JPS6219028A - 器官培養した根と共生するアゼニツク性ベシキユラ−ア−ビユスキユラ−菌根菌類の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 液で湿潤した多孔性基体中で産生される根の器官培養物
と共に小胞状繁茂性アゼニック菌根菌類（ａｘｅｎｉｃ
　ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　−ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｇ
ｃｎ！ｉｚａｌｆｕｎｇｉ　）を増殖する方法に係る・
発明の背景 発明の背景を明らかにするために本文中で使用した刊行
物及びその他の材料は本明細書に含まれるものとする。

また便宜上１本文中ではこれら参考文献を符号で示し、
本文末尾に参考文献目録を添付した。

菌根は、有用土壌菌類と高等植物の根との共生解装であ
る（１．２）。菌類は植物の根部でコロニーを形成し周
囲土壌内に（糸状フィラメントの）菌糸を伸長させ、植
物と地中環境との基本的に重栄養化合物を宿主から摂取
する。これに対して植物では、リン、微量元素及びその
他の難溶性栄養物の吸収性が向上しく３，４）、多くの
根病原体に対する抵抗力が強化され（５，６）、増殖率
、収穫率及び生存率が一般に２０〜２００％増加する。

全ての高等植物のうちの約９８％が菌根を形成し、これ
が十分に発育するためには殆んどの場合解装が必要であ
る。

菌根解装に含まれる菌類は菌根菌類と指称される。これ
らの微生物のいくつかのグループはすで　　□に文献に
記載されている。最も多く見られるグループが小胞状繁
茂性菌根（以後「ＶＡＭＪと指称する）ｍ類である。こ
れらの微生物が有し得る宿主は極めて広範囲に及ぶ。こ
れら微生物は高等植物種全体の９０〜９５％と解装を形
成し得る。これら植物種には農業作物、園芸作物及び多
数の有用な樹木種が含まれる（３，７．８）。

ＶＡＭ菌類は根組織をコロニー化するのみでなく根細胞
に侵入して根細胞と密接な関係を生じろ。

これらの関係の性質について十分には理解されていない
が、Ｖ　Ａ　Ｍ菌類が強制的共生生物であり増殖及び発
育のために宿主植物を必要とすることは公知である（９
）。即ち宿主無しでＶＡＭ菌類を培養することはできな
かった。本文中では本発明をＶＡＭ）ＩＪ類のみに関し
て記載する。

ＶＡＭ菌類は、多（の商業的に重要な植物の成長、収穫
及び生存を顕著に改良し得るので、農業、林業、土地改
良及び園芸に利用できる回部性が大きい（７，８）。

しかし乍らＶＡＭ菌類の接種物の産生が技術的に難しい
ため、’ＶＡＭ菌類の十分な商業利用はまだ実現してい
ない。ＶＡＭ菌類の培養方法として３種類の技術が開発
されたが、いずれの技術にも接種物の量産を阻む問題が
残っている。鉢栽培と指称される第１の方法では温室内
の無蓋植木鉢の植物の根で菌類な産生ずる（ｌＯ）。鉢
栽培は商業生産されたが、植物病原体による汚染が生じ
易く接種物が使用不評になる。第２の方法では栄養フィ
ルム法（水栽培）を使用し、土を含まない栄養液に根を
浸漬させた完全植物の根で菌類な産生ずる。しかし乍ら
この方法でも温室内で産生な行なうので接種物力１汚染
され易い。

汚染の問題が最も少ない第３の産生方法では、無菌の液
体又は固体寒天基体で成長させたアゼニックな（・即ち
非汚染性）根の器官培養物で菌類な増殖させる（１２，
１３．１４）。この方法は原価効率の面で商業規模の量
産が難しい。これらの難点は少くとも３つの点に現われ
る。第１に、２種類の生物を含む共生培養物は発育が比
較的遅い。

従って世代時間が長いため（培養から採取まで３〜８週
）、資本集約的大規模産生用発酵槽の使用攪拌又は空気
噴射によって酸素増加を助けることはできるが、これら
の処理に付随する乱流によって、菌類のコロニー形成と
その後の増殖に必要な菌類と根との接触が妨害される。

第３に、固体寒天基体を使用するため、コストが格段に
智くなりまた通気不良の問題が再び生じる。

腐生菌類、即ち生体宿主を必要としない菌類の産生に於
いては、バルク培養物の通気と乱流との問題を解決する
ためにバーミキュライトと謹にの粒子とを含む多孔質基
体を培地成分として使用してきた。しかし乍らＶＡＭ菌
類と組織培養根とを共生培養するための適当な培地はま
だ開発されていない。

発明の要約 本発明は、汚染物を含まないＶＡＭ菌知菌種接種物業ベ
ースで増殖及び量産する方法を提供すさせた植物根を菌
類宿主として利用する。本発明では、菌類増殖と胞子形
成とを促進し経済的な接種物産生を行なうために液体又
は寒天基体でなくさせたバーミキュライトの如き多孔性
基体を含む培地を使用する。多孔性基体は酸素の拡散が
良（。

ＶＡＭ菌類の発育を妨害する攪拌を行なわなくても培養
物全体の通気が得られる。本発明の結果として、アゼニ
ック菌根の根器官培養物の増殖及び発育の増進が得られ
る。本発明の多孔性基体は比較的安価でありまた取扱い
も容易なため、この系の使用によってＶＡＭ菌類接種物
を商業ベースで産生ずることが可能になった。

Ｌ里五血旦友脱里 本文中の用語を以下の如く定義してお（。

無　菌−生きた微生物が存在しない アゼニック−不要な生きた微生物が存在しない接種物−
植物及び／又は微生物の移植又は新しい増殖開始に使用
されろこれら植物及び／対する微生物の移植又は増殖開
始 基　体−固相マトリクス 培　地−生きた微生物又はその組織の培養に使用される
栄養液と基体とを含む栄養源担持系Ｏ 本発明は、アゼニックＶＡＭ菌類を植物根の組織培養物
との解装として培養するための改良培地及び方法に係る
。

根の器官培養は、苗条をもたないアゼニックな完全植物
根な栄養培地中で増殖させる方法である。

多数の植物種の根を培養し得る（１６）。本発明での使
用に好適な植物はベニバナウマゴヤシ（Ｔｒｉｆｏｌｉ
ｕｍ　ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ　）とナンキンマメ（Ａｒ
ａｃｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ　）である。根の器官培
養の方法概論については文献（１６）Ｑ参照するとよ（
１゜ 又は、アゼニックな実生の茎の切除部分から発生した不
定根の先端でもよい。例えば、ペエバナウマゴヤシ（Ｔ
ｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ　）の根器官
培養物は幼根から発生させるのが容易であり、ナンキン
マメでは不定根を用いる方が容易である。

長さ１．０〜２．０ｃＩＩＬの根先端部分を切除し、植
物種に特異的な組織培養基受培養して培養物を得るのが
好ましい。標準法を用い周期１４−１７日の継代培養を
順次行なって板材料のクローンを維持するＯ ＶＡＭ菌類は、予め発芽した表面消毒胞子として根器官
培養系に導入される。表面消毒はトマラツプ（Ｔｏｍｍ
ｅｒｕｐ）及びキトバイ（ｘｔａｂｙ　）の方法で行な
う（１７）。予め発芽させるには、胞子発芽を支持する
ペプトン−酵母抽出物培地（表３）の如き無菌栄養液を
少量用いる。発芽を確認し汚染のないことを確認するた
めに、菌類の鍾に従って種々の経過時間後に胞子をモニ
ターする。本発明で使用できるＶＡＭ菌類は、グロムス
（Ｇｌｏｍｕｓ　）属及びギガスポラ（Ｇｉｇａｓｐｏ
ｒａ　）属の種を含む。

特定例として、グロムス・エツニカツム（Ｇｌｏｍｕｓ
ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ　）、グロムス・モセアエ（Ω−
堕且胆）ｎｏｓｓｅａθ）、グロムス・イントララジシ
エス（Ｇｌｏｍｕｓ　１ｎｔｒａｒａｄｉｃｉｅｓ　）
及びギガスポラ・マルガリータ（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ　
ｍａｒｇａｒｉｔａ　）がある〇本発明に於いて、根器
官培養物とＶ　Ａ　Ｍ胞子接種物とはアゼニックなＶＡ
Ｍ共生体の発育を支持する多孔性培地に導入される。こ
の培地としては、比較的不活性の多（の粗粒状基体が適
当である。

