JPS62118896A - 酵母の外質隙中に局在するポリペプチドの回収法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵母により製造されそして少なくとも部分的
にそれの外質隙（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　　５ｐａｃ
ｅ）中に局在しているポリペプチド類を水性媒体中に放
出させるための方法に関するものである。より特に、本
発明はその目的のために遺伝的に操作された酵母により
製造されるリゾチームを水性媒体中に放出させるための
方法に関するものである。

酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、商業的に興味
のあるポリペプチド類を発酵により製造する際に意図さ
れる遺伝的操（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ）作用の宿
主としてますます使用が増えてきている。この酵母の使
用量増大は、例えば酵母が特に食餌性有機体であるとい
う゛バ実のように他の工業用微生物類より優れている点
などの種々の利点により説明できる。酵母の他の利点は
、それの培養に絶対的な殺菌条件が必要でなくそのため
大規模な発酵用に特に適していることである。嫌気性条
件下でそれが生存できるために、代謝産物類の連続的製
造用に非可動性形にすることもできる。

酵母をポリペプチド類、例えば酵素類、を製造するため
に使用する時には、それらを原形質膜を通って分泌させ
そして発酵媒体中に排出させる点が明らかに重要であり
１次にそれらを例えば吸着または親和力クロマトグラフ
ィの如き公知の技術を使用することにより該媒体から回
収できる。酵母の原形質膜を通って分泌される蛋白質類
は外質隙に閉じこめられて保有されるかまたは少なくと
も細胞壁と結合して保有される傾向があることは知られ
ている。これはサツカロミセス属の、そして特にＳ、セ
レヴイシエ種の、酵母中でしばしば観察される（Ｒ，シ
ェックマン（ＳＣＨＥＫＭＡＮ）　およびＰ、／ヴ４−
／　り（ＮＯＶＩＣＫ）著、酵母サツカロミセスの分子
生物学、代謝および属表示（ｔｈｅ　　Ｍｏ、１ｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｂｉｏｌ。

ｇｙ　　ｏｆ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ、　　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　　ａｎｄ　　Ｇｅ
ｎｅ　　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、Ｊ、Ｎ、ストラサー
ン（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ）他編集、コールド・スプリン
グ・ハーバ−、ニューヨーク、１９８２．３６１−３９
３頁）、シかしながら、酵母にある種の機能的利益をも
たらすこの特性は商業的に興味のある蛋白質類の発酵に
よる製造の実施時には実際的な観点からすると大きな欠
点となる。

実際、当該蛋白質は細胞に結合して保有されているため
細胞内蛋白質の場合のように細胞物質全体から分離しな
ければならないので、そのような場合には生じた利点が
興味ある蛋白質を回収するための分泌により失われてし
まう。酵母が分泌した蛋白質類を酵ｌす壁に結合させて
保有するというこの酵母の傾向は、これらの蛋白質類の
ほとんどが大量にグリコジル化されているという事実の
ためであるとされていた。このことは、大きい割合で本
質的にマンノースからなる多糖類を含有している転化酵
素および酸性燐酸酵素の場合にそうである。これらの蛋
白質類のグリコジル化された部分の一機能は、蛋白質類
を本質的にマンノースだけからなる壁の多糖類マトリッ
クスに結合させて保有することである（Ｊ、０．ランペ
ン（ＬＡＭＰＥＮ）ｉ、アントニイΦヴアン・リイウベ
ンヘーク（Ａｎｔｏｎｉｅ　　ｖａｎ　　Ｌｅｅｕｖｅ
ｎｈｏｅｋ）、３４．１−１８．１９６８）、この説明
によると、Ｍａｔα−型酵母類またはある種の酵母菌株
により製造されたキラー蛋白質のα−因子の媒体中への
排出はそれらがグリコジル化されていなかったという事
実から解釈できる。

