JPS62228277A - エレクトロポレ−シヨン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の行頭〕 技術分野 本発明は、エレクトロポレーション技術に関する。さら
に具体的には、本発明は、エレクト臼ボレーションによ
って植物プロトプラスト中に外来遺伝子を導入り゛る方
法の改良に関する。換言すれば、本発明は、外来）真仏
物質を包有する植物プロ１−プラス１〜の製造法に関り
る。

植物細胞中にＲＮ高分子を導入Ｊ−ることは、細胞内で
のｍ　ＲＮΔの機能を研究するための有用な手段である
。このことは、自己増殖能を持つｒｎ　ＲＮ　Ａ　、た
どえばプラス鎖ＲＮＡウィルスのゲノムＲＮΔ、の場合
に特にいえることである。また、ＤＮＡ分子を植物細胞
中に導入Ｊることは、（ＩＩ′ｉ物細胞中で発現しうる
遺伝子の検出または遺伝子の機能に関する研究、ひい（
は植物細胞の形質転１９！　Ｊｊよび分子的側面からの
改良に有用な手段である。

そして、上記のＪ：うな理学的な観に（に加えて、農学
的観点からｂこの技術は有用である。植物ｌ１を改変し
て外来遺伝子の形質を持たけるためには、外来遺伝子を
植物細胞中に導入づる必要があるからである。

先行技術 植物細胞中に外来遺伝子を導入する方法には、現在のと
ころ二種類が知られている。すなわｊ５、アグロバクテ
リウムを仲介としてＴｉプラスミド（またはその一部）
を外来遺伝子用ベクターとして使用する方法、および植
物プロトプラス１〜へ外来遺伝子を直接導入する方法、
である。

これらの二種類の方法のうち、前者は、外来遺伝子導入
という目的に対して間接的な手段であるという生得の問
題点の外に、特に単子葉植物への遺伝子導入が一部のも
のでしかできないことならびに遺伝子をＴｉプラスミド
上の特定の部分に導入するまでの手順が複雑であること
、等の欠点がある。

一方、後者の直接導入法は、植物付に制限がなくしかし
操作が簡と１１ぐあるという要請に近づいたものである
という点で、有意桟なものである。しかしながら、従来
慣用されている直接導入法は、必ずしも満足すべきもの
ではなかった。すなわち、植物細胞はそれをプロトプラ
ストの形にしても外来遺伝子の導入が不十分であるので
、導入促進剤どしてポリエチレングリコール、ポリビニ
ルアルコール、ポリカブ−Ａンボリマー等の合成高分子
を使用Ｊることが必要であるが、そのような手段を講じ
てもなお遺伝子導入効率が低く、また使用する合成高分
子のブ［１ドプラストへの副作用があること、等の問題
があったからである。さらに、直接導入法の他の例とし
てマイクロイレジ１クシヨン法があるが、この方法にら
扱える細胞数が少ないという問題があった。

最近に至−）で、このにうな薬品処理によらないで物即
的手段ｒ−逍伝物質を導入づる直接導入法、！Ｊへわも
電気パルスににる方法、が開発された。

この電気パルスによる方法は、ブＬｌ　ｌ−プラストに
電気パルスを印加づることにＪ、って、りなわＩう高い
電圧を知１１．１間印加することによつＣ、プ［１ドプ
ラスト表面に一時的に小孔（ボア）を開けて、そこから
遺伝物質を導入することからなるらのＣあって、エレク
トロポレーションと呼ばれている。

電気パルスの印加が装置的にｂ方法的にも簡便であるの
で、エレクトロボレーシ」ンは工業的直接導入法として
は大いに興味のあるものｅある。

しかしながら、本発明者らの検品４したところでは、こ
のようなエレクトロポレーション技術にも問題がある。

すなわら、エレクトロポレーション技術の一例はＰｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　　８２．５
８２４−５８２４（１９８５）に記載の５のであって、
電気パルスはプロ］・ブラストを等張緩衝液（電解質が
溶存している）に懸ＰＡさせておいで印加りるのぐある
が、本発明者らがこれを追試したところでは（後記比較
例１参照）パルス印加によってブ１］ドブラストが破裂
してしまってその残存率が低く（たとえば５０％程１α
）、またこの残存分を培養しく゛ム生存率があまり高く
ない（たとえば、残存分の７０％程度）ので、電気パル
スの衝撃に耐えて生ｒ？ヂるプロトプラストは極めて低
率（上記の例では３５％程度と計算される）であるから
である。そして、このＪ：うな致命的な問題に加えて、
遺伝物質のと２人率があまり高くない（たとえば、生存
力の６０％程度）という遺伝子導入手段としては木質的
な問題があるのである。