適当な基体の例として、粗粒バーミキュライト、バーラ
イト、粗粒ケイ砂、粒状モンモリロナイト−粘土配合物
（例えば、インターナショナル・ミネテルズ・アンド・
ケミカルズの商標登録製品ターフエース（Ｔｕｒｆａｃ
ｅ　）　）、ビート及びこれら物質の混合物がある。こ
れらは勿論非限定的な例である。基体の重要な選択基準
は間隙率である。ガス拡散が自由で十分な通気が確保さ
れるように。

基体が広い孔間隙をもつ必要がある。基体の別の選択基
準は湿潤性及び不活性である。適当な水分の分布を確保
するために基体が液体を吸収及び／又は吸着することが
必要であるが、これによってた従来の基体とは違って、
多孔性基体は攪拌しなくても自由にガス交換が行なわれ
る。このことはまた、植物根に対するＶＡＭ菌類のコロ
ニー形成を促進し、ＶＡＭの胞子形成と根の良好な成長
とが十分に行なわれる。

本発明の実施中に、多孔性基体はベトリ皿、フラスコ又
はプラスチックバッグの如き適当な培養容器に所定容量
ずつ又は所定重量ずつ供給されてする。使用される植物
種及び菌類様と適合性をもつ溶液を選択する。グロムス
（Ｇｌｏｍｕｓ　）種及びギガスポラ（Ｇｉｇａｓｐｏ
ｒａ　）種がベニバナウマゴヤシ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ
　ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ　）の根と解装な形成する培養
物には、比較的低濃度の塩（）、＜ｗｉ、ＭＷ２．ＭＷ
３：表２）を含有するホワイト（ｗｂｔｔθ）溶液（１
８）を修正した栄養液が好ましい。しかし乍ら、上記菌
類がナンキンマメ（Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ　
）との解装を形成する培養物ではムラシゲ（Ｍｕｒａｓ
ｈｉｇｅ　）及びスクーグ（Ｅ３ｋｏｏｇ　）（１９）
の溶液を修正した比較的面濃度の塩溶液（ＭＳ　３　：
表１）が好ましい０グロムス（（）ｌｏｍｕｓ　）種の
栄養液はｐＨ６，５、ギガスポラ・マラガリータ（Ｇｉ
ｇａｓｐｏｒａ　ｍａｒａｇａｒｉｔａ　）　’ＦＡの
栄養液はｐＨ５，５〜６．５に緩衝するのが好ましい。

調製した栄養液を好ましくはフィルター殺菌し、次に、
多孔性基体を収容した無菌容器に所定容量ずつ供紬する
。本発明での使用に適した適当な基体対栄養液の比を表
４に示す。溶液の添加量は、基体が完全に湿潤され容器
の底に薄層状の液体だけが残るように調節される。多孔
性基体の過度の湿潤に、通気を低下させるので避けた方
がよい。

調製済の多孔性培地に、先ず根組織を接種し、次にＶＡ
Ｍ菌類な接種する（第２図）。適当な板抜種物は各植物
種毎に異なる。例えばベニバナウマゴヤシ（Ｔｒｉｆｏ
ｌｉｕｍ　ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ　）培養物では、新芽
をもつ種子から切□除した１〜７個の幼根を接種するか
、又は、１群当り３０〜５０の側端なもつクローン根の
群を１〜７個接種するのが好ましい。また、ナンキンマ
メ（Ａｒａａｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ　）培養物では
、５〜１０個の側根なもつクローン根先端を接種するの
が好ましい。板材料を多孔性培地と培養物との上に重ね
るか又は該培地内に層状に配置し、根が成長して分枝な
開始するまでインキュベートするのが好ましい。インキ
ュベーション期間の経過後、選択ＶＡＭ閉類の予め発芽
させた表面殺菌胞子を培養物に接種する。少量の前記胞
子発芽培地に入れた胞子を培養物に移植する。

コロニー形成のためには胞子と根とをじかに接触させる
必要はない。

ガス交換は生じるが汚染と早急な乾燥とは防止できる程
度の弛みを伴なって培養物容器をシールする。適温好ま
しくは２５°〜２８℃を維持して培養物を暗中でインキ
ュベートする。

４〜８週間経過俊、培養物でのＶＡＭ菌類の増殖と発育
とを査定する。査定は、根先に対する菌類のコロニー形
成の程度と菌類の胞子形成の程度とを測定することによ
って行なう。有意レベルのコロニー形成（２０％〜５０
％）及び／又は胞子形成が、培養物の十分な発育の指針
となる。

前記の如（産生された根器官培養物は、新しい出発接種
材料として使用できる。コロニー化した根とマトリクス
外の菌糸と胞子と基体とを含む銘全ＶＡＭ根器官培養物
を無菌法で採取し、新しい多孔性無菌培地内に層状に配
置する。次に、新しい根培養物で覆う。根が成長して完
全接種物を貫通するとコロニーが形成される。このよう
にして培養が永続する。

又は、耕種植物及び園芸作物、例えばモロコシ（Ｓｏｒ
ｇｈｕｍ占」ユ匹）、ウマゴヤシ（油ゆ舷田但５ａｔｉ
ｖａ　）及びナンキンマメ（より１亘■Ｊ褌Ｐ■朋Ａ）
の接種のためにＶＡＭ根器官培養物を使用しても養源、
主として糖と塩とを除去する。次に接種物が発育する根
と確実に接触するように接種物を種子、移植体、微小苗
条又は挿木の下方に層状に配置する。かかる接触によっ
て接種植物のＶＡＭコロニー形成が容易に行なわれる。

接種を温室内で行なってもよく又は野外で行なってもよ
い。ＶＡＭコロニー形成を定常的に維持するために、植
物を軽度のリン欠乏状態に維持する。

以下の実施例は本発明の説明のために用いられた非限定
的な例であり、本発明の範囲は記載の実施例に限定され
ない。

（以下余白） 実施例１ 液体、寒天および多孔性培地中でのベニバナツメクサ（
Ｔｒｌｆｏｌｌｕｍ　Ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ　）の根の
器官培養物のギガスポラ　マルガリタ（但旺呻車す坦丑
車田）によるＶＡＭコロニー化の比較： 根の器官培養物の調製 ベニバナツメクサ（Ｔｒ１ｆ虹−１ｎｃａｒｎａｔｕｍ
　）の種子を濃硫酸中で１５分間表面滅菌し、滅菌蒸留
水を５回交換して十分に洗浄した。種子の不稔性（５ｔ
ｅｒ…ｌｙ　）を、１チ寒天（Ｄｌｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ
　Ａｇａｒ）と３％サッカロース（ｐＨ５，８）とを含
むＭＳ　Ｉ培地（表１）で２８℃、３日間インキュベー
トして調べた。この期間中種子は発芽した。長さ１−２
ｃｍの幼根チップ１０本を切シ取り、これらをＭＷ　１
溶液（表２）（ｐＨ５，７）５０ゴ中でインキュベート
することによって、根の器官培養物を液体振盪培養物中
で定着させた。早くに生育し急速に分岐した根を初期の
チップ群から選択し、標準的手法［相］を用いてクロン
化させた。ストック培養物を、前記ＭＷ　１溶液５０ｔ
ｎｌを収容した１２５−三角フラスコ内の液体振盪培養
物中で維持した。クロン化された根を１４−１７日間隔
で継代培養させた。

