JPS61502093A - バクテリア菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 でノｊソし乙１抹 弦−」シ」辷−」 本発明は遺伝子工学技法によって得られる有用なバクテリアの菌株に関する。

少くとも最も広い意味で本発明が関連をもっと云い得る問題は腸内の病源体の主 なカテゴリイに対して有効な免疫を施すことの困難性にある。

かような病源体に属し得る典型的な病源体はコレラ菌ビブリオコレレ（Ｖｉｂｒ ｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）である。

宣−員一及一玉 腸内細菌である病源体は二つのカテゴリイに分けられる。第一カテゴリイの病源 体は腸上皮細胞群に作用するトキシン（毒素）の産生によって発病させ、この場 合に細菌自体は腸の内腔に閉じ込められていてそこで生育する。ヒトにコレラを 起させるビブリオ　コレレ、及びヒトの下痢症、ブタの伝染性下痢症並びに子ウ シの伝染性下痢症を起させる多種株を包含する腸管前産生性のエシェリキア　コ リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）はすべてこのカテゴリイに属する。他 の部類のものはサルモネラ（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａｅ）のごとき微生物であって ヒト及び動物の双方に対して全身性疾患を起させ得るが該疾患として下痢は主な 疾患である。これらの微生物は初めに腸壁を透過し、そこからリンパ様組織即ち バイエル板（Ｐｅｙｅｒ　’　５ｐａｔｃｈｅｓ）として知られる１１１Ｉｗｉ へ入り込む。潜伏期にその場所（サイト、５ｉｔｅｓ）の内側で生育し潜在性感 染として排出されるか又は拡散する。

宿主が特異的抗体をもち抗体が腸管中へ分泌されるならば宿主は該第−カテゴリ イの微生物に対して抵抗可能であるし、感染宿主からかなりの量の腸内抗体が短 期間だけ通常の場合に見出されることば真実である。サルモネラの場合に特異的 抗体が産生されても免疫を与えるためには不充分であり、他の細胞の変化が起る ことは必至である。但しバイエル板を増加させ転移増殖させる能力に恐らく基づ くらしく該微生物は前者即ち非透過性の微生物に対する抗体応答よりも優るＩｇ Ａ分泌型の抗体応答を誘発する。動物モデルの使用により本発明者らは“基本的 にはサルモネラのゲノムを有し、これに対して第二カテゴリイの微生物の抗原構 造を特性化する小片をプラスされた雑種（ハイブリッド）の微生物”が経口投与 により基本的に天然のサルモネラに類似する行動をとることを証明した。該ハイ ブリッド微生物はバイエル板を透過してバイエル板を一時的に増殖させ腸内流体 中で測定され得る著しく良好な局在１ｇＡ抗体応答を刺激するのである。この抗 体応答は導入された抗原に対する抗体応答を包含する。

よって本発明に従うワクチン産生株はサルモネラによって代表される第一カテゴ リイの微生物の免疫原性能とビブリオ　コレレによって代表される第二カテゴリ イの微生物の所望の抗原とを結合した菌株である。

従来は、経ロ用ポリオ生（なま）ワクチンを除き、使用され推奨されるを効ワク チンの大部分は筋肉内注射によっている。

ビブリオ　コレレについては変異株のテキサススター５Ｒ（Ｔｅｘａｓ　５ｔａ ｒ−ＳＲ、米国特許第４３２８２９０号〕及び類似の遺伝子工学的変異株か弱毒 化生ワクチン製造用として提供されているがこれは経口投与可能である。ところ が該株は成る欠陥をもつ点に困難があり、それは既知のトキシン遺伝子のすべて を欠失させても制限された下痢（Ｉｉπ１ｔｅｄ　ｄｉａｒｒｈｏｅａ）を起さ せる事実である。この残存性下痢は“咳微生物が小腸上皮を転移増殖させる能力 に関連す°るか又は他のトキシンに関連するビブリオ　コレ１ノの他の毒性決定 因子′によって起される下痢であると説明されている。免疫処置剤が有効であれ ば小腸内微生物の弱毒化菌株の使用に対する見返りとして該免疫処置剤中の成る 残存性毒性の存在はやむをえない。ビブリオ　コレレのひとつのケースとして該 残存性毒性は該菌が産生ずる菌体外ヘモリシン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　 ｈａｅ＋＊ｏｌｙｓｉｎ）によることもある。

幾多の実験的研究の後に本発明者らは経口用に適するワクチンの使用が有利と考 えられることを見出し、更に、遺伝子工学的技法を用いて゛哺乳動物の小腸のリ ンパ様組織に先ず侵入し、増加し、短時間に転移増殖する生菌の菌株を特性化す ることにより、及び導入された遺伝子又は遺伝子群又はそれらの一部分を用い° て抗原又は抗原群を合成してＩｇＡ抗体群を産生させることにより、上記のアプ ローチは著り、＜有効なワクチンの製造を可能とすることを見出すに至った。

尤−五一公一固一足 従って本発明の要旨は、非病源体から又は病源体が非病源化された菌体から実質 上誘導された一組の遺伝子であって哺乳動物の小腸のリンパ様組織に侵入し、増 加し、短期間内に転移増殖し得る該−組の遺伝子を有瞳それと共に小腸表面及び 他の分泌器管表面におけるＩｇＡ抗体産生を誘発させる抗原又は抗原群を特性的 に合成する効果を与える′導入された遺伝子又は遺伝子群又はそれらの一部分′ をも有することを特徴とするバクテリア菌株に在る。

リンパ様Ｍｉ織の典型は小腸内のバイエル板である。

抗原又は抗原群としては下記の属即ちエシェリキア属、ロタウィルス（Ｒｏｔａ ｖｉｒｕｓ）属、ビブリオ属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属及びボル デテラ（Ｂｏｒｄｅ　ｔｅ　ｌ　Ｉａ）属の菌に対して有効なＩｇＡ抗体群の産 生を誘発する抗原又は抗原群であることが好ましい。

ボルデテラを除き上記容態のすべての病源体は小腸内の微生物である。すべてが 病源論的機構により特徴づけられるが該機構には粘膜への付着という前提条件的 段階とそれに続くトキシン序生が包含されるので該病源体は透過型のものではな い。ボルデテラは腸の病源体ではないけれども肺に対する病源体である０本発明 は分泌器管表面に付着する病源体に対する保護の作用をする菌株を提供する。そ の理由は遠方の粘膜のサイト例えば肺に対してバイエル板の中のＩｇＡ前駆細胞 群が抗原による刺激を与え、そ・れによって感作細胞が伝播される中心的径路が 存在する点にある。

本発明のその他の特徴的態様はｒｇＡ産生刺激が免疫応答の発生を測定する手段 を提供する点にある。導入された遺伝子が、生体内侵入性微生物例えばカムピロ バクター（Ｃａａ＋ｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）　、”）　）Ｌｔモネラ又はシゲラ （Ｓｈｉｇｅｌｌａ）に対する保護抗原をコード（信号）すれば、導入された抗 原に対して指向されるＩｇＡ抗体の産生は、該１ｇＡ抗体がこの場合における重 要な保護因子ではないとしても、免疫応答を測定する手段を提供することになる であろう。

導入された遺伝子又は遺伝子群は本発明のバクテリア菌株の染色体の中に組込ま れ得るか或は本発明のバクテリア菌株のプラスミドの上に組み込まれ得る。

非病源化される菌体は下記のもの即ちエシェリキア、サルモネラ又はシゲラのう ちのひとつから選ばれることが好ましい。

導入された遺伝子又は遺伝子群は下記のもの即ち病源体のアトへシン（ａｄｈｅ ｓ　ｉ　ｎｓ）、外膜タンパク質又はリボポリサンカライドの少くとも一部分を 合成する特性をもつものであることが好適である。

成る場合には、遺伝子又は遺伝子群は腸管前産生性のエシェリキア　コリのに８ ８抗原を合成する特性をもっことが好ましい。

別Ｌｉ様として、導入された遺伝子群は腸管前産生性のエシェリキア　コリのに ９９抗原を合成する特性をもっことが好適である。

別層様として、導入された遺伝子又は遺伝子群はＣＦＡ／ｎ産生の腸管前産生性 エシェリキア　コリの抗原Ｃ５Ｉ、Ｃ３２又はＣ３３のうちのひとつ又はそれ以 上を合成する特性をもっことが好ましい。

