JPS61502910A - 血清中のｈｔｌｖ−３中和抗体を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血清中のＨＴＬＶ−１中和抗体を検出する方法」」１ 最近１９８４年に、ウィルスＨＴＬＶ−ＩＩＩは後天性免疫不全症候群（エイズ ）病の最も可能性の高い原因ウィルスとして現われた（ガロ等、イン　ザ　マテ リアル　イ〉フォメーシ璽ン　ディスクロージャー、ポスト１１２゜５　（Ｇａ １ｌｏ、　ｅｔ　ａｌ、　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔ ｉｏｎ　Ｄｉｓｃｌｏ−ｓｕｒｅ、　ｐｏｓｔ　１　、２　＋　５　）参照）。

Ｈ９細胞ｔｉ当にＨＴＬＶ−ｍウィルスに感染でせ、そして培養する場合にも、 不朽化されたものが生じる。ＨＴＬＶｐ２４　コア抗原は、不朽化Ｈ９／ＨＴＬ Ｖ−ｎ［細胞系から分離及び精製されている（ガロ等、米国特許第５ｅｒｉａｌ 　Ａ　６３５．６１０号、１９８４年７月３０日出Ｂ、°ＨＴＬＶ−Ｊｉｏ　ｐ ２４　コアｉ白質０公離（ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ２４　Ｃｏｒｅ　Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＨＴＬＶ−１１１）’　）。

総括的方法 本発明において、血清中の自然な抗体は、ＨＴＬＶ−１１感染を中和する能力に よシ評価される。ＨＴＬＶ　−１［感染は、ＨＴＬＶ−［１ｐ２４　に対する特 異的モノクローナル抗体によってウィルスのコア蛋白質、ｐ２４　の表出を追う ことによシ調べられる。

本発明において、効果はかなりの量のウィルスを効果的に中和する抗体を含む血 清を使用することである。この抗体中和は、全体または部分でろって良い、そし て中和する抗体価の童の算出は、略述した方法を用いて行なわれても良い。この 方法は、めらゆる種からの血清に適用でき、そしてそれ故にＨＴＬＶ−１１中和 抗体反応を引き出す効果のある潜在的ワクチン製造を評価するために有用である 。最後の段階で、３日以内にウィルスの感染を観察することができない場合には 、血清は完全にウィルスの感染を中和した。血清中の中和抗体がウィルスのレセ プターへの初期の付着に関係するウィルスのエンベロープの糖蛋白質に結合し、 この様にウィルスの感染作用を阻止すると思われる。

また、抗原−抗体反応並びにウィルスの抗原を中和し保護に有用であるエイズ及 び関連した患者の血清中の抗体の存在に依存するＨＴＬＶ−ｆｌｉｔ試験する特 別な目的のために、使用することにも努力した。

スケッチ■は、本発明の方法を示す。

スケッチＩ ウィルス（）ＩＴＬＶ−Ｉ［［） ＋ ↓　ウィルス抗原への特異的抗体の結合Ｈ９細胞を感染させ、そして培養する（ ３日続ける）↓ ＨＴＬＶ−［［ｐ２４の表出を追うことによシウイルス感染を評価 材料の情報開示 １）サルンガドハラ／等、“エイズ患者の血清中のヒトＴ−向リンパ性レトロウ ィルス（１−ＩＴＬＶ−Ｉｎ）と反応する抗体”、サイエンス、第２２４巻：第 ５０６−５０８頁、１９８４年（Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、　ｅｔ　ａｌ、　 ”　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｒｅａｃｔｉｖｅｗｉｔｈ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−１ｙ ｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　（ＨＴＬＶ　−ｆｆＪ　） ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｅｒｕｍ　ｏｆ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　、 　’　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２４：５０６−５０８，１９８４） ２）サファイ等、“後天性免疫不全症候群中のヒ）Ｔ−向リンパ性レトロウィル スタイプ■の血清疫学的研究−（５ａｆａｉ、　ａｔ　ａｔ、　”　Ｓｅｒｏｅ ｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｈｕ−ｍａｎ　Ｔ−１ ｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　ｌｌｌ１ｎ　Ａｃ ｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、　’　Ｌ ａｎｃｅｔ、　ｉ、１４３８−１４４０．１９８４） ３）ガゾロ等、″仏領ギアナにおけるハイチ移住民のＨＴＬＶ−１１に対する抗 体・、ニエーイングル、ジェイ。