表１：　根の器官培養→用に使　した栄養溶液ＮＨ，Ｎ
ｏ、　　　　　　　　１６５０　　８２５　　１６０　
　２４０ＫＮ０．　　　　　　　　１９００　１９００
　１８１８　２７２７０ａ（ｌｔｌ”　２ＨｍＯ４４０
８８０２２０１１０ＫＯＬ　　　　　　　　　　　　　
　　　０　　　３５０　　　　　０　　　　　０ＫＨ鵞
Ｐ０．　　　　　　　１７０　　１７０　　８４　　４
２Ｍｇ８０４”　７Ｈ＊０　　　　３７０　　３７０　
　　ｉｓｓ　　　９２ＮａＦｅＥＤＴＡ　　　　　　　
　　　　３６．７　　　３６．７　　　１８．５　　　
９．２５Ｈ，Ｂｏ、６．２　　１２．４　　３．１　　
１．５５ＭｎＳＯ４＊Ｈ１０１６，９３＆６　　　＆５
　　４．２５ＺｎＳＯ４ｓ　’ｙＨ，ｏ　　　　　　ａ
、ａ　　　２１．０　　４．３　　１１５０ｕ８０４＊
５Ｈ１００，０２５０，０５０，０１２０，００６Ｎａ
１Ｍｏ０４”　　２Ｈ１００，２５０，５００，１１８
０，０５９ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
８３Ｌ６６　　　０．４２　　　０．２１０ｏＳＯ４＊
　’ＩＨ＠０　　　　０．０２５　　０．０５　０．０
１２　０．００６パントテン酸　　　　　ＬＯ１，０−
−Ｍｙｏイノシトール　　１００．０　１００．０　　
−　−ビオチン　　　　　　　ｏ、ｏｉ　　　ｏ、ｏｉ
　　　　−−ニコチン酸　　　　　　１．０　　１．０
　　０．５　　０．５ピリドキシン　　　　　１．０　
　１．０　　０．１　　０．１チアミン　　　　　　　
１．０　　１．０　　０．１　　０．１グリシン　　　
　　　　　−　　　−３，０３，０シヨ糖　　　　　　
　３０．０ｇ２０，０ｇ２０．０９　２０．０ｇｐＨ５
，８５，８６，０６，０ 注） ＊　未改質ムラシゲ　スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ８
ｋｏｏｇ　）溶液 ＊＊　この栄養溶液は３倍の手製度量（ｈａｌｆ−ｓｔ
ｒｅｎｇｔｈ　ａｍｏｕｎｔ　）窒素を有する０、５倍
濃度（ｏｎｅ　　ｈａｌｆ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　）　Ｍ
　Ｓ　３である（実施例２参照）。

表２：　ベニバナツメクサ根を用いる培養用低−ＫＮ０
．　　　　　　　　　　８０　　　　３２００ａ（ＮＯ
ｓ）＊・４Ｈ＊ｏ　　　　　３００　　　１２００ＫＯ
１６５ ＩＧ（、ＰＯ，２Ｑ　　　　　２０ ＮａＨｙ　ＰＯｙ Ｍｇ８０４・７Ｈｚ０　　　　　７２０　　　７２ＯＮ
ａｔＳＯ４２００２０Ｏ ＮａＦｅ　ＥＤＴＡ　　　　　　　　３６．７　　　　
３６．’ＩＨｍＢＯｍ　　　　　　　　　　　”・５１
°５Ｍｎ　８０４　”　Ｈ鵞０　　　　　　　５．３　
　　　５．３Ｚｎ８０ａ”　５Ｍｍ０　　　　　　　　
　　　　　　　３．０　　　　　　　　　　　＆００ｕ
ＳＯ４”　５Ｈ雪０　　　　　０．０１９　　　０．Ｏ
１９ＮａｌＭｏＯ４”　２Ｈ鵞０　　　　　　　　　０
．００２５　　　　　　０．００２５ＫＩ　　　　　　
　　　　　　Ｏ，７５０，７５グリシン　　　　　　　
　　３，０　　　　３．０ニコチン酸　　　　　　　０
，５　　　　０．５ピリドキシン　　　　　　　０，１
　　　　０．１チアミンＨｏｔ　　　　　　、　０．１
　　　　０．１シヨ糖　　　　　　　　２０．０９　　
　２０．０ｇｐＨ５，５−６，５５，５−ａ　５ 菌類胞子の調製 ■λＭ菌類ギガスポラ　マルガリタ（徂註痺■賜」吐山
）の胞子を、トムラップ（Ｔｏｒ圃ｅｒｕｐ　）および
キッドバイ（Ｋｉｄｂｙ　　）が記載した方法αηを用
いて表面滅菌した。次いで表面滅菌した胞子を、１ウエ
ルあたり０．５−の無菌液体ペプトン−酵母抽出物溶液
（表３）を含有するマルチウェル組織培養プレートでプ
レ発芽させた。１ウエルあたシ５−１０個の表面滅菌し
た胞子をインキュベートした。胞子の発芽および汚染状
態を５−７日間に亘ってモニターした。

一３！− 表３：　グロムス種（Ｇｌｏｍｕｓ　ｓｐｐ＋　）およ
びギガスボア種（凱丑泗ムｓｐｐ、　）の胞子をプレ発
芽させるために使用したペプトン−酵母ペプトン（Ｏｘ
ｏｉｄ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｅｐｔｏ
ｎｅ）　　　１．０酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ　）　　　
　　　　　　　０．２Ｍりｓｏ、・７Ｈ鵞０　　　　　
　　　　　　１．２３０ａＯＬ鵞”　２　Ｈ＊ＯＯ，０
１５ Ｍ０Ｐ８　　　　　　　　　　　　　　　　２．０９ｐ
Ｈ６，５ 根および菌類胞子の基　への接種 液体、寒天（１０９Ｄｌｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ寒天／リッ
トル）あるいは多孔質（バーミキュライ）、１００チ；
バーミキュライトおよびビート、　　９５．５　ｖ／ｖ
）基体と濾過滅菌した栄養溶液（ＭＷ　Ｉ、　ｐＨｅ、
　５、表２）を含有するベトリ皿（直径８ｃｒｒＬ×深
さ２ｃｌｎ）５０の側根チップを有するクロン化された
ベニバナツメクサ（實用車画廁相用選）根の群まシとギ
ガスボア　マルガリタ（伍翻」且１匹」紅江Ｏの表面滅
菌したプレ発芽胞子１５−２０個とを接種した。プレー
トは１処置あた９１０枚用いた。根の材料を多孔質基質
の表面に置いた。プレートを２層のパラフィルムで密封
し、２８℃、暗所でインキュベートした。エアレーショ
ン’ｉ促進ｔべく液体培養物を６０　ｒｐｍで連続振盪
させた。４週間後培養物を採取し、分析した。

椴ｉ寵Ω魚土丘値 培養物の発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　）を幾つかの
方法で評価した。根の生長状態を、根を１５分分間−標
本プロッタ間に吸取らせた後すぐの重量基準（ｆｒｅｓ
ｈ　ｗｅｉｇｈｔ　ｂａｓｉｓ　）に基づいて調べた。

ＶＡＭコロニー化の程度は、新鮮な根を１０％ＫＯＨ中
、８０℃で４時間、次いで室温で一晩処理した後測定し
た。次いで根を水道水で洗い、１％ＨＯ６で酸性化し、
ラクトグリセロール（乳酸。

グリセロール、水：　１　：　１　：　１　：　ｖ／ｖ
／ｖ　）に溶解した０、　０５　％　）リバンブルーで
染色後、コルマニク（Ｋｏｒｍａｎｌｋ　）およびマツ
クグロ−（ＭｃＧｒａｗ）の方法（イ）を用いてラクト
グリセロール中で一晩脱着色させた。こうすると、ＶＡ
Ｍ菌類でコロニー化された根の網状組織部分がブルー染
色によりはっきりと区別された。ＶＡＭ発達の初期段階
のサンプルの場合、個々のコロニー化点が明確になると
、明らかな染色機をペトリ皿に分散し、感染ユニットの
数を系統的に数えることによってｖλＭ感染数が測定さ
れΔ。根の長さに対する根培養物のＶ　Ａ　Ｎコロニー
化（知はグリッド　インターセプト法Ｑｐを用いて測定
した。

ぺ）　Ｉ）血中の培養物の胞子形成指数は、皿の底を通
して目に見える胞子の数を系統的に数えることによって
求められた。

胞子の生存度は、根の器官培養物中に形成された胞子を
無菌状態下で無菌の水寒天あるいはベブ２８℃でインキ
ュベートし、７，１４および２１日後に胞子の発芽状態
をチェックすることによって評価した。

第５表の結果から、根の生長については処置間で差異が
ないが、■ＡＭの発達については多孔質培地を用いた方
が液体あるいは寒天培地に比べて優れていることが判明
した。培養物あたりのＶＡＭ感染数は、バーミキュライ
ト培養物やバーミキュライト　ピート培養物では液体あ
るいは寒天中よシも有意に多かった。多孔質培地を使用
するとコロニー化パーセントは顕著に増大した。更に、
培養物間のＶＡＭコロニー化および胞子形成における頻
度は増大した。バーミキュライト基体で生産された培養
物は実質的に全てコロニー化されかつ胞子形成された。