更に別の処置法においては該遺伝学的物質はヒトに対して病源性を呈する腸管前 産生性のエシェリキア　コリの転移増殖因子抗原を合成する特性をもつ。

好ましくは、他の別法として、該遺伝学的物質はビブリオ　コレレの外膜タンパ ク賃を特性化する遺伝子をコードするプラスミド即？）ｐＰＭ４４０、ｐＰＭ５ ＱＱ、ｐＰＭ５１０又はｐＰＭ４５５のうちのひとつに存在するものである。

更に他の別層様においては、導入された遺伝子群はビブリオコレレの〇−抗原の 合成を果すものである。

ビブリオ　コレレの〇−抗原の合成が達成はされたけれどもそこには特別な困難 性が含まれているのであってこれについては本明細書に後記して論するであろう 。

合成されたビブリオ　コレレの〇−抗原はエシェリキア　コリの表面上に存在す ることが好ましい。

別層様として、合成された〇−抗原はサルモネラ又はシゲラの表面上に存在する 。

上記のことに更に付は加えると、成る弱毒性のサルモネラ属菌株は経口投与され た後にリンパ様小胞（バイエル板）への侵入能を覗持していることが観察されて いる。

サルモネラ属菌株の夫々についてリンパ様小胞の転移増殖の程度及び時間と免疫 性刺激能との間に直接的相関が存在することが見出されたことは真実である（第 １表参照）。

担体としての微生物の代表的なものはガラクトースエピメラーゼ欠失サルモネラ 又は有毒性−プラスミド欠失シゲラであり得る。

弱毒の程度としては該菌株が充分な数を以てツクイニル板へ侵入することができ ると共に侵入した後にはその転移増殖力（数日間、典型的には３〜１０日間のみ に限定されるべきであること力（重要である。その結果宿主が長きにわたる免疫 応答活性を達成し宿主から微生物を除くであろう。

本発明によるワクチンの追加の利点は担体として使用される／イクテリア種に対 し同時に保護を受けることにある。

本発明に従って構成され経口用の生ワクチン中で活性成分として使用されるバク テリア菌株のその他の利点は一回投与又は制限された回数の投与で有効であるこ と、ワクチン用菌株は有毒性へ反転する理論的可能性を有せず遺伝学的に良好に 特徴づけられていること、産生された抗体１ｇＡは初乳及び母乳の中で母から子 へ伝えられるので能動的及び受動的免疫処置の双方の場合に適切に使用されるこ とにある。

皿皿立国皇久脱里 添付図面の第１図はプラスミドｐ　ＰＭ４４０の制限酵素地図を示し、諸種のフ ラグメントの分子寸法はＥｃｏ　Ｒ１で消化された。ＸＪクテリオファジＳＰＰ 　１のＤＮＡを標準として使用して計測された。

第２図は各種のプラスミドをもつＥ、コリに−１２の細胞膜（Ｃｅｌｌｅｎｖｅ ｌｏｐｅｓ）を、ビブリオ　コレレ５６９Ｂの生菌に対する抗血清の使用下でウ ェスタン　プロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）にか けた結果を示す、第３図は各種のプラスミドをもつＥ、コリに−１２の細胞膜の ５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析とそれに続く染色を示す。第４図はｐＰＭ４４０、欠失誘 導体ｐ　ＰＭ４４１及びｐＰＭ４４２、並びにトランスポゾンＴｎ１７２５挿入 誘導体ｐＰＭ４４３〜ｐ　ＰＭ４４８の２２０００ダルトンタンパク質に対応す る遺伝子の物理的地図を示す、第５図は各種プラスミドを宿すミニセル（ｌｌｉ ｎｉｃｅｌ　Ｉｓ）中のプラスミドでコードされたタンパク質の分析を示し、こ の場合に（”　Ｓ　）−メチオニンで標識し、続いて５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び オートラジオグラフィを使用した。第６図は２２０００ダルトンのｐ　ＰＭ４４ ０のタンパク質の示差抽出による特性化、それに続＜　５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析及 び染色（左側のパネル）又は抗−生菌−■３コレレ５６９Ｂ血清を用いるウェス タン　プロット分析（右側のパネル）を示す。第７図は夫々のプラスミドをもつ 各種の菌株の細胞膜の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析とそれに続く染色を示す。矢印はク ローン化されたビブリオ　コレレの表面抗原、即ち２２０００ダルトンのタンパ ク質を示す。

第８図は夫ＨのプラスミドをもつＥ、コリに一１２誘導株（複数）のウェスタン 　ブロア）分析を示す、該菌株（複数）の細胞膜を単離しＳＤＳポリアクリルア ミドのゲル上で分析してからクマシイ青（Ｃｏｏｗａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）で染 色する（上方のパネル）か又はタンパクｆｔ−ニトロセルロースへ移してから抗 −生ｍ−ｖ、コレレ５６９Ｂ血清を用いるウェスタン　プロット分析（下方のパ ネル）にかけた、第９図はプラスミドｐ　２Ｍ５０　Ｑの制限酵素地図を示す、 太い線はクローン化されたＶ、コレレＤＮＡの領域を表す、第１０図はプラスミ ドｐＰＭ５１０の制限酵素地図を示す。太い線はクローン化されたＶ、コレレＤ ＮＡの領域を示す。第１１図はＶ。

コレレの全細胞膜及びシェフロース比重勾配分別法で得られた内膜と外膜とのＳ ＤＳポリアクリルアミド　ゲル電気泳動を示す。

第１２図はプラスミドｐＰＭ４５５の制限酵素地図を示す、太い線はクローン化 されたＶ、コレレＤＮＡの領域に対応する。第１３図は各種のプラスミドをもつ Ｅ、コリに−１２の細胞膜と共に抗−２５ｋＤａｌタンパク質血清を用ル）るウ ェスタン　プロット分析を示す、純化された２５ｋＤａｌタンパク質（Ｏｓｐ　 Ｖ）は比較のために示されている。第１４図はｐＰＭ４５５の各種プラスミド誘 導体の中へトランスポゾンＴｎ１７２５を挿入する点を示し、プラスミドｐＰＭ ５４４、ｐ　２Ｍ５４２、ｐ　２Ｍ５４８１．　Ｐ　Ｍ５５６、ｐ　２Ｍ５４９ 及びｐ　２Ｍ５５４の中のトランスポゾンはすべてはＯｍｐ　Ｖタンパク質の検 出能を欠き、遺伝子の中に存在する。第１５図はＶ、コレ１５６９８株の細胞膜 タンパク質の次元交差免疫電気泳動（ｄｉａ＋ｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｒｏｓｓｅ ｄ　ｉａ＋ｉ＊ｕｎｏ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の結果の２種を示す 。細膜膜をＳＤＳポリアクリルアミド　ゲルで第一次元で処理し、ストリップを 切り出し、トライトンＸ−１００内で平衡化してからＶ、コレレ５６９Ｂに対す る抗血清を含むアガロースの中で電気泳動させた。第１６図はプラスミドｐＰＭ ４３１の制限酵素地図を示す。太い線はクローン化された■、コレレＤＮＡに対 応する領域である。第１７図はプラスミドｐＢＲ３２２（クローン化ベクター） 及びｐＰＭ４３１をもつＥ、コリに−１２とＶ、コレレ０１７株とによる５％ヒ ツジ赤血球含有普通寒天培地上でのへモリシン産生を示す。第１８図はｐＰＭ４ ３１のトランスポゾンＴｎ１７５２誘導体のミニセル分析を示す、プラスミドで コードされたタンパク質は（”Ｓ）メチオニンによる標識及びそれに続＜５ＤＳ −ポリアクリルアミ・ド　ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィ（ａｕ　ｔｏ ｒａｄ　ｉｏｇｒａｐｈｙ）によって分析された。第１９図はｐＰＭ４３１の中 に含有された■、コレレＤＮＡの物理的地図を示す。Ｔｎ１７２５の各種プラス ミド中への挿入点が示され、ｐＰＭ４３１　（＋＋＋）と比較されるヘモリシス （ｈａｅＩＩＩｏｌｙｓｉｓ）の程度（−、＋、＋＋、＋＋＋）が表されている 。