生存率が低いという問題は、電気パルスのｖＭ撃を弱く
することによって解決することができよう。

すなわち、電気パルスの印加は、たとえば前記の例では
電圧３５０Ｖの電気エネルギーを９４０ｔｔ　Ｆのコン
デンサーを介して知ｕｙ間に放出させることによってｔ
′ｉなわれているが、コンデンサーの容量をたとえば１
００μＦにり−ることによって残存率および生存率がそ
れぞれ８０〜９０％程度Ｊ３Ｊ：び９０％程度にまで向
上づることを本発明とらは見出している（後記比較例２
参照）。

しかしながら、そのような１段を講すると、遺伝物質導
入率が悪化する（たとえば、前記の例での６０％程度が
４０％程度に低ドづる）ことが判明したのである。

電気パルス印加によるプロトプラス１〜への運転物質導
入の促進ということが、前記のようにエレクトロポレー
ションリ“なわち「電気的な錆孔」に阜くらのであるど
すれば、残存率／生存率と遺伝物質導入率とは拮抗的関
係にある訳であるから、低容量コンデンリー使用に際し
て認められた導入率の低下は首出しうるものであるし、
また従って電気パルスによる！ｆｉ撃の緩和という方策
はエレクｉ・ロボレーシ；」ン技術の前記の問題Ｊｊス
を解決する手段としては妥当ではないということにもな
る。

〔発明の概要〕

要旨 本発明は前記の点に解決を与えることを［１的とし、電
気パルスによる衝撃を緩和するど共に緩衝液中の電解質
を主としてＫＣＩとづることによってこの目的を達成し
にうどする乙のである。

すなわち、本発明によるエレク［−ロボレーションによ
る植物プロ１〜ブラストへの遺伝物ｖ１〔の導入法は、
植物プロ１〜プラストを遺伝物質と共に等張！１！衝油
中に分散した状態において：Ｉンデンリーを介して電気
パルスを印加りることからなるエレクトロポレーション
に何すことによって該遺伝物質を該植物プロ！・ブラス
ト中に導入する方法にＪ３いて、このエレクトロポレー
ションを下記の条件下に行なうこと、を特徴とするもの
である。

（イ）　電気パルスの電圧が、パルス印加用電極間の距
Ｂｉｔ　１　ｃｍにつき２５０〜２５００Ｖ′Ｃ−ある
こと。

（ロ）　］ンデンリ゛−容聞が、パルス印加用電極の面
積１　ｃＭにつき・０．４〜３００μＦであること。

（ハ）　緩を５液が主要電解質としてＫＣＩを１５〜２
１０１ｒＬＭの濃度で含むしのであること。

効　　果 本発明によれば、処理されたプロ１〜ブラストの残存率
／生存率向上を遺伝物質導入率向上との両方が実現可能
である。これらの両者が拮抗的関係にあることは前記し
たとところであって、Ｍ衝液中の゛ｉヒ解質を比較的多
量のＫＣＩとすることによってこれらの両名が同時に向
上Ｊるどい・）ことは思いが（プなかったことというべ
きである。

従って、本発明によれば、エレクトロポレーション技術
固有の利点、すなわら装詩的に６方法的にも曲伸である
こと、に加えて、＾率で改変ブ１］ｌ−プラストを得る
ことがぐぎる。

〔発明の詳細な説明〕

エレクトロポレーション装置 本発明ににるエレクトロポレーションは、前記（イ）〜
（ハ）の点を除（）ば、従来公知のエレクトロポレーシ
ョンと木質的には異ならない。本発明と矛盾しない限り
、従来提案されるであろうエレクトロボレーシ」ンの改
良らまた本発明に適用しうろことはいうまでもない。

エレクトロポレーションの内容イ≧いし装置は、添付の
図に模式的に示した通りである。放電槽にはあるか離を
置いて対向するある面積の電極が少なくど−６一対設け
てあって、対向電極間で放電が起る。Ｊ：うになついる
。エレク［・ロボレーシミ１ンを実滴り−る場合には、
先ずスイッチを充電側にして「電源」−「コンテン１ナ
ー」回路が形成されるようにしてコンアン４ノーに電気
エネルギーを貯留（きせてから、スイッチを放電側にし
て「コンアン１ナー」−［放電槽１回路が形成されるＪ
ニー’Ｊにして、対向電極間に存在するプロトプラス１
〜懸濁液に瞬間的に１′Ｉｉ流を流れさせる。

