JPS6156084A - 酵素反応方法 - Google Patents

酵素反応方法

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JPS6156084A
JPS6156084A JP17695984A JP17695984A JPS6156084A JP S6156084 A JPS6156084 A JP S6156084A JP 17695984 A JP17695984 A JP 17695984A JP 17695984 A JP17695984 A JP 17695984A JP S6156084 A JPS6156084 A JP S6156084A
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Shoichi Kise
木瀬 昇一
Hidekatsu Maeda
前田 英勝
Hisafumi Kimura
尚史 木村
Noriaki Koizumi
小泉 典秋
Yukinae Yamazaki
幸苗 山崎
Hiroyuki Araki
宏之 荒木
Mikio Hayashida
林田 幹夫
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ  4上の1 本発明は酵素及び補酵素を利用した9素反応に関し、特
に酵素及び補酵素を利用して反応せしめるようなバイオ
リアクター(生物反応器)において、反応中補酵素が反
応系外に漏出しないような膜を組み込んで捕rJ)jf
iを外部から新たに補給しなくても、あるいは補給を極
めて少量に抑え、効率よく反応を進行せしめるようなシ
ステムを提供することに関するものである。
■す」【胆悲墓嵐 酵素利用の分野では補酵素を必要としない酵素群と補び
素を必要とする酵素群とに分けられる。
補u?llを必要としない酵素群には加水分解反応ある
いは異性化反応を司る酵素が知られており、中でも現在
工業的に用いられている酵素としてはデンプン液化酵素
、@i化酵素等の加水分解酵素あるいは砂糖の代替品と
して用いられている果糖シロップ(異性化りを生成する
グルコースイソメラーゼが知られている。現在、これら
の各種加水分解酵素及び異性化酵素の用途開発が急速に
進展している。
一方、補酵素を必要とする酵素群として酸化還元酵素、
モノオキシゲナーゼ、合成酵素(リガーゼ)及び付加・
脱離酵素(リアーゼ)が知られている。これらの酵素は
その反応に当り補酵素を必要とするため、その工業的利
用は遅々として進まず、現在やっとその開発が端緒につ
いたところである。とりわけ、有用な不斉還元体を生成
することができる各種脱水素酵素及び位置特異的に水酸
基(−OHンを導入し、有用な水酸化化合物を生成する
ことができるモノオキシゲナーゼの利用が脚光を浴びて
いる。
この目的に適したバイオリアクターの開発が必要となる
。また同時に補酵素をいかに効率良く共役反応の開を回
転させるかが重要な課題となる。言い換えると補酵素1
分子当り信子分子の生産物を作り出し得るかということ
である。
バーnがF、シようとするr。2点 補酊素を効率良く使用する方法としては補酵素を高分子
化し、次いでこの高分子化補酵素を酵素と共に限外ろ過
膜を有するバイオリアクターに保持し、共役反応を行な
わせる方法がある。すなわちNAD、NADPあるいは
ATPのアデニン核の6位のアミノ基にカルボキシメチ
ル基のような端子を結合させ、さらにこの端子を介して
水溶性高分子と結合させる1次いで、このような高分子
化NAD(P)もしくは高分子化ATPを酵素と共に限
外ろ過膜を装着したバイオリアクターに加え、両者を系
内に固定しながら反応を行い、有用物質を生産する。し
かしながらNAD(P)及びATPの高分子化は多段階
の合成反応を必要とし、したがって多額の費用と日数を
要し、NAD (P)等を系内にとどめる方法としては
解決すべき多くの課題がある。
一方、天然のNAD (P)もしくはATPをそのまま
使用する場合は酵素のみを限外ろ過膜で系内にとどめる
ように操作し、NAD (P)等は系外にそのまま排出
することになる。したがって排出されたNAD (P)
及びATPは吸着剤を用いて回収することになる。この
場合は多量の反応液中から少量のNAD (P)もしく
はATPを回収しなければならず、経済性の観点から大
きな課題がある。このようにNAD (P)及びATP
の回収・再利用を目的としてバイオリアクター系内にこ
れらを固定することは、いずれの場合もまだ数々のi題
が残されている。
二 。  を ゛するための 本発明者等は上記の課題を解決すべく天然のNAD (
P)、ATP等の補酵素をそのままの形で。
酵素と共にバイオリアクター系内に固定化する方法につ
いて鋭意研究を重ねた結果、アニオン性官能法を導入し
た荷電型限外ろ過膜を用いることによってNAD (P
)もしくはATP等の補酵素をそのままバイオリアクタ
ー系内に酵素と共に固定でき、下記のような共役反応を
極めて円滑に行なうことができることを見出し、本発明
に到達したものである。
すなわち1本発明はU索及び補酵素を用いて酵素反応を