角型の囲いは夫々のタンパク質をコードするＩ）ＮＡの量と位置とを示す。第２ ０図はプラスミドｐ　ＰＭ４７４の制限酵素地図を示す。太い線はクローン化さ れたＣＦＡ／Ｕプラスミドの領域に対応するや第２１図はｐ　ＰＭ４７４中に存 在するクローン化されたＣＦＡ／ｌｌＤＮＡの中へトランスポゾンＴｎ１．７２ ５を挿入するサイトを示す、該トランスポゾン挿入サイトはカッコで括られて示 されているが該挿入はＣ’Ｓ　３産生能を失わせる。第２２図はＣＦＡ／ＩＩプ ラスミドの切れ目のない旧ｎｄｌ［［フラグメントの地図であり、ｔｉｃＦＡ／ ＩＩプラスミドはｐＢＲ３２２ブラミドベクターの旧ｎｄｌＩ［サイトへクロー ン化されて図示のプラスミド誘導体を与えたのである。第２３図はプラスミドｐ ＰＭ１００］のＤＮＡの制限酵素分析を示す。第２４図は適切なプラスミド（複 数）を有するＥ、コリに−１２のＤＨＩ株の細胞膜の分析を示す。細胞膜を５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動で分析してから銀染色してバンド（複数 ）を顕出させた。第２５図は適切なプラスミドを有するＥ。コリに−１２のＤＨ Ｉ株の純化されたりボボリサーノカライド（Ｌ　Ｐ　Ｓ）の分析を示す。純化さ れたＬＰＳをＳＤＳポリアクリルアミド　ゲル電気泳動によって分析してから銀 染色してバンド（複数）を顕出させた。第２６図はＴＢＥ緩衝液中３．３％アガ ロースの中での電気泳動による染色体ＤＮＡの分析、それに続く臭化エチジウム による染色と紫外線トランスイルミネイティング光源を用いる顕出とを示す、製 造担当者の推奨に従って制限酵素による消化と連結（ｌｉｇａｔｉｏｎｓ）とを 施した。

１、　ビブリオコレレ５６９Ｂ　ＤＮＡ不切断２、　ネズミチブス菌ＬＴ２　Ｄ ＮＡ不切断３゜上記１におけるＤＮＡをＰｓｔ、　１　（左側パネル）又はＥｃ ｏＲｌ（右側パネル）で消化したもの４、　上記２におけるＤＮＡをＰｓｔ　１ 　（左側パネル）又はＥｃｏＲｌ（右側パネル）で消化したもの５、上記３にお けるＤＮＡを連結したもの６３　上記４におけるＤＮＡを連結したものを　する ための最　の／暑 勇−上 ブタの伝染性下痢症（ｅｎｔｅｒｉｃ　ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）に対す る経口用ワクチンとして有用な生菌のバクテリア菌株について以下に記載する。

本発明に従う有用なワクチンのひとつは腸、管毒産生性のエシェリキア　コリの に８８抗原を発現するプラスミドを宿すネズミチブス菌（Ｓ、　ｔｙｐｈｉｓｕ ｒｉｕｍ）のガラクトース　エとメラーゼ欠失変異株である。かような菌株はに ８８のピルス（ｐｉｌｕｓ、毛）に対する腸管の抗体群の産生を誘発する有用な 免疫原であり、該誘発の結果として腸管前産生性のＥ、コリに８８株に対して保 護作用をする。

純化されたに８８製品で雌ブタに予防接種するとに８８Ｅ、コリに対する受動免 疫を子ブタに与えることができることが証明された。初乳及び母乳中のに８８抗 原に対する抗体はに８８抗原にもとづく接着性の中和によって子ブタを保護する と結論され得る。

即ちに８８付着因子即ちに８８ピルスに対する抗体が保護を行う。

その他のに９９．９８７Ｐ、Ｆ４１で示される付着型抗原も父子ブタの伝染性下 痢症について重要であると同定された。これらのものはに８８付着に類似し、本 明細書中でに８８ビルス抗原について示される如きワクチンの構成に使用され得 た。

本発明者らは担体菌株としてネズミチブス菌Ｇ３０株（ｇａｌ　Ｅ変異株）を使 用した。

腸管毒産生性Ｅ、コリからのクローン化されたに８８抗原をコードするプラスミ ドｐ　ＦＭ２０５を上記のＧ３０株へ導入した。

１０８個の生菌バクテリアを投与するか又は５ＸＩＱ’個のホルマリンによる死 菌バクテリアを腹腔内注射することによりマウスを免疫した。１週問おきに３回 免疫処置を行った。１力月後にマウスを放血させてから殺して腸を取出し洗浄し た。Ｋ８８に対する抗体のレベルをＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）により純 化抗原（ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動により均質化）を使用して測定した 。その結果を第２表に示すがこれから経口的免疫処置は腹腔内注射免疫処置によ って産生したのと同様の血清抗体レベルを産生じたことが証明された。これとは 対照的にバクテリアを腹腔内注射したときに腸管内には抗体が検出され得なかっ たが経口的免疫処置の結果では良好な腸管的抗体レベルが誘発された。

第　２　表 化に８Ｂビルスに対するｒ体産生 子ウシ、子ヒツジ及び子ブタについて腸管前産生性のに９９Ｅ。

コリにもとづく新生児期の下痢に対する保護のために有効な生菌バクテリア菌株 について以下に記載する。

Ｋ９９ピルスを宿すプラスミド、例えばｐＲ１９９０６−１０Ｇ３０株中への導 入は本発明に従う他の有用なワクチンの取得である。かようなワクチンは子ウシ 、子ヒツジ及び子ブタを腸管前産生性に９９Ｂ、コリにもとづく新生児期の下痢 に対して保護作用をなす。

■−１ ヒトに対して病源性を呈する腸管毒産生性Ｅ、コリの転移増殖因子抗原（ＣＦ　 Ａ）を宿すプラスミドの導入について以下に′記載する。かようなワクチンは相 同型の腸管毒産生性Ｅ、コリによって起される旅行者下痢症に対して保護作用を する。

数種の既知の転移増殖因子は腸管毒産生性Ｅ、コリ、即ちＣＦＡ／１．ＣＦＡ／ ｎ、ＣＦＡ／ＩＩＩ及びＥ８７７５ニツイテ記載されている。これらの抗原は、 ＣＦＡ／Ｉ［を除き、夫々単毛型を示し、菌株の生物型に依存して３種の可能な 表面抗原を産生じ得る。これら３種はＣ３Ｉ、Ｃ３２及びＣ５３と記号され、Ｃ ３Ｉ及びＣ３３はＡ生物型の菌株の中に発現し、Ｃ３２及びＣ３３は生物型Ｂ、 Ｄ及びＦの菌株中に発現する。Ｃ３３に関する抗原は一連のプラスミドの中にク ローン化され、その中のＩＩ＋　ＰＭ４７４は精細に分析されて該型が示されて いる（第２０図）。切れ目のない（ｃｏｎｔ　ｉ　ｇｕｏｕｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａも 又プラスミドｐＰＭ４７６、ｐＰＭ４７７及びｐＰＭ４８３におけるようにクロ ーン化されたがこれらは少くともＣ３Ｉをコードし、恐ら（Ｃ５３に加えてＣ３ ２をもコードすると考えられる。

ｐＰＭ４７４のトランスポゾン挿入分析は少くとも３．５ｋｂの領域がＣ３３産 生に関係している（第２１図）ことを示した。このことは次のことを意味してい る。即・ちそれは遺伝学的に錯綜してかタンパク質をコードするのに必要である からであり、サブユニット（部分単位）は僅かに約５００塩基対の大きさである 。切れ目のないＤＮＡを有するプラスミドが少くともＣ３Ｉを更にコードすると いう証拠は野生型ＣＦＡ／ＩＩプラスミドの自然の欠失という事実にもとづいて おり、それはＣ３１及びＣ３３の能力を失わせたが約１５ｋｂを欠失していた。

欠失の結果は本発明者らのクローン化ＤＮＡの右端上で０．７１ｋｂのフラグメ ントに対応する。

従ってＣ３１とＣ３３との双方は左方へ１５ｋｂ以内をコードされ、本発明者ら は約１６ｋｂをクローン化した（第２０図参照）。

本発明に従う特に有用なワクチンの例ばＳ。チフィ　（Ｓ、　ｔｙｐｈｉ）のＴ ｙ２１ａ株の中へＣＦＡ／ＩＩのＣＳ３抗原を宿すプラスミドｐＰＭ４７４を導 入することによるワクチンである。

