ
る。従って、それらは温和な洗剤に耐え、そして凍結乾
燥された状態で保存することができ、その結果再懸濁さ
せた時にそれらはそれらの十分な活性を再開することが
でき、一方周辺組織の選択透過性を保持している。

本発明の微小区画の寸法は広い範囲で変わることができ
る。従って、それらの全径は約０．１〜約１００μの範
囲であることができ、そして周辺の膜の厚さは一般的に
は約１００〜約１０００人の範囲である。その基礎膜の
幅は定型的であり、それは構成成分の量ではな（て性質
に依存する。

微小区画組織を構成する物質については、これらは、適
切な高分子がそれらの構造中に比較的疎水性の部分及び
比較的親水性の部分を含むことを条件にして広い範囲か
ら選ぶことができる。

本発明の一実施態様においては、微小区画の周辺組織を
形成する高分子は蛋白質分子を含む。本発明の他の実施
態様においては、高分子は糖蛋白質分子を含む。本発明
の更にその上の実施態様においては、高分子は少なくと
も２種の蛋白質分子、糖脂質分子及び糖蛋白質分子を含
む。蛋白質出発分子は、例えば、蛋白質を生産するため
の細菌の巧みな操作の結果として生じる生産物、例えば
ウィルス抗原決定基又は細胞表面レセプターまたは抗体
のような、バイオテクノロジーの生産物から得られる。

しかしながら、他の方法としては、そしてこれは微小区
画の組織の一層好ましい源であり、蛋白質及び／又は糖
脂質及び／又は糖蛋白質は天然産細胞の嘆中に存在し、
それらを天然産細胞の膜から抽出しそして本発明の方法
に従って配向させる。本発明のこの一層好ましい実施態
様を実施する時には、もとの細胞壁の燐脂質内容物は今
度は微小区画の空洞内に含まれることが見出されている
。しかしながら、本発明は、周辺組織が例えば蛋白質の
みで、又は糖蛋白質のみで形成されている時の本明細書
に記載の微小区画、並びに周辺組織が蛋白質、糖脂質及
び糖蛋白質の任意の２種又は３種の総てから誘導されて
いる微小区画に等しく関係しそして等しく包含すること
が強調されなければならない。

微小区画周辺組織の源として天然産細胞膜を利用する時
には、これらは、例えば、赤血球、種々の真核細胞又は
原核生物細胞の膜に起源をもつ。

天然産細胞膜のもとの蛋白質物質の約９０％のような多
量が本発明の方法によって再構成され得ることが実際に
見出だされている。

既に示されているように、本発明の微小区画のＭｉ織は
、カゼイン、卵白、全血液、又はその成分（例えば、ア
ルブミン、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、免疫グロ
ブリン）のような蛋白質に冨んだ９通の源のような、又
は、例えば、高分子が合成ポリマー分子を含むもののよ
うな、適した任意の物質で構成される。特に適した合成
ポリマーは比較的現水性のポリマーを比較的疎水性の残
基に結合させることによって生じるものである。

周辺組織の原料は不溶性高分子のみに限定されるもので
はないことに留意すべきである。例えば、普通には可溶
性蛋白質と考えられているものの内のあるものは、本発
明に従って膜構造を引き受けることもできることが見出
だされている。

本発明の微小区画の特に有用な特性は、その調製過程に
おいて、非常に多種類の不溶性物質を取り囲んで微小区
画を形成し、そのことによりその不溶性物質は微小区画
によって閉じ込められ、それで微小区画の空洞内に含有
されることである。

例えば、調製媒体中に懸濁した磁性粒子はその空洞内に
閉じ込められるようになり、従って一態様においては有
用な分析用具を生じさせ、他の態様においては微小区画
中に更にＤＮＡを閉じ込めそしてこれを細胞壁に侵入さ
せることを可能にする磁性をもちいることによって遺伝
子転移を可能にし、そして更に他のＣ，様においては微
小区画を単離することのできる好都合で融通性のある技
術を提供する。

この閉じ込めの特性は、例えば（ａ）ａ環境の疎水性の
徐々の変化によって可溶性反応体の相互作用を容易にす
るために粒状触媒を取り囲んで仲介物層を発生させるこ
とによる不均一触媒現象、又は（ｂ）ポリスチレンビー
ズが微小区画によって包み込まれており、その膜が特殊
な細胞集団の細胞表面マーカーを含有している、細胞診
断用基準、に応用されてもよい。

微小区画は特殊なリガンド、例えばホルモンのためのレ
セプターを含有する膜で構成されてもよい。この場合に
は、微小区画は次の用途に用いることができる：　（ａ
）固定量の標識ホルモンとの競合によるリガンド、例え
ば血清中のホルモン量、の検定、又は（ｂ）レセプター
に対する自己免疫応答を引き出すためのレセプター含有
膜での免疫化、その結果として、（ｉ）　レセプターに
結合させることにより細胞を刺激するか、又は（１１）
レセプターをマスキングすることによりホルモン作用を
抑制するかのいずれかの抗体が作られる。この態様にお
いては、例えば、微小区画の膜が抗原を提供するその微
小区画中にアジュバントを含ませることによって、免疫
化を増強させるために結合ワクチン構成することができ
る。他の態様においては、抗体を閉じ込める微小区画を
ホルモン又は医薬の免疫検定法にもちいてもよい。

本発明のその上の実施態様においては、微小区画は、可
溶性であるか又は不溶性であるかの蛋白質物質でその蛋
白質物質が既に枚目体中に含まれているか含まれていな
いかの蛋白質物質を閉じ込める、即ち濃縮するかあるい
は含有する、ために用いてもよい。これらの蛋白質物質
は天然産でもよく、例えば、それらはもともと天然細胞
の一部を形成しているものでもよい。蛋白質物質はある
いはまた合成によって、又はバイオテクノロジー法によ
って人工的に作られていてもよく、そしてそれらもまた
そのような方法によって作られた蛋白質の一部でもよい
。バイオテクノロジー法は、例えば、前記で示したよう
な細菌の巧みな操作を利用するものでもよい。

本発明の更にその上の実施態様は、微小区画の膜が酵素
又はアポ酵素を閉じ込めているものである。本発明のこ
の実施Ｂ様の多くの用途は、例えば、酵素に基づく診断
、治療又は商品生産のように、当業者には自明である。

これらの方法の幾つかは、アポ酵素が最初に微小区画中
に閉じ込められていること、及び補酵素が後の段階で微
小区画の半透膜を通しての移動によって取り入れられる
ことを必要とする。単なる例示として、微小区画中に閉
じ込められる酵素又はアポ酵素はアルカリ性ホスファタ
ーゼ、アスパラギナーゼ、カタラーゼ、コレステロール
オキシダーゼ、コリンエステラーゼ、アポ−グルコース
オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、ウレアーゼ、グリセロール燐酸オキシダーゼ及び
ウリカーゼからなる群から選ばれてもよい。