メト１、第３１１巻：第１２５２−１２５３頁、１９８４年（Ｇａｚｚｏｌｏ、 　ｅｔ　ａｌ、　＠Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ＨＴＬＶ−［７ｉｎ　Ｈａｉ −Ｓ）クルメック等、°選択された群異性愛のアフリカ人の間のＨＴＬＶ　−■ 抗体優勢の血清疫学的研究”、　１９８５年４月１４−１７日、アトランタ、エ イズに関する国際学会で発表（Ｃ１ｕｎｎｅｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、　＠Ｓｅｒｏ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ＨＴＬＶ−■Ａｎｔｉ ｂｏｄｙ　Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ　Ａｍｏｎｇ　５ｅｌｅ−ｃｔｅｄ　Ｇｒｏｕ ｐｓ　１（ｅｔｅｒｏｓｅｘｕａｌ　Ａｆｒｉｃａｎｓ　、　＋ｔｏ　ｂｅ　ｐ ｒｅｓｅｎｔｅｄａｔ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅ ｎｃｅ　ｏｎ　ＡＩＤＳ、　Ａｔ１ａｎｔａ。

Ａｐｒｉｌ　１４−１７　ｙ　１９８５　）。

５）ゴング等、°エイズウィルス、ヒトＴ−細胞向リンパ性ウィルスタイプ■（ ＨＴＬｖ−■）及びビスナウィルス、病原性レンチウィルス亜科の仲間の配列相 同性及び構造の類似°、サイエンス、印刷中（Ｑｏｎｄａ、　ｅｔａｌ、　＠５ ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ　５１ｍ １ｌａｒｉｔｙｏｆ　ｔｈｅ　ＡＩＤＳ　Ｖｉｒｕｓ、　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅ ｌｌ　Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｖｉ−ｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　■（ＨＴＬＶ　− ［１）　、　ａｎｄ　Ｖｉｓｎａ　Ｖｉｒｕｓ、　Ｍｅｍｂｅｒｏｆ　ｔｈｅ　 Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ、　’　５ ｃｉｅｎｃｅ。

ｉｎ　ｐｒｅｓｓ　）。

６）ｅ！バートーガロフ等゛モノクローナル抗体を使用して皮膚のＴ−細胞り／ バ腫及び白血病患者数人の細胞中のヒトＴ−細胞リンパ腫ウィルスｐ１９の検出 ゝ、！エイ、エクスプ、メト１、第１５４巻：第１９５７−１９６４頁、１９８ １年（Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ、　ｅｔ　ａｌ、　’　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 　ｏｆｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　’ｌ’−ｃｅｌｌ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ 　ｐ　１９　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｓ　ｏｆＳｏｍｅ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　 Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　ａｎｄＬｅｕｋｅｍｉ ａ　Ｕｓｉｎｇ　ａ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、　’　Ｊ、　 ＥｘｐｏＭｅｄ、。

１５４：１９５７−１９６４．１９８１）。

７）米７％許第５ｅｒｉａｌ、６６５５．６１０号、ガロ等、　１９８４年７月 ５０日出願、“ＨＴＬＶ　−ｌのｐ２４コア蛋白質の分離”　（Ｕ、Ｓ、　５ｅ ｒｉａｌＡ６５５，６１０．　Ｇａ１ｌｏ、　ｅｔ　ａｌ。

ｆｉｌｅｄ　Ｊｕｌｙ　３０　、　１９８４　、＠ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ｐ２４　ＣｏｒｅＰｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＨＴＬＡ−１［Ｉ＋）。

ＨＴＬＶ　−［１を中和し、それを保護し及び特異的ＭＡＢ例えば抗ｐ　２ａ　 ＨＴＬＶ−１１１（ＢＴ３バイオチク　リサーチラプス（ＢＴ　３　Ｂｉｏｔｅ ｃｈ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ　）、ペロネーゼ等（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ　ｅ ｔ　ａｌ　）が提出した）で残りのウィルス感染性を測定する血清中の自然の抗 体を検出する本方法を上記参考文献のどれ本開示していない。

