JPS6210021A - ウリカ−ゼ活性フラグメントまたは精製ウリカ−ゼ及びそれらを用いた血中尿酸量調整剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、ウリカーゼ活性フラグメントまたは精製ウリ
カーゼ及びそれらを用いた血中尿酸Ｉｌ！整剤（痛風な
らびに抗癌剤投与による癌治療の際に生じる血中尿酸量
の急激な増加にともなう腎障害、例えば腎結石、腎実質
障害の治療）に関する。

「従来の技術」 従来の痛風治療剤としては急性発作時に用いるコルヒチ
ン（関節などの炎症を防止すると考えられている）、そ
の他、フェニルブタシン、インドメタシンなどがあり、
尿酸産生増加阻止剤としてアロプリノール、７０シトー
ル、ザイロリック錠があり、尿酸排泄促進剤としてプロ
ベネシド、スルフィンピラゾンなどがあるが、一方、尿
酸を分解する酵素としてウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）
が知られている。本発明者等は血中高尿酸値を減少せし
むる手段としてウリカーゼ酵素製剤は極めて有効な血中
尿酸調整剤となると考えた。

ウリカーゼは人間を含む霊長類以外の微生物から哺乳類
にいたる一般生物が有する尿酸分解酵素であり、その分
子量は約１２０．０００である。

［発明が解決しようとする問題点」 しかし、ウリカーゼを血中尿酸量調整剤、例えば痛風治
療剤とした場合には次のような欠点がある。

すなわら、ウリカーゼを全く保有しない人間に注射治療
薬として使用すると、人間に対して異種抗原となるため
、頻回の注射による投与はウリカーゼに対する抗体の産
生をまねき、血清病、過敏症反応などの副作用が生じる
ことが当然予想されるということである。

そこで、かかる副作用を除去するために、精製ウリカー
ゼの内服剤の開発ならびにウリカーゼを低分子化させる
ことが考えられるが、ペプシン（Ｉｌｅｐｓｉｎ）　、
　ｔ−リブシン（ｔｒｙｐｓｉｎｌ消化では、至適１）
Ｈを極端にずらして消化時間を検討しても、ウリカーゼ
は直ちに低分子のペプチドに切断されて失活してしまう
。

また、プロリン　エンドペプチダーゼ （ｐｒｏｌｉｎｅ　　ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）で
は切り目（ｎｉｃｋ）が入らない。スタフィロコッカス
　オウレウスｖ８エンドペプチダーゼ（ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　　Ｖ　８ｅｎｄｏｐｅ
ｐｔｉｄａｓｅｌでは分子量が　１００．０００程度の
ペプチドにしかならない。

従って、ウリカーゼを酵素的分解により低分子化して抗
原性を極力低下させ、しかも活性を保持する活性フラグ
メントを調整することが要求される。

本発明の目的は、抗原性が極めて低く、血清病、過敏症
反応などの副作用のない血中味ＭＦＪ調整剤（痛風治療
ならびに抗癌剤投与による癌治療の際に生じる血中尿酸
量の急激な増加にともなう腎障害、例えば腎結石、腎実
買障害の治療）に用いることができるウリカーゼ活性フ
ラグメント、精製ウリカーゼ及びそれらを用いた血中尿
酸量調整剤を提供することにある。

「問題点を解決するための手段」 本発明者は、かかる精製ウリカーゼ、活性フラグメント
の調整につき、鋭意工夫を重ねた結果、上記目的は、カ
ンジダ菌由来のウリカーゼを後述するような精製法によ
る精製ウリカーゼ、またはパパイン（ｐａｐａｉｎ）に
より分解せしめることを特徴とするウリカーゼ活性フラ
グメント及び上記精製ウリカーゼまたはカンジダ菌由来
のウリカーゼをパパインにより分解することにより生成
せしめたウリカーゼ活性フラグメントよりなる血中尿酸
量調整剤によって達成されることを見出し、本発明を完
成するに至った。パパインとしてはシスティンで処理し
たマーキュリ−パパイン（Ｈｅｒｃｕｒｉ　ｐａ−ｐａ
ｉｎ（Ｓｉａｍａ）　）が最適テアル。