本発明のその上の有用な実施態様においては、微小区画
の周辺膜は薬学的に共存性の物質で組み立てられそして
薬理学的に活性な物質を閉じ込める。この実施態様は、
所望の部位にねらいをつけることを可能にする有益な医
薬解放法を提供する。

広範囲の薬学的に活性な物質を利用することができる。

それらは例えば抗菌活性、抗真菌活性、駆虫活性、抗炎
症活性、抗癌活性、中枢又は抹消神経系活性、鎮痛活性
、局所麻酔活性、麻酔活性又は抗うつ活性をもつことが
でき、あるいはそれらは心臓病の治療に有用な特性をも
つことができる。

他の態様としては、薬理学的に活性な物質は免疫変調活
性、例えば免疫刺激活性又は免疫抑制活性をもつことが
できる。免疫変調化合物の例はロイコトリエン及びイン
ターロイキンであり、一方シクロスポリンＡは免疫抑制
活性をもつ化合物の特定例である。一実施態様において
は、微小区画はワクチンを含有することができる。

薬理学的に活性な物質を含有する微小区画は、前記した
ように、適した担体又は希釈剤も含む薬学的組成物の一
部を成してもよく、そしてそのような組成物は本発明の
一部を成してもよく、担体又は希釈剤の少なくとも一部
は１種以上の薬理学的に活性な物質と共に微小区画中に
閉じ込められてもよいことは明らかである。そのような
薬学的組成物は好ましくは吸入又は吹き込みによる投与
、又は経口、非経口又は直腸投与に適した形態に構成さ
れ、そしてそれらは−回量剤形であってもよい。そのよ
うな薬学的組成物の非限定例としては、例えば、本発明
のｉＤ小区画中に閉じ込められておりそして非経口投与
に適した媒体中に懸濁されている抗炎症性ステロイドが
炎症の部位に好都合に向けられることが挙げられる。

本発明のこの用途、即ち標的化、は次のように説明され
る。非経口投与ルートの制限は一般的に周知である。注
入された小嚢はもっばら網内皮糸によって吸収される。

しかしながら、この現象は、医薬を特定的にマクロファ
ージ中に解放することが望ましいならば、大きな利益と
考えることができる。グルココルチコイドはそのような
標的化についての優秀な候補である。それらはマクロフ
ァージ機能の全般的なアテニュエーターと考えることが
できそして炎症治療の選択医薬であることを示す。しか
しながら、ステロイド治療は、周知のように、ステロイ
ドは疎水性の小さな分子であるので注入は総ての組織中
に一様に分配されることになるという事実に起因して、
副作用の不利益をこうむる。しかしながら、それらを本
発明の微小区画内に閉じ込めることはそれらの治療イン
デックスを数桁増加させることができる。同様にマクロ
ファージ中に向けられるその他の治療剤は次のものであ
るニ ゲルコースオキシダーゼ（これは過酸化水素を作る）の
様なマクロファージの活性化剤、又は公知のマクロファ
ージ活性化因子；及び 網内皮糸中に住む細胞内寄生虫に対する医薬、例えば菌
感染に対するアムフォテリシンＢ６多くの場合に、遊離
医薬の慣用の投与は副作用を引き起こし、このことはそ
の実際の投与範囲を厳格に制限する。例えば、上記のア
ムフオテリシンＢは高度に腎臓毒性である。免疫抑制医
薬シクロスポリンＡの実際の投与はその腎臓毒性によっ
て同様に制限される。同様に、遊離形態で慣用的に投与
される時には望ましくない副作用が抗癌剤によって示さ
れる；例えば、シスプラチンは腎臓毒性でしかも神経毒
性であり、一方デキソルビシンは心臓毒性である。その
ような場合には、本発明に従って医薬を閉じ込めること
は（例えば腎臓毒性の場合に）糸球体ろ過を避けそして
傷つきやすい組織への利用を低下させることを助けるべ
きである。微小区画化によって達成される差別的な分配
はそれ故に毒性の減少及び多くの薬理学的活性物質の有
効性の増加を導く。

本発明のその上の実施態様においては、微小区画の周辺
膜は食べられる物質で構成されていてもよく、そしてそ
れと共存できる栄養素又は物質を閉じ込めていてもよい
。膜は栄養になる蛋白質物質で構成されていてもよく、
そしてまた栄養になる蛋白質物質を含有していてもよい
という事実は全く別にして、その半透特性はこの特定の
利益、即ち食品調味料及び精油のような揮発性物質が長
時間にわたって徐々に解放されること、をもつ。

無論、本発明の微小区画は食品調味料及び精油だけでな
く、１種以上の概して疎水性の物質をも閉じ込めていて
もよい。

上記したように、微小区画の半透性周辺膜により徐々に
解放されるという特性は揮発性食品成分の徐々の解放に
限定されるものではない。例えば、成長調節活性、又は
除草、殺菌、殺ダニ又は殺虫活性をもつＴｈ質をそれら
の環境に徐々に解放することはその他の理由で十分に望
ましく、そして本発明はそのような活性をもつ物質を含
有する微小区画も包含する。実際、揮発性物質を徐々に
解放するという半透性膜の特性はフェロモンの使用によ
る昆虫の生物学的防除の分野に特に有用な用途があり、
その有用性は現時点ではそれらの揮発特性によって制限
されることが考察される。

半透性周辺膜により揮発性物質が徐々に解放されること
に基礎を置く本発明の更にその上の存用的な実施態様は
香料組成物の分野にある。従って、本発明はまた、周辺
膜が香料組成物又は香料濃厚組成物を閉じ込めている、
本明細書で定義したような微小区画を包含する。

周辺膜の選択透過性の更にその上の重要性は、膜が比較
的高分子量の１種以上の反応体を閉じ込めておりそして
比較的低分子量の反応体がその膜を通過して入ることを
許す、ということである。

反応がこの微環境中で、通常の大環境中では一般的に達
成できない非常に高い反応体濃度で生じることができる
ことは明らかである。従って、本発明に従って、本明細
書で定義した微小区画中に閉じ込められている少なくと
も約６０００の分子量をもつ高分子物質反応体を適した
媒体中で約１０００までの分子量をもつ物質と反応させ
る化学反応の実施法も提供される。

以下余白 膜の構造 すでに述べたように、本発明の微小区画の膜は特定の態
様で配向されている高分子の層からなる。

無論、本発明はこの層の一層詳しい構造に関して何らか
の理論によって制限されるものではないが、それにもか
かわらず、少なくともある種の場合には、その層は単分
子であると思われる。

従って、例えば、本発明に従って調製された、ヒト赤血
球（ＩＩＲＢＣ）ゴースト又はマウス腫瘍細胞のいずれ
かからの、微小区画の再構成膜の電子顕微鏡写真は約２
００人の幅の構造を明らかにした。例えば第３Ｃ図及び
第３Ｄ図を参照のこと。この発見は膜高分子によって発
生された国有の細胞外被の寸法と一敗する。（評論文献
として、Ｌｕｆｔ、　Ｉｎｔ。