新鮮な培地に移された５０個の新たに形成された胞子の
うち、２４個（４８％）が２１日以内に発芽し、良好な
胞子生存度を示し一３計− た。

表４：ＶＡＭ根の器官培養物を定着させる際に用いた１
ぺ）　ＩＪ皿あたシの多孔質基体お粗バーミキュライト
（１００チ）　　　５５　　　　３０＋８石英砂　　　
　（１００ヂ）　　　６５　　　　１８バーライト（Ｉ
Ｗａ：　１００％）　　　　６０　　　　２５バーミキ
ュライト−砂（５０：５０　Ｓｖ／ｖ）　　　６０　　
　　　２２−３を− 表５二　ギガスポア　マルガリタ（唄脛凹μ＝■ｌ田）
を接種したベニバナツメクサの根の器官培養物のＶＡＭ
発達に及ぼす液体　５００±６２２±２０．５±０．２
　６５　　０固　体（寒天）４６２±１７９　１４±１
２　　１．３±１．０　　　　８０　　　　１０多引 （パ 実施例２ 各種栄養溶液で湿潤させたパーミギュライト基。

体におけるギガスボア　マルガリタ（凱訓■旧狐」ｌ旦
）によるベニバナツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍｉｎｃ
ａｒｎａｔｕｍ　）の根の器官培養物のＶＡＭコロニー
化： 滅菌バーミキュライトｓ、（ｌｅ収容するペトリ皿（直
径８Ｃｒｎ×深さ２α）に濾過滅菌した栄養溶液２８ゴ
を導入した。１２種のＭＳ３塩溶液（表１）を用いて、
栄養溶液強度（ｓｉｒｅｎｇｔｈ）および相対窒素含量
のＶＡＭコロニー化に及ぼす影響を調べた。通常濃度（
表１）の０．２．　０．５．　１．０および２０倍の濃
度を有するＭＢ３塩についてテストした。各浴液強度で
窒素濃度を各レベルの１．０゜２０および３．０倍（Ｉ
Ｘ、２Ｘ、３Ｘ）に調整した。ＭＢ２の０．５倍強度で
その３倍の窒素を有する調製物を表１ではＭＢ２として
表示している。

全処置においてビタミン類、ショ糖およびｐＨは表１に
示す通りであった。各処置について１０枚のプレートを
用意した。

プレートに、ベニバナツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｌｕｍ−
２０個を接種した。前記したようにプレートをバラフィ
ルムで密封し、２８℃、暗所でインキュベートさせた。

７週間後、培養物を採取し、分析した。

結果（第６表）から明らかなように、栄養溶液の組成は
ベニバナツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｉｎｃａｒｎ
ａｔｕｍ）の根器官培養物の生育およびＶＡＭコロニー
化に大きな影響を及ぼした。ＭＳ３塩濃度を０．２強度
からＬＯ強度に増大すると根の新鮮重量も３−４倍に増
加した。更に増大させると、特に通常の９素レベル（１
×）の２倍（２×）や３倍（３×）の窒素濃度で根の生
育は横ばい状態になる傾向を示した。

通常の窒素レベル（１×）では、Ｍ８３塩濃度合０．２
強度から２０強度に増大させるとＶＡＭコロニー化度（
係）は１λ３チから１．８％に低下した。

しかしながら、窒素レベルをあげて２×窒素、３×窒素
を有する０、５強度ＭＳ３塩では、夫々２１．１％、３
２．０％のコロニー化ピークが認められた。

同様の結果が胞子形成でも認められた。通常の窒素レベ
ル（１×）で、ＭＳ３塩濃度を０．２強度から２０強度
に上げると胞子形成の程度は３２胞子／プレートから４
胞子／プレートに減少した。

また窒素レベルを上げると、３×窒素、２×窒素を有す
る０、５強度ＭＳ３塩で夫々最高７３〜８３胞子／プレ
ートの値を示した。

イオン強度２０−４０ｍＭ、絶対（ａｂｓｏｌｕｔｅ　
）リン濃度５−ｘｓｍｇ／ｌおよび絶対窒素濃度２５〇
−５００ｍｇ／ｌの溶液を用いたときに、これら培養物
の優れた性能が認められた。

表６二　ギガスポラ　マルガリタ（…Ｗ唾圧ｍｌ堕）を
接種したベニバナツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｊｎ
ｃａｒｎａｔｕｍ　）の根の器官培養物の生育、コロニ
ー化および胞子形成に０．２　　１０　　　３７１±　
７６１３．３±　７．３　　　３２±２３ＬＯ４７１＋
１３５　１３．６±６．６　　３１±２８３．０　　５
７７±１９８２４．２±　７．５　　２３±２゜ｏ、ｓ
　　ｉ、ｏ　　　ｇｏｏ±３４９　９．１±　６．１　
　２７±２９１０　　１２８０±２２０　２１．１±　
３．８　　　　８３±３２３．０　　１４３３±３８７
　３１０±１１．８　　　　７３±５６１．０　　１．
０　　１６２３±４３８　　６．６±　４．６　　　　
２８±３２２．０　　１８８６±４２２　１０．２±　
３．６　　　　２５±１４＆０　１８３９±３２７　２
１．５±　７．８　　３２±２２２、ＯＬｏ　　　２２
６ｇ±３３８　　１．８±　１．８　　　　　１＝４２
．０　１８９７±４１７　　＆６±　２’１　　　．１
±１１０　　１５８２±３２３　　１．４±　１，３　
　　　０±０実施例３ 多孔質培地におけるナンキンマメ（Ａｒａｃｈｉａｍ）
の根の器官培養物のギガスポラ　マ／ｌｚナンキンマメ
（Ａｒａｃｈｌｍ　ｋＨ匹註阻）の根の器官培養騨をア
ゼニック性不定根から次のようにして開始した。ナンキ
ンマメ（Ａｒａｃｈｌｍ　町匹ト懸）の種子を、０．０
５チツイーン２０を含有する次亜塩素酸ナトリウム１．
０チ溶液中で攪拌させながら真空下で１５分間浸漬させ
て表面滅菌した。次いで、無菌蒸留水で５回洗浄した。

前記と同様にして種子の不稔性をテストした。アゼニッ
ク性種子から、１チ寒天（ＤＩｆｃｏ　）を含みショ糖
を含まない（ｐＨ５，８）Ｍａｌ培地１００−を収容し
た滅菌５０〇−ジャー中で生育させた。こうして形成さ
れた苗からＬＯ−２，０（ｍ長の茎セグメントを切）取
り、これらセグメントの基底端を上にして無菌容器中の
１チ水寒天〔蒸留水ｌｔ中に１０９の（Ｄｉｒｃｏ　）
寒天を含む〕に中途まで差し込み、２−４週間インキュ
ベートして、アゼニック性不定根を形成させた。不定根
が形成されたとき、１１−２（長のチップ切片を切シ取
り、ペトリ皿内の１チ寒天を含むＭＳ２培地（表１）、
ｐＨ５，７上で培養した。ストック培養物をベトリ皿内
の同じ培地で維持して１４日継代培養した。

濾過滅菌したムラシゲ１スクーグ栄養溶液（表１のＭ　
Ｓ　３　）　２８　ｍｌで湿潤させた滅菌バーミキュラ
イト（１００％）５．０９ｆ収芥したベトリ皿（直径８
ｃＩｒＬ×深さ２　ｃｍ　）を、前記したようにして調
製した。プレートにナンキンマメ（Ａｒａｃｈｌｓｈｙ
ｐｏｇａｅａ　）根のクローン化セグメントとギガスボ
ア　マルガリタ（Ｑｌｇａｓｐｏｒａ　ｍａｒｇａｒｉ
ｔａ　）の表面滅菌したプレ発芽胞子１０−２０個を接
種した。パラフィルムで密封し、暗所で２８℃でインキ
ュベートした。４週間後、培養物を収穣（採集）し、分
析した。

培養物あたシのコロニー化チおよび感染数は測定しなか
った。何故なら、ナンキンマメ（Δ。

ｈｙｐｏｇａｅａ　）の根の皮層細胞が透明化および染
色過程で脱却（ｓｌｏｕｇｈ　ｏｆｆ　）する傾向を示
したからである。

それにもかかわらず、根は十分に生長しく４週後の新鮮
な重量は平均２００９±２３６１ｖ）、全ての培養物で
（コロニー化が起こったことを示す）マトリクス外ｔ・
（ｅｘｔｒａｍａｔｒｌｃａｌ　）菌糸の顕著な増殖が
認められ、５０％の培養物でＶＡＭ菌類の胞子形成が認
められた。