本発明 後天性免疫不全症候群（エイズ）の多くの患者の細胞からヒトＴ−細胞白血病（ 向リンパ性）ウィルスタイプＩＩＩ（ＨＴＬＶ−［７）　の分離は、このウィル スがこの疾病の病因であるという最初の証拠を提示した。この結論は、大部分の エイズ及びエイズ関連コンプレックス（ＡＢＣ）患者の血清中Ｋ　ＨＴＬＶ−Ｉ ＩＩの特異的抗体の存在を示すそれらの血清疫学的研究を包含する多くの一連の 研究の結果によって強化されてきた。加えて、同性愛男性、第■因子の血友病患 者、静脈内薬剤投与者及びハイチ人を包含するエイズの危険性として初期に認め られたあらゆる群の血清中に、ウィルスの特異的抗体が発見された。さらに最近 のそして広範囲にわたる血清学的研究は、エイズまたはＡＢＣ患者の異性愛の相 手及びアフリカのめる地域、特にエイズ並びにＨＴＬＶ−Ｉｌｌは風土性である と思われるザイール及びルワンダからの個人を包含して、ウィルスにきらされて いる付加的な人々を認めた。

これらの血清疫学的研究は、ＨＴＬＶ　−１［感染の伝達の様式及び範囲に多く の示唆を与えたけれども、血清陽性の個人のＨＴＬＶ−［１の特異的抗体の可能 な保Ｓｔたは治療効果に関する報告はなかった。それ故に、研究はエイズ及びＡ ＢＣ患者がウィルス感染を阻害できる抗体活性を有するかどうかを決定するため に行なわれた。そのような自然の防御機構は感染された宿主に細胞をウィルスの 広がった細胞から回避することを可能にし、それ故に疾病の進行が阻止または予 防され得る。数種の動物のレトロウィルス系において、中和抗体は、標的細胞レ セプターへのウィルスの初期の付着に関係するウィルスのエンベロープ塘蛋白質 に結合することであると記載されてきた（スチープス、アール、エイ、等、ジェ イ、バイロル、。

第１４巻：第１８７−１８９頁、１９７４年（８ｔｅｅｖａｓ、　Ｒ。

Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　１４　：　１８７−１８９　；　 １９７４　）。

このレセプターに対するウィルスの結合を阻止することによシ、ウィルス中和抗 体は効果的にウィルスの感染を阻害し得る。ここに報告された研究において、　 ）ＩＴＬＶ−■はエイズまたはＡＢＣ患者の特異的な中和抗体を引き出、すかど うか及び該抗体は何らかの保護効果を示し得るのかどうかがめられた。

ＨＴ細胞系のＨ９クローン（特定の方法及び例）は無細胞ＨＴＬＶ　−ＩＩＩ感 染の標的として使用され、そしてウィルス中和抗体活性について数種の血清を初 めに分析した。

Ｈ９細胞の感染は１間接免疫螢光試験（１ｎｄｉｒｅｃ、ｔ　ｉｍｍｕｎｅｆｌ ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｓｓａｙ　）でモノクローナル抗体を使用してＨＴＬ Ｖ−［１ｐ２４　の表出を追跡することによシ評価された。ウィルス中和活性に 対し血清陽性または陰性の予備培養されたＨＴＬＶ　−■ウィルスでＨ９細胞の 感染の動力学を第１図に示す。感染後３日めまでに、健康な通常の献血者の血清 で前処理されたＨＴＬＶ−［１と共に培養されたＨ９細胞（Ｄ　タイタイ８０　 ％　７３（、ＨＴＬＶ−１［ｐ２４　Ｏ表出によシ示されるように感染された。

一方、ＡＢＣ患者からの血清で前処理したウィルスに感染された場合の３日メＫ Ｉｄ、　Ｈ９細１ｔａＯ１０％ＬカＨＴＬＶ−１１１　ｐ２４　ｆ表出しなかっ た。この感染の阻害が細胞の抗原よりむしろウィルスの抗原により実現されたこ とは、同じ血清で処理したウィルスよりもＨＴＬＶ−［１と処理し続いて細胞の 前処理によるＨ９細胞の方がよシ容易に感染することによシ示された（第１ａ図 ）。ろる種の血清の阻害活性は、活性が滴定可能であるから、高血清濃度の非特 異的効果のみではなかった。第１ｂ図に滴定した数種の血清により示されるよう に、阻害活性を有する血清は、エイズの危険性のある群の患者及び健常者の全て のカテゴリーに見い出された。