しかしながら、グリコジル化されていない異型の蛋白質
類が酵母中に現われる時には製造される蛋白質の一部分
だけしか媒体中に排出されないということがしばしば起
き、それが原形質膜を通る分泌を可能にするシグナル配
列を備えている時でさえ起きる。人間のＣ１インターフ
ェロンの場合にそうであり（Ａ、シン（ＳＩＮＧＨ）他
著、ヌクレイツク・アシズΦリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）、１２．８９２７−８９
３８．１９８４）、それの分泌は酵母α因子の先駆体の
先導配列用にコード付けされているＤＮＡと対応する属
の融合により保証されているのだが、それらの半分しか
媒体中で観られない、このことは、自身のシグナル配列
の結果として分泌される鶏のリゾチームの場合でもそう
である（ベルギー特許番号９０１，２２３）、そのよう
な場合には蛋白質の可溶性部分だけを回収できるが、こ
れが収率の損失をもたらすことは明白である。

また、細胞に結合して保有されている部分を回収するこ
ともできるが、これには余分の操作が必要である。いず
れの解決法も高い製造費用がかかり、そのことは酵母を
製造用の有機体として使用する際の上記の利点をある程
度減じることとなろう。

本発明の主な目的は、酵母により製造されそして排出さ
れているか外賀隙内に部分的にもしくは全部が局在して
いるようなポリペプチド類を簡単な方法でしかも高収率
で回収するための方法を提供することである。より特に
、本発明の目的は意図的に遺伝的操作がなされている酵
母により製造されそして少なくとも媒体中に分泌されて
いる異型の蛋白質類を高収率で回収することである。さ
らに特に１本発明の目的は酵ｆｆｔＳ、セレヴイシエか
ら遺伝的操作の結果としてその中で製造されそして分泌
されたりゾチームを回収することである。

本発明に従うと、これらの酵母を水性媒体中で（ｉ）中
性の可溶性鉱物質塩（ｍｉｎｅｒａｌ　５ａｌｔ）およ
び（ｉｉ）　８〜１５の間にあるＨＬＢ　（親木性−親
脂性平衡）を有するポリエトキシル化されたアルキルフ
ェノール型の可溶性の非イオン性表面活性剤からなる系
により処理することからなる方法によりこれらの目的が
達成される。

酵母の培養媒体中に充分な濃度の塩化ナトリウムまたは
他の塩類、例えばＫＣＩもしくはＮａＮＯ３、が存在し
ているとそれらの中での可溶性蛋白質類が遊離しやすく
なるということは公知である。すなわち、通気媒体中で
のパン酵母の６時間にわたる培＠後の媒体中の蛋白質量
は０．６ＭのＮａＣ１の存在下では塩の不存在下の場合
よりも３倍はど高いということが示されている（Ｔ、Ａ
、フランクリン（ＦＲＡＮＫＬＩＮ）他著、バイオチク
ノロシイ・アンド・バイオエンジニアリング・シンポジ
ウム（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＯｇＶａｎｄ　　Ｂｉｏｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　　ＳＶｍｐ　、）　、　Ｎｏ　
、　１４，４６７．１９８４）、この結果は浸透圧衝撃
による蛋白質類の遊離では説明できず、その理由はＳ、
セレヴイシエの外質隙蛋白質類はこの処理により遊離さ
れないということが認められているからである（Ｗ、Ｎ
、アーノルド（ＡＲＮＯＬＤ）著、酵母細胞外包の物理
的な面；酵母細胞外包における生化学、生物理学および
超微細構造（Ｐｈｙｓｉｃａｌ　　Ａｓｐｅｃｔｓ　　
ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｅｎｖ
ｅｌｏｐｅ；　　ｉｎ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｃｅ１ｌＥｎ
ｖｅｌｏｐｅ：　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　　ａｎｄ　　Ｕｌｔｒａｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ）、１巻、Ｗ、Ｎ、アーノルド（ＡＲＮＯＬ
Ｄ）編集、ＣＲＣ・プレス・インコーホレーテッド、ポ
カ・ラドン、フロリダ、１９８１．２５−４７頁）、こ
の塩の作用機構は詳細には知られていないが、酵母細胞
壁と媒体中に可溶性の蛋白質との間でイオン結合が生じ
、塩の効果はこれらの結合を破壊しそして蛋白質を遊離
させることであろうと推測できる。この現象は下記の実
験でも証明できる。