「実施例」 ａ〉ウリカーゼの分離精製 カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ　ＩＦＯ−
０３９６）（この他、ＩＦＯ−０６２６，１０８６）を
１％イーストエキストラクト（Ｏｆｆｃｏｌ　、２％バ
クトペブトン（（ｌｔｆｃｏ）　、２％グルコース、３
％コーン　ステイープ　リカー（Ｃ。

ｒｎ　ｓｔｅｅｐ−Ｉｉｑｕｅｒ）（Ｓｉｇｍａ）培地
、ｐＨ６，５中で３０℃、　４８時間、撹拌培養後、６
０００回転、２０分遠心分離して集めた菌体的８０ｇを
０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，５４００ａｆで洗い
、この菌を５％グルコース、　０．３％−Ｎａ　　ＨＰ
Ｏ−１２Ｈ２０、０，１％ＫＣ，ｆ’、０．０５％　Ｍ
ＱＳｏ　　・７日２０、０．０３％尿酸、ＤＨ７，２１
６００Ｉｄに懸濁し、３０℃で約３時間、撹拌培養する
。

さらに６０００回転、２０分の遠心分離で集めた菌を４
００ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７，５で洗い、約１４０Ｉ
Ｉ１１！の０．５Ｍソルビトール、０．０２Ｍリン酸緩
衝液、Ｉ）８７．５に再懸濁して、これに６０■のチモ
リアーゼ（Ｚｙｇ＋ｏ　ｌ　ｙａ　ｓｅ　）１００　Ｔ
　（生化学工業製）を加えて３７℃、３０分娠盪後、６
０００回転、２０分の遠心分離で集めた菌を直ちに氷冷
し、１６０ｄの０．０２Ｍホウ酸−０，０３８Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液、　ＤＨ９，５に懸濁後、透析膿に入れ
、３アの０．０２Ｍホウ酸−０，０３８Ｍ炭酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ９，５に対して４℃で透析外液を交換し
ながら４日間撹拌透析した後、１０．０００回転３０分
の遠心分離で得られる微黄色上清をウリカーゼ分離精製
の出発材料とした。

なお、出発材料としては、Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ。

３１　（１１）＋　１２５６−１２６４　（１９６７）
に記載されているようにカンジダ菌を１％イーストエキ
ストラクト、２％バクトベブトン（Ｄｉｒｃｏｌ、５％
グルコース、３％コーン　ステイープ　リカー（Ｃｏｒ
ｎ　５ｔｅｅｐ　ｌｉｑｕｅｒ）（Ｓｉｇｍａ）培地　
０．８４％尿素、　０．１５％（ＮＨ）　　ＨＰＯ４，
０、１５％（ＮＨ）Ｓｏ　　　、　　　　　０．　１％
ＭＯＳｏ　　・　７Ｈ０，０，１％Ｋ（、ｔ’、　　　
ｐＨ６，２中で２８℃４８時間、撹拌環！ｉ後、６００
０回転、２０分遠心分離して集めた菌体内８０ｇを　０
．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，２８００ｍで洗い、　
５％グルコース、　０．０３％尿酸、０．１％ＫＣｊ’
、　　０．３％Ｎａ２）−ＩＰＯ−１２Ｈ，、Ｏ，０，
０５％ＩｖｌＳＯ４・７Ｈ２０、ＤＨ７，２に懸濁し、
２８℃、４時間撹拌培養後、遠心分離して菌を集め、０
．０２Ｍリン酸緩衝液で洗った後、８００ａｌｔの０．
９飽和食塩液に懸濁し、４℃−夜静置後、６０００回転
、２０分の遠心分離で集めた菌を１６０ａｌｔの０．０
２Ｍホウ酸−０，０３８Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、　ｐ
Ｈ９，５に再懸濁後、透析膜に入れ、３ｉ！の上記緩衝
液に対して４℃で、透析外液を交換しながら４日間撹拌
透析した後、１０．０００回転３０分の遠心分離で得ら
れる微黄色上清をウリカーゼ分離精製の出発材料とする
方法が知られている。