検出された阻害活性が、細胞の抗原よりむしろウィルスの抗原に対して影響され ることを確認するために、血清を無細胞ウィルスの調製物または感染もしくは未 感染Ｈ９Ｍ胞に吸収させた。細胞での吸収はあまり効果はなかったけれども、ウ ィルス調製物での吸収は下の第１表に示すように阻害効果を有する血清の力価を 実質的に減じた。

Ｈ９細胞のＨＴＬＶ−１１感染を中和することができる自然の抗体は、成人工イ ズ患者の６０％に及びＡＲＣの成人の８０釜に検出されるが、しかし通常の健常 な異性愛者の対照においては０％である。抗体力価の相乗平均は。

エイズ患者に比べＡＢＣ患者では２倍高く、２人の抗体陽性な健康異性愛者でさ え高かった。この発見は、ウィルス中和抗体は生体内である種の保線効果を発揮 する可能性のあることを示唆する。これらの抗体の存在は、有利な治療に利用さ れ得るＨＴＬＶ−１１に対する免疫学的応答ヲ示す。また、これらの研究に使用 された方法論は、将来のワクチン研究に直接利用できる。

従って、血清ＩｇＧが、Ｈ９細胞に対するＨＴＬＶ−ＩＩＩの感染性をウィルス に結合することによシ中和することができるという系を明らか圧したので、多く のヒト血清をこの抗体活性のために分析した。その結果を下記の第２表に示す。

エイズまたはＡＢＣの患者の多くは、そのような活性を示さなかった健康な異性 愛の個人と対照的に。

ウィルス中和抗体を有することは明白でるる。抗体価は。

両患者群では５００以上に及ぶが、全般的な力価は低かった。しかしながら、Ａ ＢＣ患者は研究されたエイズ患者の抗体価に比較して、２倍高い相乗平均の抗体 価を有することがわかった。エイズ発症の危険性を有する健康々同性愛者の間で は、抗体価の相乗平均は、２人だけの抗体陽性の個人について決定されたもので あるが、２？ｉ１の患者群のどちらかの値より実質的に高かった。よシ軽いまた は重要でない疾病の徴候でのより高い力価のこの傾向は、中和抗体の保護効果を 示唆する。

ＨＴＬＶ　−１［１中和抗体活性は、通常の健康な異性愛者には検出されなかっ た（第２表）。しかしながら、かろうじて検出可能な力価（１３の）は急性の単 核症の患者からの４血清試料のひとつに得られた。この結果は、高レベルの血友 病の抗体を有する血清中のウィルスの抗原との弱い交叉反応性を示唆するであろ う。

他のレトロウィルス系において、多くのエンベロープ循蛋白は、中和抗体の標的 でろる。これらの自然に起こるウィルス中和抗体は、生体内での保護効果に関し て意味深いものである。

本発明の結果は、よシ軽い疾病の人またはＨＴＬＶ−■に感染されたが、まだ病 気の徴候も示していない人が、よシ高い中和抗体価を有する傾向を示す。このこ とは、ヒトワクチン研究が値うちのおることを示唆する。一方。

ＨＴＬＶ　−［ｉの生物学全体において中和抗体の役割がビスナウィルス（ｖｉ 、ｓｎａ　ｖｉｒｕｓ　）系においてみられたものと類似しているであろうこと を推測することは興味深い。第一に肺及び中枢神経系に影響するヒツジのゆりく シと進行する疾病を起こす非発ガン性レトロウィルスであるとスナウイルスの感 染は、永続性でおる。ウィルスによって引きだされた、中和抗体は、病気の途上 で生じる突然変異ウィルスによる感染を阻害することができない狭い範囲の特異 性を有することがわかった。このように、中和抗体は選択圧を及ぼし、非中和の 突然変異ウィルスの複製を導く。比較的最近感染てれた動物から取り出した′初 期の血清°は、３年取上前感染された動物から得られた°後期の血清ゝに比較し て、より制限された中和範囲を有することもまた興味深い。これら１後期の血清 ”は、全ての先祖の株を包含したよ多広い範囲のビスナ突然変異体を中和するこ とができた。このことは、特に分離から分離までの明白な遺伝子の変化、特にウ ィルスのエンベロープ部分での変化のために、及びＨＴＬＶ−ｎ［（Ｄビスナウ ィルスとの明白な類縁のためにも、ＨＴＬＶ　−■に関係がおる（ゴング等、サ イエンス、印刷中（Ｇｏｎｄａ。