最少量の媒体（３％のグルコース、０．６７％の酵母窒
素基質、０．００２％のヒスチジンおよびロイシン）中
で成長しそして静止相の最初のところで捕集された酵母
（Ｓ、セレウ゛イシエ、ＧＲＦ１８菌株）を、鶏のリゾ
チーム（ベリンガー・インゲルヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　ｌｎｇｅｌｈｅｉｍ）が６７０ｉｉ位／ｍｌの
懸濁液の濃度となるまで加えられであるＰＨが６．５の
０．１Ｍの燐酸塩緩衝液中に再懸濁させた。３７°Ｃに
おける２時間の培養後に、細胞を遠心分離し、そして上
澄み液中に存在しているリゾチームをり、シュガー（Ｓ
ＨｔＪＧＡＲ）の方法（バイオキミカＯ工・バイオフィ
ジカΦアクタ（Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ、Ｂｉ　ｏｐｈｙｓ、
Ａｅｔａ）、旦、３０２−３０９．１９５２）により測
定する。その結果、リゾチーム濃度は４４０単位／ｍｌ
、すなわち最初の値の６６％、でしかないことが示され
た。０℃においても同じ結果が観察された。初期培養の
上澄み液中で同一濃度および同一温度において培養され
たリゾチームは活性損失を示さなかったため、この結果
が培養中の酵素の部分的不活性化によるものではあり得
ない。

他の実験では、リゾチームの存在下での４°Ｃにおける
１時間の培養後にＮａＣｌを酵母懸濁液に０．５Ｍの濃
度となるまで加え、それを３０°Ｃにおいてさらに２時
間培養した。懸濁液を次に遠心し、そして）、澄み液中
に存在しているリゾチームを上記の如くして測定した。

初期のリゾチームの９８％が上澄み液中に溶解されてい
ると測定されたが、それに対してＮａＣ１が省略されて
いること以外は同一である実験では３８％であった。

これらの実験は、他のりゾチームは酵母の細胞壁に可逆
的に結合しており、媒体のイオン強度を増大させること
によりそこからそれを定量的に遊離できるということを
示している。この状態は。

細胞についているリゾチームがその中の分枝系属（Ｃ１
ｏｎｅｄ　　ｇｅｎｅ）の出現から生じる時には生じな
い。酵母中で１．４−β−Ｎ−アセチルムラミダシン活
性を有する酵素用のコードのついた属、例えば鶏のリゾ
チーム用のコードのついた属、が分枝および出現できる
ということは公知である（ベルギー特許９０１，２２３
）、このようにして酵母中で製造されたリゾチームは下
記の作用を示す；それは一部分培養媒体中に存在してお
り、そこからそれはＰＨ６，５の０．１Ｍ燐酸塩緩衝液
中の急速流動カルボキシメチルセファロース（ファーマ
シア）」；での吸着により分離され、その後同一緩衝液
で洗節され、次に０．５ＭのＮａＣ１が補充されている
同一緩衝液中で溶離される。このようにして得られた溶
離液を次に限外濾過によりｅ１ｉｌシ、セファデックス
Ｇ−２５（ファーマシア）上を通過させて脱塩し、限外
濾過により再濃縮し、そして凍結乾燥により乾燥する。