Ｒｅｖ、　Ｃｙｔｏｌ、　４５：２９１〜３８２　、１
９７６の“Ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ　Ｐｒｏ
ｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｒｆａ
ｃｅ　Ｃｏａｔ”を参照のこと）。

同様に、カゼインから調製された再構成膜は約１００人
の幅をもち（第５Ｂ図を参照のこと）、これは個々のカ
ゼイン分子の概算長さにほぼ一致する（Ｗａｕｇｈ等、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　９ニアＢ６〜９５．１９
７０）。

本発明の製法 本発明に従って、比較的親水性の部分及び比較的疎水性
の部分を含む高分子物質を、水中のカオトロピックイオ
ンと水とは完全には混和しない透析されうる有機溶剤と
の均質混合物の可溶化作用に会わせ、必要ならば又は所
望ならばその混合物をろ過又は遠心分離に会わせ、微小
区画先駆物質を含む微小球を形成させ、そしてその有機
溶剤及びカオトロピックイオンを透析除去することを含
む、本明細書で定義した微小区画の調製法が１是供され
る。

ある場合には、高分子物質は可溶化作用によって完全に
溶解され、それで任意工程のろ過又は遠心分離工程は不
要であるかもしれない。しかしながら、不溶性物質が混
合物中に残っている時には、次のような方法で処理され
てもよい。微小区画が混合物に存在する不溶性物質を閉
じ込めることが望ましくない場合には、その混合物を前
記の微小球の形成の前にろ過または遠心分離して不溶性
物質を除去すべきであり、あるいは他の方法としてろ過
又は遠心分離工程を省いてもよい。微小区画がその混合
物中に存在する可溶性物質を閉じ込めること、又は微小
区画が微小球の形成の前に添加される可溶性物質を閉じ
込めることのいずれかが望まれる時には、”ろ過又は遠
心分離工程を原論実施する。微小区画がその混合物中に
存在するもの以外の不溶性物質を閉じ込めることが望ま
れる時にも明らかなようにろ過又は遠心分離工程を実施
する；この場合には、そのような不溶性物質はろ過又は
遠心分離工程の後に好都合に添加される。

調製法においては、透析工程は透析バッグ中で行なって
もよい。透析に先だって、その混合物を微小球の微分割
を確実にするために、例えば超音波手段によるような激
しい撹拌に会わせることが好ましい。有機溶剤は例えば
４．５又は６個の炭素原子を含有する脂肪族アルコール
でありうる。

ｎ−ブタノールの使用は特に好ましい。好ましいカオト
ロピックイオンはＣＣ１、Ｃ００−及び−５ＣＮである
。

本発明の方法においては、そのプロセスにおいて約２０
〜約５０％　−／Ｖの濃度のカオトロピックイオン水溶
液及び有機溶剤を実質的に等容量部で用いることが特に
有益であると見出されている。

微小球が形成される工程に関しては、有機溶剤がその水
溶性が温度の上昇と共に低下するもの（例えばｎ−ブタ
ノール）であるならば、その時には微小球の形成を、温
度を上昇させることによって、及び／又はその溶液を水
で稀釈させることによって実施する。逆に、有機溶剤が
その水溶性が温度の上昇と共に増加するものであるなら
ば、その時には微小球の形成を、温度を低下させること
によって及び／又はその溶液を水で稀釈させることによ
って実施する。

本発明の方法で用いる有機溶剤の水溶性は温度と共に変
化するが、いずれの場合にも微小球の形成は水によるそ
の溶液の稀釈によって助けられる。

一方、ｎ−デカノールのような実質的に不混和性の有機
溶剤を水の代りにその抽出物に加えるならば、油中水エ
マルジョンが生成し、周辺膜が比較的疎水性の部分が微
小区画の外側に向けられておりそして比較的親水性の部
分が微小区画の内側に向けられている高分子を含む、逆
相の微小区画が形成される。本発明は前記の方法のこの
変更も包含する。

更に、本発明は、比較的親水性の部分及び比較的疎水性
の部分を含む高分子物質を、水中のカオトロピックイオ
ンと水とは完全には混和しない透析されうる有機溶剤と
の均質混合物の作用に会わせ、そして必要ならば又は所
望ならばその混合物をろ過又は遠心分離に会わせること
による、核高分子物質の可溶化法を提供する。この方法
によって有用に可溶化され得る不溶性高分子物質は、例
えば、細菌における遺伝子工学によって得られた蛋白質
物質の凝固物である。

以下の実施例は本発明を例示するためのものであって本
発明を限定するものではない。

以下余白 実　　　施　　　例 諸実施例で用いた源物質のリストを下記する：Ａ、チオ
シアネート原？夜は５００ｇのＮａ５ＣＮ　・２Ｈ２０
を蒸留水６００ｍｌ１中に溶解させることによって得ら
れる。

Ｂ、　　Ｉ−リクロロアセテート原液は室温、ｐＨ７，
０で飽和のＣＣ１２、、ＣＯＯＮａ水溶液からなる。

Ｃ，ヒト血清アルブミン（ＩＩｓＡ）原液は静脈内注射
用の塩の少ない２５％無菌溶液である（ＭａｇｅｎＤａ
ｖｉｃｌ　Ａｄｏｍ、イスラエル）。

Ｄ、ヒトヘモグロビン原液：ヒトの血液５−を生理的食
塩水で洗い、そしてその赤血球ベレットを低張ＰＢＳ、
即ち蒸留水で６：ｌで稀釈した燐酸緩衝溶液、の冷溶液
３２．５ｍｊ２で溶血した。そのヘモグロビン含存上澄
を集め、次いで高速遠心分離によってゴーストを沈積さ
せた。

ｍｌ：チオシアネート及びｎ−ブタノールの混合物を用
いてのＩＩＲＲｃゴーストからの膜の可溶化及び再構成
。

ＨＲＢＣゴーストを、ＰＢＳで２回洗ったヒトの血液０
．５ｍｆｆから調製した。そのＨＲＢＣペレットを冷低
張ＰＢＳ中に２回再懸濁させ、そしてその溶面上澄を捨
て、次いで高速遠心分離した。そのベレットを氷バスケ
ット中に保った。これらのＨＲＢＣゴーストを、チオシ
アネート原液１ｍＩ！＋ｎ−ブタノール１ｍ／＋蒸留水
３ｍ７！からなる冷抽出溶液５　ｍＡの添加によって溶
解させた。低温で約１５分間混合した後、そのゴースト
抽出物を透析バッグに移した。そのバッグを、３７℃の
蒸留水を収容している５０ｍｊ２の試験管中に入れ、そ
の結果相分離がバッグ内で起った。そのバッグの入って
いる試験管を、その内容物を一定のエマルジョン状態に
保つために１１００ｒｐの速度で回転させた。温かい蒸
留水を１５分毎に交換し、４回の交換の後に、更に数時
間３７℃の蒸留水に対して透析するために、そのバッグ
を２ｅの三角フラスコに移した。その水を交換し、そし
て透析を低温で一晩続けた。チオシアネート及びｎ−ブ
タノールの両方とも透析法によって容易に除去された。

