JPS6167478A - 新規な微生物の育種法 - Google Patents
新規な微生物の育種法Info
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- JPS6167478A JPS6167478A JP59189989A JP18998984A JPS6167478A JP S6167478 A JPS6167478 A JP S6167478A JP 59189989 A JP59189989 A JP 59189989A JP 18998984 A JP18998984 A JP 18998984A JP S6167478 A JPS6167478 A JP S6167478A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fused
- yeast
- strain
- breeding
- strains
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
- C12N15/04—Fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野〕
本発明は、新規な微生物の育種法に関する。さらに詳し
くは、細胞融合もしくは細胞省融合させたい２株の微生
物、特に有核微生物細胞に、該宿主細胞内で発現可能な
異なる遺伝的符号を付加したプラスミドＤＮＡを、各々
公知またはそれに準じる形質転換法により導入し、各々
の微生物に選択可能な遺伝的符号を付与後、公知または
それに漁じる細胞融合法を用いて各々の形質転換体を融
合させ、導入したプラスミド性遺伝的符号を指標として
、細胞融合体もしくは細胞質融合体を選択することを特
徴とする新規な微生物、特に有核微生物の育種法に関す
る。
くは、細胞融合もしくは細胞省融合させたい２株の微生
物、特に有核微生物細胞に、該宿主細胞内で発現可能な
異なる遺伝的符号を付加したプラスミドＤＮＡを、各々
公知またはそれに準じる形質転換法により導入し、各々
の微生物に選択可能な遺伝的符号を付与後、公知または
それに漁じる細胞融合法を用いて各々の形質転換体を融
合させ、導入したプラスミド性遺伝的符号を指標として
、細胞融合体もしくは細胞質融合体を選択することを特
徴とする新規な微生物、特に有核微生物の育種法に関す
る。
本発明の育種法は、形質転換および細胞融合が可能な微
生物であれば、すべての微生物に適用できるが、特にカ
ビ・酵母のような有核微生物、さらには酵母に適用する
のが好ましい。また、酵母のうちでも特に野生型実用酵
母を用いる育種において、本発明の育種法は威力を発抽
する。
生物であれば、すべての微生物に適用できるが、特にカ
ビ・酵母のような有核微生物、さらには酵母に適用する
のが好ましい。また、酵母のうちでも特に野生型実用酵
母を用いる育種において、本発明の育種法は威力を発抽
する。
本発明の育種法において使用するシラスミド性遺伝的符
号としては、育種しようとする微生物で選択可能なもの
であればどんな遺伝的符号でもよいが、薬剤耐性符号で
あることが好ましい。
号としては、育種しようとする微生物で選択可能なもの
であればどんな遺伝的符号でもよいが、薬剤耐性符号で
あることが好ましい。
なお、本発明の育種法では、説明を簡単にするため、酵
母特にサツカロマイセス・セレビ・クエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ｆ例にと
って説明するが、本発明はこれに限定するものではない
。
母特にサツカロマイセス・セレビ・クエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ｆ例にと
って説明するが、本発明はこれに限定するものではない
。
（従来の技術）
通常、研究室で用いられている酵母（主にす。
カロマイセス属酵母）は、典型接合型２倍体でも墨
良い胞子形成能を有するので容易に接合能を示す減数分
裂分離株を得ることができ、また栄養要求性などの選択
可能な遺伝的符号をもっているため、通常の交配法や低
頻度でしか交雑味が得られないようなグロトプラストに
よる細胞融合法によっても、容易に交雑味を分離、育成
することができる。
裂分離株を得ることができ、また栄養要求性などの選択
可能な遺伝的符号をもっているため、通常の交配法や低
頻度でしか交雑味が得られないようなグロトプラストに
よる細胞融合法によっても、容易に交雑味を分離、育成
することができる。
一方、？＊酒酵母、ビール酵母、・々ン酵母、ワイン酵
母等の実用酵母は、一般に、１）胞子形成能が低く、ま
た胞子発芽率が悪いなどのため接合能を示す減数分裂分
離株を得ることが困難である。したがりて、他の株との
自由な交配ができない。２）細胞融合法による無性的な
交雑を行うにしても、栄養要求性など交雑味を効果的に
選択２分離できる遺伝的符号をもってない。また、そう
した選択符号を突然変異処理によって付与しようとして
も、多くの実用株が２倍体あるいはそれ以上の高次倍数
体であるため突然変異株の分離が容易でない。
母等の実用酵母は、一般に、１）胞子形成能が低く、ま
た胞子発芽率が悪いなどのため接合能を示す減数分裂分
離株を得ることが困難である。したがりて、他の株との
自由な交配ができない。２）細胞融合法による無性的な
交雑を行うにしても、栄養要求性など交雑味を効果的に
選択２分離できる遺伝的符号をもってない。また、そう
した選択符号を突然変異処理によって付与しようとして
も、多くの実用株が２倍体あるいはそれ以上の高次倍数
体であるため突然変異株の分離が容易でない。
−゛ また、