ドデシル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリアクリル
アミドゲル上での電気泳動法では１個だけの蛋白質帯が
示され、それは卵白から抽出された市販の鶏のりゾチー
ムのものと同じ電気泳動可動性を有していた。実際のと
ころ、上記の方法により培養媒体から抽出された蛋白質
のＮ−末端部の最初の１０個のアミノ酸類の配列は成熟
鶏のリゾチームのものと同一であることが示されていた
。この結果は１分枝症の出現により酵母中で製造された
プレリゾチームのシグナルペプチドが酵ｈＬにより正確
に認識されそして処理されて、酵母によってリゾチーム
が活性形で分泌されたことを明白に示している。しかし
ながら下記の実施例により証明されているように、酵母
により製造されるリゾチームの一部は上記の実験で示唆
されているように細胞を０．５ＭのＮａＣ１の存在下で
培養した時でさえ媒体中にＩｆｔｇｌされない。このリ
ゾチーム部分は、細胞を粉砕しそして細胞残層を遠心し
た後に検出でき、特に粉砕を０．５ＭのＮａＣ１の存在
下で実施した時に検出できる。従って、たとえＮａＣ１
の効果が示されているように思えるため該リゾチームが
部分的に一方だけの細胞成分上に吸着可能な場合でも、
該リゾチームは可溶性部分（分子内または性質性）に相
当すると結論づけることができる。

しかしながら、酵母により製造されるリゾチームの無視
できない部分が膜構造（原形質膜および／または細胞内
構造）と、多分プレリゾチームの形で、結合しうる可能
性がある０例えば酵母中で出現する子牛のキモシンは細
胞が崩壊して遠心可能な細胞残層になった後にそして充
分な洗浄後でさえかなりの部分が結合されて保有されて
いる（Ｊ、メラー（ＭＥＬＬＯＲ）他、Ｇｅｎｅ、２４
．１−１４．１９８３）、ある場合には、膜構造に結合
している蛋白質をエトキシル化されたアルキルフェノー
ル型の穏やかな表面活性剤を用いる処理により溶解させ
ることができる（Ａ、ヘレニウス（ＨＥＬＥＮＩＵＳ）
およびに、シモンズ（ＳＩＭＯＮＳ）、バイオキミカΦ
工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ　
ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、ｌ１１．２９−７９．１９７
５）。この処理はあるときには細胞に結合している蛋白
質を放出させることができる。従って、す、ンカロミコ
プシス・リポリチカ（Ｓａｃｃｈａｒｏ鵬ｙｃｏｐｓｉ
ｓ　　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の懸濁液をエトキシル化
されたノニルフェノール（エマルゲン　９５０、カオ番
アトラス・カンパニイ）で処理することにより、それに
結合していたリパーゼを細胞を崩壊させずに溶解させる
ことができた（Ｙ、オタ（ＯＴＡ）他、アグリカルチュ
ラル・バイオロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒｉｃ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）。

４６．２８８５−２８８９．１９８２）。しかしながら
、同じ工程をリゾチームを製造するために遺伝的に操作
されたＳ、セレウィシエに適用するときにはこれの放出
は観察されなかった。リゾチームを製造する酵母細胞を
例えば０．０５％の濃度のトリトン　Ｘ−１００（ロー
ム・アンド・ハアース）の如きポリエトキシル化された
オクチルフェノールの存在下で粉砕した時でさえ、上澄
み液中で測定されたりゾチーム活性は表面活性剤の不存
在下で観察されたものと実質的に異ならなかった。

これらの種々の結果は、１図的に遺伝的操作がなされた
酵ｌすにより製造されるリゾチームの主部分を回収する
ためには先行技術により示唆されている如き表面活性剤
を用いたとしても細胞を可溶性塩で処理することだけで
は不充分であることを示しており、公知の技術にたよる
ときには細胞構造を破壊することが依然として必要であ
り、それには実際にこの操作に伴なう全ての欠点が存在
している。従って、細胞を本発明の方法によりすなわち
水溶性の中性塩および疎水性部分が置換された芳香族核
である非イオン性表面活性剤を同時に用いて処理するこ
とにより、該細胞に結合されているリゾチームの主部分
がそれらの構造を破壊する必要なしに回収されるという
ことは驚くべきことである。このことは、酵母細胞に結
合して保有されているリゾチームの主部分は細胞内性で
はなくそれらの性質陣中に放出されていることを示して
いる。