行なうにあたり、アニオン性官能基を導入した荷電型限
外ろ過膜を使用することを特徴とする酵素反応方法に関
するものである。
以下、本発明の酵素反応について更に詳細に説明する。
本発明方法で用いるアニオン性官能基導入荷電型限外ろ
過膜の基体として用いられる限外ろ過膜は、酵素の漏出
を妨げるような分画分子量を持つ通常の限外ろ過膜でよ
く、このものに荷電を有する官能基を結合させるが、そ
の種類は問わない。
基体となる限外ろ過膜の例としては、ポリスルホン、ポ
リアクリロニトリル及びアセチルセルロースなどの通常
の膜素材が挙げられ、このものに官能基としてスルホン
基、リン酸基、カルボキシメチル基などを導入して調製
することができる。またポリアクリロニトリル膜にスル
ホン基及び4級アミノ基の両方を導入したもの(ロース
・ブーラン社製、商品名PAN3042等)も使用する
ことができる。官能基の導入については、たとえばスル
ホン基の導入は@素材を適当な有機溶媒(クロロホルム
など)に溶かしてクロロスルホン酸を添加しスルホン化
することで達成できる。イオン交換容量は好ましくは0
.1rneq/g〜5meq/gの範囲のものが使用で
きる。またこれらの荷電型限外ろ過膜を用いて反応を行
う場合、アルブミン、カゼインあるいはゼラチンなどの
たんばく質であらかじめ膜表面を塗布することによって
も上記補酵素類の阻止率をさらに向上させることができ
、より好ましい結果が期待できる。
上記荷電型限外ろ過膜を装着したバイオリアクターの反
応型式は共役反応終了時、その都度限外ろ過する完全回
分方式、あるいは基質の添加と限外ろ過を連続して行う
連続撹拌混合方式等がある。
他方、ろ過膜部分を反応槽と別に設置し、集中的に限外
ろ過することも可能である。また膜の様式としては平膜
あるいはホローファイバーに成型したもの等、限定され
ない。
この新しいバイオリアクターに用いる補酵素としてはN
AD (H)、NADP (H)、AMP。
ADP、ATPあるいはそれらの修飾物などを用いるこ
とができる。また補酵素の安定化剤としてEDTA及び
N a N 3などを共存させてもよい。
バイオリアクターに添加する酸化還元酵素としてアルコ
ール脱水素酵素、インクエン酸脱水素酵素、グルコース
−6−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、アルド
ース還元酵素、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素
、安息香酸−モノオキシゲナーゼ等の酵素群を挙げるこ
とができる。
これらは精製酵素あるいは粗醇素及びそれらの固定化物
、さらにはそれらの醇索を含む細胞であってもよい。こ
の他、合成酵素(リガーゼ)としてNADキナーゼ、ホ
スホグリセリン酸キナーゼ、アスパラギン酸シンターゼ
等の酵素群を使用できる例として挙げることができる。
さらに必要ならば前者の酵素群及び後者の酵素群からそ
れぞれ選択し、それらを組み合せて複合酵素系で使用す
ることも可能である。NAD (P)H及びATP再生
反応を組み合せた共役反応のp)(及び温度条件は複数
の酵素をそれぞれ満足し得る最大公約数的な条件を選択
することになる。
口盆走肛 本発明のアニオン性官能基を導入した荷電型限外ろ過膜
は導入したアニオン性官能基がNAD、NADPあるい
はATPなどのリン酸基に対して静電的なイオン反発を
引き起こし、この作用によってNAD、NADPあるい
はATPが荷電型限外ろ過膜内に保持、固定できるもの
である。
立Ω大里■ 以下、本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが1本発
明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例1 荷電型限外ろ過膜として■5PS−I (スルホン化ポ
リスルホン膜1分画分子量1万;製法は木材等、ジャー
ナル・オブ・ケミカルエンジニアリング・オブ・ジャパ
ン、上6.389 (1983)に記載〕、■PAN3
042 (スルホン化および第4Rアミン化ポリアクリ
ロニトリル膜、分画分子基2万;ローヌ・ブーラン製)
、■5P83026 (スルホン化ポリスルホン膜1分
両分子量2万;ロース・ブーラン製)を選択し、これら
を用いてNADPの阻止率を調べた。この結果を第1表
に示す。
第1表  NADPの阻止率(%)×1×1阻止率二N
ADP0,1mMの溶液16m1を4 m l限外ろ過
したときのる液のNADPI度を260nmの吸光度で
測 定し、以下の計算を行った。
×2組成液ニゲルコース、ソルビトール各0.2M溶液 実施例2 SPS[をアルブミンで処理することによって阻止率を
大巾に向上させることができる。以下、その結果を示す
実施例1の5PS−I膜を0.1M酢酸緩衝液(pH3
,2)に溶解した1%アルブミン溶液で処理し、次いで
この処理膜を用いてNADP、NAD及びATPに対す
る阻止率を調べた。結果を第2表に示す、いずれもグル
コース、ソルビトール、グルコン酸および食塩を各0.
2M含む溶液(1/15Mトリス緩衝液、PH7,5)