透析が進行するにつれて、疎水性液滴が消失し、そして
微小区画が形成された。位相差顕微鏡写真を第１図に示
す。

実施±叉：有核細胞及び固体組織からの再構成膜の調製 ５Ｘ１０’個のマウス腹水腫瘍（ＥＬ−４又はエールリ
ッヒ腹水）細胞、又は５Ｘ１０’個のマウス肺臓細胞を
用いて、実施例１で記載した方法に正確に従った。唯一
の違いは、膜の可溶化が低温で完了された後に、低温で
のわずかの遠心分離によって核を除去したことであった
。同じ方法を細分した固体組織に適用した。これらの総
ての場合に、再構成膜は光学顕微鏡下では、第２Ａ、２
Ｂ及び３Ａ〜３Ｄ図に示されているように、ｌ（ＲＢ　
Ｃゴーストから調製されたものと同様に見えた。

Ｍ：　トリクロロアセテート及びｎ−ペンタノールの混
合物を用いての、ＨＲＢＣゴーストからの膜の可溶化及
び再構成。

抽出ン容液がｎ−ペンタノール０．３　ｍｌ　＋トリク
ロロアセテート原液１．５　ｍｊ２＋蒸留水２．７ｍβ
からなるものであった以外は、実施例１の方法に正確に
従った。他の違いは、この場合には低温での１５分間の
インキ二一ベーションの後に蒸留水２ｍｌを添加するこ
とによって相分離を行なったことであった。簡単に混合
した後に、そのエマルジョンを透析バッグに移し、そし
て実施例１で記載したように操作を続けた。

１隻炭土：ソニケーション（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）に
よる一層小さな再構成膜の調製及びその中でのヘモグロ
ビンのン農縮 ゴーストのベレットを、ｎ−ブタノール１　ｍｌ＋チオ
シアネート原ｌｉｍｂ＋ヒトヘモグロビン原液３ｍｌの
冷混合物によって可溶化したヒトの血液１．７１から調
製した。この膜抽出物＋可溶性蛋白質を、次のスケジュ
ールに従って、ＭＳＥソニケーター、モデル６０Ｗ、４
１度１．７アンペアの使用によって超音波処理に会わせ
た：４５秒間のソニケーション、この間にその混合物は
温められ、相分離が起り、そして微細エマルジョンが生
成された。その次の９０秒間のソニケーションの間に、
蒸留水９　ｍｌを滴下し、そして次いでソニケーション
を更に４５秒間実施した。その全懸濁液を透析バッグに
移し、そして低温の蒸留水に対して完全な透析に会わせ
た。その生成微小区画は次の点で実施例１で得られたも
のとは異なっていた：それらは一層小さく　（直径は１
５μの代りに約２μである）、そして最初には遊離して
いたヘモグロビンの約９５％が微小区画内に閉じ込めら
れていた。言い換えれば、可溶性蛋白質の約５０倍の濃
縮が起っていた。

丈丘侃】：糖脂質抗原の表面発現 実施例１又は４に従って調製された再構成周辺膜をもつ
微小区画はその表面に、もとの細胞と同し血液型抗原を
表現する。例えば、Δ型の）ＩＲＢＣゴーストから調製
された膜は、抗〜Ｂ抗体によってではなくて抗−Ａ抗体
によって凝集するようになり、そして第４Ａ及び４Ｂ図
によって表わされているように、逆の場合も同じである
。

大流±工：蛋白質抗原の表面発現 実施例２に従って、（Ｃ５７ｂ　６マウスで生じた）Ｐ
Ｌ−４細胞から調製した再構成周辺膜を持つ微小区画は
それらの表面に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原を
表現する。即ち、それらは、後で蛋白ｆｆ−７Ｂｓ持細
菌にさらすことによって求められるように、抗−ト２４
抗血清にではなくて抗−Ｈ−２ｂ抗血清に特定的に結合
する。

天ＩＬＬ：モザイクに偵た周辺膜をもつ微小区画の発生 実施例１に従って血液型Ａ及び血液型Ｂの細胞から別々
に膜抽出物を調製し、そしてそれらの抽出物を、再構成
相に先立って、低温で混合した。

その生成膜はＡＢ供与体から調製されたものと同様に挙
動する。即ち、抗−Ａ又は抗−Ｂのいずれかの抗血清と
一緒でのインキューベーション及びそれに続く蛍光第二
抗体での染色に際して、その微小区画周辺膜は表面で均
質に染色された。

次差■１：免疫原性 Ｂａ　ｌ　ｂ／ｃマウスからの傷ついていない胸腺細胞
、又は実施例２に従ってそのような細胞から調製した再
構成周辺膜をもつ微小区画をＡＫＲ／Ｊマウスに注入し
た。各々の場合に、Ｂｏｙｓｅ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓＭｅｄ、　Ｒｅｓ、　１０　：　３９．１９６４）に
よって測定して、同じ力価の抗ｔｈｙ−１，２抗体が得
られた。

ｌＬ［Ｌｌ−：表面レセプターの発現、及び磁性粒子の
含有 再構成膜をもつ微小区画を、実施例２に従ってシチメン
チョウの赤唾球ゴーストから調製した。

次の検定において（洗浄工程において）好都合であると
いう理由で、ちっぽけな磁性粒子を抽出混合物中に含有
させた〔２％Ｗ／Ｖの磁性酸化鉄を含有したｎ−ブタノ
ール（ＴＭＯ−Ｎ２３２５、パーキュレス社）〕。再構
成の後には、これらの磁石含有膜は、本来の細胞と同様
に、インシュリンに特定的に結合することが見出だされ
た。その検定を、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ等によって記載され
た方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ。

１００：ｌ？２．１９７７）に従って実施した。

夫施侃土ユニ卵白成分からの微小区画の調製分嶋＋７二
での卵白１ｇを低温でｎ−ブタノール２　ｍＡ＋チオシ
アネート原′／ｅ、２ｍｌ！と混合した。次いで冷蒸留
水５　ｍ！！を加え、そしてその全体を低ｌ詰で十分に
混合した。ソニケーターモデルＷ−３７５（Ｉ（ｅａｔ
　５ｙｓｔｅｎ＋ｓ　ｔｌｌｔｒａｓｏｎｉｃ　Ｉｎｃ
、）を、出力調節セットのステップ６で用いて、次のス
ケジュールに従って超音波処理を実施した：微細エマル
ジョンを得るための最初の１分間のソニケーション、次
いでソニケーションを続けながら、冷蒸留水１８ｍ＃を
３０秒間にわたって徐々に加え、そしてソニケーション
を更に１分間続けた。その懸濁液を透析バッグに移し、
そして１２時間毎に水を交換しながら２日間低温で透析
した。その生成物は、再構成周辺膜をもつ、直径２〜５
μの球形微小区画を含むことが見出だされる。