本発明に従い使用される塩は水溶性の中性鉱物質塩であ
る。例えばＮａＣ１，ＫＣＩ、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、
Ｎａ２５０４他が挙げられる。経済的および生物学的の
両方の理由から、ＮａＣ１が好適に使用される。１１１
の使用濃度は厳密なものではないが、希望する結果を最
も良く得るためには少なくとも０．１Ｍの濃度が使用さ
れるであろう。はとんどの場合、０．５Ｍ以上の濃度を
使用しても特別な利点はない。

本発明に従い使用される表面活性剤は非イオン性のもの
から選択される。アニオン性またはカチオン性表面活性
剤とは対照的に、非イオン性のものは一般的に蛋白質中
でそれらの生物学的活性の減少もしくは損失をもたらす
ような構造的改変を誘発しないという本質的な利点を有
する。性質隙の蛋白質の回収用に水溶性の中性鉱酸塩類
と共に相乗効果を示す非イオン性表面活性剤は、水中に
可溶性でありそして８〜１５の間になるＨＬＢを有する
ポリエトキシル化されたアルキルフェノール型のもので
あるということが、本出願人により見出された。そのよ
うな試薬類の代表例として、ポリエトキシル化されたオ
クチル−、ノニル−およびトリブチル−フェノール類、
特に商標トリドアＸ−Ｚｏｏ、ノニデット　Ｐ−４０、
ルチンツル　ＡＰ　　８、シンペロニック　ＮＰ　　１
０、セムルソル　ＯＦ　　９．サボゲナッ）　　Ｔ−０
８０などとして市販されているもの、が挙げられる。

そのような表面活性剤の選択時には、それらの活性は置
換された芳香族核によってだけでなくエトキシル化され
た鎖の長さによっても影響を受けるということを考慮す
べきである。一般的原則として、それらのＨＬＢが８〜
１５の間にあるようなエトキシル化された鎖を有する表
面活性剤類が選択されるであろう、ＨＬＢが８より低い
時には、一般的に水中での表面活性剤の溶解度が不充分
である。一方、ＨＬＢが１５より高い時には、本発明で
特許が請求されている相乗効果か弱すぎて実用的でない
。表面活性剤の使用濃度はあまり厳密なものではない、
はとんどの場合、０．０２〜１％の間の濃度が有利に使
用される。

本発明に従うと、回収しようとするポリペプチドと結合
している酵母細胞を可溶性の中性塩および非イオン性表
面活性剤の両方を含んでいる水性媒体中に懸濁させる。

操作温度は厳密なものではない。しかしながら、回収し
ようとするポリペプチド類の変性を最少にするためには
室温以上での操作は避けるべきであろう、一方、細胞お
よび媒体の間の充分な接触時間をもつ必要がある。一般
原則として、室温付近の温度においては期待する結果を
得るためには３０〜１２０分間、より特に４５〜９０分
間、の間の接触時間で充分である。

次に細胞を遠心または他の適当な技術により分離する。

好適にはそれらを同じ媒体中または他の水性媒体中に、
実際には純水中に、再懸濁させることによりそれらを洗
浄する。その後それらを再び分離し、次に圧縮または乾
燥することができ、すなわち例えば動物飼料中の蛋白質
源としてのそれらの価格安定性を確実にするための有用
な操作にかけることができる。

一方、媒体からの蛋白質類を遠心し、分離し、そして当
技術で公知の技術、すなわち凍結乾燥、限外症過、沈澱
、クロマトグラフィ他、の適当な組み合わせにより精製
することもできる。実際のところ、本発明は他の蛋白質
類との混合物から分離するのが困難な物理化学的性質を
有する蛋白質類を単離するのに特に有用である。実際に
酵母細胞の簡単な遠心により、全部または部分的に性質
隙と結合している蛋白質が、培養媒体中に溶液状で存在
している他の蛋白質類から容易に分離できる。さらに、
それらの培養媒体から単離された酵母を最少量の本発明
に従う媒体で処理することにより、興味ある蛋白質は細
胞内蛋白質と混ざらずにかなり濃縮された形で放出され
る。