班−土 本例においてビブリオ　コレラに対する経口用ワクチンとして有用なバクテリア 菌株について記載する。

現行のコレラに対する非径口的死菌ワクチンは無益であることが真実である。第 一に、菌は殺されているので非常な重要性をもつ表面抗原の各種は損傷されるか 又は破壊されている。第二に、免疫処理のルートは腸管内膜上のＩｇａ群に対す る杭体生成のため−に適切でない。従って本発明者らは重要な抗原即ち内膜抗体 （Ｉｇａ）の適当なサイト、即ちバイエル板、を刺激し得る抗原を宿す優秀な生 ワクチンを開発するに至ったのである。

本発明の他の実施例であるワクチンは生（なま）の二価の経口用ワクチンであっ てサルモネラ　チフィ（Ｓａｌａ＋ｏｎｅｌｌａ　ｔｉｐｈｉ）とビブリオ　コ レラの双方に対し同時に防御する。該ワクチンはサルモネラ　チフィのＴ１２株 のガラクトース　エピメラーゼ欠失（ｇａｌ　Ｅ）誘導菌にもとづくものである 。咳Ｓ、チフィの変異株即ち’ｒｙｚｔａはチブス様の熱病に対して防御を誘発 し得る安全な経口用生ワクチンであることが証明された。その製法及び諸性質は 米国特許第３８５６９３５号〔発明者ゲルマニエ（Ｒ，Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ）） 明細書に記載されている。どの先行発明の態様はビブリオ　コレラの表面抗原の ＤＮＡの組換え即ち遺伝子工学技法によるクローン化及び該抗原のＳ。チフィｇ ａｌ　２株への導入とそれによる遺伝学的雑種の産生を包含する。この雑種（ハ イプリント）は本質的にビブリオ　コレラの特異的抗原のためのＤＮＡを保有し 発現するＳ９チフィｇａｌＥ株である。

上記のワクチンがもとづいているビブリオ　コレラの表面抗原には二種類があり 、リボポリサンカライド（Ｌ　Ｐ　Ｓ＞であるか又は表面タンパク質である。こ れらの抗原は保護抗原又は標的抗原（ｔａｒｇｅｔ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）とされ ているがその理由はビブリオ　コレラに対する防御を果す抗体の産生を誘発し得 ることにある。

防御「　のクローン化 ビブリオ　コレラ５６９８株（クラシカル　イナバ株）及び０１７（ＢＩＴｏｒ オガワ株）はクローン化の諸実験に際し染色体ＤＮＡの供給源として使用されて いる。該ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａ、ＢａｍＨｌ又はＰｓｔ　ｌのうちのひと つを用いて部分的に消化ベクトルＤＮＡ即ちｐＢＲ３２２をＲａｍ　８１　（Ｓ ａｕ　３　Ａ又はＢａｇＨｌで消化された染色体Ｄ’ＮＡのクローン化のため） の使用下に又はＰｓｔ　１の使用下に消化し、次にアルカリホスファターゼで処 理して自己連結を防止した。上記三者のＤＮＡを混合し終夜かけて連結させて非 制限性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌｅｓｓ）のＥ、コリに１２株へ形質転換させ た。形質転換菌（複数）をアムピシリン（Ｒａｍ　Ｈ１で消化されたｐＢＲ３２ ２の場合）又はテトラサイクリン（１）ＢＲ８０％以上の形質転換菌が得られた 。

これらの形質転換菌を適当な抗生物質含をの普通培地上の多数の格子の上に接種 して３７℃に終夜生育させた。該形質転換菌をニトロセルロース　ディスクへ移 してコロニイ　ブロッティング（ｃｏｌｏｎｙ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）処理した。

かようにして濾紙上で０．５ＮＩｌ（Ｊの使用下にコロニイを溶解させてから流 水下に非結合の細胞破片を除去した。濾紙のタンパク質結合能に対して子ウシ血 清アルブミンを用いて飽和させ、その後に第一抗体を加えた。

二抗体を加えた。この第二抗体はヤギー抗ウサギ抗体とワサビダイコンの過酸化 酵素との接合体であった。非結合の接合体を洗去してから酵素基質を加えビブリ オ　コレラ抗原を発現するコロニイを目視し得るようにした。該抗原は第一抗体 と反応可能である。

かようにして単離された陽性のコロニイを純化し、コロニイ　プロット（ｃｏｌ ｏｎｙ　ｂｌｏｔ）の中で再検査し、クローン化されたＤＮＡに使用した。

４６０のうちのひとつを指向するものである。これらのプラスミ）”ｍＮＡ供給 源としてのビブリオ　３１１０１７株の使用下に夫々独立にクローン化された。

これら三種のプラスミドは明かに同一であるが本発明においては特性化の研究の ためにｐ　ＰＭ４４０を使用した。該プラスミドは約２．２ｋｂの挿入ＤＮＡを 含有し、制限酵繁地図は第１図に示されている０本明細書中でｋｂはＤＮＡの長 さを示すために用いられていて１０３塩基対合に該当する。

本発明においてクローン化された遺伝子製品即ちコロニイ　ブロッティングにお いて抗血清と反応した遺伝子製品を同定するために細胞膜（ｃｅｌｌ　ｅｎｖｅ ｌｏｐｅｓ）を準備した。この細胞膜を５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中で 溶解させ５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル上で処理した０次に該ゲル中の該物 質をニトロセルロースへ電気泳動によって移し、次にコロニイ　ブロッティング におけると同様に処理した。該移し換えの結果を第２図に示す。

第２図はｐＰＭ４４０の中に約２２０００ダルトンのタンパク質に対応するバン ドが存在すること、これはベクターの中でもな（又マイナスの反応のクローンの 中でもないことを明かに示している。該タンパク質は５ＤＳ−ポリアクリルアミ ド　ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とそれに続くタンパク質染色の後に細胞 膜中に明かに目視された。

ｐＰＭ４４０の欠失誘導体が構成された。これらの誘導体の最初のもの即ちｐＰ Ｍ４４１はベクターＤＮＡの中の）Ｉｉｎｄ　ｍサイトからクローン化ＤＮＡ中 のＨ４ｎｄｌＩ［サイトに対し右回りに欠失させることにより構成された。第二 の欠失誘導体、即ちｐ　ＰＭ４４２はクローン化ＤＮＡの中のＨｐａ　Ｉサイト （複数）の中間のＤＮＡを欠失させることによって得られた。これらの欠失誘導 体は双方共抗血清と反応する能力を失った。

ｐ　ＰＭ４４０の一連のトランスポゾンＴｎ１７２５挿入誘導体即ちｐ　ＰＶＡ 　４３〜ｐＰＭ４４８がｍ離された゛。これらのうちｐＰＭ４４７及びｐ　ＰＶ Ａ　４８を宿す夫々菌株は双方共に陽性のコロニイ　プロットを与えるけれども ｐ　ＰＶＡ　４７はｐ　Ｐ　Ｍ４４８及ヒｍ（７１）プラスミドｐＰＭ４４０よ りも弱い。その他のプラスミドは全く反応しない。

これらのプラスミドを宿す菌株（複数）の細胞膜を５ＤＳ−Ｐ　Ａ　Ｇ　ＩＦ、 法によって欠失及び挿入の双方について試験するとｐＰＭ４４８はｐ　ＰＶＡ　 ４０に比し正常なレベルの２２０００ダルトンのタンパク質を産生ずるけれども ｐＰＭ４４７はより少いレベルのタンパク質を産生じ、その他のすべては検出さ れる程のタンパク質を産生しない（第３図）や 第４図においてこれらの各種のプラスミドの制限酵素による分析の総合を示す、 これらのデータ及び“ｐ　ＰＶＡ　４７に対するＴｎ１７２５挿入は恐ら＜２２ ０００ダルトンタンパク質のレベル低下へみちびく正反対の挿入（ｐｏｌａｒ　 １ｎｓｅｒｔｉｏｎ）であるという観察結果”から２２０００ダルトンタンパク 質をコードするＤＮＡの位１は第３図の下方部に示される地図に示される通りで ある。