このよう４１エレクトロポレーシヨン装置は、各種の改
変が０１能であることはいうまでもない。たとえば、コ
ンデンサーを直列または並列に複数個使用して充電−放
電間の間隔を短縮すること、放゛市槽の電極を慣用され
る共形的な形状である根の代りに棒その他の形状にした
り、放電槽内に複数対設置ｉ、１７　′？Ｊ′ること、
放電槽を電気的に直列または並列に複数個使用１゛るこ
と、あるいは放電槽内のプロ１〜プラスト懸濁液を撹拌
装首によりまたは複数’ｆＩＩ間の液の循環によってｌ
ｊ２拌り”ること、その他を必要に応じて実／ＩＩ！ｉ
することができる。

」−レクトロボレーシ３１ン方法 木発明は、上記のようなルり１〜ロボレーシヨンを、前
記した特定の条件（イ）〜（ハ）の充足Ｆに実施りるこ
とからなるらのである。

ブ【：１ドブラス１−置溝１液 対象と・するプロ１〜プラス１−は、各種の植物からの
乙のぐありうる。具体的には、たとえば、イネ、１〜つ
し＋−’ｌ　ｍｕシ、ＡＡムギ、二１ムギ、ニンジン、
バレイシ三１、！〜マド、タバコ、キｔＩベツ、ハクリ
イ、ダイコン、１−１ンリ、メロン、スイカ、アルフン
？）レノア、べび−ユニア、ニブニブソウ、ヂコウレン
ニンジン、オウレンなどがある。なａ３、本発明化らが
実験に供したのは、タバコ懸濁培養細胞、ニブ二ｆソウ
懸濁培ｆｓｍ胞、イネ懸濁培養細胞およびタバ］ｔＪ肉
細胞である。これらの植物の細胞からのそのブ［１ドブ
ラス１〜を得る手段ｂ　慣用のらのであって、具体的に
は、たとえばレルラーゼ、ベクチノーＬ簀の肩１１胞壁
溶解酵素による処理によれぼＪ：い。

プロ１〜プラストの分散媒をなす等張緩′ｆ５！Ｊ液は
、合１」曲内＜ｒ　ｆｆ意のｂのでありうる。具体的に
１．１、たとえば、バッファーがたとえばＭＥＳ　（す
なわ１５．２−　（Ｎ−Ｈｏｒｐ、ｈｏｌｉｎｏ）ｅｔ
ｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、リン酸Ｊ８．
１−ＩＥＰＥＳ（す１．１わら、Ｎ−２−１１ｙｄｒｏ
ｘｙｃｔｔ＋ｙｌｌ＋１ｐｅｒａｚｉｎｃ−Ｎ’　−２
−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　）その他
″Ｃあり、等張化剤がたとえばＤ−マンニトール、Ｄ−
ソルビトール、ショ糖その他であるしのである。Ｆ）Ｈ
は５〜８稈疫が好ましい。

緩衝液は緩衝イオンとして１ｆｉｌｌｉまたは２１＋ｔ
ｈのイオン、特【ごアルカリ金属イオンＪ、たけアルカ
リ土類金属イオン、を含むが、本発明はこのような緩衝
イオンの全部法たＩＪ一部が１５〜２１０ｒＴＩＭ、好
ましくは２０〜１８０ｍＭ、の濶庶のＫＣｌであるとい
うことを特徴の一つく要件（ハ））とするムのである。

このような６ｑ張緩衝液中のプロトプラストの澗１σは
任怠であるが、１０〜１０７細胞／ｄ、好ましくは１０
〜６Ｘ１０’細胞／　ｎｄｌ、程度であることがふつう
ぐある。

ｊ貞伝子物ｒ′ｉ ブ［１ドブシストに導入すべき遺伝物質は、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡＪ３Ｊ、び植物ウィルス粒子が代表的である。

本発明で【よ、ウィルス粒子をも遺伝物質として扱って
いることに留怠されたい。ウィルス粒子は、外殻タンパ
クに波頂されていでｂその内部にはＲＮΔまたはＤＮＡ
を持つところから、これをｉｌ伝物ｖ１どして取扱うこ
とがＣきるばかりぐなく、本発明方法によるプロトプラ
ス１へへの導入が確認されでしいるからである。なＪ３
、本発明化らがｊａ伝物質として実験に使用したｂのは
、タバコモザイクウィルス（Ｔ　Ｍ　Ｖ　）およびキウ
リモ１アイクウイルス（ＣＭＶ）のＲＮＡ、クロラムフ
ェニコールアレデル転移酵素またはネオマイシンリン酸
転移酵木の構造遺伝子を持つＤＮＡ、’ｒ　Ｍ　Ｖ粒子
おＪ：びｃ　Ｍ　Ｖ粒子である。