本発明の方法は、固体担体上または例えばアルギネート
もしくはアクリルアミドゲルの如き重合体ゲル中での固
着によるような何らかの手段により不動性化された酵母
により分泌された蛋白質類の回収にも適用できる。当技
術の専門家に明らかな他の適用も本発明の範囲内である
。同様に、本発明は遺伝的操作の結果としてＳ、セレヴ
イシエの酵母により製造された異型の（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ）蛋白質類の回収用に特に適しているが、ポ
リペプチドが酵母の性質隙中に局在している時には酵母
の属および種がいずれであろうとも或いは異型であって
ももしくはそうでなくてもいずれのポリペプチドの回収
用にも明らかに使用できる。

実施例１ サツカロミセスφセレヴイシエ種、菌株ＧＲＦ１８（ロ
イシンおよびヒスチジン用の栄養要求株）に属しそして
プラスミツド　ｐＬｙ　ｓΔ４９により転換された酵母
を２８℃において、０．００２％のヒスチジンが補充さ
れている最少量の媒体（グルコース：３％；酵母窒素基
質：０．６７％）中で成長させた。プラスミツド　ｐＬ
ｙｓΔ４９は転換された酵母にロイシン用の原栄養を与
えるＬＥＵＺ属を含んでおり、それはまた鶏のりゾチー
ムの完全なｃＤＮＡも含有している（ベルギー特許９０
１，２２３．セントラル・ビューロー・ヴール・シュメ
ル力ルチュアス、オオステルストラート　ｌ、バーン、
オランダ、に１９８４年１２月５日に番号ＣＢＳ　　７
１３０として保管されている菌株）。

培養が静止相に達した時に、１０ｍ１の部分標本を２５
００ｇにおいて１０分間遠心した０次に細胞を０．５Ｍ
ｃ７）ＮａＣＩおよび０．０５重量％の濃度のポリエト
キシル化されたｐ−オクチルフェノール型の表面活性剤
（ローム・アンド・ハース製の商標トリトン　Ｘ−１０
０として重版されている製品であり、該表面活性剤は一
般的に１分子当たり１０個のオキシエチレン単位を含ん
でいる）が補充されているｐＨが６．５の３ｍｌの０．
１Ｍ燐酸塩緩衝液中に再懸濁させた。比較のために、培
養の他の部分標本から遠心された細胞を（ｉ）燐酸塩緩
衝液だけの中に、（２）０．５ＭのＮａＣ１だけが補充
されている同じ緩衝液の中に、そして（３）０．０５９
６のトリトン　Ｘ−１００だけが補充されている緩衝液
の中に、再懸濁させた。種々の媒体中での２８℃におけ
る６０分間の培養後に、細胞を再び遠心により分離し、
そして上澄み液中に存在しているリゾチームをり、シュ
ガー（ＳＨＵＧＡＲ）の方法（バイオキミカ・工・バイ
オフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ａｃｔａ）、旦、３０２−３０９．１９５２）により
測定した。まだ細胞と結合しているリゾチームを測定す
るためには、後者を同一媒体中に再懸濁させそしてブラ
ウン・ホモゼナイザー中で５分間にわたりガラス球によ
り粉砕した。２５００ｇにおける遠心により細胞残層を
分離した後に、上澄み液中に存在しているリゾチームを
上記の如くして測定した。