強い突然変異処理は、実用株のもつ有用形質を損゛傷さ
せる可能性がある、など、研究室法とは異なる特性をも
つため、通常の細胞融合法を含む従来の交雑育種法をそ
の！！ま適用することは困難であった。一方、実用酵母
間の交雑による育種は、産業上大いに期待されている。
せる可能性がある、など、研究室法とは異なる特性をも
つため、通常の細胞融合法を含む従来の交雑育種法をそ
の！！ま適用することは困難であった。一方、実用酵母
間の交雑による育種は、産業上大いに期待されている。
（問題点を解決しようとする手段〕
本発明者らは、これらの問題点を解決すべく野性型実用
酵母株の育種法の可能性について鋭意研究の結果、各々
異なるプラスミド性選択符号を付与した酵母（形質転換
）株金用いることにより、細胞融合体および細胞質融合
体を効率良く分離できることを見出し、本発明を完成す
るて至りた。
酵母株の育種法の可能性について鋭意研究の結果、各々
異なるプラスミド性選択符号を付与した酵母（形質転換
）株金用いることにより、細胞融合体および細胞質融合
体を効率良く分離できることを見出し、本発明を完成す
るて至りた。
即ち、融合させようとする２株の酵母株各々に、選択可
能な遺伝子を付加したシラスミドＤＮＡを通常の形質転
換法（Ｂｅｇｇｓ＋ Ｊ、Ｄ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２７
５−１０４．１９７８）によｆ）導入し、次に各々の形
質転換株を通常の細胞融合法（ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅ
ｎ、 Ｐ、 ａｎｄｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌａａｔ＋ Ｂ
、Ｐ、＋ Ｊｅ Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、 １３０ ＋
９４６＋１９７７）により融合させ、該２種のプラスミ
ド共存下でのみ生育できるような条件で培養することに
より細胞融合体（細胞質融合体も含む）ｔ−効率良く分
離することを可能とした。
能な遺伝子を付加したシラスミドＤＮＡを通常の形質転
換法（Ｂｅｇｇｓ＋ Ｊ、Ｄ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２７
５−１０４．１９７８）によｆ）導入し、次に各々の形
質転換株を通常の細胞融合法（ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅ
ｎ、 Ｐ、 ａｎｄｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌａａｔ＋ Ｂ
、Ｐ、＋ Ｊｅ Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、 １３０ ＋
９４６＋１９７７）により融合させ、該２種のプラスミ
ド共存下でのみ生育できるような条件で培養することに
より細胞融合体（細胞質融合体も含む）ｔ−効率良く分
離することを可能とした。
プラスミドＤＮＡ上の遺伝子によって栄養的に互に相補
するような同型接合型１倍体酵母の２株を用いた予備的
実験では、細胞融合体の割合は２５％〜８８係と非常に
高い値を示した。この結果を第１表に示す。本実験で使
用したプラスミド（第１表中〔〕で示される）は、いず
れも公知のプラスミドであり、ＴＲＰ １− ＲＩはＺ
ａｋｉａｎ、 Ｖ、Ａ、、 ａｔ。
するような同型接合型１倍体酵母の２株を用いた予備的
実験では、細胞融合体の割合は２５％〜８８係と非常に
高い値を示した。この結果を第１表に示す。本実験で使
用したプラスミド（第１表中〔〕で示される）は、いず
れも公知のプラスミドであり、ＴＲＰ １− ＲＩはＺ
ａｋｉａｎ、 Ｖ、Ａ、、 ａｔ。
ａｌ、 Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、ｙ ２ｔ
２２１１（１９８２）に、ｐＬＴ３はＨａｒａｓｈｉｍ
ａ、Ｓ、＋ ｅｔ、ａｌ、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。
２２１１（１９８２）に、ｐＬＴ３はＨａｒａｓｈｉｍ
ａ、Ｓ、＋ ｅｔ、ａｌ、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。
Ｂｌｏｌ−＝ ４．７７１ ｍ （１９８４）に、ｐ
ＡＤＡ ３はＭｌｙａｊ１ｍｍ＋ Ａ、ｔ ａｔ、
ａｌ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、４ ＋４０７
、（１９８４）に各々記載されている。また、ｐＡＪ
５０は、広島大学工学部東江昭夫博士により作成された
シラスミドである（第１図１−Ａ参照）。
ＡＤＡ ３はＭｌｙａｊ１ｍｍ＋ Ａ、ｔ ａｔ、
ａｌ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、４ ＋４０７
、（１９８４）に各々記載されている。また、ｐＡＪ
５０は、広島大学工学部東江昭夫博士により作成された
シラスミドである（第１図１−Ａ参照）。
また、第１表中のＳおよびＫは、各々酵母菌株■す）の
略でちゃ、各々寄託番号Ｆ’ｇＲＭ Ｐ−７５２７゜Ｆ
ｇＲＭＰ−７５２６ｆ：得、微生物工業技術研究所に寄
託されている。また、これらの株は、Ｈａｒａｓｈ１ｍ
ａ＋Ｓ、らによｌ） Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ
、、 ４ 、７７１ （１９８４）にも記載されている