中で測定した。    ′ 第2表 種々の補酵素に対する阻止率(%)第2表にお
いて、アルブミン前処理とはアルブミンで前処理した膜
を用い水洗した後、反応系内には新たにアルブミンを加
えないで反応させることを指し、アルブミン存在下とは
上記の処理をしないで、反応液中に0.2%のアルブミ
ンを存在させて反応を行なうことを指す。
実施例3 アルブミンで前処理した5PS−I膜をアミコン社製限
外ろ過器(モデル52型)に組み込み。
第3表に示した反応組成液を添加してバイオリアクター
によるソルビトールとグルコン酸の生産を行った。
第  3  表 反応温度は30℃ 反応は第1図に示したように半回分式、すなわち所定時
間反応後、反応内液を限外ろ過し、ソルビトール及びグ
ルコン酸を分取する方式を採用した。1回目の反応終了
後、反応液をろ過し、次いで減量した分のみ400mM
濃度のグルコース溶液を所定量添加し、再度反応を行っ
た。これを6回繰り返した。NADPは初回に1.5.
−mole添加しただけで以後添加しなかった。各回分
反応後のる液を分析した結果、グルコースの転化率は1
回目の回分反応が98%で、それ以後は100%で反応
が進行していた。また260nmにおける吸光度計算か
らろ液中のNADP量を定量した結果、6回目の回分反
応が終了した時点でも1゜2pmo l eのNADP
量が残存していた。なお、この反応系において生成した
グルコン酸は炭酸ナトリウム水溶液で中和されるため、
反応中、内液は徐々に増加する。
実施例4 NADPの代りにNADを用いて実施例3と同様にソル
ビトールとグルコン酸の生産を行った。
第4表に示す反応組成液を用いたが、このときのグルコ
ース濃度は100mMであった。
反応温度は30’C 22時間反応援5PS−I膜を用いて反応終了液を2 
m l限外ろ過し、ろ液の分析を行った。生成リンゴ酸
量は161.−mole、グルコン酸量は152.、、
moleであった。またろ液中に漏出したNAD量は0
.15.wmo l eであった。
実施例5 限外ろ過膜として5PS−I膜、補酵素としてATPを
用いて第5表に示す組成液でグルコース−6−リン酸の
生産を行った。この場合ATPがアセテートキナーゼに
よって再生されながらグルコース−6−リン酸が生産さ
れることになる。
第  5  表 反応温度は30℃ 70分反応援5ps−111Kにより反応液を1ml限
外ろ過し、ろ液の分析を行った。グルコース−6−リン
酸は493Pmole生産された。また260nmにお
ける吸光度から算出したATP及びADPの反応液中総
量は9.8.mmo 1 eであり、その残存率は98
%であった。
豆Eと臥釆 酵素及び補酵素を用いて酵素反応を行なうにあたり、ア
ニオン性官能基を導入した荷電型限外ろ過膜を用いるこ
とによって酵素、補酵素の固定が完全に行なわれ、反応
系外へ補酵素が流出しなくなるため、補酵素を途中で補
給する必要が殆んどなく、本発明では、限外ろ過膜にア
ニオン性官能基を導入するという極めて簡単な操作だけ
であるから、従来の補酵素を高分子化するための複雑な
操作、或いは補酵素の回収に伴なう多額の費用及び時間
の節約ができ、酵素反応を効率的に行なうことができる
。このような効率的な、しかも経済性の高い、全く新し
い体系のバイオリアクターを構築することが可能となっ
たので、このバイオリアクターを用いることによって上
述の不斉構造を有する化合物あるいは位置特異的な水酸
化物などの有用物質を工業的規模で効率よく生産するこ
とが可能であり、技術的、経済的効果は極めて大きいも
のである。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の一実施例の半回分式反応方式を示す図
である。 θ    /ρ    :lOJ(79反 た・ h 
山 (hつ

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)酵素及び補酵素を用いて酵素反応を行なうにあた
    り、アニオン性官能基を導入した荷電型限外ろ過膜を使
    用することを特徴とする酵素反応方法。
JP17695984A 1984-08-25 1984-08-25 酵素反応方法 Granted JPS6156084A (ja)

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JP17695984A JPS6156084A (ja) 1984-08-25 1984-08-25 酵素反応方法

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JPS6156084A true JPS6156084A (ja) 1986-03-20
JPS6161799B2 JPS6161799B2 (ja) 1986-12-27

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ID=16022704

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