得られた結果を表１に示す、酵母懸濁液に０．５ＭのＮ
ａＣ１だけをまたは０．０５％のトリトン　Ｘ−１００
だけを添加しても細胞と結合しているリゾチーム活性の
放出をもたらさないということがわかる。この活性は細
胞を０．５ＭのＮａＣ１の存在下を粉砕することにより
得られる均質物中でのみ検出できた。ＮａＣ１の不存在
下でまたはトリトン　Ｘ−１００の存在下での粉砕によ
り測定された活性は、０．５ＭのＮａＣ１の存在下で観
察されたものの２０〜３０％にしか達しなかった。それ
とは対照的に、ＮａＣ１およびトリトン　Ｘ−１００の
両方が存在している場合には細胞からのリゾチームの放
出に関して相当な相乗効果が生じ、この場合均質物中で
測定された活性の８８％が初期の上澄み液中で観察され
た。

本実施例で本発明の方法の適用により放出されるリゾチ
ームの量が細胞を粉砕することにより検出できるリゾチ
ームの合計量に近いという事は、この場合にリゾチーム
が酵母性質隙中に主に局在しているということを示して
いる。しかしながら、性質隙中に分泌されていないリゾ
チームの無視できない部分が依然として細胞内にあるよ
うな場合もありうる。そのような場合には、本発明の方
法により回収されるリゾチーム中の収率は本実施例中で
得られたものより明らかに低いはずである。

実施例２ トリトン　Ｘ−１００を１重量％のセムルソル０Ｐ−５
（ｉ分子当たり９個のオキシエチレン「１位を有するポ
リエトキシル化されたｐ−オクチルフェノール；ソシエ
テ・フランセイス拳テ・オルガノ・シンセセ、５ＦＯＳ
により販売されている製品）により置換したこと以外は
、実施例１中に記されている工程を繰り返した。得られ
た結果を表２に示す。

酵ｔｉｔにより製造されたリゾチームの２１％が、粉砕
せずに１表面活性剤の不存在下で０．５ＭのＮａＣｌに
より放出されたことがわかる。これはすでに媒体中に排
出されているリゾチームの酵母壁土での吸着により説明
できる。しかしながら、本発明の方法では４倍も高いリ
ゾチームの量が媒体中で得られるということに注目すべ
きであり、このことは本発明の方法で使用される画成分
類の相乗効果を明白に示している。

実施例３ この実施例は酵母の性質隙中に局在しているリゾチーム
の放出に対する本発明の方法に従う表面活性剤濃度の影
響を説明するものである。

実施例１の工程を繰り返したが、遠心後に細胞を０．５
ＭのＮａＣ１および種々の濃度のトリトン　Ｘ−Ｚｏｏ
が補充されているｐＨが６．５の０．１Ｍ燐酸塩緩衝液
中に再ｒｌＡ＃Ｉさせた。実施例１中に記されている如
き細胞の培養後に得られた結果を表３に示す。

０゜０１％以下のトリトン　Ｘ−１０ｏｅ度ではリゾチ
ームの放出は観察されなかった。それとは対照的に、０
．０５％の濃度では酵素の意義ある放出が観察され、そ
れは表面活性剤の濃度をこの１ｌｆｉを越えて増すとさ
らに改良できた。

実施例４ この実施例は酵母の外賀隙中に局在しているリゾチーム
の放出に対する本発明の方法に従う可溶性塩濃度の影響
を説明するものである。

実施例１の工程を繰り返したが、遠心後に細胞を０．０
５％のトリトン　Ｘ−１００および種々の濃度のＮａＣ
１が補充されているＰＨが６．５の０．１Ｍ燐酸塩緩衝
液中に再懸濁させた。実施例１中に記されている如き細
胞の培養後に得られた結果を表４に示す。

０．１Ｍ以下のＮａＣｌｅ度では、リゾチームの放出は
観察されなかった。リゾチーム活性の全部が細胞と結合
しておりそして粉砕により部分的にａ１１定できた。０
．２５ＭのＮａＣ１濃度からりゾチーム活性が上澄み液
中で検出され、そして０．５Ｍの濃度で最高ｆ直に達し
た。

実施例５ 実施例１の工程を繰り返したが、０．０５％のトリドア
Ｘ−１ｏｏおよび０．５ＭのＮａＣ１が補充されである
燐酸塩緩衝液中での酵母細胞の培養時間を変えた。得ら
れた結果を表５に示す。