去旌±上上二卵白から調製された微小区画内の油状物質
の含有 最初の冷水５ｍ７！の添加の前に油状物質０．１ｍＡを
卵白抽出混合物に加えた以外は、実施例１０に従って微
小区画を卵白成分から調製した。大豆油、又は大豆油で
５：ｌに稀釈されたレモングラス油のいずれかを０．１
ｉ用いた。十分に混合した後、冷蒸留水５ｍｌを加え、
そのプロセスを前記したように続けた。直径約５μのそ
の生成微小区画は内在化した油状液滴としてその油状物
質を含有する。レモングラス油を含有する微小区画の場
合には、その典型的な奥の持続した解放が達成された。

実施炎上層：カゼインからの微小区画及びその内での可
溶性蛋白質の濃縮 カゼインは“水に及び非極性有機溶剤にほんのわずかし
か溶解しない”ことが知られている（ＴｈｅＭｅｒｃｋ
　Ｉｎｄｅｘ　、第１０版、１９８３．２６３頁）。し
かしながら、カゼインはカオトロピックイオンの水溶液
＋有機溶剤の混合物中には容易に溶解する。

カゼイン（本質的にビタミンを含まない、シグマ）０．
１ｇをチオシアネート原液２．５ｍｆ＋Ｈ−ブタノール
２．５ｍｊ２の冷混合物中に溶解させた。冷蒸留水５ｍ
ｌを加え、そしてその全体を低温で混合した。

次いで超音波処理を実施例１０で記載したように正確に
実施した。約１〜約１０μの直径をもつ球形の陥没して
いない微小区画が生じた。最初の蒸留水５ｍｉの内の１
　ｍ１以上を等容量のヒトヘモグロビン原液で置き換え
る時には、分光測光的に求めてヘモグロビンの少なくと
も９０％が微小区画内に濃縮された。燐酸残基がカゼイ
ン分子の親水性部分に濃縮されるに従って、これらの再
構成膜はカルシウムイオンの添加で凝集された。第５Ａ
及び５Ｂ図はそのような少量のヘモグロビンを閉じ込め
ているカゼイン微小区画を示している。

去犯炎上主：生体共存性生体分解性高分子からの微小区
画の調製及びその中への水不溶性ステロイドの閉じ込め （１１、１７）　−１７−エチルチオ−９−フルオロ−
１１−ヒドロキシ−１７−メチルチオアンドロスタ−１
，４−ジエン−３−オン１０ｍｇを、チオシアネート原
液５ｍｊ！＋ｎ−ブタノール５　ｍｊ＋の混合物中に溶
解させ、そして低温で保存した。ヒトヘモグロビン原液
２　ｒｓｌを添加し、混合し、次いでヒト血清アルブミ
ン原液４　ｍｌを添加した。次いでトウモロコシ油０．
２　＋＋Ｊを添加し、そしてその全体を十分に混合した
。ソニケーターモデルＷ−３７５（前記参照）を用い、
次のスケジュールに従って超音波処理を実施した：出力
調節セットのステップ１０での５０秒間のソニケーショ
ン、その最後の２０秒間に冷莫留水３０＋ｎ４を添加し
た。上記のセントを次いでステップ６に変えそしてソニ
ケーションを更に５０秒間続け、その最初の２０秒間に
冷蒸留水を更に３０ｍ６添加した。その得られた直径約
１μの油含有微小区画を低温で蒸留水に対して完全な透
析に会わせた。

トウモロコシ油をその系から省いた時には、チオシアネ
ート及びｎ−ブタノールが稀釈され、透析で除去される
に従って、ステロイド結晶の沈澱物が発生した。しかし
ながら、トウモロコシ油含有系においては、沈澱物は観
察されなかった。このことはステロイドが油相中に分配
されそしてその中に溶解したことを示す。第６図はヒト
ヘモグロビン及びヒト血清アルブミンからなるトウモロ
コシ油含有微小区画の電子顕微鏡写真を示している。

災！上土二本来の膜蛋白質の回収及び再構成微小区画中
でのそれらの保持された配向 ４Ｘ１０９個の新たらしいＩＩ　ＲＢ　ＣをＰＢＳで十
分に洗浄し、そして１ｍＭのトリニトロベンゼンスルホ
ネート（ＴＮＢＳ）と−緒に３７℃で３０分間温装した
。そのような条件下では、トリニトロフヱニル（ＴＮＰ
）残基が表面蛋白質の露出アミノ基及びスルフヒドリル
基に共有結合するようになり、一方試薬の細胞内侵入は
無視できる。膜蛋白質の全集団がＴＮＰによって変性さ
れるので、それは全般的な蛋白質マーカーであると考え
ることができる（Ｂｏｎｓａｌｌ及びＨｕｎｔ、　Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　２４９：
２８１．１９７１）。その細胞を次いでＰＢＳで（３回
）洗浄し、そして２つの等部分に分けた。次いで、外部
的に露出されたＴＮＰ残基の定量測定を下記の方法に従
って、第一群の傷のついていない細胞について実施した
。第二群の細胞からゴーストを調製し、可溶化し、そし
て実施例１に従って処理した。ＩｇＧ及びＩｇＭのよう
な高分子に対して不透過性である再構成膜を同じＴＮＰ
定量測定に会わせた。

加えて、対照の細胞及び対照の膜を、ＴＮＢＳを省いた
以外は同じ処理を受けたＨ　ＲＢ　Ｃから調製した。表
面に露出したＴＮＰ残基の定量測定を次のようにして実
施した：有限量の細胞又は膜を、増加濃度のラビット抗
−ＴＮＰ血清の存在下で１時間温置した。

（５回）洗浄した後に、その調製物を１１２５標識Ｉｇ
Ｍ及びＩｇＧモノクロチール抗体（詳細については５ｔ
ｅｉｎｉｔｚ等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　、　５４：２７３．１９８２を参照のこと）と−緒に
１時間温間し、再び（５回）洗浄し、そしてその結合し
た放射能を計数した。その結果は第７図に示されている
。最初に標識された蛋白質の少なくとも９０％が回復さ
れそして再構成微小区画のそれらの膜中で適切に配向さ
れるようになることが理解できる。

去隻五土工：再構成膜は選択透過性である。

再構成膜が選択透過性であることは、一方では可溶性蛋
白質についての研究から、そして他方では小分子量染料
分子の研究からすでに明らかであった。インシュリン分
子（分子量約６０００）は微小区画の再構成膜によって
閉じ込められて保持されることができ、一方、分子量約
１０００の染料であるエバンス・ブルーは自由に透過で
きる。この特定の染料は特に興味のあるものである。な
ぜならばそれは蛋白質に対して高い親和性をもつからで
ある。その現象を更に定量するために、ヘモグロビン含
有再構成微小区画を実施例４に従って調製した。再構成
の前、又はプロセスが完了した後のいずれかで種々の濃
度のエバンス・ブルーを加えた。