実施例４ 次のＶＡＭ根器官培養を開始させるための接種材料とし
ての、ＶＡＭ根器官培養物の使用：多孔質基体で果差さ
せたベニバナツメクサ（哲ｍ徂画助１１出匝）−ギガス
ポラ　マルガリタ（伍註泗旦狐ム用弁）ＶＡＭ根器官培
養物を接種材料として用いて、新しいベニバナツメクサ
根に次のアゼニック性ＶＡＭ根器官培養を開始させた。

この移動は、アゼニック性ＶＡＭ根器官培養物のバルク
を継代培養し増殖させる工程を指す。

５個のフエルンバツハフラスコ（２ａ　ｏ　ｏｉ）の各
々に、多くの窒素を含有する低塩改良ホワイイ）１．５
ｔを充填した。各フラスコに、ギガスポア　マルガリタ
（奥胛垣Ｑ暉玉枦弁）でコロニー化したベニバナツメク
サ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ　）根
の４個に部分的に切って均質化されたＶＡＭ根器官培養
物を接種した。これらの接種材料培養物トリ皿で形成さ
せた。接種材料は４周存在し、良好な菌糸繁殖と胞子形
成を示した。接種材料を、新しい多孔質培地に埋め込ん
だ４個の別々の塊９（ｃｌｕｍｐｓ　）に置いた。次い
で各フラスコにクローン化したベニバナツメクサ根の８
個の切片を接種した。根を予め添加したＶＡＭ接種材料
に重層させた。この上を１０厚さの無菌で予湿側させた
バーミキュライト基体の層でカバーした。フラスコに、
ぴったりと適合する無菌コツトン・ガーゼ栓を被せ、ア
ルミニウムホイルのキャップをした。

２８℃で暗所でインキュベートした。

８週後、培養物は良好な菌糸発達と胞子形成を示した。

５個のフラスコから採取した根サンプルのコロニー化（
％）は平均２６．１±７．３チであった。

菌糸および胞子がフラスコの内壁に沿って均一に分布し
ていることから判断して、ＶＡＭコロニー化は培養物全
体に広がっていた。

実施例５ 多孔質培地を含む４ｔプラスチツク製容器におけるＶＡ
Ｍ根器官培養物の産生： （オートクレーブ可能な）４ｔポリプロピレン製バッグ
１０個の各々に、高窒素含有改良（改質）ホワイト栄養
溶液（表２のＭＳ２）９３０−で湿潤させたバーミキュ
ライ）ＩＯｔを充填した。ラングロワ（Ｌａｎｇｌｏｌ
ｓ　）およびフォーティン（Ｆｏｒｔｌｎ　）（２）が
記載した如きメタル’８１　（ｍｅｔａｌ　ｃｏｌｌａ
ｒｓ　）とフオーム栓（ｆｏａｍ　ｐｌｕｇｓ）で密封
し、オートクレーブおよびシロツメフサ（−出…唾睡出
旦皿唾）の苗により滅菌し、冷却後接種した。実施例４
で記載した如き接種材料として、ＶＡＭ根器官培養物と
クローン化されたベニバナツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕ
ｍｉｎｃａｒｎａｔｕｍ　）根の新しい切片を用いた。

培養物を再びシールし、２８℃、暗所でインキュベート
した０ ８週間後、培養物は良好なＶＡＭ発達および胞子形成を
示１〜だ。１０個のバッグから採取した根サンプルのコ
ロニー化（チ）は平均２４．３±１１．６％であシ、胞
子密度は平均１．７胞子／ｍｔであった。

実施例６ 全植物体を接種するためのＶＡＭ根器官培養物の使用： 良好な菌糸増殖および胞子形成を示したＭＡ菌根器官培
養物〔ギガスボア　マルガリタ（Ｏｉ［別張ｍａｒｇａ
ｒｌｔａ　）を接種したベニバナツメクサ（Ｔｒｉｆｏ
ｌ　ｉｕｍＩｎｃａｒｎａｔｕｍ　）クローン〕を収穫
し、温室内の土壌ポット中で生育させたモロコシ（Ｓｏ
ｒｇｈｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　）施例２に記載した方法
を用いて、改良ホワイト栄養溶液（表２のＭＷ２）で湿
潤させたバーミキュライトを収容したベトリ皿で産生さ
せた。収穫時これらの培養物を軽く刻み、十分に混合し
、４５μｍスクリーン上で水道水で洗浄して過剰のショ
糖と塩を除去した。材料を部分的に空気乾燥して６０％
水分含量とし、滅菌した砂を含んだローム壌土を入れた
２、２１ポツトに重層した。１ボツトあたシ５０−の接
種材料を土壌表面下５αの層に置いた。２０個の接種済
ポットと２０個の非接種ポットを用意した。接種済ポッ
トと非接種ポットの半分に表面滅菌したモロコシ（鉦轟
唄ＹｕｊＪＬＭｊ）種子を、半分にはシロツメフサ（Ｔ
ｒｌｆｏｌｌｕｍｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ　）種子を
蒔いた。ポットを滅菌石英砂で根おおいをし、温室のペ
ンチに置いて１日あたり１８時間に及ぶ光同期で人工的
に光を与えた。

い生強度へグランド溶液（ｈａｌｆ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ
　Ｈｏａｇｌａｎｄｓ６ｏ１ｕｔｌｏｎ　）６！１を；
ｉｔ入し　　　　　　　　　　番い促゛−３た。８週間
後、植物を収 穫し、根のＶＡＭコロニー化を分析した。

モ０　コシ（８，ｖｕｌ胆匹）根は平均３４±１１チの
コロニー（Ｉｆ示し、シロツメフサ（ニー　−面山地国
）根は平均４６±８チのコロニー化を示した。未接種の
コントロール植物ではコロニー化がみられなかった。得
られた感染レベルは、全ポット培養物接種材料を用いた
ときに通常認められる程度であった。

（以下余白） 参考文献 （１）サンダース（５ａｎｄｅｒｓ、　Ｆ、Ｅ、　）　
、　Ｂ、モツス（Ｍｏ５ｓｅ）　、　　Ｐ、　Ｂ、ティ
ンカー（Ｔｉｎｋｅｒ）、　１９７５年。

内菌根（Ｅｎｄｏｍｇｃｏｒｒｈｉｚａｓ　）　、アカ
デミツク　プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、
ニューヨーク、６２６頁０ （２）マークス（Ｍａｒｋｓ、αＯ−）、　Ｔ、Ｔ、コ
ズロウスキイ（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｌ　）　、　１９７３
年、外菌根（Ｅｃｔｏｍｇｃｏ　−ｒｒｈｉｚａａ）　
、アカデミツク　プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
　）　、ニューヨーク、４４４頁。

（３）ゲルデマン（Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ、　Ｊ、　Ｓ、
　）　、　１９６８年。

ベシキュラー・アーピュスキュラー菌根と植物の生長（
Ｖｅｓｌｃｕｌａｒ−ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｇｃｏ
ｒｒｈｉｚａ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈ　）　
＋年刊植物病理学概観（人ｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ、　）、　　６　：　３９７−４１
８゜（４）　　ロス（Ｒｏｓｓ、　Ｊ、　Ｐ、　）　、
　　Ｊ、んハーバ−（Ｈａｒｐｅｒ）＋１９７０年、ダ
イズ収穫に対する内因性菌根の作用（Ｅｆｆｅｃｔ　ｏ
ｆ　Ｅｎｄｏｇｏｎｅ　ｍｇｃｏｒｒｈｌｚａ　ｏｎ　
５ｏｙｂｅａｎｙｉｅｌｄｓ）、植物病理学（Ｐｈｙｔ
ｏｐａｔｈ、　）、　６０　：１５５２−１５５６　。

（５）　　シエンク（５ｃｈｅｎｃｋ、　Ｎ、０．　）
　、　　几んキンロツホ（Ｋ１ｎ１ｏｃｈ　）、　Ｄ、
　Ｗ、ディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ　）、　１９７５年
、ダイズに関する内菌根菌類と根瘤線虫の相互作用（Ｉ
ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｍｇｃｏｒｒｈ
ｉｚａｌ　ｆｕｎｇｉ　ａｎｄｒｏｏｔ−ｋｎｏｔ　ｎ
ｅｍａｔｏｄｅ　ｏｎ　５ｏｙｂｅａｎ　）、　６０７
−６１７　頁。