従来のかかる方法を本例では用いず、上記方法を用いた
理由は、本例の方法によればＺｙｍｏｌｙａｓｅ−１０
０丁処理によってカンジダ菌の細胞壁が破壊され、菌体
内からのウリカーゼの放出が極めて多くなる（０．９飽
和食塩液に懸濁した場合の５０〜８０倍程度）からであ
る。

本発明にかかる方法で得られるウリカーゼは、従来の方
法で得られるウリカーゼとスラブ電気泳動、Ｄｉｓｃ電
気泳動によって全く同一の泳動度を示し、このＺｙｍｏ
ｌｙａｓｅ　−１００Ｔ処理は極めて有利な方法である
。

上記の上清に０．００１％にＴｒｉｔｏｎＸ　−１００
を加え、Ｎ２ガスで加圧しながら旧ａｔｔｏ　Ｃｅ１ｌ
でＰＭ−１０！ｌ！を用いて５〜８ａｌｌに濃縮し、０
．０２Ｍホウ酸−０，０１７Ｍホウ砂−〇、００１％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ　−１００−０，５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　
ＤＨ（３，５（Ｂｏｒｉｃ−Ｂｏｒａｘ−Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００−ＥＤＴＡ）で平衡としたセファデックスＧ
−２００（２，６４Ｘ６５α〉カラムを用いてゲル濾過
を行ない、各々４．５ａｉ！をフラクションコレクター
で分画し、その各画分より０．１ｄをとり、パーオキシ
ダーゼ法によりウリカーゼ活性を測定した。

即ち１ＯＮ／ｄｉの尿酸溶液０．０５ａｌｔを加え、２
０ｕ／ａｉ！のアスコルビン酸オキシダーゼと２０ｕ／
ｄのパーオキシダーゼを含む０．１Ｍリン酸緩衝液−０
，３ｍＭ　　Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＥＨ８ＰＴ）、ｐ
Ｈ６，０溶液０．２５ａｄを添加し、３７℃、５分後、
１８μｍＯｆ　　４−７ミノアンチピリンーＥＨ８ＰＴ
　　０．５ａｄｌを加えて　３７℃、２０分後、紫色に
発色したウリカーゼ画分をＡ　ｓｓｏ　ｎ　ｍの吸光度
を測定した（第１図Ａ、Ｂ）、この画分をＡｑｕａｓｉ
ｄｅＩ　Ａ　ｔ’濃縮後、１％グリシン−１ｍＭホウ砂
−〇、０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に２〜３時間透析
し、ＤＨ５〜７のキャリアーアンホライト（ＬＫＢ）を
用いたＦｌａｔＢｅｄ　ｏｅｌ　（ゲル１００ｄ当り５
０ｕｆのＴｒ目０ｎｘ−ｉｏｏを添加）等電点電気泳動
にて　５℃、１２ｍＭ、　７４０Ｖｏｌｔから通電しく
　８　Ｗａｔｔ　Ｃｏｎ５ｔａ−ｎ【）、最終３１ｍＡ
、　１２８０Ｖｏｌｔとなるまで、２４時間泳動した後
、Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ−Ｇｒｉｄを用いてゲルを３０
等分し、３ｒＬＪ’の　Ｂｏｒｉｃ−Ｂｏｒａｘ−Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００−ＥＤＴＡｔ’抽出した液、各々０
゜１ｍｆを上記のパーオキシダーゼ法にて酵素活性を測
定した（第２図）。

ＤＨ５，３〜５．９に検出される活性画分をＢｏｒｉｃ
−Ｂｏｒａｘ−Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１００−Ｅ　Ｄ
　Ｔ　Ａで平衡としたセファデックスＧ−５０（１ｘ５
０α）カラムにてキャリアーアンホライトを除き、Ａｑ
ｕａｓｉｄｅｌＩ　Ａにて濃縮後、６００〜８００μ９
相当の蛋白質をＤｉｓｃ電気泳動ゲルにのせ、ＤＮＰ−
Ｌｙｓｉｎｅ−ＨＣ１！・Ｈ２Ｏをマーカー色素として
３ｍＡ／ゲルにて約３時間泳動俊、ゲルをガラス管より
取り出し、縦に半割し、その半分を１％　Ａｍ１ｄ。