。第１表中のＳＫは、８株とに株の細胞融合体であるこ
とを示す。
略でちゃ、各々寄託番号Ｆ’ｇＲＭ Ｐ−７５２７゜Ｆ
ｇＲＭＰ−７５２６ｆ：得、微生物工業技術研究所に寄
託されている。また、これらの株は、Ｈａｒａｓｈ１ｍ
ａ＋Ｓ、らによｌ） Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ
、、 ４ 、７７１ （１９８４）にも記載されている
。第１表中のＳＫは、８株とに株の細胞融合体であるこ
とを示す。
本実験では、２種の形質転換酵母株を通常の細胞融合株
で融合後、プラスミド性栄養要求性遺伝子符号（Ｌｅｕ
とＴｒｐ）’を利用して細胞融合体を選択したもの
である。即ち、融合後表現型がＬ ｅ ｕ −ｔ−。
で融合後、プラスミド性栄養要求性遺伝子符号（Ｌｅｕ
とＴｒｐ）’を利用して細胞融合体を選択したもの
である。即ち、融合後表現型がＬ ｅ ｕ −ｔ−。
Ｔｒｐ＋となる株（ＬｅｕとＴｒｐ ｆ含まない培地上
で増殖できる融合株）を分離後、さらにそれらの分離株
について核由来の遺伝的形質を調べた結果である。ＳＫ
株（雑種細胞融合体）の他に８株およびに株がＬｅｕ”
、 Ｔｒｐ＋株中に見出されるのは、それらの株が、
８株とに株の細胞質は融合しているが核は融合していな
い所謂細胞質融合体（ｃｙｔｏｄｕｃｔａｎｔ ）であ
ることを示す。
で増殖できる融合株）を分離後、さらにそれらの分離株
について核由来の遺伝的形質を調べた結果である。ＳＫ
株（雑種細胞融合体）の他に８株およびに株がＬｅｕ”
、 Ｔｒｐ＋株中に見出されるのは、それらの株が、
８株とに株の細胞質は融合しているが核は融合していな
い所謂細胞質融合体（ｃｙｔｏｄｕｃｔａｎｔ ）であ
ることを示す。
本発明は、上記の知見ムら完成されたものである。即ち
、融合させたい酵母菌株２株に、野生型実用酵母の形質
転換体の選択が可能な薬剤耐性遺伝子をもつプラスミド
ＤＮＡ ｔ−導入し、異なるプラスミド性薬剤耐性符号
が付与された薬剤耐性形質転換体を取得する。次に、各
々の形質転換株をプロトプラスト融合法もしくはそれに
準じる方法で融合させ、両薬剤耐性株の中から該２株間
の雑種細胞融合体を同定する。この方法は、これまで知
られてない新しい有用な酵母の育種法であり、これまで
困碓であった実用酵母の育種を容易にするものである。
、融合させたい酵母菌株２株に、野生型実用酵母の形質
転換体の選択が可能な薬剤耐性遺伝子をもつプラスミド
ＤＮＡ ｔ−導入し、異なるプラスミド性薬剤耐性符号
が付与された薬剤耐性形質転換体を取得する。次に、各
々の形質転換株をプロトプラスト融合法もしくはそれに
準じる方法で融合させ、両薬剤耐性株の中から該２株間
の雑種細胞融合体を同定する。この方法は、これまで知
られてない新しい有用な酵母の育種法であり、これまで
困碓であった実用酵母の育種を容易にするものである。
野生型実用酵母の形質転換体の選択が可能な薬剤耐性符
号としては、カナマイシン類縁の抗生物１Ｇ４１８耐性
（Ｊｌｍｅｍｅｚ、 Ａ、 ａｎｄ Ｄａｖｉｓ、 Ｊ
、。
号としては、カナマイシン類縁の抗生物１Ｇ４１８耐性
（Ｊｌｍｅｍｅｚ、 Ａ、 ａｎｄ Ｄａｖｉｓ、 Ｊ
、。
Ｎａｔｕｒｅ ２８７＋ ８６９ｅ １９８０ ）
＋ ｍａｔｈｏｔｒｅｘａｔｅとａｕｌｆａｎｉｌａｍ
ｉｄａ耐性（Ｍｌｙａｊｌｍａ、 Ａ、ａｔ、 ａｌ、
＊Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、、 ４ 、４０７
．１９８４ ） 。
＋ ｍａｔｈｏｔｒｅｘａｔｅとａｕｌｆａｎｉｌａｍ
ｉｄａ耐性（Ｍｌｙａｊｌｍａ、 Ａ、ａｔ、 ａｌ、
＊Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、、 ４ 、４０７
．１９８４ ） 。
ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ耐性（Ｇｒｌｚ、 Ｌ、 ａ
ｎｄ Ｄａｖｌｇｓ Ｊ、＊Ｇｅｎｅ ２５，１７９．
１９８３）、オリゴ糖付加反応を阻害するｔｕｎｉｃａ
ｍｙｃｉｎ耐性（Ｒ１ｎｅ＋ Ｊ、 ａｔ、 ａｌ、。
ｎｄ Ｄａｖｌｇｓ Ｊ、＊Ｇｅｎｅ ２５，１７９．
１９８３）、オリゴ糖付加反応を阻害するｔｕｎｉｃａ
ｍｙｃｉｎ耐性（Ｒ１ｎｅ＋ Ｊ、 ａｔ、 ａｌ、。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳ
Ａ１８０ ｒ ６７５０ ＋１９８１ ）等が利用可能
である。
Ａ１８０ ｒ ６７５０ ＋１９８１ ）等が利用可能
である。
融合後の両薬剤耐性株よｐ真の雑種細胞融合体を同定す
る方法としては、色累培地上でのコロニー゛の色調、細
胞の大きさ、ＴＴＣ染色性、各種糖質化性など、融合さ
せる菌株の各々の特性に応じた方法が可能である。また
、得られた雑種細胞融合株は、プラスミド非選択条件下
で数世代継代培養するとプラスミドＤＮＡが脱落してし
まうので、導入した外来異種ＤＮＡ ｉもたないクロー
ンを容易に得ることができる。このことは、雑種細胞融
合株を分離後、不要なりＮＡ （該融合株の選択のため
にのみ用いたプラスミドＤＮＡ ） ｆｆｉ除くことが
できることを意味し、特に実用酵母の育種において大き
なメリットとなる。
る方法としては、色累培地上でのコロニー゛の色調、細
胞の大きさ、ＴＴＣ染色性、各種糖質化性など、融合さ
せる菌株の各々の特性に応じた方法が可能である。また
、得られた雑種細胞融合株は、プラスミド非選択条件下
で数世代継代培養するとプラスミドＤＮＡが脱落してし
まうので、導入した外来異種ＤＮＡ ｉもたないクロー
ンを容易に得ることができる。このことは、雑種細胞融