遺伝物質はエレクトロポレーションの際はプロ１−プラ
ス１〜懸濁液中に（？白りる訳であるが、そのときの濃
度はＲＮＡおよびＤＮＡの場合はたとえば１〜１００μ
ｇ／威、好ましく（よ５〜６０μす／威、ウィルス粒子
の場合はたとえば５０〜１０００　ＩＩ　Ｑ　／　ｍｅ
、好ましくは１００〜５００μｇ／威、であることがふ
つうである。

電圧／コンデンＩＪ−容■ 本発明の他の要件は、コンデンサーを介して印加すべき
電圧が２５０〜２５００／　ｃｍ、好ましくは５００〜
１２００■／ｃｍ１であること（要件（イ））、ならび
にコンデシ１ノー容吊が０．４〜３００μＦ　／　ｃｔ
ｉ、好ましくは２０〜６０μＦ　／　ｃｉ、であること
（要件（ロ））、である。ここで、電圧は対向する電極
の距１ＩｌＩ１１ｃＩＲについてのそれであり、］ンデ
ンリー容４（よ対向１゛る電極の面積１　ｃｉ当りのそ
れである。

電極が典型的な板状の外に棒状その他の形状であっても
にいことは前記したところであるが、電極の形状がどう
あれ、電極の面積（接液部の面積゛Ｃあることはいうま
でもない）は対向し合う電極の面積の相加平均を指称す
るものとする。電極（ＪＪ　Ｊ、び放°市１ｆ１１）が
どのような形状のｂ（Ｉ）Ｃあれ、放ｆｆｉ槽内のブ０
１〜プラスト粒子のできるだけ多くが電気パルスを受り
るにうに配慮すべさこと【よいうまでｂない。

放電／電気パルスの印加 電気パルスの長さは、本発明（゛限定Ｊる電圧およびコ
ンデシ１ノー容吊の下では０．５〜３０ミリ秒（ｍｓ）
、好ましくは３〜１０ｍ５．Ｃあることがふつうである
。ここで、電気パルスの長さとは、パルスの初期電圧（
パルスの初期電圧は、回路の内部抵抗のため、充電電圧
より低い）が１／ｅ（ｃ：自然対数の底）に落Ｉうるま
での時間（τＦ）を意味する。

エレクトロポレーションは系での被導入物の存在を必須
とすることはいうまでもないが、被導入物は必ずしｂ電
気パルス印加時に存在していなくてもよい゛。何故なら
ば、電気パルスの印加によって形成された小孔はすぐに
は閉じないこと、また、事実、たとえば電気パルス印加
１０分後のプロトプラスト懸濁液にＲＮＡを添加して６
１０ドプラスト 明者らの実験によって確認されているからＱある。

もっと−６１電気パルス印加とＲＮＡ添加との間が長く
なるにつれて導入率が低Ｆりるから、遺伝物質（ま電気
パルス印加時に既にプロ１−プラストと共存しているこ
とが好ましい。上記したところから、、迫伝物質共存在
十に電気パルスの印加を行なったどきも、印加後もたど
えば１０分間程度は懸濁液を放電しくＪ３いて遺伝物質
のプ［１１・プラス１−への導入率を向上さＵることが
好ましい。

エレクトロポレーションの際の温度は、０〜３５℃程度
がふつうである。温度が高すぎるとプロトプラスト 低温すぎると凍結によるプロトプラス１−の破壊がＪり
こるからである。

改変プ［］ドブラストの処理 上記のようにしてエレクトロポレーション処理ブし１１
−プラス１−は、適当７７回路手段によって集め、培養
細胞壁の再形成その伯の処理を施すなどし、さらに適当
４【手段によって遺伝物質が導入されたしのを’Ｓ　ｆ
Ａｔして、適宜利用り“ることがでさる。

実　　験　　例 実験例１（ＲＮへの導入） （イ）　エレクトｌ］ポレーション装置実験に供した装
置は手製であって、図示の構成の５のである。電源は、
電気泳動用電源（Ｖ−Ｃスタビライずー、モデルｒｓＪ
−１０６１Ｊ、Ａ　ｔ　ｔ　ｏ　ｂネ１装）である。図
示の構成ではコンデンサーは１１１！ｉｌだ１ノである
が、様々な程度の電気放電を得るために、個々にあるい
は組合ばて使えるように、１、１０、４７、１００１２
２０および／１７０μＦの容量のコンデンサーを回路に
並列に配置した。コンデンサーは、４７μＦのものが日
本ケミカルコンデンザ−（株）（肖梅市）製ぐある外は
、すべて信栄通信（株）（伊那市）装である。放電槽は
、分光光度甜に使・）ポリスチレンまたはガラス製のキ
ュベツト（内径１　０Ｘ４　２Ｘ５　ｒｍ　）中に４Ｍ
の間隔をおいで２枚のスデンレス鋼板（１０Ｘ４２Ｘ０
．５＃ＩＩ１１）を配置した乙のからなる。電極間の′
上気放電Ｌ；Ｌ　、シンクロスコープ（モデルＶ−１５
５（株）日立製作所製）を使っ（調べた。