後者の場合には、微小区画をその染料と一緒に２４時間
温置きせておいた。その両方の調製物を次いで十分に洗
浄し、その閉じ込められた染料を１％のドデシル硫酸ナ
トリウムで処理することによって解放させ、そして分光
測光的に求めた（６０５ｎｍ）。その２つの系の間には
差異は見出だされなかった。即ち染料はその閉じ込めら
れた蛋白質に自由に近ずく。

去血炭土工：蛋白質分解酵素に対する感応性再構成膜は
、生物学膜を溶解しそしてリポソームを破壊する条件下
で、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ＮＰ−４０
のような温和な洗剤又はデオキコレートでの処理に耐え
るが、それらは蛋白質分解酵素によって分解されうる。

実施例４に従って調製したヘモグロビン含有微小区画を
０．２５％トリプシン溶液と一緒に温間しく３０分間、
３７℃）、ヘモグロビンを周りの媒体へ解放させた（第
８Ａ、８８図を参照のこと）。この発見はまた、微小区
画化蛋白質は凝固されなかったが、可溶形態で存在する
という事実を指摘する。

本発明の特定の実施態様を上記してきたが、多くの変更
及び改良をなしうろこと、及び従って本発明はそのよう
な実施態様に限定されるものではなく、むしろ本発明の
範囲は特許請求の範囲によって定められることは当業者
には明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に従って調製された、ＨＲＢＣゴー
ストから再構成された微小区画の４５０倍位相差顕微鏡
写真である。その全般的な形状は陥没した球形の形状で
ある。その薄暗い“ボタン状物”は内部に閉じ込められ
た燐脂質二重層である。 第２Ａ図は実施例２に従って調製された、ＥＬ−４細胞
から再構成された微小区画の４５０倍位相差顕微鏡写真
である。。その全般的な形状は陥没した球形の形状であ
る。その薄暗い“ボタン状物”は内部に閉じ込められた
燐脂質二重層である。 第２Ｂ図は実施例２に従って調製された、Ｅｌ−４細胞
から再構成された部分的に陥没した微小区画の３７５０
倍走査型電子顕微鏡写真である。 第３Ａ図は実施例２に従って調製された、エールリッヒ
腹水（ＥＡ）細胞から再構成された微小区間の４５０倍
位相差顕微鏡写真である。その全般的な形状は陥没した
球形の形状である。その薄暗い“ボタン状物”は内部に
閉じ込められた燐脂質二重層である。 第３Ｂ図は実施例２に従って調製された、ＥＡ細胞から
再構成された微小区画を通り抜ける横断面の２９２５０
倍電子顕微鏡写真である。その構造は内部同心二重層を
含む陥没した球形の構造である。 第３Ｃ図及び３Ｄ図は第３Ｂ図と同じ微小区画の、ただ
し２２５０００倍の異なった横断面を示している。微小
区画の陥没していない部分の表面層の幅は、微小区画の
陥没した部分を表わす“尾状部”の幅の半分であること
に注目される。 第４Ａ図は実施例４に従って血液型Ａの）ＩＲＢｃから
調製された、ヘモグロビンを閉じ込めている微小区画の
４５０倍位相差顕微鏡写真である。その凝簗は抗−Ａ抗
血清と一緒にしてのインキューベーションによって引き
起こされた。 第４Ｂ図はインキューベーションを抗−Ｂ抗血清の存在
下で実施したこと以外は第４Ａ図と同じものを示してい
る。 第５Ａ図は実施例１２に従ってカゼインから再構成され
た、少量のヘモグロビンを閉じ込めている微小区画の４
５０倍位相差顕微鏡写真である。この場合には、微小区
画が陥没していないことが注目される。 第５Ｂ図は第５Ａ図に示された調製物の、ネガ的に色付
けされた９００００倍電子顕微鏡写真である。 第６図は実施例１３に従って調製され、ネガ的に色付け
された、トウモロコシ油を閉じ込めている生体共存性微
小区画の２００００倍電子顕微鏡写真である。 第７図は表面露出ＴＮＰ残基の滴定曲線である。 その上の詳細については実施例１４を参照のこと。 第８Ａ図は実施例４に従って調製され、蛋白質分解酵素
の不存在下で３７℃で３０分間温置きれた、閉じ込めら
れたヘモグロビンを含有するｍ小区画の４５０倍位相差
顕微鏡写真である。 第８Ｂ図はインキューベーションを０．２５％トリプシ
ンの存在下で実施した以外は第８Ａ図と同じものを示し
ている（実施例１６を参照のこと）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、蛋白質高分子の再組み立てによって人工的に調製さ
   れそして実質的に該高分子の層から成る周辺膜によって
   境界が定められている半透性微小区画であって、その各
   々の高分子が比較的親水性の部分及び比較的疎水性の部
   分を含み、又その膜を形成している上記の高分子の大部
   分が、それらの比較的親水性の部分がその微小区画から
   外側に向けられそしてそれらの比較的疎水性の部分が微
   少区画の内部に向かって内側に向けられた状態で配置さ
   れている、半透性微小区画。 ２、該高分子の実質的に総てが上記のように配置されて
   いる、特許請求の範囲第１項記載の微小区画。 ３、概して球形である、特許請求の範囲第１又は２項記
   載の微小区画。 ４、概して部分的に陥没している球形である、特許請求
   の範囲第１又は２項記載の微小区画。 ５、概して環状円盤の中心空間に挿入されて適合してい
   る球形である、特許請求の範囲第１又は２項記載の微小
   区画。 ６、約０．１〜約１００μの全径をもつ、特許請求の範
   囲第３〜５項のいずれかに記載の微小区画。 ７、約１００〜約１０００Åの壁厚をもつ、特許請求の
   範囲第３〜６項のいずれかに記載の微小区画。 ８、該高分子が蛋白質分子を含む、特許請求の範囲第１
   〜７項のいずれかに記載の微小区画。 ９、該高分子が糖蛋白質分子を含む、特許請求の範囲第
   １〜７項のいずれかに記載の微小区画。 １０、該高分子が少なくとも２種の蛋白質分子、糖脂質
   分子及び糖蛋白質分子を含む、特許請求の範囲第１〜７
   項のいずれかに記載の微小区画。 １１、膜が天然産細胞膜中に含まれている物質から誘導
   されたものである、特許請求の範囲第８項〜１０項のい
   ずれかに記載の微小区画。 １２、膜が真核細胞又は原核生物細胞から誘導されたも
   のである、特許請求の範囲第８〜１０項のいずれかに記
   載の微小区画。 １３、膜が全血液、赤血球膜、カゼイン又は卵白の諸成
   分中に含まれている物質から誘導されたものである、特
   許請求の範囲第８〜１０項のいずれかに記載の微小区画
   。 １４、膜が天然産細胞膜中の蛋白質物質の約９０％を含
   有している、特許請求の範囲第１１〜１３項のいずれか
   に記載の微小区画。 １５、膜が燐脂質を閉じ込めている、特許請求の範囲第
   １〜１４項のいずれかに記載の微小区画。 １６、膜が１種以上の磁性粒子を閉じ込めている、特許