Ｂｌａｃｋ　１０Ｂ含有のメタノール中水・酢酸（５：
　５　：１）溶液で約８分間染色した後、メタノール・
水・酢Ｍ（５：５：１）中で脱色用カラムを用いて１０
ｍＡ／ゲルで電気泳動脱色した。このゲルを染色しない
一方の半割ゲルと並べ、蛋白の分別帯に相当する部位を
染色しないゲルから切断し、こノ切断シタゲルにＢｏｒ
ｉｃ−ａｏｒａＸ−ＴｒｉｔＯｎ　　Ｘ　−１０Ｏ−Ｅ
ＤＴＡを加えて氷冷しながらテフロンホモジナイザーで
磨砕後ｉｏ、ｏｏｏ回転２０分の遠心分離により蛋白を
抽出する。そのｏ、ｉｙに付いてパーオキシダーゼ法に
よって酵素活性を検定した。

ｐＨ５，３〜５．９画分（Ｆｌａｔ　Ｂｅｄ　Ｇｅ１）
にはＤｉｓｃ電気泳動により４本の分別帯（ｂａｎｄｓ
）が存在し、Ｍａｉｎ　ｂａｎｄ　１本及びその上方に
３本の旧ｎｏｒｂａｎｄｓが検出され、パーオキシダー
ゼ法によってＭａｉｎ　ｂａｎｄがウリカーゼ活性を有
するｂａｎｄであることが明らかとなった（第３図）。

従って同様な方法により、最終的にＤｉｓｃ電気泳動に
よってウリカーゼを分離し、口１ｓｃｉｌ気泳動的に純
粋な単一のｂａｎｄ　（第４図）としてウリカーゼを精
製した。

ｂ）精製ウリカーゼの生化学的性状 本酵素ｉ；ｔ　Ｂｏｒｉｃ−Ｂｏｒａｘ−Ｔｒｉｔｏｎ
　　Ｘ　−１００−ＥＤＴＡ溶液中では比較的安定であ
るが、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液その他の中では
会合体を形成する性質があり（第５図）、活性の低下を
来たす。

この会合体は２−メルカプトエタノールによって解離し
、単一の酵素蛋白となる（第６図）。

本酵素は２〜８Ｍ尿素によっては解離せず（第７図）、
また活性にはほとんど影響を受けないが、０．１〜１％
Ｓ　Ｄ　Ｓ（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆ
ａｔｅ）処理により、口ｉｓｃ電気泳動で２本のサブユ
ニットに解離しく第８図）、全く活性を失う性質がある
。

５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−２００（２，６４Ｘ６５ＱＩ
）カラムによるゲル濾過により本酵素の分子量は約１２
０．０００と推定した。

Ｃ）活性フラグメントの調製方法 精製ウリカーゼ１５０γを６０μノの０．０２Ｍホウ酸
−０，０１７Ｍホウ砂−０，００２ＭＥＤＴＡ−０，０
１Ｍシスティン、ＤＨ７，０に溶解し、約２γのマーキ
ュリ　パパイン（Ｍｅｒｃｕｒｉｐａｐａｉｎ（Ｓｉｇ
Ｉｌａｌｌを加え、３７℃、４時間消化後、７．５％ゲ
ルのＤｉｓｃ電気泳動にかけると無処理生酵素より遅い
泳動度を有するｂａｎｄとなり（第９図）これを切断、
抽出して精製した。このフラグメントは０．１％５ＤＳ
−７，５％スラブゲル電気泳動にかけると２個のサブユ
ニットに解離する（第１０図）。