（口）　プロトプラスト ブ［１１−プラス１〜は、長田らの方法（Ｈｏ１．Ｇｃ
ｎＧｅｎｅｔ、１８４．１（ｉｌ−１６５（１９８１）
　）にＪ：ッて、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　　ｔａ
ｂａｃｕｍ　　Ｌ、ｃｖ、Ｂｒｉｇｈｔ　　Ｙｅｌｌｏ
ｗ　２゜ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　ＢＹ２　）　、ニチニチ
ソウ（Ｖｉｎｃａ　ｒｏｓｅａ　）おＪ：びイネ（ｏｒ
ｙｚａ　ｓａｔ　ｉｖａ　）の懸濁培養細胞から調製し
た。なＬ１３、長日らの方法で使用するヒルラーゼ・オ
ノズカ・Ｒ８の代りに、セルラーゼＹＣ（血道製薬製）
を使用しで得たブ０ドブラストをも使用した。

タバコ葉肉プロトプラストは、長日の方法（Ｅｎｃｙｃ
ｌｏｐｅｄｉａ　ｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏ
ｇｙ、Ｎｃｖｓａｒｉｃｓ、Ｖｏｌ、１７．ｐｐ４９１
−５０７　ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ刊）によっ
て、タバ］　（Ｎ、ｔａｂａｃｕｍ　１．ｃｖ、Ｘａｎ
ｔｈｉ　ｎｃ）からＩｔｉｌｌｌ［した。

（ハ）　ウィルスＲＮＡ ＲＮへは、福永らの方法（Ｖｉｒｏｌｏｏｙ　、　１１
３，７５２−７６０（１９８１）　）によって、タバコ
モデイクウイルス（Ｔ　Ｍ　Ｖ　”）およびキウリモヂ
イクウィルス（ＣＭ　Ｖ　）の粒子から子離した。

（ニ）　エレクトロポレーション ｉ、　　　（タバコ懸濁培養細胞、丁Ｍ　Ｖ　−１’＜
　Ｎ　Ａ　。

ＭＥＳ−７０ｍＭ　　ＫＣＩの例） タバコのｆ＆濁培養細胞のプロトプラストを７０１ｒＬ
Ｍ　　ＫＣＩおよび３００７ＦＬＭ　　ｏ−？ン＝トー
ルを含む５ｍＭ　　ＭＥＳ緩ｍ液、ＤＨ５，８、に３　
Ｘ　１０６ｔｉＡＮ／　ｌ１１１！（１）１１ｊＪニ１
１１ｍｆｆ　ｕ、ソコヘ−ｒ　Ｍ　Ｖ　（Ｄ　ＲＮ　Ａ
　ｖＡｍ　ヲ４０　ｕ　Ｑ　／　ｍＡ　ｔＤ　濃度ト／
ｊ　ルように添加し、このように調製した供試液の１１
Ｈ１に電圧３００Ｖで１００μＦのコンデンサーを用い
て１回の電気パルスを与えた。このときの該プロトプラ
スト 存率は残存していたものの９０％（供試ブＯ　ｌ−ブラ
ストの８１％）で、生存ブ［１１〜プラスト０８７％　
（同７０％）のものがＴＭＶに感染しでいた。

’ｒ　Ｍ　Ｖの感染率は蛍光抗体法Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，
　３８，４９７−　　４９９．（１９６９）　）　’（
’検定した。またこのどさ・の電気パルスの長さはτＥ
勺６ミリ秒−〇あった。

ｉｉ．　　　（タバコ！！！濁培Ｍ　ｍ　ｒｒａ、ＣＭ
Ｖ　−　ＲＭＡ、ＭＥＳ−７０７ＦＬＭ　　ＫＣＩの例
）前記ｉ　ニＪ３　イー（、１−　Ｍ　Ｖ　−　Ｒ　Ｎ
　へヲ３　０　ｔｔ　＜Ｊ　／ｄｆＡ度（７）　Ｃ　Ｍ
　Ｖ　−　Ｒ　Ｎ　Ａ　ｋ：　Ｐ７　８換エテ、前ｎｊ
２　Ｉ　（！：同様にエレクトロポレーションを行なっ
た。このときの該プロトプラストの残存率は９２％、２
４時間後の生存率は残存していたものの８９％（供試プ
ロトプラストの８２％）で、そのうちの８５％（同７０
％）のものがＣＭＶに感染していた。