合株を分離後、不要なりＮＡ （該融合株の選択のため
にのみ用いたプラスミドＤＮＡ ） ｆｆｉ除くことが
できることを意味し、特に実用酵母の育種において大き
なメリットとなる。
さらに本発明は、異株の雑種融合体の育種だけでなく、
同質倍数体株の育種にも適用できる。即ち、同−株に異
なる薬剤耐性選択符号をもつプラスミドを導入し、細胞
融合により両薬剤耐性全示す雑種細胞融合体全得ればよ
い。薬剤耐性符号をもつプラスミドＤＮＡの導入と脱落
をくり返し、融合を行えば２種の薬剤耐性符号だけで、
１缶体ムらそれと同質の遺伝的背景をもつ高次倍数体の
育種を行うことができる。
同質倍数体株の育種にも適用できる。即ち、同−株に異
なる薬剤耐性選択符号をもつプラスミドを導入し、細胞
融合により両薬剤耐性全示す雑種細胞融合体全得ればよ
い。薬剤耐性符号をもつプラスミドＤＮＡの導入と脱落
をくり返し、融合を行えば２種の薬剤耐性符号だけで、
１缶体ムらそれと同質の遺伝的背景をもつ高次倍数体の
育種を行うことができる。
本発明による育種法は、理論的には、用いる遺伝的符号
が形質転換体で選択可能であり、また細胞融合が可能で
あれば、すべての微生物もしくは単細胞生物種に適用可
能である。そのうち特に酵母の育種において本発明の方
法は有用であるが、現在組換えＤＮＡ宿主として酵母で
認可されているのは、サツカロマイセス・セレビシェ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ ）
に限られている（組換えＤＮＡ実験指針、昭和５７年８
月３１日改訂）。従って、本発明の実施例においては、
Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＫＤ−５Ｄ株とＤＳ１２
−１０Ｂ株を用いた例を示すが、本発明の育種法はこれ
らに限るものではない。尚、これらの株は、各々ＦＩＥ
ＲＭ Ｐ−７５２６，ＦＥＢＭ Ｐ−７５２７の寄託番
号を得、微生物工業技術研究所（微工研）に寄託式れて
いる。
が形質転換体で選択可能であり、また細胞融合が可能で
あれば、すべての微生物もしくは単細胞生物種に適用可
能である。そのうち特に酵母の育種において本発明の方
法は有用であるが、現在組換えＤＮＡ宿主として酵母で
認可されているのは、サツカロマイセス・セレビシェ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ ）
に限られている（組換えＤＮＡ実験指針、昭和５７年８
月３１日改訂）。従って、本発明の実施例においては、
Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＫＤ−５Ｄ株とＤＳ１２
−１０Ｂ株を用いた例を示すが、本発明の育種法はこれ
らに限るものではない。尚、これらの株は、各々ＦＩＥ
ＲＭ Ｐ−７５２６，ＦＥＢＭ Ｐ−７５２７の寄託番
号を得、微生物工業技術研究所（微工研）に寄託式れて
いる。
形質転換体および細胞融合体選択に用いるプラスミド性
選択符号としては、カナマイシン類縁の抗生物質Ｇ４１
８耐性符号と大腸菌のａプラスミド（Ｒ３８８）由来の
ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａａ＠によ
るｍｅｔｈｏｔｒａｘａｔｅ、 ｓｕｌｆａｎｉｌａｍ
ｉｄｅ耐性符号を）実施例では示すが、形質転換体およ
び細胞融合体の選択が可能であれば、これらに限るもの
ではない。
選択符号としては、カナマイシン類縁の抗生物質Ｇ４１
８耐性符号と大腸菌のａプラスミド（Ｒ３８８）由来の
ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａａ＠によ
るｍｅｔｈｏｔｒａｘａｔｅ、 ｓｕｌｆａｎｉｌａｍ
ｉｄｅ耐性符号を）実施例では示すが、形質転換体およ
び細胞融合体の選択が可能であれば、これらに限るもの
ではない。
Ｇ４１８耐性符号号を有するゲラスミ１ドとしては、ｐ
ＡＪ ５０およびＹＲｐＧ １などが、ｍｅｔｈｏｔｒ
ｅｘａｔｅｓｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ耐性符号を有
するプラスミドとしては、ｐＡＤＡｌおよびｐＡＤＡ３
などが知られておジ（第１図参照）、その有効性は
既に確認済である。
ＡＪ ５０およびＹＲｐＧ １などが、ｍｅｔｈｏｔｒ
ｅｘａｔｅｓｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ耐性符号を有
するプラスミドとしては、ｐＡＤＡｌおよびｐＡＤＡ３
などが知られておジ（第１図参照）、その有効性は
既に確認済である。
ｐＡＪ ５０ （既述）は第１図の１−Ａに、ｙ′ＥＬ
ｐｃ １（児島宏行ら、日本農芸化学会大会費旨集ｐ、
３４１゜１９８３）は第１図のｌ−Ｂに示されている。
ｐｃ １（児島宏行ら、日本農芸化学会大会費旨集ｐ、
３４１゜１９８３）は第１図のｌ−Ｂに示されている。
ｐＡＤ入１およびｐＡＤＡ３（既述）は、Ｍｉｙａｊｊ
ｍａ、 Ａ。
ｍａ、 Ａ。
ａｔ、 ａｌ、、 Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ
４．４０７（１９８４）に記載されているプラスミドで
ちゃ、各々第１図１−ｃおよび１−Ｄに示される。これ
らのプラスミドおよび類縁のものは、既述の文献を参考
にすれば通常の遺伝子操作技術により容易に作成するこ
とができる。
４．４０７（１９８４）に記載されているプラスミドで
ちゃ、各々第１図１−ｃおよび１−Ｄに示される。これ
らのプラスミドおよび類縁のものは、既述の文献を参考
にすれば通常の遺伝子操作技術により容易に作成するこ