   請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の微小区画。 １７、膜が不活性ビーズを閉じ込めている、特許請求の
   範囲第１〜１６項のいずれかに記載の微小区画。 １８、膜が抗体を閉じ込めている、特許請求の範囲第１
   〜１７項のいずれかに記載の微小区画。 １９、膜が天然産又は人工的に製造された蛋白質物質を
   閉じ込めている、特許請求の範囲第１〜１７項のいずれ
   かに記載の微小区画。 ２０、膜が酵素又はアポ酵素を閉じ込めている、特許請
   求の範囲第１〜１７項のいずれかに記載の微小区画。 ２１、膜が対応する補酵素と共にアポ酵素を閉じ込めて
   いる、特許請求の範囲第２０項記載の微小区画。 ２２、膜表面が特定のリガントを提示する、特許請求の
   範囲第１〜２１項のいずれかに記載の微小区画。 ２３、膜表面がホルモンレセプター、抗原、抗体及び酵
   素からなる群から選ばれた１種以上の物質を提示する、
   特許請求の範囲第２２項記載の微小区画。 ２４、膜が薬学的に共存性の物質からなりそして薬理学
   的に活性な物質を閉じ込めている、特許請求の範囲第１
   〜２３項のいずれかに記載の微小区画。 ２５、薬理学的に活性な物質が抗炎症特性をもつ、特許
   請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ２６、薬理学的に活性な物質がステロイドである、特許
   請求の範囲第２５項記載の微小区画。 ２７、薬理学的に活性な物質が抗癌特性をもつ、特許請
   求の範囲第２４項記載の微小区画。 ２８、薬理学的に活性な物質がシスプラチンである、特
   許請求の範囲第２７項記載の微小区画。 ２９、薬理学的に活性な物質がドキソルビシンである、
   特許請求の範囲第２７項記載の微小区画。 ３０、薬理学的に活性な物質が中枢神経系活性をもつ、
   特許請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ３１、薬理学的に活性な物質が末梢神経系活性をもつ、
   特許請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ３２、薬理学的に活性な物質が鎮痛活性をもつ、特許請
   求の範囲第２４項記載の微小区画。 ３３、薬理学的に活性な物質が局所麻酔活性をもつ、特
   許請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ３４、薬理学的に活性な物質が麻酔活性をもつ、特許請
   求の範囲第２４項記載の微小区画。 ３５、薬理学的に活性な物質が抗うつ活性をもつ、特許
   請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ３６、薬理学的に活性な物質が抗菌活性をもつ、特許請
   求の範囲第２４項記載の微小区画。 ３７、薬理学的に活性な物質が抗真菌活性をもつ、特許
   請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ３８、薬理学的に活性な物質がアムフォテリシンＢであ
   る、特許請求の範囲第３７項記載の微小区画。 ３９、薬理学的に活性な物質が駆虫活性をもつ、特許請
   求の範囲第２４項記載の微小区画。 ４０、薬理学的に活性な物質が心臓病の治療に有益な特
   性をもつ、特許請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ４１、薬理学的に活性な物質が免疫変調活性をもつ、特
   許請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ４２、薬理学的に活性な物質が免疫刺激活性をもつ、特
   許請求の範囲第４１項記載の微小区画。 ４３、薬理学的に活性な物質が免疫抑制活性をもつ、特
   許請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ４４、薬理学的に活性な物質がロイコトリエンである、
   特許請求の範囲第４１項記載の微小区画。 ４５、薬理学的に活性な物質がインターロイキンである
   、特許請求の範囲第４１項記載の微小区画。 ４６、薬理学的に活性な物質がシクロスポリンＡである
   、特許請求の範囲第２４項記載の微小区画。 ４７、薬理学的に活性な物質がワクチンである、特許請
   求の範囲第２４項記載の微小区画。 ４８、膜が食べられる物質で構成されておりそしてそれ
   と共存できる栄養素又は物質を閉じ込めている、特許請
   求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の微小区画。 ４９、膜が食品調味料物質を閉じ込めている、特許請求
   の範囲第４８項記載の微小区画。 ５０、膜が除草活性、殺菌活性、殺ダニ活性又は殺虫活
   性をもつ物質を閉じ込めている、特許請求の範囲第１〜
   １７項のいずれかに記載の微小区画。 ５１、膜が成長調節活性をもつ物質を閉じ込めている、
   特許請求の範囲第１〜１７項のいずれかに記載の微小区
   画。 ５２、膜がフェロモンを閉じ込めている、特許請求の範
   囲第１〜１７項のいずれかに記載の微小区画。 ５３、膜が１種以上の疎水性物質を閉じ込めている、特
   許請求の範囲第１〜１７項のいずれかに記載の微小区画
   。 ５４、膜が香料組成物又は香料濃厚組成物を閉じ込めて
   いる、特許請求の範囲第１〜１７項のいずれかに記載の
   微小区画。 ５５、膜が粒状触媒を閉じ込めている、特許請求の範囲
   第１〜１７項のいずれかに記載の微小区画。 ５６、膜が１種以上の少なくとも約６０００の分子量を
   もつ反応体高分子物質を閉じ込めている、特許請求の範
   囲第１〜２１及び５５項のいずれかに記載の微小区画。 ５７、特許請求の範囲第１〜２１及び５５項のいずれか
   に定義されているような微小区画中に閉じ込められてい
   る１種以上の少なくとも約６０００の分子量をもつ反応
   体高分子物質を適した媒体中で約１０００までの分子量
   をもつ物質と反応させる、化学反応の実施法。 ５８、酵素又はアポ酵素がアルカリ性ホスファターゼ、
   アスパラギナーゼ、カタラーゼ、コレステロールオキシ
   ダーゼ、コリンエステラーゼ、アポ−グルコースオキシ
   ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
   ウレアーゼ、グリセロール燐酸オキシダーゼ及びウリカ
   ーゼからなる群から選ばれたものである、特許請求の範
   囲第２０項記載の微小区画。 ５９、酵素又はアポ酵素がグルコースオキシダーゼであ
   る、特許請求の範囲第５８項記載の微小区画。 ６０、比較的親水性の部分及び比較的疎水性の部分を含
   む蛋白質高分子物質を、水中のカオトロピックイオンと
   水とは完全には混和しない透析されうる有機溶剤との均