また、このときの電気パルスの良さはτＥ”？６ミリ秒
であった。

ｉｉｉ．　　（タバコ懸濁培養細胞、ＴＭＶ−ＲＮＡ。

リン酸塩−１４０ｙＦＬＭ　　ＫＣＩの例）前記ｉにお
イテ、７０ｍＭ　　ＫＣＩおよび３００１１ｔＭ　　Ｄ
−マンニトールを含む５ｍＭＭＥＳ緩衝液を、１４０７
１１Ｍ　　ＫＣＩおよび２　０　０　ｍ　Ｍ　　Ｉ）　
−　’？マンニトール含む１０ｒｒＬＭカリウムーＪＪ
リウムリンＭｌｉｍ液ｐト１７．０に％ｔき換えて、前
記ｉど同様にエレク］・自ボレーシ」ンを行なった。こ
のときの該ブ１］ドプラストの残存率は８０％、２４時
間後の生存率は残存していたものの７７％（供試プロｉ
・プラス１−の６２％）で、そのうｌうの７６％〈同４
７％）のらのがＴ　Ｍ　Ｖに感染していた。

ｉｖ．　　（タバコ懸濁培Ｆｊｌｌ胞、ＴＭＶ−１＜Ｎ
Ａ、ＨＥＰＥＳ−７０ｍＭ　　ＫＣＩの例）前記ｉにお
いて、７０ｍＭ　　ＫＣＩおよび３００ｍＭ　　Ｄ−マ
ンニトールを含む５７ａＭＭ　Ｅ　Ｓ　緩ｌｉｔ液を、
７０ｍＭ　　ＫＣＩ、５ｍＭＣａＣＩ２おＪ：び３００
ｍＭ　　Ｄ−マンニトールを含・む５ｍＭ　　ＨＥＰＥ
Ｓ緩［液、ｐＨ７．０に置き換えて、前記ｉと同様にエ
レクトロポレーションを行なった。このときの該プロト
プラストの残存率は７９％、２４時間後の生存率は残存
していた一ｂのの７５％（供試プロトプラス１−の５９
％）で、ぞのうらの７７％（同４６％）のらのがＴ　Ｍ
■に感染していた。

Ｖ．　　　にチニチソウ懸濁培養細胞、ＴＭＶ−ＲＮＡ
、ＭＥＳ　−　７０１１ＬＭ　　ＫＣ　ｌの例）前記ｉ
にＪ３いて、タバコ懸濁培養細胞のプロトプラストをニ
チニブーソウ懸濁培養細胞のプロトプラスト ンを行った。この時のブａ　１−プラス１−残存率は９
５％、２４詩間後の生存率は９０％（供試ブ１］ドプラ
ストの８６％）であり、生存プロトプラス１−の７３％
（同６２％）のものがＴＭＶに感染していた。また、こ
のときの電気パルスの長さはτＥ〜６ミリ秒であった。

Ｖｉ、　　　（イネ懸濁培養細胞、ＣＭＶ−ＲＮＡ、Ｍ
ＥＳ　−７０ｍＭ　　ＫＣｌ　ｃｌｉ例）前記ｉｉにお
いて、タバコ懸濁培養細胞のプロトプラストをイネ懸濁
培養細胞のプロトプラストに首ぎ換えて、同様にエレク
ト「１ボレーシヨンを行った。この時のプロトプラスト
残存率は９７％で、２４時聞培苺後の一ト存率は９９％
（供試プロトプラストの９６％）であり、生存プロトプ
ラストの３７％（同３６％）がＣＭＶに感染していた。

ｖｉｉ、　　（９バコ菓肉細胞、１−ＭＶ−ＲＮＡ。

ＭＥＳ−７０ｍＭ　　ＫＣＩ（７）例）前記ｉにおいて
、タバコ懸濁培養細胞のプロトプラストをタバコ葉肉細
胞のブ［１ドプラストに置き換え、電圧２００　Ｖで、
エレクト０ボレーシヨンを行った。この時のプロトプラ
スト残存率は９６％で、２４０）間後の生存率は９７％
（供試プロトプラストの９３％）であり、生存プロ］へ
プラストの４４％（同４１％）がＴ　Ｍ　Ｖに感染して
いた。