酵母と結合されたリゾチームを放出させるためには細胞
を媒体と充分な時間にわたり接触させて保つ必要がある
ことがわかる。３０分後にリゾチームの意義ある放出が
観察されそして培養時間をさらに伸ばすとさらに改良で
きた。

実施例に の実施例では、ＫＣＩの効果をＮａＣ１のものと比較し
た。実施例１の工程を繰り返し、そして得られた結果を
表６に示す。

０．５Ｍ（７）ＫＣ１またはＮａＣ１を酵母懸濁液媒体
に添加しても細胞と結合しているリゾチーム活性の放出
をもたらさないことがわかる。それとは対照的に、細胞
を０．５ＭＫＣＩおよび０．０５％のトリトン　Ｘ−１
００を含有している媒体中に懸濁させる時には、リゾチ
ームはＮａＣ１を可溶性塩として使用した時と同じ割合
で放出された。

実施例７ この実施例は本発明に従う一般式に適合する種々の表面
活性剤の影響を説明するものである。これらの全ての表
面活性剤の間にある差異は芳香族基のアルキル置換基お
よびオキシエチレン単位数ｎにある。比較するため、こ
の式に相当しない他の表面活性剤類も試験した。

これらの種々の表面活性剤類の活性を実施例１に記され
ている条件下で０．５ＭのＮａＣ１の存在下で試験した
。得られた結果を表７に示す。全ての試験した表面活性
剤類の中で、＠水性部分が本発明に従う置換された芳香
族環を有しているものだけが活性であることがわかる。

実施例８ この実施例は、一般式およびＨＬＢ　（親木性−親油性
平衡）が本発明に従っている表面活性剤類の影響を説明
するものである。比較するため、他の表面活性剤類も試
験した。これらのうち後者は同じ一般式を満たしている
がそれらのＨＬＢが本発明で記されている限界外のもの
である。得られた結果を表８に示す、ｖｋ者の場合には
リゾチームの放出が弱いかまたは０であることがわかる
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵母により製造されそして少なくとも部分的にそれ
   の外質隙中に局在しているポリペプチド類を水性媒体中
   に放出させる方法において、該酵母を水性媒体中で（ｉ
   ）中性でそして水溶性の鉱物質塩および（ｉｉ）８〜１
   ５の間にあるＨＬＢを有するポリエトキシル化されたア
   ルキルフェノール型の水溶性の非イオン性表面活性剤か
   らなる系により処理することを特徴とする方法。 ２、酵母を遺伝的に操作してポリペプチドを製造する、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、酵母を遺伝的に操作して異型のポリペプチドを製造
   する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、異型のポリペプチドがリゾチームである、特許請求
   の範囲第３項記載の方法。 ５、酵母がサッカロミセス属に属している、特許請求の
   範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、酵母がサッカロミセス・セレヴィシエ種に属してい
   る、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、酵母がＧＲＦ１８菌株に属している、特許請求の範
   囲第６項記載の方法。 ８、中性でそして水溶性の塩を媒体中で少なくとも０．
   １Ｍの濃度で使用する、特許請求の範囲第１〜７項のい
   ずれかに記載の方法。 ９、非イオン性表面活性剤を少なくとも０．０２％の濃
   度で使用する、特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに
   記載の方法。 １０、非イオン性表面活性剤が１０〜１５の間にあるＨ
   ＬＢを有するポリエトキシル化されたオクチル−および
   ノニルフェノール類からなる群から選択される、特許請
   求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の方法。 １１、非イオン性表面活性剤が８〜１２．５の間にある
   ＨＬＢを有するポリエトキシル化されたトリブチルフェ
   ノールである、特許請求の範囲第１〜９項のいずれかに
   記載の方法。 １２、前記の特許請求の範囲のいずれかに記載の方法に
   より回収されるポリペプチド。 １３、特許請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の
   方法により回収されるリゾチーム。