該タンパク質のＮＨ，−末端は恐らく右方末尾部にコードされている。

ミニセル内のこれらのプラスミドのすべてによってコードされるタンパク質を試 験すると第５図に示すのと同じ結果が得られる（第５図）。これらの結果は又ｐ 　ＰＶＡ　４０にペターＰ　Ｂ　Ｒ３２２に比しＭＰＭ４４０についてのみ新規 タンパク質即ち２２０００ダルトンタンパク質が検出されること、及びこのタン パク質は該プラスミドについてコードされることを示す。

サザン法によ　ブロッティング分析 サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法に従うＤＮＡ／ＤＮＡ雑種形成技法を用い本発明 者らは被検物としてｐＰＭ４’４０を用いて各種のビブリオコ１／し株（複数） の中の染色体の領域における類似性を観察した。

三種の互に異なる制限酵素を用いる分析の結果はｐ　ＰＶＡ　４０中のクローン 化されたＤＮＡはクラシカル株及びＥ　Ｉ　Ｔｏｒ株の双方に存在すること、両 者の株の間に何らの相違も認められないことを示した。このことは該遺伝子及び タンパク質はビブリオ　コレレの双方の生物型に共通であることを意味する。

ｚＰＭ４４０タンパク　のキャラクタリゼーシランｐ　ＰＶＡ　４０でコードさ れる２２０００ダルトンタンパク質を部分的にキャラクタリゼーシランしかつ精 製した。第６図には、プラスミドｐ　ＰＶＡ　４０を保持する　Ｅ、コリ　Ｋ１ ２の細胞の細胞膜（エンベロープ）を分別した後の５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示 す、左側パネルはゲルを染色して得た結果を示し、右側パネルはｐＰＭ４４Ｑ蛋 白質を同定するためビブリオコレレ抗血清を用いるウェスタンプロットによって 分析された重複ゲルを示す。

分別の結果はｐＰＭ４４０タンパク質が多分ペプチドグリカン会合外部膜タンパ ク質であることを示している。

この方法でのタンパク質の分別後にＳＤＳ中ヒドロキシアパタイト上でのイオン 交換クロマトグラフィを行い、次いでＳＤＳ中バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ｐ 　１５０上でゲル濾過を行ってタンパク質を精製することができた。

サルモネラにおける　ＰＶＡ　４０タンパク　の関連免疫学的試験を行いかつｐ 　ＰＶＡ　４０タンパク質がサルモネラ中で発現されるか否かを決定するため、 Ｓ、チフィムリウム株Ｇ３０及びＳ、チフィ株Ｔ）’　２１　ａを精製ｐＰＭ４ ４０プラスミツドＤＮＡで形質転換させねばならなかった。対照としてプラスミ ツドベクターをも導入した。これらの株とビブリオコレレ５６９Ｂと元の大腸菌 隔離菌との細胞エンベロープを調製し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果を第 ７図に示す。ｐＰＭ４４０タンパク質はビブリオコレレ中の微少タンパク質に過 ぎず、検出されにくいことがわかる。しかしながらＥ、コリ、Ｓ、チフィムリウ ム、Ｓ、チフィ中におけるクローン化形ではこのタンパク質は主要バンドである 。

これらの菌株のすべてを、ビブリオコレレ５６９Ｂ抗血清によって凝集される能 力について分析した。これらの凝集の結果を第３表に示す。これらの試験では、 ｐ　ＰＶＡ　４０．従って２２０００ダルトン蛋白質が存在するとき、細胞は明 らかな凝集を示すことが観察された。このことは２２０００ダルトン蛋白質が付 着因子であることを示唆している。データはビブリオコレレに対する抗体がｐ　 ＰＶＡ　４０保持歯株を凝集させ得ることを示している。かくしてこのタンパク 質はサルモネラワクチン株中において発現されるだけでなく抗体によって認識さ れる形で発現される。

従ってｐ　ＰＶＡ　４０は本発明によって記載されるように経口ワクチンの形で 有用である。

かくして本発明はプラスミツドｐＰＭ４４０中で本発明者らがクローニングした ビブリオコレレ表面抗原を発現するサルモネラチフィがラクトースエピメラーゼ 欠失（ｇａｌ　Ｅ）突然変異株を担持する薬理学的又は生理学的に受容可能な担 体を経口投与によって動物中へ導入する段階による動物受納者（ヒトを含む）の 免疫処置にある。

本発明はプラスミツドにコードされる表面抗原を指向する発明である。

本発明は染色体にコードされかつサルモネラチフィの染色体中へ遺伝工学的に導 入されている表面抗原にある。

第　３ 生ビブリオコレレ５６９Ｂに対する抗血清による凝集〔注〕十力価は凝集を与え る最小希釈の逆数である０明瞭な自己凝集 プラスミド　ＰＭ５００ この型のもうひとつの例はプラスミツドｐ　ＰＭ５００によってコードされるタ ンパク質であることである。このタンパク質はそのサイズが約１６〜１８にダル トンであり、ウェスタンプロットにおいて抗血清と極めて容易に反応する（第８ 図）。

プラスミドｐ　ＰＭ５００はｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位中にクローニングされ たＶ、コレレＤＮＡの６．７　ｋｂ　Ｐｓｔ　１フラグメントからなる。ｐ　Ｐ Ｍ５００タンパク質のための遺伝子は、トランスポゾン突然変異誘発によって位 置決定されかつｐＰＭ５００地図上１０．４ｋｂに於ける旧ｎｄｌ［［部位にわ たる４００〜５００塩基対合の領域に対応する（第９図）。

プラスミ　ドでコードされるタンパク質を検出するためのミニセル分析はｐＰＭ ５００蛋白質にメチオニンが欠除していることを示唆する。

７’５ｘ　ミ　ド　ＰＭ５１０（び　ＰＭ５　２　０）この型の更に他の例は二 種のタンパク質をコードするプラスミツドｐＰＭ５１０（第１０図）である。

これらのタンパク質はそのサイズが約２２ｋＤａ＋及び６Ｏ−６５ｋＤａｌＴｈ ありかつ両方共にウェスタンプロットにおいて強力に反応する（第８図）。

プラスミドｐ　ＰＭ５１０はｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位中にクローニングされ た５、　１　ｋｂ　Ｐｓｔ　］断片からなる。このクローン化ＤＮＡ内のタンパ ク質のための遺伝子の位置決定（ｌｏｃａ　ｔｊｏｎ）は未だなされていないが 、これらは−緒に、クローン化断片のコード能力の約５０％をとるであろう。

プラスミツドｐＰＭ４５１、ｐＰＭ４５５、ｐ　ＰＭ４７２、ｐ　ＰＭ５３０の 夫々にコードされるＶ。コレラ（第１１図）のｐ　ＰＭ４５５を用いて詳細な分 析を行い、このプラスミツドの制限地図を第１２図に示す、ウェスタンプロット 分析（第１３図）によって２５ｋＤａｌタンパク質が同定されかっ欠失及びトラ ンスポゾン挿入分析（第１４図）によってクローン化ＤＮＡ内の遺伝子の位置決 定がなされた。これらの分析はプラスミツドｐＰＭ５５１中のＴｎｌ、７２５の 挿入点と７゜Ｏｋｂにおける旧ｎｄｌ［１部位との間にＯｍｐ　Ｖ遺伝子がある ことを示す、一部分Ｏｍｐ　Ｖから誘導される融合タンパク質の生成を含む他の 研究は転写が左から右へであることを示す。

０＋ｓｐ　Ｖ蛋白質は極めて免疫原性であるように思われ（第１５図）かつ主要 外部膜タンパク質である以外に、鞭毛の鞘の部分である。

かくしてこのタンパク質に対する抗体は、鞭毛に結合することによって細菌を固 定化する筈であり、そうすることによってＶ、コレラが腸管内で転移増殖しない ようにする。

プラスミド　ＰＭ４３１ 他のものと組合わせて保護の増加に用いることができたこの型のもうひとつの例 はプラスミントｐＰＭ４３１（第１６図）でコードされる。このプラスミツドは 溶血素産生に関連するタンパク質の幾つかをコードする（第１７図）。トランス ポゾン挿入分析によりかつミニセル中におけるプラスミツドコードタンパク質を 決定することによって遺伝子が位置決定された（第１８図）、これらの結果は決 定されるべきプラスミツドの部分的な物理的地図を可能にした（第１９図）、最 も重要なことは溶血素のためのｉｕｙ　Ａ構造遺伝子がこのＤＮＡ内にコードさ れることである。