とができる。
尚、本発明に用いる選択可能な遺伝的符号を有するプラ
スミドは４、宿主細胞および細胞融合体で複製可能であ
れば、どんな種類のプラスミドでもよりが、細胞融合体
からの導入プラスミドの除去（脱落）１ＦＣ考慮する場
合、染色体ＤＮＡに組み込まれないプラスミドであるこ
とが好ましい。
スミドは４、宿主細胞および細胞融合体で複製可能であ
れば、どんな種類のプラスミドでもよりが、細胞融合体
からの導入プラスミドの除去（脱落）１ＦＣ考慮する場
合、染色体ＤＮＡに組み込まれないプラスミドであるこ
とが好ましい。
以下、本発明を実施例でさらに詳しく説明する。
実施例ｌ
０４１８耐性形質転換体の取得は、以下の方法で行なっ
た。ＤＫＤ −５Ｄ株（ＦｇＲＭ Ｐ−７５２６） （
ｈａ。
た。ＤＫＤ −５Ｄ株（ＦｇＲＭ Ｐ−７５２６） （
ｈａ。
ＭＡＴａ、 ｔｒｐ １．１ｅｕ２ ＊ ｈｉｓ ３
） ｓ ＤＳ １２−１０Ｂ株（ＦＥＲＭ Ｐ−７５２
７）（ｈｏ、 ＭＡＴａ＋ ｔｒｐｌ、 １＠ｕ２゜ｈ
ｉｓ ４ 、 ａｄｅ ’ｌ ） ｆ、各々、別々に４
ｍｌ ＹＰＤＡ液体培地（１％酵母エキス、２チポリ
イグトン、２係グルコース、０．０４１アデニン）に１
％植菌し、３０℃で１晩靜置培養した。集菌（２，００
０ｒｐｍ 。
） ｓ ＤＳ １２−１０Ｂ株（ＦＥＲＭ Ｐ−７５２
７）（ｈｏ、 ＭＡＴａ＋ ｔｒｐｌ、 １＠ｕ２゜ｈ
ｉｓ ４ 、 ａｄｅ ’ｌ ） ｆ、各々、別々に４
ｍｌ ＹＰＤＡ液体培地（１％酵母エキス、２チポリ
イグトン、２係グルコース、０．０４１アデニン）に１
％植菌し、３０℃で１晩靜置培養した。集菌（２，００
０ｒｐｍ 。
５分、 ＫＵＢＯ’ｒＡ Ｋ−８０） した各々の菌体
をクエン酸緩衝液（０，１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ
５，８）。
をクエン酸緩衝液（０，１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ
５，８）。
１０ ｍＭ ＩＩＥＤＴＡ 、 １．２ Ｍンルビトー
ル）で洗浄した後、３．６ｍのクエン酸緩衝液に懸濁し
、Ｑ、４ｍのディモリアーゼ溶液〔上記クエン酸緩衝液
に３０＋ ｍｌにディモリアーゼ６．０００（キリン
ビール社製〕３０■金溶かして無菌濾過したもの〕全加
え、３０℃で２時間静置してグロトグラスト化した。
ル）で洗浄した後、３．６ｍのクエン酸緩衝液に懸濁し
、Ｑ、４ｍのディモリアーゼ溶液〔上記クエン酸緩衝液
に３０＋ ｍｌにディモリアーゼ６．０００（キリン
ビール社製〕３０■金溶かして無菌濾過したもの〕全加
え、３０℃で２時間静置してグロトグラスト化した。
これを集菌しく、 ２．００ Ｏｒｐｍ、 ５分）、４
Ｍの１０ｍＭＣａＣｔ２ ｋ含む１．２Ｍソルビトール
で２回洗浄し、上澄除去後、残った溶液（約０．１ ｒ
Ｌｌ）にグロトプラストを穏やムに懸濁した後、ＤＫＤ
−５Ｄ株、またはＤＳ１２−１０Ｂ株、各々に約５μ
ｇのプラスミドル入Ｊ５０またはＹＲｐＧ １ ｉ添加
した。次いで２５℃で１５分保温した後、４リエチレン
グリコール溶液（２０憾ポリエチレングリコール、１０
ｍＭ ＣａＣｌ２．１０ ｍＭ ）リス塩酸緩衝液Ｐ
ｉ′１７．０）２ｒＩＬｌ’ｉ加え、穏や必に懸濁し、
２５℃で１５分保温した。集菌（２，０００ｒｐｍ、
５分）した後、Ｑ、５ ｍｌの１．２Ｍソルビトールを
含むＹＰＤＡ液体培地に懸濁し、３０℃で２０分静置し
た。これを１，２Ｍソルビトールを含むＹＰＩ）平板培
地に広げ、あらかじめ溶必して４６℃に保っておいた８
１ｎｌの上層培地〔１係酵母エキス、２係４リペプトン
、２憾グルコース、３係寒天（Ｄｌｆｃｏ ） 、 １
．２Ｍゾルビトール〕全重層し、３０℃で１５〜１８時
間培養した。終濃度で１ｍ９７ｆｎｌになるように２５
０ ｍ９／ｍｌＧ ４１８ ｉ液ｋ１４０μを取９、形
質転換用培地表面に直接スプレッダ−で塗布し、さらに
７〜１０日間培養した。形質転換培ｉＫ出現Ｌ＆：ｊ
ロニ−’ｅ、ｌ ｍ９／ｍｔのＧ４１８′Ｉｔ含むＹＰ
Ｇ１ｙ平板培地（１係酵母エキス、２優ポリベグトン、
２幅グリセロール、２チ寒天）に植菌し、この平板培地
上での生育コロニー１Ｇ４１８選択形質転換体とした。
Ｍの１０ｍＭＣａＣｔ２ ｋ含む１．２Ｍソルビトール
で２回洗浄し、上澄除去後、残った溶液（約０．１ ｒ
Ｌｌ）にグロトプラストを穏やムに懸濁した後、ＤＫＤ
−５Ｄ株、またはＤＳ１２−１０Ｂ株、各々に約５μ
ｇのプラスミドル入Ｊ５０またはＹＲｐＧ １ ｉ添加
した。次いで２５℃で１５分保温した後、４リエチレン
グリコール溶液（２０憾ポリエチレングリコール、１０
ｍＭ ＣａＣｌ２．１０ ｍＭ ）リス塩酸緩衝液Ｐ
ｉ′１７．０）２ｒＩＬｌ’ｉ加え、穏や必に懸濁し、
２５℃で１５分保温した。集菌（２，０００ｒｐｍ、
５分）した後、Ｑ、５ ｍｌの１．２Ｍソルビトールを
含むＹＰＤＡ液体培地に懸濁し、３０℃で２０分静置し
た。これを１，２Ｍソルビトールを含むＹＰＩ）平板培
地に広げ、あらかじめ溶必して４６℃に保っておいた８
１ｎｌの上層培地〔１係酵母エキス、２係４リペプトン
、２憾グルコース、３係寒天（Ｄｌｆｃｏ ） 、 １
．２Ｍゾルビトール〕全重層し、３０℃で１５〜１８時
間培養した。終濃度で１ｍ９７ｆｎｌになるように２５
０ ｍ９／ｍｌＧ ４１８ ｉ液ｋ１４０μを取９、形
質転換用培地表面に直接スプレッダ−で塗布し、さらに
７〜１０日間培養した。形質転換培ｉＫ出現Ｌ＆：ｊ
ロニ−’ｅ、ｌ ｍ９／ｍｔのＧ４１８′Ｉｔ含むＹＰ
Ｇ１ｙ平板培地（１係酵母エキス、２優ポリベグトン、
２幅グリセロール、２チ寒天）に植菌し、この平板培地
上での生育コロニー１Ｇ４１８選択形質転換体とした。