また５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−７５（２，ＩＸ４２ｃｍ
）カラムによるゲル濾過にかけると推定分子量約１８．
０００の位置に溶出する。（第１１図）第１１図におい
てＶＯｉｄ　ＶＯｌｕｌｌｌｅ　１．：溶出している画
分（Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ、　１１　＝１３）はパパ
イン消化２時間で消化されなかったウリカーゼ画分であ
り、黒矢印Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｎ　
ｏ　、　２９〜３１　）が活性フラグメント画分である
。

ｄ）精製ウリカーゼの動物テスト １）実験方法 ＩＣＲ系雌マウス１５匹を一群として、Ａ群は対照とし
、８群、Ｃ群に尿酸投与、群にはさらに精製ウリカーゼ
投与を行なった。即ちＢ、Ｃ群に尿酸３００■をＩＭト
リス溶液５０ｍ１に撹拌溶解し、直ちにその７　（１２
η／２ｄ）を腹腔内に接種する方法でこれを４日間連続
し、４日日に尿酸を投与すると同時にＣ群には精製ウリ
カーゼをマウス当り約１００μｑを尾静脈に接種し、４
８時間後にＢ、Ｃ群各５匹から全採血して１００００回
転５分の遠心分離で血漿を採り、Ｃ群の残り１０匹に再
び精製ウリカーゼを約５００μ９マウスに静注し、その
２４時間後にＢ、Ｃ群各々５匹から全採血して血漿を分
離する。ウリカーゼ再投与４８時間後に残りのＢ、Ｃ群
各々５匹から全採血して血漿を分離した。

分離した血漿を直ちにパーオキシダーゼ法によって尿酸
の定量を行なった。即ち血漿０．０５ｄに２０Ｕ／−７
スコルビン酸オキシダーゼ、２０Ｕ／ｄ！パーオキシダ
ーゼ溶液（０，１Ｍリン酸緩衝液ＰＨ６，０、０，３ｍ
Ｍ　　Ｎ−ｘチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スル
ホプロピル）　−ｍ−トルイジン（以下Ｐ−ＥＨ’ＳＰ
Ｔと省略）１ａｆｆｉを加え、３７℃、５分加温後、０
．２３Ｕ／ｄウリカーゼ・０．１２２１ＳＦ／ａｔ！の
４−アミノアンチピリンＰ−ＥＨ８ＰＴ溶液２ｄを加え
、３７℃、５分加温後、室温まで冷却し、Ａ５５゜。、
で吸光度を測定し、一方、尿酸１０ｑ／ｄｉ７溶液０．
０５ｄを同様の操作でｍ単波として次式 資料の吸光度 ｘｌＯ−ｑ／ＩＩ＆ 標準液の吸光度 により尿酸含有料を計算した。（尿酸測定試薬ウリカラ
ー・エース（小野薬品工業）を使用）。

２）実験結果 対照Ａ群の尿ｌ！ＩＭは３．４４〜３．８４ｊＩｌＦ／
ｄｉ７で、尿酸投与８群マウスは、尿酸投与後２日目（
４８時間）において５．２ａｉ／ｃｉ１１３日目（７２
時間）において４．１３１９７ｄｌ、４日目（９６時間
）で３．５５＃ｊ／ｌｅと対照の尿酸量に近付いていく
。マウスは本来、ウリカーゼを産生じており、投与した
尿酸は時間の経過と共に減少して対照群の尿酸量と同じ
になると考えられる。

一方、０群ウリカーゼ投与マウスにおいては、ウリカー
ゼ投与後２８後（第１回ウリカーゼ投与後４８時間）で
尿ｌ農が０．６３ｑ／ｄｌと急激に低下し、３日目（７
２時間）で　０．４７ｑ／ｄノとなり、ウリカーゼ第１
回投与後２日目く４８時間〉にウリカーゼを再投与した
残りの０群（第２回ウリカーゼ投与群）は再投与４８時
間後（第１回投与後９６時間）に１．０９η／ｄノと低
床Ｉｌｌ値を維持していた。即ち尿酸を投与することに
よって血中高尿酸値を示すマウスはウリカーゼを投与す
ることによって直ちに対照群の尿酸値以下まで減少する
ことが明らかとなった。