防御における溶血素蛋白質の重要性は該タンパク質がウサギ回腸ループにおいて 下痢原性であることが示されたことである。かくして腸管内の抗体がこの排出タ ンパク質による下痢の減少に有益であると期待することができる。

減弱■、コレレ株における溶血素産生を決定する遺伝子又はその部分の欠失も、 本明細書に記載した型と異るワクチン株産生に有用であり得る。特に、もし溶血 素がコレラ毒性喪失（ｃｈｏｌｅｒａ−ｔｏｘｉｎ−１ｅｓｓ）　Ｖ、コレラに おけるある種の下痢の原因である場合には欠失または不活性化がこれらの株を大 いに改良するであろう。

本例に関して極めて特異的な困難を経験した。

ビブリオコレラの〇−抗原が有用であり得ることが疑われた。

ビブリオコレラの〇−抗原に対する抗体が動物モデル系およびヒトにおけるビブ リオコレラに対する防御に非常に有効であり得ることは公知である。〇−抗原は 良好な免疫反応を誘発するので上記の型のワクチン株のための理想的な抗原であ り得ることも公知である。

サルモネラに関する研究から、〇−抗抗原多糖モモノマー合成を可能にする遺伝 子はサルモネラ遺伝子地図上の約４２分に位置する遺伝子のひとつの集団中に大 部分存在することも知られている。これらの遺伝子の幾らかは成分単糖類の合成 のための酵素をコードし、他の遺伝子は脂質担体上のモノマーの集合のための酵 素をコードする。この遺伝子集団はＤＮＡの実質的なセグメントを占めるであろ うと推測されている。

サルモ不うに関する研究から〇−抗抗原フッマー〇−抗抗原ソリマーの重合を決 定する遺伝子及び〇−−原ポリマーをリボ多糖ＩＩ（ＬＰＳ）コアへ転位させて 完全なリボ多ｌ１１１を分子を与えるトランスロカーゼをコードする遺伝子は共 に主遺伝子集団から遠くに位置することも知られている。サルモネラとの比較に よりビブリオコレラの〇−−原合成のための遺伝的基礎が等しく複雑であろうし 、かつビブリオコレラの〇−抗原の合成のために所要な遺伝子の全組がクローニ ングされかつＥ、コリ又はサルモネラへ移行されたとしても、〇−抗抗原ソリマ ービブリオコレラのＬＰＳコアと異るＥ、コリ又はサルモネラのリボ多Ｉｉ類コ アへ移行され得ないことが期待されるべきである。

かくしてＥ、コリ又はサルモネラのＬＰＳ上で発現され得るＯ−抗原合成系のク ローニングにおける困難さは、第１には主遺伝子集団がＤＮＡの実質的な長さを 占める可能性゛をもつことであり、第２には主集団中には存在しない完全な発現 のために不可欠な他の遺伝子があり得ることであり、第３には遺伝子がＥ、コリ 又はサルモネラ中にクローニングされかつ一緒に置かれたとしても、これらの菌 及びビブリオコレラのリボ多ｔＩ！類コアの差異のため細胞表面上に〇−抗原を 充分に発現することができないので、トランスロカーゼがビブリオコレレ〇−抗 原ポリマーをＥ、コリ又はサルモネラコアへ移行させないであろうということで ある。

ビブリオコレレ〇−抗原をＥ、コリ又はサルモネラの表面上に発現させるために 必要な遺伝子の完全な組のクローニングにおける上記の予期された真人な困難の ために、本発明者らは主としてサルモネラチフィ又は関連菌の適当なワクチン株 中に存在するとき有効な免疫性を誘発する′ことができるビブリオコレラの表面 蛋白質をコードするクローンを探しめた。しかし、これに加えて本発明者らはビ プリオコレレの〇−抗原をＥ、コリの表面上に発現させることを可能にする１組 の遺伝子をクローニングすれば、本発明者らのスクリーニング方法で検出される であろうと思われる方法で実験を行った。

クローニングにおける本発明者らの第１の企画ではコスミンドベクターｐＨＣ７ ９を用いた。該ベクターはサイズが３Ｏ−４０ｋｂの程度のＤＮＡ上の遺伝子集 団のクローニングを可能にする筈だからである。しかし常法で得られたビプリオ コレレのＤＮＡは恐らくビブリオコレラが産生ずる細胞外ＤＮＡａｓｅによる部 分的分解のために、低分子量であった。従って本発明者らはプラスミントベクタ ー中へのクローニングによって進めねばならず、Ｅ。

コリ中にビブリオコレラの表面蛋白質を発現させる多くのクローンを得たが、す べてが、使用した制限酵素によるが平均２ｋｂ〜８ｋｂのビブリオコレラＤＮＡ の少量しか含んでいなかった０次に本発明者らはプロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ） の存在下に於てビブリオコレラＤＮＡを抽出する方法を考案し、ＤＮＡが高分子 量形で残留し、それから次に制限酵素によりニスミド中へのクローニングに適し た３０〜４０ｋｂの片に切断できるようにした。

本発明者らは今回実際にビブリオコレラがニスミド中に一群としてクローニング されることができ、かつＥ、コリ中におけるビブリオコレレ〇−抗原の合成を決 定することができるように共通の場所内にある゛遺伝子を担持することを発見し た。

この目的のために有効なりＮＡの長さは大きいが４０ｋｂ未満であることも発見 した。

更に本発明者らはビブリオコレレ染色体ＤＮＡのような物質に関して用いられる とき、この物質を十分に高い分子量片に保ことができ、かつ同時にかかる物質の 充分な濃度と純度とを与え、かつこのことが４０ｋｂ対範囲の断片を得るのに有 用であり得、かつ次のクローニング技術のために有用である技術が実際にあるこ とを発見した。

本発明者らはプロナーゼの存在下において細胞を溶解しかつこの過程中で染色体 ＤＮＡを同一容器内に保ちながら溶媒抽出を用いて分離及び濃縮を行うならば非 常に長い長さのＤＮＡ鎖を単離できることを発見した。

塩化セシウム勾配上での遠心を用いる場合よりも抽出方法は幾らか速やかに行う ことができ、このためそうでなければＤＮＡａｓｓが一体的ＤＮＡ物質と接触す る時間が短縮されるという事実によって、ＤＮＡの一体性も助長される。

かかる長さの長いＤＮＡを得るための特別な好ましい方法又は更にクローニング する方法は本明細書の後文中に記載される。

しかし特にビブリオ３１１５６９８株（古典的なイナバ株）及び０１７（ＢＩＴ ｏｒ、オガワ株）の夫々から大分子量の染色体ＤＮＡを得ることができたので、 この染色体ＤＮＡを次に約３５〜５０ｋｂ対の範囲に少くとも幾らかのフラグメ ントを残すことが期待され得る適当な制限酵素を用いて部分的に消化した。

好ましくはこの目的のために制限酵素５ａｕ３Ａを用いたが、適当な制限断片を 得るのに実際に有効であった６ワクチン用に適したタンパク質抗原でさえも長さ が約４０ｋｂ対のＤＮＡ鎖内に含まれることができる遺伝子集団からより好く発 現され得るという仮定を進めてコスミンド中へのクローニングを続けた。従って コスミッドベクターｐＨＣ７９のＤＮＡをＢａｇ　ＨＩで完釡に消化し、次に自 己結合を防ぐためアルカリ性ホスフプターゼで処理した。

次にビプリオコレレからの制限断片とコスミソドベクターＤＮＡとを混合し、終 夜にわたり結合させ、インビトロでバグテリオファージ人中に充填した０次にフ ァージ溶解産物を、非制限（ｒｅｓ　ｔ−ｒｉｃｔｉｏｎｌｅｓｓ）（ｈｓｄ　 Ｒ）　、組換え欠除（ｒｅｃ　Ａ）のＥ、コリに一１２株を感染するために用い た。コスミッド含有細胞をアンピシリン含有栄養培地上で選択した。得られたコ ロニイの９０％以上がテトラサイクリンに対して敏感な細胞からなっており（Ｄ ＮＡがベクターのＢａｇ　Ｈ１部位中にクローニングされるならば期待されるよ うに）、クローニングされたビプリオコレレＤＮＡを有するコスミソドｐ）（Ｃ ７９を担持すると仮定することができた。従って該細胞はＤＮＡの３５〜５０ｋ ｂ対を含むコスミッドクローンを含んでいた。