Ｆ、Ｅ、サンダース（５ａｎｄｅｒｓ　）、　Ｂ、モッ
ス（Ｍｏ５ｓｅ　）。

Ｐ、Ｂ、ティンカー（Ｔｉｎｋｅｒ　）編、内菌根（Ｅ
ｎｄｏｍｇｃｏｒｒｈｌｚａｓ　）　、アカデミツク　
プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、　ニューヨ
ーク。

（６）ジョンペック（８ｃｈｏｎｂｅｃｋ、　Ｆ、　）
、　１９７８年。

高等植物の病気に対する抵抗性に対する内生菌根の影響
（Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｍｇ
ｃｏｒｒｈｉｚａ　ｏｎｄｌａｅａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔ
ａｎｃｅ　ｏｆ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ　）　、
植物病・植物保護誌（Ｚ、　Ｐｆｌａｎｚｅｎｋｒ、　
Ｐｆｌａｎｚｅｎｓｃｈｕｔｚ　）　。

１３５：１９１−１９６゜ （７）　　メンタ（Ｍｅｎｇｅ、　Ｊ、Ａ、　）　、　
１９８１年、菌根農業技術（Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ　ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｌｅｓ）、
　　３８３−４２４頁、低開発国のための革新的生物技
術に関する背景情報文書（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　Ｐａ
ｐｅｒｓ　ｆｏｒＩｎｎｏｖａｔｌｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｌｅｓ
ｓｅｒＤｅｖｅｌｏｐｅｄ　０ｏｕｎｔｒｌｅｓ　）、
米国政府印刷局（Ｕ、Ｓ。

Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｌｎｔｌｎｇ　０ｆｆｉｃ
ｅ　）　、ワシントンＤ、Ｏ，。

（８）　　モツス（Ｍｏａｓｅ、　Ｂ　）　、　１９８
１年、熱帯農業のベシキュラーーアービュスキュラー菌
根研究（Ｖｅｓｌｃｕｌａｒ−ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　
Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ　　Ｒａａａａｒｃｈ　　ｆｏｒ
Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　）　、　
／’クワイ帯農業・人的資源研究所（Ｈａｗａｉｉ　Ｉ
ｎ５ｔ口ｕｔｅ　ｏｆ　ＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ
　）　、研究報告（Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｕｌｌｅｔｉ
ｎ　）　１９４　、　８２頁。

（９）ヘラバー（Ｈｅｐｐｅｒ、　Ｏ，Ｍ、　）　、　
１９８４年、　ＭＡ菌根（ＶＡＭ）菌類の単離と培養（
ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄＯｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｖ
Ａ　ｍｇｃｏｒｒｈｉｚａｌ　（ＶＡＭ）　　ｆｕｎｇ
ｌ）、　　９５−１１２頁、Ｏ，Ｌパラエル（Ｐｏｗｅ
ｌｌ　）ｔ　ｎ１ｔＴ、バギャラジ（ＢａｇｙａｒａＪ
）、　Ｖ　Ａ菌根（ＶＡ　Ｍｙｃｏｒｒｈ１ｚａλＯＲ
Ｏプレス（ＯＲＯＰｒｅｓｓ　）　、　ボカ　ラドン（
Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ　）　、　　７　ｏリダ州。

αリ　メンタ（Ｍｅｎｇｅ、　Ｊ、Ａ、　）　、　１９
８４年、接種材料生産（Ｉｎｏｃｕｌｕｍ　ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ）　、　　１８７　２０３頁。

０、Ｌ、パラエル（Ｐｏｗｅｌｌ　）、　Ｄ、Ｊ、バギ
ャラジ（Ｂａｇｙａｒａｊ）　、　　Ｖ　Ａ菌根（ＶＡ
　Ｍｙ’ｃｏｒｒｈｌｚａ　）。

ＯＲＯプレス（ＯＲＯＰｒｅｓｓ　）　、ボカ　ラドン
（Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ　）　、　フロリダ州。

（ロ）モツス（Ｍｏｓｓｅ）ら、米国特許第４，２９４
，０３７号、１９８１年、菌根菌類の生産（Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ　ｏｆＭｙｃｏｒｒｈｌｚａｌ　Ｆｕｎｇｉ
　）。

（６）モツス（Ｍｏ５ａｅ、　Ｂ、　）　、　　αヘラ
パー（Ｈｅｐｐｅｒ　）。

１９７５年、根の器官培養物のベシキュラー・アービュ
スキュラー菌根感染（Ｖｅｓｌｃｕｌａｒ−ａｒｂｕｓ
ｃｕｌａｒ　ｍｇｃｏｒｒｈｌｚａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｎｓ　ｉｎ　ｒｏｏｔ　ｏｒｇａｎｃｕｌｔｕｒｅｓ
　）　、植物生理病理学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　）　、　　５　：　
２１５−２２３゜（２）　ミラー−ワイドマン（Ｍｉｌ
ｌｅｒ−Ｗｌｄｅｍａｎ、　Ｍ、Ａ、）、　　　　′Ｌ
、Ｓ、ワトラッド（Ｗａｔｒｕｄ　）　、　１９８４年
、トマト培養根におけるギガスポラ　マルガリタの胞子
形成（５ｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　７７　ｏｎ　ｒ
ｏｏｔｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｔｏｍａｔｏ　）　、
カナディアン　ジャーナル　オプ　マイクロバイオロジ
イ（Ｏａｎ、　Ｊ。

Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ、）、　　３０　：　６４２−６４
６゜Ｑ４　　ミュグニエ（Ｍｕｇｎｉｅｒ、　Ｊ、　）
　＋　Ｂ−ジャン（Ｊｕｎｇ）＋Ｊ、プリウル（Ｐｒ１
ｏｕｌ）、　１９８２年、小胞状体と潅木状部を有する
内菌根きのこのインビトロ取得方法（Ｐｒｏｃｅｄｅ　
Ｄ’０ｂｔｅｎｔｌｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｅ　Ｏ
ｈａｍｐｌｇｎｏｎｓＥｎｄｏｍｇｃｏｒｈｌｚｅｎｉ
　ａ　Ｖｅｓｌｃｕｌｅｓ　ｅｔ　ａ　Ａｒｂｕｓｃｕ
ｌｅｉ　）　。

係属中の仏画特許出願、ローヌ　ブーラン（Ｒｈｏｎｅ
Ｐｏｕｌｅｎｃ　Ｓ、Ａ−）　ｒ　サンドル　ド　／Ｉ
／　シｘ　／ｌ／　シュ（Ｃｅｎｔｒｅ　ｄｅ　Ｒｅｃ
ｈｅｒｃｈｅｓ　）　、　アントニイ（Ａｎｔｏｎｙ）
＋フランス。

（ト）マウル（Ｍａｕｌ、　Ｓ、Ｂ、　）、　Ｐ、Ａ、
レムケ（Ｌｅｍｋｅ）。

Ｗ、Ｌ、ゲルナー（Ｇｅｒｎｅｒ　）、　Ｊ、　Ｂ、ヨ
ーダー（Ｙｏｄｅｒ　　）、　１９８０年、固体基体上
で細胞を無菌培養するための方法と装置（Ｍｅｔｈｏｄ
　ａｎｄＡｐｐａｒａｔｕｓ　ｆｏｒ　５ｔｅｒｉｌｅ
　０ｕｌｔｊｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｓ　ｏｎ　
５ｏｌｉｄＳｕｂｓｔｒａｔｅｓ　）　、米国特許第４
．２０４．３６４号。