比較例−１ タバコの懸濁培養細胞のプロトプラストを１０ｍＭ　　
ＫＣＩ　、６０ｍＭ　　Ｎａ　ＣＩ　Ｊ３よび３００ｍ
Ｍ　　Ｄ−ｖ’ンニトールを含む５ｍＭリンＭ　［ｎｉ
　’ａ、ｐＨ７°、　Ｏｋ：３Ｘ　１０”ａｎ’ｄ／ｍ
１ｌ）濃度に懸濁させ、ＴＭＶのＲＮＡを４０μＱ／ｒ
ｄの淵爪どなるように添加し、このにうにしく調製した
供試液の１ｍに実施例１の装置において電圧３５０■で
９４０μＦのコンデンサーを用い、１回の電気パルスを
与えた。このときの該プロトプラストの残存率は５０％
、２４時間後の生存率１．Ｌ残存していたものの６７％
（供試プロトプラストの３４％）で、そのうらの６０％
（同２０％）のものがＴＭＶに感染していた。また、こ
のときの電気パルスの長さはτＥζ１８ミリ秒て・あっ
た。

比較例−２ 比較例１において、電圧３５０Ｖ、コンデンサー容吊９
４０μＦを電圧３００■、コンデンサー容ｂｌ　１００
　ｕ　Ｆに置き換えて、比較例１と同様にエレク１−　
ｏボレーションを行なった。このときの該プロトプラス
トの残存率は８０％、２４時間後の生存率は残存してい
たものの７０％（供試プロ１〜ブラストの５６％）で、
そのうらの３９％（同２２％）のものがＴＭＶに感染し
ていた。

実施例２　（ＤＮＡの尋人） ｉ、　実施例１の（ニ）−ｉのＴＭＶ−ＲＮＡを１０μ
ｇ／−のＤＮＡ−１、またはＤＮＡ−２に首き換え、同
様にエレク１−１コポレーションを行った。この時の残
存率、生存率は実施例１の（ニ）−１に同じであった。

６〜３６１に’＋培養した細胞を回収し、細胞と同門の
０．２５Ｍｔ”リス緩衝液（１−１７，８）を加え、超
音波発生装″？ｌ（トミーネ１製）で細胞を破壊した。

６５℃′ｃ１０分間加温し１６０００ｘｇ１５分間／４
℃で遠心し、上清を回収した。

」曾＋’ｉ　４０μｍに、４０μｍの０．２５ＭＴｒ　
ｉ　ｓ　（ｐＨ７，８）　、１ｔｌＩ（Ｑ”Ｃ標識クロ
ラムフェニコール（０，１ｔｉｃ　ｉ　、５０ｍＣｉ／
ｍｍｏ　１．ＮＥＮ礼製）を加え、３７℃で５分間加湿
し、４ｍＭアセデル−ＣｏＡ２０μｍを加え、３７℃で
１時間反応させた。

反応後、５００μｍの酢酸エチルを加え、混和して、反
応を止めると同時に１４Ｃ−りｌコラムフェニコール及
び反応生産物である１−アレヂルークロラムフェニ」−
ル、３−アしブール−クロラムフェニコール、１．３−
シアしブルークロラムフェニコールを酢酸エチル層に抽
出した。酢酸エチル層を回収、濶縮し、シリカゲルの薄
層上にスポラ］・シ、クロロホルム：メタノール（９５
：５）の溶媒で薄層り０７１−グラフィーを行い、溶媒
を自然気化後、オー］・ラジオグラフィーをｆ’ｉつｌ
ζ。

その結束、リケ精巣由来ＤＮＡまたは涼核生物内でクロ
ラムノ１ニコール耐性苅伝子を発現するｐＩ”＝　Ｒ３
２５Ｄ　Ｎ　Ａを用いた場合、反応（１産物であるアヒ
ブール化クロラムノ１ニコールはｊ！ｌられ／ｊかった
が、ＤＮＡ−１、ＤＮＡ−２を用いた場合はアｕｆル化
りロシｌ＼）↓ニニ」−ルを得た。その時の活性は０．
４ユニツト酵素と比較して、ＤＮＡ−１では約５０％、
ＤＮＡ−２では９０〜１２０％であつｌこ。また、この
活性は、細胞を１０〜５０μ（Ｊ／ｄのα−７マニヂン
または、１０μＱ／ｒｔｄｌのシフ臼へキシミド存在ド
で培穆した場合は発現しなかったが、１００μｇ／Ｉｄ
のカッ−マイシン存在下で培養した場合Ｇ、Ｕ無処理の
ものと同じように発現した。