   質混合物の可溶化作用に会わせ、必要ならば又は所望な
   らばその混合物をろ過又は遠心分離に会わせ、微小区画
   先駆物質を含む微小球を形成させ、そしてその有機溶剤
   及びカオトロピックイオンを透析除去することを特徴と
   する、特許請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の
   微小区画の調製法。 ６１、比較的親水性の部分及び比較的疎水性の部分を含
   む蛋白質高分子物質を、水中のカオトロピックイオンと
   水とは完全には混和しない透析されうる有機溶剤との均
   質混合物の可溶化作用に会わせ、必要ならば又は所望な
   らばその混合物をろ過又は遠心分離に会わせ、微小区画
   先駆物質を含む微小球を形成させ、そしてその有機溶剤
   及びカオトロピックイオンを透析除去することを特徴と
   する、特許請求の範囲第１５〜５６、５８及び５９項の
   いずれかに記載の微小区画の調製法であって、該微小区
   画によって閉じ込められることが望まれるあらゆる可溶
   性又は不溶性の物質が最初の反応混合物中に存在してい
   るか又は場合によって実施されるろ過又は遠心分離工程
   の後に添加されることを更に特徴とする調製法。 ６２、比較的親水性の部分及び比較的疎水性の部分を含
   む蛋白質高分子物質を、水中のカオトロピックイオンと
   水とは完全には混和しない透析されうる有機溶剤との均
   質混合物の作用に会わせ、そして必要ならば又は所望な
   らばその混合物をろ過又は遠心分離に会わせることを特
   徴とする、該蛋白質高分子物質の可溶化法。 ６３、透析工程を透析バッグ中で実施する、特許請求の
   範囲第６０又は６１項のいずれかに記載の方法。 ６４、透析に先立って、微小球の微分割を確実にするた
   めに混合物を激しい撹拌に会わせる、特許請求の範囲第
   ６０、６１又は６３項のいずれかに記載の方法。 ６５、激しい撹拌が超音波手段によって実施される、特
   許請求の範囲第６４項記載の方法。 ６６、有機溶剤が４、５又は６個の炭素原子を含有する
   脂肪族アルコールである、特許請求の範囲第６０〜６５
   項のいずれかに記載の方法。 ６７、脂肪族アルコールがｎ−ブタノールである、特許
   請求の範囲第６６項記載の方法。 ６８、カオトロピックイオンが＾−ＳＣＮまたはＣＣｌ
   ＿３ＣＯＯ＾−である、特許請求の範囲第６０〜６７項
   記載の方法。 ６９、約２０〜約５０％Ｗ／Ｖの濃度のカオトロピック
   イオン水溶液及び有機溶剤を実質的に等容量部で用いる
   、特許請求の範囲第６０〜６８項のいずれかに記載の方
   法。 ７０、有機溶剤がその水溶性が温度の上昇に従って低下
   するものであるか又は増加するものであるかのいずれか
   に依存して、微小球の形成をそれぞれ温度を上昇させる
   か又は低下させることによって、及び／又は水溶液を水
   で希釈することによって実施する、特許請求の範囲第６
   ０、６１及び６３〜６９項のいずれかに記載の方法。 ７１、比較的親水性の部分及び比較的疎水性の部分を含
   む高分子物質を、水中のカオトロピックイオンと水とは
   完全には混和しない透析されうる有機溶剤との均質混合
   物の可溶化作用に会わせ、必要ならば又は所望ならばそ
   の混合物をろ過又は遠心分離に会わせ、実質的に水と不
   混和性の有機溶剤の添加及びそれに続く油中水エマルジ
   ョンの発生によって微小区画先駆物質を含む微小球を形
   成させ、そしてその有機溶剤及びカオトロピックイオン
   を実質的に不混和性の有機溶剤中に透析除去することを
   特徴とする、周辺組織が特許請求の範囲第１項で定義し
   た方向とは逆の方向にむけられた比較的親水性の部分及
   び比較的疎水性の部分をもつ蛋白質高分子で形成されて
   いる微小区画の調製法。 ７２、実質的に不混和性の有機溶剤がｎ−デカノールで
   ある、特許請求の範囲第７１項記載の方法。 ７３、実質的に明細書に記載したような、特許請求の範
   囲第６０〜７２項のいずれかに記載の方法。 ７４、実質的に実施例のいずれかに記載したような、特
   許請求の範囲第６０〜７２項のいずれかに記載の方法。 ７５、特許請求の範囲第６０、６１及び６３〜７４項の
   いずれかに記載の方法によって製造された微小区画。 ７６、活性成分として特許請求の範囲第２４〜４７項の
   いずれかに記載の微小区画中に閉じ込められた１種以上
   の薬理学的に活性な物質を、担体又は希釈剤と共に含む
   医薬組成物。 ７７、担体又は希釈剤の少なくとも一部が１種以上の薬
   理学的に活性な物質と共に微小区画中に閉じ込められて
   いる、特許請求の範囲第７６項記載の医薬組成物。 ７８、１回量剤形となっている、特許請求の範囲第７６
   又は７７項のいずれかに記載の医薬組成物。 ７９、経口投与、非経口投与、直腸投与、吸入による投
   与又は吹き込みによる投与に適した形態に構成されてい
   る、特許請求の範囲第７６〜７８項のいずれかに記載の
   医薬組成物。 ８０、実質的に明細書に記載したような、特許請求の範
   囲第７６〜７９項のいずれかに記載の医薬組成物。 ８１、実質的に実施例のいずれかに関して記載したよう
   な、特許請求の範囲第７６〜７９項のいずれかに記載の
   医薬組成物。 ８２、実質的に明細書に記載したような、特許請求の範
   囲第１〜５６、５８、５９及び７５項のいずれかに記載
   の微小区画。 ８３、実質的に図面のいずれかに関して記載したような
   、特許請求の範囲第１〜５６、５８、５９及び７５項の
   いずれかに記載の微小区画。 ８４、実質的に実施例のいずれかに関して記載したよう
   な、特許請求の範囲第１〜５６、５８、５９、及び７５
   項のいずれかに記載の微小区画。 ８５、周辺膜が本質的に該高分子の単分子層からなる、
   特許請求の範囲第１〜５６、５８、５９、７５、及び８
   ２〜８４項のいずれかに記載の微小区画。 ８６、実質的に明細書に記載したような、特許請求の範
   囲第５７項記載の方法。 ８７、合成重合体高分子の再組み立てによって人工的に
   調製されそして実質的に該高分子の層から成る周辺膜に
   よって境界が定められている半透性微小区画であって、
   その各々の高分子が比較的親水性の部分及び比較的疎水
   性の部分を含み、又その膜を形成している上記の高分子
   の大部分が、それらの比較的親水性の部分がその微小区
   画から外側に向けられそしてそれらの比較的疎水性の部
   分が微少区画の内部に向かって内側に向けられた状態で
   配置されている、半透性微小区画。 ８８、該合成重合体高分子が、比較的親水性の重合体を
   比較的疎水性の残基に結合させることによって生じたも
   のである、特許請求の範囲第８７項記載の微小区画。