（第１３図） ｅ）活性フラグメント及び精製ウリカーゼの動物テスト マウスを使用した活性フラグメントの尿酸分解活性は現
時点では未だ実験を行なっていないが、活性フラグメン
ト調整方法の項目で述べたように、パパインによる限定
分解後に本活性フラグメントはその抗原性が著しく低下
しており、試験管白日ｎ　ＶｉｔｒＯ）において生酵素
の約１／２０の活性を有する事実から考えて、生体内（
ｉｎ　ｖｉｖｏ）においても副作用（過敏症反応など）
なしに充分に尿酸分解活性を発現すると推定している。

この　１ｎｖｉｖｏにおける活性フラグメントの尿酸分
解活性については今後の実験において確認したい。

ｆ〉投与量について マウスに対するウリカーゼ投与１（１００μＱ／３０マ
ウス）から計算するとヒトの場合には３．３ＬＩＩＩ／
に９となる。但し、今回の投与量によって極めて急激に
尿酸の低下を来たす事実から考えて、投与量を１／１０
に減らしても充分に有効である。従ってヒトの場合は、
５０に９体重として１６．５ｊｌ＃　（０，３３ｑ／に
９）また、活性フラグメントの場合には生酵素の約１／
２０の活性になるから単純計算するとヒトのばあい、ウ
リカーゼに換算すると０．３３ｑｘ２０／幻−６，６ｑ
／に９となり、体１５０　Ｋｇとして３３０■で有効で
ある。

［発明の効果］ 本発明の活性フラグメントの解素活性は精製生酵素（約
３ユニツト／Ｒｇ蛋白）の約１／２０　（約０．１５ユ
ニツト／η蛋白）であった。

試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏｌにおいて生酵素の約１／
２０の活性を有する事実から考えて、生体内（ｉｎ　ｖ
＋ｖｏ）においても充分に尿酸分解活性を発現するとの
根拠が与えられる。

Ｍ製つリカーゼ１　ｑ＠ＩｎＣ０１ｌｌ）ｆｅｔｅ　ａ
ｄｊｕｔａｎｔと共に１５日間隔で４回皮下接種し、ｂ
ｏｏｓｔｅｒ後、−週間で全採血して得られたウサギ抗
血清に対して、生酵素は一本の強い沈降線を形成するが
、本活性フラグメントは全く沈降線を形成しないため、
生体内においても生酵素に比して抗原性は弱く注射の際
にウリカーゼについて考えられる５１１作用発生の心配
はない。

痛風は尿酸の過剰生産あるいは排泄障害またはその両者
によっておきる高尿酸血症が原因の疾患である。男性に
おきやすく、患部の関節には尿酸ナトリウム塩の結晶が
沈着し、いわゆる痛風結節の形成がおこり、その周囲の
肉芽組織の増生および炎症反応、いわゆる急性関節炎に
伴なう関節の発赤ｌ！脹と激烈な痛みが生じ、全身的に
悪寒、発熱、血沈促進、白血球増加などの症状がおきる
。

また尿酸塩の血清中の溶解度は低く、６．８〜７．０■
／ｄ、ｆｆで、この垣を越すと組織中に尿酸ナトリウム
として析出する可能性が大となり、慢性痛風となると関
節の破壊変形がおこり、腎結石あるいは腎実質障害など
の原因となり、尿毒症性アシド−シスなどの症状を出現
する。現在使用されている内服痛風治療剤は急性発作時
に用いるコルヒチン（これは増加した白血球に作用して
炎症を防止すると考えられている。副作用は悪心、下痢
）その他、フェニルブタシン、インドメタシンなどがあ
り、尿酸産生増加阻止剤としてアロプリノール、尿酸排
泄促進剤としてプロベネシド、スルフィンピラゾンを用
いるが、尿路の尿酸結石（腎結石）を生じやすいため、
尿酸２ア／日以上となゐように、また尿を弱アルカリ性
（重炭酸ナトリウム投与）に保つように配慮する必要が
あるとされている。　抗原性の極めて弱いウリカーゼ活
性フラグメント及び精製ウリカーゼ投与によって尿酸を
分解した際、その生じる分解産物のアラントインは水に
易溶性なので、尿酸排泄促進剤や尿Ｍ増加阻止剤の使用
時にみられる尿酸、キサンチン（尿酸の前駆体）による
尿路結石を生じる心配もなく、且つ極めて速効性、低抗
原性なため、過敏症反応の恐れも少ないすぐれた尿ＦＬ
ａ調節剤である。また現在、癌による死亡率が極めて高
いが、抗癌剤を投与された患者において癌細胞の死滅に
伴うく細胞の有する核酸の分ｗＩ＞高尿酸血症による腎
結石、腎実質障害が問題となっているが、従って本ウリ
カーゼ活性フラグメント及び精製ウリカーゼは痛風治療
のみでなく、この様な症例の高血中尿１ｉ！！１を急速
に調節し得る極めて有効な酵素製剤である。