ｍ５ｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、 ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉ
ｄｅ耐性形質転換体の取得は、Ｇ４１８耐性形質転換体
取得とほぼ同様の方法で行なった。即ち、プラスミドｐ
ＡＪ５０またはＹＲｐＧ １の代わりに、プラスミドｐ
ＡＤＡ １ ＋ ｐＡＤＡ ３約５μｇ′ｆ：、ＤＫＤ
−５Ｄ株、またはＤＳ１２−１０Ｂ株のプロトプラス
トに添加し、以下上記と同様の操作の後、これ２５ｍｇ
／ｍｌ ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅを含む１．２Ｍソ
ルビトールＹＰＤ−２平板培地（１俤酵母エキス。
ｄｅ耐性形質転換体の取得は、Ｇ４１８耐性形質転換体
取得とほぼ同様の方法で行なった。即ち、プラスミドｐ
ＡＪ５０またはＹＲｐＧ １の代わりに、プラスミドｐ
ＡＤＡ １ ＋ ｐＡＤＡ ３約５μｇ′ｆ：、ＤＫＤ
−５Ｄ株、またはＤＳ１２−１０Ｂ株のプロトプラス
トに添加し、以下上記と同様の操作の後、これ２５ｍｇ
／ｍｌ ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅを含む１．２Ｍソ
ルビトールＹＰＤ−２平板培地（１俤酵母エキス。
０．２５係？リベグトン、２憾グルコース、２チ寒天）
に広げ、あらかじめ溶かして４６℃に保っておいた５グ
〜の５ｕｌｆａｎｉ ｌａｍｌｄａ ｔ−含む８ゴのＹ
ＰＤ −２上層培ｍ（１％酵母エキス、０．２５チポリ
ペグトン、２ｍグルコース、１．２Ｍソルビトール、３
係寒天（Ｄｉｆａｏ ） ） ’に重層し、３０℃で０
〜１５時間培養後、終濃度で４０μｇ／ｍｌになるよう
１ｌｔｌ： ｌ Ｑ ■／ｍ ｍｅｔｈｏｔｒｒｘａｌ
ｅ溶液を１３０μを取り、形質転換用培地表面に、直接
スプレッダ−で塗布し、さらに７〜１０日間培養するか
、もしくは為プロトプラストｔ−４０μｇ／ｍｌ ｍｅ
ｔｈｏｔｒｅｘａｔｏ ＋５嬌Ｎｓｕｌｆａｎ１１ａｍ
ｉｄｓ ｋ含む１，２ＭソルビトールＹＰＤ −２平板
培地に広げ、あらムじめ啓ムして４６℃に保っておいた
４０μｇ／ｍ７ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ 、 ５ｍ
９〜ａｕｌｆａｎ１１ａｍｔｄｅ ｔｌ−含む８ゴのＹ
ＰＤ −２上層培地を重層し、３０℃で７〜１０日間培
養した。形質転換培地に出現したコロニーを、４０μｇ
Ａｌ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ 。
に広げ、あらかじめ溶かして４６℃に保っておいた５グ
〜の５ｕｌｆａｎｉ ｌａｍｌｄａ ｔ−含む８ゴのＹ
ＰＤ −２上層培ｍ（１％酵母エキス、０．２５チポリ
ペグトン、２ｍグルコース、１．２Ｍソルビトール、３
係寒天（Ｄｉｆａｏ ） ） ’に重層し、３０℃で０
〜１５時間培養後、終濃度で４０μｇ／ｍｌになるよう
１ｌｔｌ： ｌ Ｑ ■／ｍ ｍｅｔｈｏｔｒｒｘａｌ
ｅ溶液を１３０μを取り、形質転換用培地表面に、直接
スプレッダ−で塗布し、さらに７〜１０日間培養するか
、もしくは為プロトプラストｔ−４０μｇ／ｍｌ ｍｅ
ｔｈｏｔｒｅｘａｔｏ ＋５嬌Ｎｓｕｌｆａｎ１１ａｍ
ｉｄｓ ｋ含む１，２ＭソルビトールＹＰＤ −２平板
培地に広げ、あらムじめ啓ムして４６℃に保っておいた
４０μｇ／ｍ７ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ 、 ５ｍ
９〜ａｕｌｆａｎ１１ａｍｔｄｅ ｔｌ−含む８ゴのＹ
ＰＤ −２上層培地を重層し、３０℃で７〜１０日間培
養した。形質転換培地に出現したコロニーを、４０μｇ
Ａｌ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ 。
５ｍ９／ｒｎｌ ｉｕｌｆａｎｌｌａｍｉｄ＠ｆ含むＹ
ＰＤ −２平板培地に植菌し、この平板培地上での生育
コロニーを、ｍｅｔｈｏｔｒｓｘａｔｅ 、 ｓｕｌｆ
ａｎｉｌａｍｉｄａｇ択形質転換体とした。Ｇ４１８耐
性形質転換体、 ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ 。
ＰＤ −２平板培地に植菌し、この平板培地上での生育
コロニーを、ｍｅｔｈｏｔｒｓｘａｔｅ 、 ｓｕｌｆ
ａｎｉｌａｍｉｄａｇ択形質転換体とした。Ｇ４１８耐
性形質転換体、 ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ 。
ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄ＠耐性形質転換体が、真の形
質転換体である小どう小は、１）同じプラスミド上の他
の符号である栄養要求性符号消失の有無、またけ２）薬
剤耐性消失の有無（ＹＰＤ液体培地で一晩培養後、適宜
希釈後、ＹＰＤ平板培地にプレートし、さらに各々の薬
剤を含む培地にレゾリカしてプラスミドの脱落を見る方
法による）ｉ７７：より判定した。
質転換体である小どう小は、１）同じプラスミド上の他
の符号である栄養要求性符号消失の有無、またけ２）薬
剤耐性消失の有無（ＹＰＤ液体培地で一晩培養後、適宜
希釈後、ＹＰＤ平板培地にプレートし、さらに各々の薬
剤を含む培地にレゾリカしてプラスミドの脱落を見る方
法による）ｉ７７：より判定した。
上記方法にて得た薬剤耐性形質転換体を、各々、別々に
、Ａ ｄ ＹＰＤＡ液体培地、もしくは各々の濃度の薬
剤を含むＹＰＤＡ液体培地に１係植菌し、３０℃で一晩