次にこのコロニイを抗体で試験して、クローニングされたビプリオコレレＤＮＡ を担持する結果として産生されたビブリオコレレ抗原を測定した。

次に得られたままのコスミフドクローンを次にアンピシリン含有栄養培地上の番 号の付いたグリッド上に貼付し、３７℃において終夜増殖させた後にコロニイブ ロッティングによる処理のためにニトロセルロースディスクへ移行した。このこ とは、フィルター上で０．５Ｎ　Ｈｌによりコロニイを溶解した後にジェット水 流で未結合細胞砕片を除去することを含んでいた。フィルター〇タンパク質結合 能力を次に脱脂粉乳を用いて飽和した後に一次抗体を添加した。

この抗血清又は抗体を、ウサギ中で余生５６９Ｂ株菌に対して発育させ、アトへ シン物質の粗製調製物で促進した。次に未結合抗体を洗浄除去し、二次抗体を添 加した。この抗体は、ヤギ抗ウサギ抗体と西洋わさび過酸化酵素との接合物であ った。未結合接合物を洗浄除去した後に酵素基質を添加して一次抗体と反応する ことができるビブリオコレレ抗原を発現するコロニイを可視化した。この方法で 単離された陽性コロニイを精製し、コロニイプロットで再検査し、コスミッドＤ ＮＡを単離し、陽性反応がコスミフドＤＮＡに関連することを確かめるため、Ｅ 、コリに−１２を再形質転換させるために用いた。この陽性反応コロニイについ て次にコロニイブロソティングを反復しかつ抗生５６９Ｂ血清をビプリオコレレ ５６９Ｂからの精ＷＬＰＳと広範囲に吸着させてＬＰＳと反応する抗体を除いた 後に、上記の抗生５６９Ｂ血清を含む抗生５６９Ｂ血清の代りに他の血清を用い ることによって、さらに分析した。

ＬＰＳの合成のための遺伝子をコードするクローンはコロエイプロット中で、精 製ＬＰＳと広範囲に吸着された後のこの抗血清と反応できないことによって検出 されるべきである。

この方法に従って幾つかのクローンをＬＰＳの〇−抗原の合成にを効な遺伝子を 含むとして同定した。

従って本発明は４０ｋｂ未満のＤＮＡを含みかつ〇−抗原の決定のために有効な 該遺伝子を共通位置に含むＤＮＡの制限断片を指向する発明である。

従って本発明はコスミソドベクターにより〇−抗原を合成し、その結果ＤＮＡの ３５〜５０ｋｂ対のサイズのクローンであるコスミッドークローンを産生ずるた めに有効な遺伝子の組換えにある。

ｐＰＭｌｏｏｌは一典型例であり、従って本発明はコスミッドｐＰＭＩＱＯ１を 指向する発明である。

このコスミ７ドを次に分析した結果このコスミンドはｐＨＣ７９中にクローニン グされた約３６ｋｂ対のビプリオコレレのＤＮＡを含むことがわかった。幾つか のエンドヌクレアーゼで制限された該ＤＮＡのゲル電気泳動図を第２３図に示す 。

細菌細胞中のｐＰＭｌｏｏｌとして同定されるこのコスミッドの存在は、細胞を イナバ血清型のＬＰＳの〇−抗原産生性にさせる。

この物質は幾つかの方法で検出されることができる。

ｐＰＭ１００１保持細菌から細胞膜（エンベロープ）を単離し、ＳＤＳ中に可溶 化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した後に銀で染色するとリボ多＊ ＊含有〇−抗原の典型的なバンドの縞の生成を検出することができる（第２４図 ）、この同じエンベロープ物質を同じ方法で電気泳動にかけ、電気泳動的にニト ロセルロースへ移行させ、ＬＰＳに対する抗血清を用いてウェスタンブロッティ ングさせることもできる。この方法により最初にニトロセルロースシートをウサ ギ抗ビブリオコレレＬＰＳ血清と反応させ、次に西洋わさび過酸化酵素をカップ リングさせであるヤギ抗ウサギ血清と反応させ、免疫複合体を過酸゛化酵素に対 する基質の添加によって可視化することにより、〇−抗原物質を検出することが できる。該ウェスタンプロントでは■、ココレ〇−抗原だけが可視化され、得ら れた陽性反応はＬＰＳがビブリオコレレ〇−抗原を担持することを示した。

精製ＬＰＳはｐＨＣ７９又はｐＰＭｌｏｏｌのいずれかを保持するＥ、コリに− １２から熱フェノールー水沫によっても抽出された、を気泳動後銀染色によりｐ ＰＭｌｏｏｌの存在はＬＰＳ担持〇−抗原の典型的なバンドの縞を与えることが わかる。（第２５図） 精製ＬＰＳは、表面にイナバＬＰＳが固定されている羊赤血球の凝集を防止する ようにｉ＆ＬＰｓが抗ＬＰＳ免疫グロブリンを中和する能力をもつか否かを見る ための凝血阻止分析にも用いられた。この分析はｐＰＭ１００１保持の結果とし てＥ、コリに一１２中に産生された〇−抗原物質がイナバ親■、コレレ株５６９ ＢのＬＰＳから免疫学的に識別され得ないことを示した。該クローンからのＬＰ Ｓ、夫々が２倍血清希釈のオガワＬＰＳまたはイナバＬ　Ｐ　Ｓを、オガワＬＰ Ｓで被覆されたヒツジ赤血球（ｒｂｃ　’　ｓ）の抗オガワ血清による凝集成い はイナバＬＰＳで被覆されたヒツジｒｂｃ　’　ｓの抗イナバ血清による凝集の いずれかを阻止するために用いた。

イナバ被覆ｒｂｃ実験では、クローンからのＬＰＳは、■、ココレイナバＬＰＳ のウェル１２（，５μｓ／ｍｆ）に対してウェル１１　（１Ｍｇ　／　ｍ　ｌ　 ）まで阻止した。オガワＬＰＳはウェル７（１６Ｍｇ／ｍｊりまで阻止した。か くしてクローンからのＬＰＳは極めて良好に阻止し、イナバＬＰＳの特異性の全 部またはほとんどを有することを示した。

オガワ被覆ｒｂｃ実験では二型のすべてからのＬＰＳがほぼウェル１５（，０６ Ｍｇ／ｍｕ）まで阻止した。かようにしてクローンからのＬＰＳはＶ、コレレイ ナバＬＰＳと同程度まで阻止し、イナバ及びオガワＶ、コレレ株からのＬＰＳに よって共有されることが知られている共通の抗原特異性を担持することを示して いる。ｐｉ（Ｃ７９１３持Ｅ、コリからのり、ＰＳはいずれの系においてもほと んど阻止を与えなかった。

既述のようにｐＰＭ１００１保持細胞の結果として産生されるこの〇−抗原物質 担持ＬＰＳは細胞膜（エンベロープ）中に見いだされる。ｐＰＭＩ００１保持細 胞は抗ＬＰＳ血清を凝集させることができるがコスミフドを保持しないか又はコ リイン（ｃｏｒｒｙｉｎ）　ｐＨＣ１９を保持する細胞を凝集させることがでこ ないので、このＬＰＳは細胞表面に暴露されていることも示すことができる。

ｐＰＭｌｏｏＩは■。コレレイナバ血清型を決定する遺伝子をコードする。しか しＶ、コレレの血清型（イナバ及びオガワ）間の変化はひとつの位置に局在して おり、今回本発明者らはイナバ〇−抗原特異性のＥ、コリ中における発現のため に必要なすべての遺伝子はひとつのＤＮＡフラグメント上にクローニングされる ことができることを発見し、本発明によってオガワ〇−抗原のＥ・コリにおける 発現のために必要な遺伝子は単一のＤＮＡフラグメント上にクローニングされる ことができないようである。