ＤＮＡ−１は、ツバリン合成酵素のプロを一ター下流に
り〔ｌラムフェニコールアセチル転移酵素のＷＩ造道伝
子を継ぎ、さらにその下流にツバリン合成Ｍｆｔ＝の３
′下流配列（ｐｏｌｙ　　Ａシグナルを含む）を継いｌ
ごムのをプラスミドｐＢＲ３２２にり０−ン化したもの
である。Ｄ　ＮＡ−２は、１−〕Ｎ△−１の、ツバリン
合成酵素のプロモーターをカリフラワー［す゛イクウイ
ルスの３５８プロモーターで：；コセぎ換えＩこムので
ある。

１１、　　実施例１の（ニ）−１のＴＭＶ−ＩＮ八を１
０μｊ／ｄ（１）Ｉ）ＮＡ−３に置き換えて、同様にエ
レク１−１１ボレーシ」ンを行った。この時の残在率お
よび生存率は、実施例１の（ニ）−１に同じであった。

４〜７日間ＬＳ　Ｍｋ細胞を培地で洗い、約１０４個／
Ｉｎｌで０．８％アガロース、１０μｊ／−の抗生物質
Ｇ／１１８（ジ１ネテイシン、ジブコ社＋ＪＡ）を含む
長口１らの培地（Ｍ　ｏｌｃｃｕｌａｒ　ａｎｃｌＧ　
ｃｎｃｒａｌ　　Ｇ　ｅｎｅｔｉｃｓ、　１８４．１６
１−　ＩＧ３ｆ１９８１）　）に埋め込み、培養した。

その結果、Ｉナケ粘巣山来のＤＮＡを用いた細胞群は、
この培地上では死滅したが、ＤＮＡ−３を用いた細胞群
よりコロニーを省た。この時の形質転換１１１胞の出現
頻度は、１０−３〜１０−４ひあった。

また、これら形質転換体よりＤＮＡを抽出し、ザＩｙン
ハイブリダイゼーション実験を行ったところ、導入した
ＤＮＡが細胞ＤＮＡ中に組み込まれていることを確認し
た。、ＤＮＡ−３は、ＤＮＡ−１のクロラムノエニコー
ルアＬ！ｆ−ルφｌ：移醇索の構ｊ告ｊｉ１伝子部分を
細菌プラス１へミド由来のネオマイシンリン酸転移Ｍ累
の構造逍伝子で置き換えたしのである。

友亙■ユ（ウィルスの導入） 実施例１の（ニ）−１において、ＴＭＶ−ＲＮ　Ａ　８
５００　ＩＩ　’Ｊ　／　ａｄ！　（７）　１−　Ｍ　
Ｖ粒子まタハＣＭ■粒子に置き換えて、同様にエレクト
ロポレーションを行なった。このときの該プロト・ブラ
ストの残存率、２／１時間後の生存率は実施例１の（ニ
）−１と同じであった。生存プロトプラス１〜の「Ｍ■
感染率は３０％（供試プロトプラストの２４％）　、Ｃ
ＭＶ感染率ハ３７　％　（同３０　％　）　（”　アラ
た。

【図面の簡単な説明】

図面はエレクトロポレーション装置を模式的に示ｉｊ説
明図である。 出願人代理人　　佐　　藤　　−却

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物プロトプラストを遺伝物質と共に等張緩衝液中
   に分散した状態においてコンデンサーを介して電気パル
   スを印加することからなるエレクトロポレーションに付
   すことによって該遺伝物質を該植物プロトプラスト中に
   導入する方法において、このエレクトロポレーションを
   下記の条件下に行なうことを特徴とする、エレクトロポ
   レーションによる植物プロトプラストの遺伝物質の導入
   法。 （イ）電気パルスの電圧が、パルス印加用電極間の距離
   １ｃｍにつき２５０〜２５００Ｖであること。 （ロ）コンデンサー容量が、パルス印加用電極の面積１
   ｃｍ＾２につき０．４〜３００μＦであるこ（ハ）緩衝
   液が主要電解質としてＫＣｌを １５〜２１０ｍＭで濃度で含むものであること。 ２、電圧が５００〜１２００Ｖ／ｃｍである、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３、コンデンサー容量が２０〜６０μＦ／ｃｍ＾２であ
   る、特許請求の範囲第１〜２項のいずれか１項記載の方
   法。 ４、遺伝物質が、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび植物ウィルス粒
   子からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１〜３項
   のいずれか１項記載の方法。 ５、ＫＣｌ濃度が２０〜１８０ｍＭである、特許請求の
   範囲第１〜４項のいずれか１項記載の方法。 ６、緩衝液のｐＨが５〜８である、特許請求の範囲第１
   〜５項のいずれか１項記載の方法。