静置培養した。集菌（２，ＯＯＯｒｐｍ 、 ５分。
、Ａ ｄ ＹＰＤＡ液体培地、もしくは各々の濃度の薬
剤を含むＹＰＤＡ液体培地に１係植菌し、３０℃で一晩
静置培養した。集菌（２，ＯＯＯｒｐｍ 、 ５分。
ＫＵＢＯＴＡ Ｋ−８０） した各々の菌体を、クエン
酸緩衝液（０，１Ｍクエン酸ナトリウム（ＰＨ５，８）
、１０ｍＭ ＥＤＴＡ 、 １．２ Ｍソルビトール）
で洗浄した後、３．６Ｍのクエン酸緩衝液に懸濁し、０
．４１ｎｌのディモリアーゼ溶液を加え、３０℃で２時
間静置して、プロトグラスト化を行なった。これを集菌
しく ２．ＯＯＯｒｐｍ 、 ５分）、４ｒｎｌの１０
ｒｎｌＶＩ ＣａＣｔｚ ｅ含む、１．２Ｍソルビト
ールで２回洗浄し、上澄除去後、残った溶液にプロトプ
ラストを穏や必に懸Ｓ Ｌりｆｆｌ、ＤＫＤ −５Ｄ
（ｐＡＤＡ３ ］とＤＳ１２−１０ＢＣｐＡＪ５０］、
ＤＫＤ−５Ｄ（ｐＡＤＡｌ）とＤＳ１２−１０Ｂ［ＹＲ
ｐＧ１’］ 、 ＤＫＤ−５Ｄ（ｐＡＤＡｌ）とＤＳ１
２−１０ＢＣＩ）ＡＪ５０） 、 ＤＫＤ−５Ｄ（ｐＡ
ＤＡ３）とＤＳ１２−１０Ｂ［ＹＲＩ）Ｇ １ ］を組
み合わせ、２５℃で１５分保温した。その後ポリエチレ
ングリコール溶液２Ｍを加え、穏やかに懸濁し、２５℃
で１５分保温した。
酸緩衝液（０，１Ｍクエン酸ナトリウム（ＰＨ５，８）
、１０ｍＭ ＥＤＴＡ 、 １．２ Ｍソルビトール）
で洗浄した後、３．６Ｍのクエン酸緩衝液に懸濁し、０
．４１ｎｌのディモリアーゼ溶液を加え、３０℃で２時
間静置して、プロトグラスト化を行なった。これを集菌
しく ２．ＯＯＯｒｐｍ 、 ５分）、４ｒｎｌの１０
ｒｎｌＶＩ ＣａＣｔｚ ｅ含む、１．２Ｍソルビト
ールで２回洗浄し、上澄除去後、残った溶液にプロトプ
ラストを穏や必に懸Ｓ Ｌりｆｆｌ、ＤＫＤ −５Ｄ
（ｐＡＤＡ３ ］とＤＳ１２−１０ＢＣｐＡＪ５０］、
ＤＫＤ−５Ｄ（ｐＡＤＡｌ）とＤＳ１２−１０Ｂ［ＹＲ
ｐＧ１’］ 、 ＤＫＤ−５Ｄ（ｐＡＤＡｌ）とＤＳ１
２−１０ＢＣＩ）ＡＪ５０） 、 ＤＫＤ−５Ｄ（ｐＡ
ＤＡ３）とＤＳ１２−１０Ｂ［ＹＲＩ）Ｇ １ ］を組
み合わせ、２５℃で１５分保温した。その後ポリエチレ
ングリコール溶液２Ｍを加え、穏やかに懸濁し、２５℃
で１５分保温した。
集菌（２，ＯＯＯｒｐｍ、５分）した後、０．５コの１
．２Ｍソルビトールを含むＹＰＤＡ液体培地に懸濁し、
３０℃で２０分靜装した。以下、次の２法にて実験全行
り九０ １）方法１：プロトグラストを、５〜／ｒｎｌのａｕｌ
ｆａｎｉｌａｍｉｄｅ ｆ：含む、１．２Ｍソルビトー
ルＹＰＤ−２平板培地に広げ、あらかじめ溶さして４６
℃に保つてオイた５ｍ９／Ｉｄのｓｕｌｆａｎｉｌａｍ
ｉｄｅ ｆ含む１８ｍ１のＹＰＤ −２上層培地を重層
し、３０℃で０〜１５時間培養後、終濃度で４０μｇ／
ｒｎｌになるように、ｍａｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ ｆ培
地表面に塗布、１５〜２０時間培養後、終濃度で１η／
ＴｎｌになるようにＧ４１８’を培地表面に塗布し、さ
らに７〜１０日間培養した。
．２Ｍソルビトールを含むＹＰＤＡ液体培地に懸濁し、
３０℃で２０分靜装した。以下、次の２法にて実験全行
り九０ １）方法１：プロトグラストを、５〜／ｒｎｌのａｕｌ
ｆａｎｉｌａｍｉｄｅ ｆ：含む、１．２Ｍソルビトー
ルＹＰＤ−２平板培地に広げ、あらかじめ溶さして４６
℃に保つてオイた５ｍ９／Ｉｄのｓｕｌｆａｎｉｌａｍ
ｉｄｅ ｆ含む１８ｍ１のＹＰＤ −２上層培地を重層
し、３０℃で０〜１５時間培養後、終濃度で４０μｇ／
ｒｎｌになるように、ｍａｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ ｆ培
地表面に塗布、１５〜２０時間培養後、終濃度で１η／
ＴｎｌになるようにＧ４１８’を培地表面に塗布し、さ
らに７〜１０日間培養した。
２）方法２：プロトプラストを４０μｇ／ゴｍｓ＋ｔｈ
ｏｔｒｅｘａｔｅｅ ５ｍ９／ｒｔｔｌ ｓｕｌｆａｎ
ｌｌａｍｉｄｅを含む、１．２ＭソルビトールＹＰＤ
−２培地に広げ、同温度の薬剤を含むＹＰＤ −２上層
培地を重層し、３０℃で１５〜２０時間培養後、終濃度
で１〜／ｒｎｌになるように、Ｇ４１８溶液を培地表面
に塗布して、さらに７〜１０日間培養した。
ｏｔｒｅｘａｔｅｅ ５ｍ９／ｒｔｔｌ ｓｕｌｆａｎ
ｌｌａｍｉｄｅを含む、１．２ＭソルビトールＹＰＤ
−２培地に広げ、同温度の薬剤を含むＹＰＤ −２上層
培地を重層し、３０℃で１５〜２０時間培養後、終濃度
で１〜／ｒｎｌになるように、Ｇ４１８溶液を培地表面
に塗布して、さらに７〜１０日間培養した。
方法１．方法２によυ形質転換培地で生育したコロニー
を、Ｉ Ｔｎ９／ｒｒｔｌ Ｇ ４１８ 、４０ μｇ
／ｒｔｄ！ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ ＋ ５ｍ９／ｍ
ｌ ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｌｄｅ ｆ含むＹＰＤ −２
平板培地に植菌し、この平板培地上での生育コロ＝−ｆ
、Ｇ ４１８ ｅ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅおよび
ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｓ耐性細胞融合株とした。
を、Ｉ Ｔｎ９／ｒｒｔｌ Ｇ ４１８ 、４０ μｇ
／ｒｔｄ！ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ ＋ ５ｍ９／ｍ