従って、要約すると、本発明の活性フラグメント及びＭ
製つリカーゼは、痛風治療だけ°でなく抗腫瘍剤を投与
された癌患者は癌細胞死滅にともなって、血中尿酸値が
急激に高まり、これが腎障害などの原因となっているの
で、かかる腎障害の予防あるいは治療剤としても使用で
き、あるいは又血中尿酸値測定試薬としても使用しうる
。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａは菌体から抽出した粗ウリカーゼをセファデッ
クスＧ−２００のゲル濾過にかけた溶出曲線（２８０ｎ
ｍの吸光度）で、ウリカーゼは黒三角破線で示した位置
に溶出する。 第１図Ｂは、第１図Ａの黒三角破線で示したウリカーゼ
活性画分をＤｉｓｃ電気泳動にかけて、ゲル濾過で得ら
れたウリカーゼの純度を検べた泳動図。この精製段階で
は共相蛋白が多数存在している。 第２図は、第１図Ａのウリカーゼ活性画分を、ウルトロ
ゲル（ＬＫＢ）を用いたＤＩ−１５からＯＨ７のキャリ
アーアンホライトによる等電点電気泳動（Ｆｌａｔ　Ｂ
ｅｄ　Ｇｅｔ電気泳１１Ｊ　（ＬＫＢ）　）にかけてウ
リカーゼの精製を行なった実験結果で、ウリカーゼ活性
は黒三角破線で示した。フラクション番号１０から２２
番のウリカーゼ活性ピークを集めて回収した。 第３図は、第２図の等電点電気泳動で回収したウリカー
ゼ画分の純度を検べるためにＤｉｓｃｌｉ（気泳動にか
けた泳動図で、ウリカーゼは黒矢印で示した。共相蛋白
はこの段階で極めて少なくなり、ウリカーゼ分別帯の上
方に２〜３本の共相蛋白のみとなった。 第４図は、第２図の等電点電気泳動にかけて部分精製し
たウリカーゼをざらにＤｉｓｃ電気泳動によって精製し
、最終的にウリカーゼは単一の分別帯にまで高度に精製
されたことを示した。 第５図〜第８図は精製ウリカーゼの生化学的性状を検べ
た結果を示した。 第５図は、精製ウリカーゼはリン酸緩衝液、トリス塩１
ｍ緩衝液中に保存すると会合体を形成する性質があり、
左側の黒矢印３本はその会合体を示しである。右側の黒
矢印はｕｒｉｃａｓｅを示す。 第６図は、第５図黒矢印の会合体は５％２−メルカプト
エタノールで還元すると解離し、元の単一な分別帯とな
ることを示した。 第７図は、２モルあるいは８モルの尿素処理によってウ
リｈ−ゼは解離せず、単一の分別帯として泳動すること
を示した。またその酵素活性にも影響を受けない。 第８図は、精製ウリカーゼを０．１％〜１％ドデシルｔ
ａｍナトリウム（ＳＤＳ）処理をすると黒矢印の如く、
２本のサブユニットに解離することを示した。ＳＯ８処
理により酵素活性は完全に失なわれる。 第９図右側は精製ウリカーゼをパパインで４時間消化後
のウリカーゼ。黒矢印が示すように左側の無処理のウリ
カーゼの分別帯よりもパパイン限定分解で得られるウリ
カーゼ活性フラグメントは泳動度が遅くなることを示し
た。限定分解は４時間から６時間まで変りなく同一の電
気泳動パターンが得られる。 第１０固点矢印はパパイン処理して得られた活性フラグ