ｅｔ　ａｌ　、　鉦１４．　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ　）。

エイズ及びＡＲＣ，を者並びにＨＴＬＶ　−ｎ［に感染された健常人の血清中の ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ中和抗体の立証は、治療に有利に利用されても良い病気進行の 途上に免疫学的応答を明らかにする重要な発見である。嘔らに適当なワクチン研 究が初めからウィルス感染を妨げることに効果的でめることを示す。ここに記載 した方法論は、これらの将来の手Ｊ＠ヲ追跡することに有用でろろうし、さらに ＨＴＬＶ−［１感染の生物学に関する基礎的な研究に有用でもめろう。さらに研 究は、患者血清のウィルス中和抗体の存在が予後の価値を有するかどうかを決定 するであろうし、または適当な養生療法を示すでろろう。

図面の説明 通常の健康な異性愛者（６）及びＡＲＣ患者（＠からの血清を第１Ａ図で比較し ている。平行実験において、これらの同じ血清を、Ｈ９細胞と共に１時間、４℃ で予備培養した。細胞ｔ−ＰＢＳで洗浄し、無細胞ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ調製物で培 養し、そして実施例２のように培養した。血清とＨ９細胞のこの処理の結果は、 通常の健康な異性愛者の血清（ハ）及び人孔Ｃ患者の血清（Ａを表わす。

第１Ｂ図において代表的な滴定は、ウィルスの中和抗体活性に関し陰性の２種の 血清を示す：エイズ患者（６）及びＡＢＣ患者（ロ）。ウィルス中和抗体に関し 陽性の代表的な血清は、小児エイズの場合（＠、ＡＢＣ患者（１−）　、健康な 同性愛者（ハ）及び成人工イズ患者に）から得られた。得られた全ての数値を、 標準抗体陰性血清の存在下で得られる感染のレベルに標準化した。

第　１　表 ＨＴＬＶ　−ＩＩＩ中和活性はＩｇＧの特性でろシ及びウィルスの抗原に対して 影響される ［ｉＩｇＧでの実験： 第１表（続き） 吸収実験： ４　ＡＲＣなし　１３５ ＨＴＬＶ−１１で吸収　＜１０ Ｈ９細胞で吸収　１２０ Ｈｑ７ＨＴＬＶ−ｍで吸収　９゜ ５　エイズ　なし　７５ ＨＴＬＶ−Ｉ［［でａ収　＜１゜ Ｈ９細胞で吸収　２２ Ｈ９／ＨＴＬＶ−１１１ｆ吸［５ａ ６　ＡＲＣなし　〉２７゜ ＨＴＬＶ−［［で吸収５Ｏ Ｈ９細胞で吸収　ン２７０ Ｈ９／ＨＴＬＶ−１１で吸収　＞２７０ＡＲＣ：エイズ関連コンプレックス （ａ）　ＩｇＧはＰＢＳに平衡化した蛋白質Ａ−セファロースに吸収させること により１５　ｍｌヒト血清から精製した。次にＰＢＳでカラムの十分な洗浄を行 ない。

ＩｇＧを１１Ｍグリシン−ＭＣＩ　、　ｐＨ２，８で溶出し、溶出液ｔ　２　Ｍ 　）リス−ＨＣｌ　、　ｐＨａｏ　テ中和し、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに 対し十分に透析し、そして凍結乾燥した。精製した画分をＰＢＳ　Ｑ、５ゴに溶 解し、濾過滅菌し、実施例２に記載するような中和抗体活性の滴定用の媒体に希 釈した。