ｌ ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｌｄｅ ｆ含むＹＰＤ −２
平板培地に植菌し、この平板培地上での生育コロ＝−ｆ
、Ｇ ４１８ ｅ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅおよび
ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｓ耐性細胞融合株とした。
この薬剤耐性株が、真のプラスミド性耐性株であるホど
う小は、同じプラスミド上の他の遺伝子符号である栄養
要求性符号（Ｌｅｕ”、 Ｔｒｐ” ）にて判定した。
う小は、同じプラスミド上の他の遺伝子符号である栄養
要求性符号（Ｌｅｕ”、 Ｔｒｐ” ）にて判定した。
さらに得られた耐性株中の雑種細胞融合株の割合を、用
いた酵母菌株の遺伝子符号である栄養要求性力１ら判定
し算出した。この結果は第２表に示した。
いた酵母菌株の遺伝子符号である栄養要求性力１ら判定
し算出した。この結果は第２表に示した。
￥Ｓ２表において、ＳおよびＫＩｉ、各々ＤＳ１２−１
０Ｂ株、ＤＫＤ−５Ｄ株を示し、ＳＫは両法間の雑種細
胞融合株であることを示す。また、Ｇ４１８耐性ＭＳ’
は、各々Ｇ４１８耐性＊ ｍｅｔｈｏｔｒ＠ｘａｔａ
。
０Ｂ株、ＤＫＤ−５Ｄ株を示し、ＳＫは両法間の雑種細
胞融合株であることを示す。また、Ｇ４１８耐性ＭＳ’
は、各々Ｇ４１８耐性＊ ｍｅｔｈｏｔｒ＠ｘａｔａ
。
ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄ・耐性であることを示す。
第２表から明らかなように、すべての組合わせで、薬剤
耐性（Ｇ４１８’、ＭＳ’）’ｉ符号として選択した細
胞融合体においても高頻度で雑種細胞融合体、即ち真の
雑種細胞が得られ、本発明の育種法が極めて有用である
ことが示された。
耐性（Ｇ４１８’、ＭＳ’）’ｉ符号として選択した細
胞融合体においても高頻度で雑種細胞融合体、即ち真の
雑種細胞が得られ、本発明の育種法が極めて有用である
ことが示された。
第１図は、薬剤耐性符号を有するシラスミドを示す。
鵜１図
−Ａ
−Ｃ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、２株の微生物特に有核微生物に、異なる選択可能な
遺伝的符号を付加しプラスミドＤＮＡを各各形質転換に
より導入後、細胞融合を行い、細胞融合体もしくは細胞
質融合体を、導入遺伝的符号を指標として選択すること
を特徴とする新規な微生物の育種法。 ２、有核微生物が、酵母であることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の育種法。 ３、酵母が、野生型酵母であることを特徴とする特許請
求の範囲第２項記載の育種法。 ４、酵母が、サッカロマイセス属に属する酵母であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２項および第３項記載
の育種法。 ５、選択可能な遺伝的符号が、薬剤耐性であることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の育種法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59189989A JPS6167478A (ja) | 1984-09-11 | 1984-09-11 | 新規な微生物の育種法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59189989A JPS6167478A (ja) | 1984-09-11 | 1984-09-11 | 新規な微生物の育種法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6167478A true JPS6167478A (ja) | 1986-04-07 |
Family
ID=16250525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59189989A Pending JPS6167478A (ja) | 1984-09-11 | 1984-09-11 | 新規な微生物の育種法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6167478A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02119783A (ja) * | 1988-10-28 | 1990-05-07 | Tax Adm Agency | 酵母における新しい形質転換法 |
| JP2008504183A (ja) * | 2004-07-02 | 2008-02-14 | ディアジオ アイルランド | 二段階弁を備える計量分配装置タップ |
-
1984
- 1984-09-11 JP JP59189989A patent/JPS6167478A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02119783A (ja) * | 1988-10-28 | 1990-05-07 | Tax Adm Agency | 酵母における新しい形質転換法 |
| JP2008504183A (ja) * | 2004-07-02 | 2008-02-14 | ディアジオ アイルランド | 二段階弁を備える計量分配装置タップ |
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