メントを１％５Ｏ３−５％２−メルカプトエタノールで
処理した後、０．１％ＳＯＳスラブゲル電気泳動にかけ
た結果、２本のサブユニットに解離することを示した。 第１１図は、精製ウリカーゼをパパインで２時間消化後
、セファデックスＧ−７５のゲル濾過にかけた溶出曲線
。活性フラグメント（図中黒矢印Ｆｒａｇｍｅｎｔ　　
１８０００）は分子量約ｉａ、ｏｏｏの位置に溶出する
。　このゲル濾過にかけた試料はパパインで２時間消化
したものなので、残存する未消化のウリカーゼが最初の
ピーク（Ｖｏｉｄ　Ｖｏｌｕｍｅと記載した位置）とし
て溶出している。 Ｅｇｇ　　Ａｌｕｂｕｌｉｎ　　　４　５　、　　ＯＯ
Ｏ、ＣｈｙＩＩｌｏｔｒｙｐｓｉ−ｎｏａｅｎ　Ａ２５
．０００、　ＣｙｔｏｃｈｒｏｉｅＣ１２。 ５００と記載した各名称の下の矢印は、これら分子量マ
ーカーの溶出位置を示している。フラクション番号２５
〜３３（（ピークの下に３３２５　　と記入し、上の方
に（ｐａＤａｉｎ消化活性フラグメントと記載しである
））を活性フラグメントとして回収した。溶出曲線は２
０８ＱｔｌＶＩＣＯＲＤ　ｍ型（ＬＫＢ）　＋１記紫％
１吸収計（２８０ｎｍの吸収）およびレコーダーを用い
て記録したチャートである。 第１２図は、精製ウリカーゼで免疫した家兎の族ウリカ
ーゼ血清を用いたゲル内沈降反応の結果を示しており、
ウリカーゼは本抗血清と単一な沈降線を形成するが、活
性フラグメント（図中ＦｒａｇＩＩｅｎｔと記載）は抗
血清と沈降線を形成せず、従ってその抗原性が極めて弱
くなっていることを示している。 第１３図は、縦軸は尿酸量、横軸は時間を表わしており
、Ｃは対照としての無処置マウスの尿酸量を示している
。（本文のＡ群） 無処置マウスの平均尿酸量は　　３．４４〜３．８４ｔ
ｔｒｙ／ｄｉであるが、Ｕで表わした尿酸投与群は尿酸
投与１１４８時間で平均５．２ｊＦＪ／ｄＪ！と高血中
尿Ｍ値を示し、７２時間後にやや値が低くなり、９６時
間後には無処置正常マウス群の尿酸値とほぼ同じになる
。（本文の８群）一方Ｕで表わした尿酸投与群にウリカ
ーゼを投与するとＬＩＲで現わした如く、ウリカーゼ投
与群の血中尿酸値はウリカーゼ投与４８時間後には平均
０．６３ａｖ／ｄｆと急速に低下し、ウリカーゼ再投与
後７２時間で０．４７１！ｇ／ｄｆと尿酸値が低下し続
け、９６時間後でも１．０９ａｙ／ＩＪ’と低尿酸値を
維持している。 （本文の０群）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カンジダ菌由来のウリカーゼを、パパインにより分
   解することにより生成せしめたことを特徴とするウリカ
   ーゼ活性フラグメント及び精製ウリーゼ。 ２、カンジダ菌由来のウリカーゼを、パパインにより分
   解することにより生成せしめたウリカーゼ活性フラグメ
   ントまたは精製ウリカーゼを有効成分とすることを特徴
   とする血中尿酸量調整剤。