（至）シェードーモーズ（５ｈａｂｄｅ　−Ｍｏｓｅｓ
、　Ｍ）、　Ｔ、ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｌｇｅ　）　
、　１９７９年、器官培養（Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　）　、　　４０−５１頁、几、ダービン（Ｄｕｒｂ
ｌｎ　）編、ハナタバコ（Ｎ１ｃｏｔｌａｎａ　）　、
実験使用法（Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｕｓｅ　）　、米国農務省技術紀要
（Ｕ、　Ｓ、　Ｄ、　Ａ、　ＴｅｃｈｎｉｃａｌＢｕｌ
ｌｅｔｉｎ　）　１５８６゜ ０カ　トマラツプ（Ｔｏｍｍｅｒｕｐ、　１．　Ｏ，）
、　Ｋ、に、キトビイ（Ｋｉｄ）＋３＋）、　１９８０
年、ベシキュラーーアービュスキュラー内生植物の無菌
性胞子の生産とその化学的物理的ストレス後の生存能（
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ　ａｓｃｅｐｔｌｃ　５ｐｏ
ｒｅｓ　ｏｆ　ｖｅｓｌｃｕｌａｒ　−ａｒｂｕａｃｕ
ｌａｒｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｖ
ｌａｂｌｌｉｔｙ　ａｆｔｅｒ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａ
ｎｄｐｈｙｓｉｃａｌ　５ｔｒｅｓｓ　）　＊応用環境
微生物学（Ａｐｐｌ−Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｌｃｒｏｂ
ｉｏｌ、　）　、　　３９　：　１１１１−１１１９゜
［相］　ホワイト（Ｗｈｉｔｅ、　Ｐ、　Ｒ，）　、　
１９３８年、双子葉植物から切除した根の培養（０ｕｔ
ｉｖａｔｌｏｎ　ｏｆｅｘｃｉｓｅｄ　ｒｏｏｔｓ　ｏ
ｆ　ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ｐｌａｎｔｓ　）
　、米国植物誌（Ａｍ、Ｊ、Ｂｏｔ、）、　　２５　：
　３４８−３５６゜（６）ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇ
ｅ、　Ｐｍ　）　、　Ｆ、スクーグ（８ｋｏｏｇ）、　
１９６２年、急速生長用改良培地と培養タバコ組織を用
いたバイオアッセイ（Ａｒｅｖｉｓｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ
　ｆｏｒ　ｒａｐｌｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｂｉｏ
ａｓｓａｙｓｗｉｔｈ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｔｌａｓｕｅ
ｃｕｌｔｕｒｅａ　）　、生理植物学（Ｐｈｙａｉｏｌ
、ＰＩａｎｔ）、　　１５　：　４７３−４９７゜（１
）　コーアニク（Ｋｏｒｍａｎｌｋ、　Ｐ、　Ｐ、　）
、　Ａ、　０．　マツフグロウ（ＭｃＧｒａｗ）　、　
１９８２年、植物根中のペシキュラーーアービュスキュ
ラー菌根の定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏ
ｆ　ｖｅｓｌｃｕｌａｒ−ａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｇｃ
ｏｒｒｈｌｘａｅ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｒｏｏｔａ　）
、　　３７−４５頁。

Ｎ、０．シエンク（８ｃｈｅｎｃｋ）編、菌根研究の方
法と原理（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌ
ｅｓ　ｏｆ　ＭｙｃｏｒｒｈｌｚａｌＲｅｓｅａｒｃｈ
　）　、米国植物病理学会（ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈｙｔ
ｏｐａｔｈｏｌｏｇｌｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　）　、
　セイントボール。

ミネソタ州。

に）　ジオバネツチ（Ｇｌｏｖａｎｅｔｔｌ、　Ｍ、　
）＋　Ｂ、モツス（Ｍｏｓｓｅ）、　１９８０年、ペシ
キュラー　アービュスキュラー菌根の根への感染を測定
する技術の評価（Ａｎ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　
Ｔｅｃｈｎｌｑｕｅａ　、ｆｏｒ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ
Ｖｅｉｌｃｕｌａｒ　Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　　Ｍｙｃ
ｏｒｒｈｉｚａｌ　　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　　１ｎＲｏ
ｏｔｓ）、新植物学（Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌ、　）　、
　　８４　：　４８９−５００゜ （イ）　ラングロワ（Ｌａｎｇｌｏｌｓ、　Ｏ，Ｇ、　
）、　Ｊ、　Ａ、、　　フォーティン（Ｆｏｒｔｉｎ　
）、　１９８２年、コンテナ輸送した苗木の菌根生長（
Ｍｙｃｏｒｒｈｌｚａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏ
ｆＯｏｎｔａｉｎｅｒｉｚｅｄ　Ｔｒｅｅ　Ｓｅｅｄｌ
ｉｎｇｓ　）　、　　１８３−２０２頁、カナダ森林局
００ＪＦＲＯシンポジウム会報（０ＯＪＦＲＯＳｙｍｐ
、　Ｐｒｏｃ、　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ
　５ｅｒｖｉｃｅ）。

Ｊ、　Ｂ、スカラット（５ｃａｒｒａｔ）　、　Ｏ，ブ
レラム（Ｇｌｅｒｕｍ　）、　ｃ、　Ａ、プレクスマン
（Ｐ　ｌａｘｍａｎ　）編。

スーセントメリー、オンタリオ。

（至）ベグランド（Ｈｏａｇｌａｎｄ、　Ｄ、　Ｒ，）
、　Ｄ、　１．　　アーノン（Ａｒｎｏｎ）、　１９５
０年、土壌を用いない植物の水栽培法（Ｔｈｅ　ｗａｔ
ｅｒ−ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｇｒｏ
ｗｉｎｇｐｌａｎｔｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　５ｏｉ１　）
　、カリフォルニア農業研究センター（０ａｌｉｆ、　
Ａｇｒｌｃ、　Ｅｘｐｔ、　８ｔａ、　０ｉｒｃ、　）
　。

３４７．３２頁。

特定の応用例に関して本発明を説明してきたが、本発明
の原理は当業者には明らかな他の応用も可能である。し
たがって、本発明は特許請求の範囲に規定したように解
すべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は（長手方向の断面で示した）植物の根と共生し
ているＶＡＭ菌の菌糸、潅木状部（ａｒｂｕｓｃｕｌｅ
ｓ　）　、小胞状体（ｖｅｓ（ｃ）ｅｓ）および胞子を
示すＶＡ菌根共生の概略図である。 第２図は多孔性栄養培地を内包する容器中で組織培養し
た根と共生しているアゼニック性ＶＡＭ菌接種物を生産
する本発明の方法のフローチャートである。