ウィルス吸収実験のために、２ないし５ｘ１０８ウィルス粒子／＋ｄｉ含む無細 胞ウィルス上清６２ｄｆ実施例２に記載するようにベレットにした。ウイルスノ ヘレットを吸収させるべき血清の１；１０の希釈液１００４に再懸濁し、４℃で 一晩培養する。ウィルスを遠心によシ再びベレットとし、吸収された血清はウィ ルス中和抗体活性の滴定のために確保した。血清を同様に洗浄した１０７個の細 胞ベレット上に吸収させ、そして滴定した。

（ｂ）　ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ　ｐ−２４−ＩＩ性ａｌ胞ノ百分１１）（ｉｉＨ１試 験血清として同様に処理した標準陰性血清の存在下で得た感染のレベルに標準化 した。ここで抗体価は、ウィルス感染がこの標準陰性血清の存在下で得られるも のの６０％であるときの血清希釈の逆数として表した。

第　２　表 エイズ及びＡＢＣ患者及び危険性　を有するその他の者のＨＴＬＶ　−［１中和 抗体 底入エイズ患者　２１１５５　６０　１０−５２０　４４小児エイズ患者　９／ 　９　５５　８０−１８０　１１７成人ＡＲＣ患者　２８７３５　８０　１７− ５６０　８８第２表（続き） 健康同性愛者　２／１２　１７　１！５ｏ−３４０２１０健康異性愛者　０／２ ０　０　− エイズ患者の異性変の相手　１／３　５５　７８小児エイズ患者の母親　０／　 ２　０　−エイズ患者のきょうだい　１／２　ｓｏ　ｓｓ　−急性単核症患者　 １／４　２５　１５ サルコイド−シス患者　０／１’Ｏ−＋エイズ＝後天性免疫不全症候群 ＡｋＬＣ＝エイズ関連コンプレラフス ミ、全ての血清ｉ１：１０希釈液でウィルス中和抗体（′−スクリーンした。活 性を有するこれら血清をさらに実施例２に記載するように滴定した。抗体価は第 １表の脚註に定義されている。

ｂ、３入金てがエリザ（ＥＬＩＳＡ　）及びウェスタンプ０フト（Ｗｅｓｔｅｒ ｎ　ｂｌｏｔ　）試験によシ）ＩＴＬＶ　−［１抗体に対し陽性だった。

Ｃ１これら２人の養育している母親からの血清はエリザ及びウェスタンブロンド 試験によ＃）ＨＴＬＶ　−ＩＩＩ抗体に対し陰性だった。

ｄ　陽性のきょうだいもエリザ及びウェスタン　プロ実施例１ ウィルス吸収実験のために、２ないし５×１０”ウィルス粒子／１ｌｊｔ−含む 無細胞ウィルス上清６２ｉＩｊ’ｉ実施例２に記載するようにベレットにした。

ウィルスのベレットを吸収させるべき血清の１＝１０の希釈液１００μｌに再懸 濁し、４℃で一晩培養する。ウィルスを遠心によシ再びベレットとし、吸収され た血清はウィルス中和抗体活性の滴定のために確保した。血清を同様に洗浄した １０１個の細胞ペレット上に吸収づせ、そして滴定した。

ＨＴＬｖ−１１ｐ　−２４−陽性細胞の百分率の値は、試験血清として同様に処 理した標準陰性血清の存在下で得た感染のレベルに標準化した。ここで抗体価は 、ウィルス感染がこの標準陰性血清の存在下で得られるものの６０％であるとき の血清希釈の逆数として表した。

実施例２ ）ｉＴＬＶ−■中和抗体のヒト血清をスクリーニングするための方法において、 ２ないし５　ｘ　１０’　ＨＴＬＶ−１１粒子／ｄを含む媒体ｔ−Ｈ９／ＨＴＬ Ｖ−１１細胞から得た。初めに使用したウィルスの童は、ウィルス調製物を滴定 すること及び感染後３日までに５０ないし８０％の感染したＨ９Ｉａ胞を得るよ うな試験の１１選択することによシ決定ばれた。これは一般的に標的細胞あたり 実質的に過剰量のウィルス粒子を要求した。細胞を低速遠心により除去し、そし てウィルスを含有する上清を３時間、３２，０００ｘｇで遠心した。ウィルスの ベレットを媒体（２０慢ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含 有するＲＰＭＩ　Ｉ　６４０　）全体積２．２５ｊ中に再懸濁した。