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. （１）多孔性培地で器官培養した根と共生するアゼニッ
   ク性ベシキュラーアービュスキュラー菌根菌類の生産方
   法であつて、 （ａ）無菌の栄養溶液と無菌の多孔性基体を用いて無菌
   の多孔性培地を作成し、 （ｂ）この多孔性培地に根の接種材料を植え付けて根の
   器官培養物を形成し、 （ｃ）この根の器官培養物にベシキュラーアービュスキ
   ュラー菌根菌のアゼニック性予発芽胞子を接種し、 （ｄ）この胞子を接種した根の器官培養物をインキュベ
   ートして、アゼニック性ベシキュラーアービュスキュラ
   ー菌根をもつ根の器官培養物を得るステップからなる方
   法。
2. （２）前記の菌がグロムス属（￥Ｇｌｏｍｕｓ￥）とギ
   ガスポラ属（￥Ｇｉｇａｓｐｏｒａ￥）から成る群から
   選択されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。
3. （３）前記の菌がグロムスエツニカツム種（￥Ｇｌｏｍ
   ｕｓ￥　￥ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ￥）、グロムスモツセ
   アエ種（￥Ｇｌｏｍｕｓ￥　￥ｍｏｓｓｅａｅ￥）、グ
   ロムスイントララジシエス種（￥Ｇｌｏｍｕｓ￥　￥ｉ
   ｎｔｒａｒａｄｉｃｉｅｓ￥）およびギガスポラマルガ
   リタ種（￥Ｇｉｇａｓｐｏｒａ￥　￥ｍａｒｇａｒｉｔ
   ａ￥）から成る群から選択されることを特徴とする特許
   請求の範囲第２項に記載の方法。
4. （４）根の接種材料が草本植物に由来することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の方法。
5. （５）根の接種材料がベニバナツメクサ（￥Ｔｒｉｆｏ
   ｌｉｕｍ￥　￥ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ￥）に由来するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の方法。
6. （６）根の接種材料がナンキンマメ（￥Ａｒａｃｈｉｓ
   ￥　￥ｈｙｐｏｇａｅａ￥）に由来することを特徴とす
   る特許請求の範囲第４項に記載の方法。
7. （７）多孔性基体が、自由なガス拡散が可能であり湿潤
   性であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。
8. （８）前記栄養溶液の窒素含量が２５０ｍｇ／ｌ〜５０
   ０ｍｇ／ｌの濃度範囲であり、イオン強度が約２０〜４
   ０ｍＭであり、リン濃度が約５〜１５ｍｇ／ｌの範囲で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第６項の
   いずれかに記載の方法。
9. （９）前記多孔性基体が粒状であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。
10. （１０）多孔性基体、栄養溶液、アゼニック性の根の接
    種物、およびベシキュラー菌根菌の予発芽胞子からなる
    、アゼニック性ベシキュラーアービュスキュラー菌根を
    もつ根の器官培養物。
11. （１１）前記多孔性基体が、自由なガス拡散が可能であ
    り湿潤性であることを特徴とする特許請求の範囲第１０
    項に記載の培養物。
12. （１２）前記多孔性基体が粒状であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１０項に記載の培養物。
13. （１３）前記粒状の多孔性基体がバーライト、バーミキ
    ュライト、砂、ビート、顆粒状モンモリロナイト粘土調
    製物、およびこれら基体の組合せから成る群から選択さ
    れることを特徴とする特許請求の範囲第１２項に記載の
    培養物。
14. （１４）前記アゼニック性の根が草本植物に由来するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の培養物
    。
15. （１５）前記アゼニック性の根がベニバナツメクサ（￥
    Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ￥　￥ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ￥）に
    由来することを特徴とする特許請求の範囲第１４項に記
    載の培養物。
16. （１６）前記アゼニック性の根がナンキンマメ（￥Ａｒ
    ａｃｈｉｓ￥　￥ｈｙｐｏｇａｅａ￥）に由来すること
    を特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載の培養物。
17. （１７）前記栄養溶液の窒素含量が２５０〜５００ｍｇ
    ／ｌの濃度範囲であり、イオン強度が約２０〜４０ｍＭ
    であり、リン濃度が約５〜１５ｍｇ／ｌの範囲であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の培養物
    。
18. （１８）アゼニック性ベシキュラーアービュスキュラー
    菌根をもつ根の器官培養物の継続培養を開始する方法で
    あつて、 （ａ）無菌の栄養溶液と無菌の多孔性基体を用いて無菌
    の多孔性培地を作成し、 （ｂ）この多孔性培地に根の接種材料を植え付けて根の
    器官培養物を形成し、 （ｃ）この根の器官培養物にベシキュラーアービュスキ
    ュラー菌根菌のアゼニック性予発芽胞子を接種し、 （ｄ）この胞子を接種した根の培養物をインキュベート
    し、 （ｅ）このアゼニック性ベシキュラーアービュスキュラ
    ー菌根をもつ根の培養物を収穫し、 （ｆ）この培養材料を新たな無菌の多孔性培地中に重層
    し、 （ｇ）この根の器官培養物をインキュベートし、こうし
    てアゼニック性ベシキュラーアービュスキュラー菌根菌
    を含有する根の継続培養を開始することからなる方法。
19. （１９）前記重層ステップの後、根の器官培養物をイン
    キュベートする前に前記多孔性培地を新たな根の器官培
    養物で覆うことを特徴とする特許請求の範囲第１８項に
    記載の方法。
20. （２０）前記の菌がグロムス属（￥Ｇｌｏｍｕｓ￥）と
    ギガスポラ属（￥Ｇｉｇａｓｐｏｒａ￥）から成る群か
    ら選択されることを特徴とする特許請求の範囲第１８項
    または第１９項に記載の方法。
21. （２１）前記の菌がグロムスエツニカツム（￥Ｇｌｏｍ
    ｕｓ￥　￥ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ￥）、グロムスモツセ
    アエ（￥Ｇｌｏｍｕｓ￥　￥ｍｏｓｓｅａｅ￥）、グロ
    ムスイントララジシエス（￥Ｇｌｏｍｕｓ￥　￥ｉｎｔ
    ｒａｒａｄｉｃｉｅｓ￥）およびギガスポラマルガリタ
    （￥Ｇｉｇａｓｐｏｒａ￥　￥ｍａｒｇａｒｉｔａ￥）
    から成る群から選択されることを特徴とする特許請求の
    範囲第２０項に記載の方法。
22. （２２）根の接種材料がベニバナツメクサ（￥Ｔｒｉｆ
    ｏｌｉｕｍ￥　￥ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ￥）から単離さ
    れることを特徴とする特許請求の範囲第２０項に記載の
    方法。
23. （２３）根の接種材料がナンキンマメ（￥Ａｒａｃｈｉ
    ｓ￥　￥ｈｙｐｏｇａｅａ￥）から単離されることを特
    徴とする特許請求の範囲第２０項に記載の方法。
24. （２４）前記栄養溶液の窒素含量が２５０ｍｇ／ｌ〜５
    ００ｍｇ／ｌの範囲であり、イオン強度が約２０〜４０
    ｍＭであり、リン濃度が５〜１５ｍｇ／ｌの範囲である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１８項または第１９
    項に記載の方法。
25. （２５）ベシキュラーアービュスキュラー菌根の全植物
    体内での共生関係を起こさせる方法であつて、 （ａ）無菌の栄養溶液と無菌の多孔性基体を用いて無菌
    の多孔性培地を作成し、 （ｂ）この多孔性培地に根の接種材料を植え付けて根の
    器官培養物を形成し、 （ｃ）この根の器官培養物にベシキュラーアービュスキ
    ュラー菌根菌のアゼニック性予発芽胞子を接種し、 （ｄ）この胞子を接種した根の器官培養物をＶＡＭ共生
    が成立するまでインキュベートし、 （ｅ）このＶＡＭをもつ根の器官培養物を収穫し、 （ｆ）このベシキュラーアービスキュラー菌根をもつ器
    官培養物を植え付けミックス中の全植物体に接種し、 こうしてベシキュラーアービュスキュラー菌根の生成を
    全植物体内で起こさせることからなる方法。
26. （２６）前記の根の器官培養物に予じめ樹立したアゼニ
    ック性ベシキュラーアービュスキュラー菌根菌をもつ根
    の器官培養物を接種することを特徴とする特許請求の範
    囲第２５項に記載の方法。
27. （２７）前記全植物体が温室または苗床で生育した園芸
    作物であることを特徴とする特許請求の範囲第２５項に
    記載の方法。
28. （２８）前記の菌がグロムスエツニカツム（￥Ｇｌｏｍ
    ｕｓ￥　￥ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ￥）、グロムスモツセ
    アエ（￥Ｇｌｏｍｕｓ￥　￥ｍｏｓｓｅａｅ￥）、グロ
    ムスイントララジシエス（￥Ｇｌｏｍｕｓ￥　￥ｉｎｔ
    ｒａｒａｄｉｃｉｅｓ￥）およびギガスポラマルガリタ
    （￥Ｇｉｇａｓｐｏｒａ￥　￥ｍａｒｇａｒｉｔａ￥）
    から成る群から選択されることを特徴とする特許請求の
    範囲第２５項に記載の方法。
29. （２９）根の接種材料が草本植物に由来することを特徴
    とする特許請求の範囲第２５項に記載の方法。
30. （３０）根の接種材料がベニバナツメグサ（￥Ｔｒｉｆ
    ｏｌｉｕｍ￥　￥ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ￥）に由来する
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２９項に記載の方法
    。
31. （３１）根の接種材料がナンキンマメ（￥Ａｒａｃｈｉ
    ｓ￥　￥ｈｙｐｏｇａｅａ￥）に由来することを特徴と
    する特許請求の範囲第２９項に記載の方法。
32. （３２）前記栄養溶液の窒素含量が２５０ｍｇ／ｌ〜５
    ００ｍｇ／ｌの範囲であり、イオン強度が約２０〜４０
    ｍＭであり、リン濃度が約５〜１５ｍｇ／ｌの範囲であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第２５項に記載の方
    法。
33. （３３）接種された培地を、前記のアゼニック性ベシキ
    ュラーアービュスキュラー菌根をもつ根の器官培養物の
    インキュベーションと生育用の殺菌したプラスチック製
    容器に分け入れるステップを含むことを特徴とする特許
    請求の範囲第１項、第１８項または第２５項に記載の方
    法。
34. （３４）２５０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌの範囲の窒素
    含量を有し、イオン強度が約２０〜４０ｍＭであり、リ
    ン濃度が５〜１５ｍｇ／ｌの範囲である、根の器官培養
    用栄養溶液。
35. （３５）２５０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌの範囲の窒素
    を有し、イオン強度が約２０〜４０ｍＭであり、リン濃
    度が５〜１５ｍｇ／ｌの範囲である改良ムラシゲースク
    ーグ媒質からなる栄養溶液。