未感染Ｈ９細胞を媒体中で洗浄し、ポリプレ／２μ９／ｄを含有する媒体中室温 で２０分間培養した。細胞を媒体中で洗浄し、そして媒体中に４Ｘ１０’／ｉｌ の濃度に再■ 懸した。試験すべき血清を５６℃、３０分間加熱不活性化し、そして濾過滅菌し た。各試験のためにウィルス懸濁液２０μｌ及び血清１：１０希釈液２０μｉｔ −混合し、そしてマイクロタイタープレー）　（ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａ ｔｅ　）ρウェル（ｗｅｌｌ）中で１時間４℃で、そして次に１５分間室温で培 養した。Ｈ９細ｖＬ（１０μｔ）を各ウェルに加えそして培養を１時間３７℃で 続けた。各混合物の一部分（１５μりを別のマイクロタイタープレートの２つの ウェル中の２００μｌの媒体中に移した。培養を５７℃・５％　ＣＯ，インキエ ペーター中で行なった。　３日後、各々のウェル中の培養物を取シ除き、燐酸緩 衝化食塩水（ＰＢＳ）で２度及びＰＢＳ：水、１：１で１度洗浄した。

細胞を同溶液およそ３０μ／に懸濁させ、セして５ないし１０　μ／分ｔＨＴＬ Ｖ−１１１ｐ２４　Ｋ対ｆルモ／　／　ａ−ｔｋ抗体を使用して間接固定細胞免 疫螢光試験用の８−ウエルノトキンプラズモシススライド（ｔｏｘｏｐｌａｓｍ ｏｓｉｓ　ｊｌｉｄｅｓ　）上にスポットした。

中和抗体活性を示す血清及び１：１０希釈液を引き続き連続して希釈し、試験は 抗体価を決定するために繰シ返した。

下記の請求の範囲中及び明細書中、血清とは実質的な童の抗ＨＴＬＶ　−ｌを含 む血清を意味する。これは成人及２１０の範囲である。

国際調査報告 １１１−−＾−−’−”’　ＰＣＴ／ＵＳ８６１００２１７ｌｎ恰帛−−−＾− ””−−１）ｃＴ／ＵＳＩＩＡ／Ｉ’１ｎ７１？

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスをＨＴＬＶ−ＩＩＩに対する抗体を含有す る血清中の自然のヒト抗体で処理し、そして（ｂ）自然の抗体により生じた保護 の測定を決定するために残りのウイルスの感染性を試験することよりなるＨＴＬ Ｖ−ＩＩウイルス感染性を中和する方法。
2. ２．試験がＨＴＬＶ−ＩＩＩに特異的なモノクローナル抗体で行なわれる請求の 範囲第１項記載の方法。
3. ３．モノクローナル抗体が抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩｐ２４である請求の範囲第２項記 載の方法。
4. ４．（ａ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスを自然のヒト抗体を含有する血清と処理し ； （ｂ）その結果の培養物をＨ９細胞で感染及び培養し；そして （ｃ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩｐ２４に特異的なモノクローナ ル抗体で残りの感染性を試験することからなるＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス感染性 を中和する方法。
5. ５．モノクローナル抗体がＨＴＬＶ−ＩＩＩｐ２４に特異的である請求の範囲第 ４項記載の方法。
6. ６．モノクローナル抗体がＨＴＬＶ−ＩＩＩに特異的である請求の範囲第４項記 載の方法。
7. ７．さらに５０ないし８０％のＨ９細胞が感染されるように試験のためにウイル スの量を選択することからなる請求の範囲第４項記載の方法。
8. ８．ＨＴＬＶまたはｐ２４ＨＴＬＶに特異的なモノクローナル抗体の添加により 、残りのウイルスの感染性を計測することからなる、中和抗体を含有する血清の 添加によりＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスの保護効果を試験する方法。
9. ９．さらにウイルスの感染をさせるために、モノクローナル抗体の添加の前に３ 日保持することからなる請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．免疫螢光試験が抗原及びモノクローナル抗体の反応に利用される請求の範 囲第８項記載の方法。