ｐＰＭｌｏｏｌは０１７のようなビプリオコレレ（オガワ）株からのＤＮＡを用 いて構築された遺伝子バンクからコスミッドクローンを得るために用いられ、こ のことは、ｐＰＭｌｏｏｌ又はオガワクローンを検出するためにＤＮＡプローブ として〇−抗原合成をコードするクローン化ビブリオコレレＤＮＡの部分を用い ることによって簡単に行われ得る。別法としてオガワ遺伝子をｐＰＭｌｏｏｌを 単離するために用いたのと同じ方法で（オガワ抗血清を用いねばならないこと以 外は）クローニングすることができる。事実、本発明者らは同じ方法でクローン 化オガワ抗原の単離に成功した。プラスミツドｐＰＭ１００２及びｐ　Ｐ　Ｍ１ ００３は典型的例であり、従って本発明はｐＰＭ１００２及びｐ　Ｐ　Ｍ１００ ３を指向する発明である。

従ってｐＰＭ１００］、ｐＰＭ１００２、ｐＰＭ１００３は本発明によって記載 されるワクチンの製造に有用である。

本発明はリボ多糖類のビブリオコレレ〇−抗原を発現する薬理学的及び生理学的 に受容可能の担体のヒトによる経口摂取にあるといもことができる。

もうひとつの形において本発明は〇−抗原を合成する酵素をコードする遺伝子を 担持するプラスミツドを担持する細菌株の複製にある。

もうひとつの形において本発明はオガワ型〇−抗原と共有される抗原特異性をも 有するイナバ型の〇−抗原の発現を与える細菌株にある。

更に他の形において本発明はビプリオコレレに対するヒトにおける免疫の促進を 助けるための経口ワクチンとして有用な細菌株であって、限られた但し充分な時 間小腸のリンパ組織に侵入する型で、かつ小腸のリンパｍ織に関する侵入特性が 残留するように非病原性にされた株であって該誘導株がビブリオコレレの〇−抗 原の合成を可能にする遺伝子をもその中に担持して上記特性を保留している細菌 株にある。

本発明はビブリオコレレ株の経口摂取からなるヒトのビブリオコレレに対する免 疫の促進方法にある。

本説明中において〇−抗原の有効値は病原ビブリオコレレに対する免疫化又は少 くとも明瞭な抵抗を促進するものであることを暗に示している。

本発明の理解をさらに容易にするためにこの最後の実施例中には本明細書中に示 した今まで産生された物質の分析をさらに付は加える。

本発明は、第１例において分離及び濃縮の工程がピペットなどを用いる遠心分離 または抽出を含まず、ＤＮＡの酵素分解を防止するためプロナーゼを含む適切な りＮＡの製造方法にある。

本発明者らはＣｓＣｌ遠心分離又は長いインキュベーション時間に頼ることな（ 、組換えＤＮＡ使用に適したビブリオコレレ又はサルモネラチフィムリウム又は 他の細菌のＤＮＡを迅速に単離し得る方法を開発した。

方法：　染色体ＤＮＡの精製のために、ビブリオ３１１５６９株（古典型、イナ バ）及び０１７　（ＢＩ　Ｔｏｒ、オガヮ）並びにサルモネラチフィムリウムＬ Ｔ２を成功裡に使用した。方法は下記の通りである。

２０ｍｊ！のプレイン−ハートインフュージョンブロス（ＤＴＰＣＯ）中、３７ ℃で曝気しながら細胞を終夜増殖させた０次に、細胞を室温下に５００Ｑｘｇ’ ？’ｌＯ分間遠心し、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ）リスＨＣｊ！、５ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、５　ＱｍＭ　ＮａＣｆ、ｐＨ８，０）で１回洗浄し、再び遠心した後に洗浄 済み細胞を原容量の１７１０（即ち２．０　ｍ　Ｊ　）に、冷２５％蔗Ｗ５０ｍ Ｍｔ−リスＨＣ１溶液（ｐＨ８，０）中に再懸濁した。これに対し１０■／　ｍ 　Ｉ！リゾチームの０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０）　１．０ｍｊ！を 添加し、この懸濁液を２０分間氷上に放置した。次に、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭト リスＨＣｌ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡＳｐＨ８，０）（０，７５ｍｊりを添加してか ら溶解液（５０ｍＭ）リスＨＣ１０，２５Ｍ　ＥＤＴＡ中５％サルコシル溶液、 ｐＨ８，、ｏ　）　０．２５　ｍ　Ａを添加した。この混合物に対し固体プロナ ーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）　（１０■）をも添加し、おだやかに混合した。これを ５６℃において、時々振りながら６０分間インキュベートした。この時間で溶解 は明らかになった。

次に溶解産物を５　ＱｍＡのエルレンマイヤーフラスコに移し、ＴＥ１１衝液（ １０’ｍＪトリスＨＣｆ、゛１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）で飽和したフェノ ールで３回穏やかに抽出した。このＴＥ緩衝液飽和フェノールは通常ＴＥ１ｍｌ につき１ｇのフェノールを添加することによって得られる。次にジエチルエーテ ルで２回抽出することによって残留フェノールを除去する。次にこの透明粘稠な りＮＡｉｇ液に２容（８ｍｆ）の冷（１５℃）９５％エタノールを添加した。

この結果ねばねばするＤＮＡの大塊の沈殿が得られた。この塊は容易に沈降し、 ＤＮＡはガラスに付着する傾向もあるので、エタノール水溶液をデカンテーショ ンすることができる０次にＤＮＡを同様な方法で７０％エタノールで２回洗浄し た。

次に洗浄済みＤＮＡを約６０分間真空乾燥した後に１、Ｏｍ　１２のＴＥＮ衝液 を添加し、５６℃で数分間加熱した０次にＤＮＡ溶液を１．５　ｍ　ｆｔのエッ ペンドルフ管に移し、エフペンドシフ５４１４テーブルトツプ遠心機で２分間遠 心することによって残留粒状物を除去した。上滑を新しい管へ移し、４℃で貯蔵 した。ＤＮＡの濃度は通常２００〜５００μｇ　／　ｍ　ｊ！の範囲であった。

結果及び考察：　第２６図は制限酵素による消化後、■。コレＩ／又はＳ、チフ ィムリウムＤＮＡのいずれかの３時間結合を行って得た結果を示す。ＤＮＡがＥ ｃｏＲｌ又はＢａｍＨｌのいずれかで十分に切断され得たこと及び結合により、 かなりの量が試料ウェル中にトラップされたままであるように高分子１物質へ戻 ることがわかる。

図示の物質は通常の使い捨てチップ〔キルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）Ｃ２０）を用い てとベント吸引したものであるが、もし特殊な刃でチップを切り落として開口を 大きくしたならば、未切断及び結合ＤＮＡの見かけの分子量は明らかにより高く なる。操作中にはＤＮＡのピペット採取が全く含まれず、かつすべての操作が剪 断を最小にするようなものであることに注目されるべきである。

本発明の方法は僅小量（２０ｍｌ）の菌が所要でありかつ長時間または終夜のイ ンキユベーションが無（、実際に３時間以下で全操作を完了することができ、多 く、のクローニング実験のための十分なりＮＡを与えるという点で　広く用いら れているマーマー（Ｍａｒｍａｒ）の方法よりも幾つかＯ利益がある。より最近 の方法は時間がかかりかつ分子クローニング実験のための充分な品質のＤＮＡを 得るために不必要と思われる終夜におけるＣｓＣＩ！遠心を含んでいる。

本発明の方法で製造されたＤＮＡの〇−抗原遺伝子のクローニングのための使用 に加えて、本発明の方法は、本発明者らの実験室において幾つかの外部膜タンパ ク質のためのビブリオコレレ遺伝子の好結果のクローニングのため及び溶血素製 造のた。めに用いられる。

本発明の方法は３８ｋｂ　より大きい制限断片を有する必要のある幾つかのビブ リオコレレのコスミッドバンクの構築のためにも用いられる０本発明の方法は他 のグラム陰性菌に成功しないという理由はなく、本発明者らの実験室で、サルモ ネラチフィムリウムのコスミソドバンクの作製のためにも成功裡に用いられる。

浄書（内容に変更なし） ｖｕＩＩ ＦＩＧＵＲＥ　１： Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｍａｐ　ｏｆ　ｐＰＭ４４０　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 ５ｉｚｅｓ　ｏｆ　ｍｈｅｖａｒｉｏｕｓ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃ ａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＳＰＰＩ　ＤＮ Ａ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｅｃｏ　Ｒ１ａｓ　ａ　５ｔａｎｄａｒｄ。

−゛シｔ…←−ｑｗ−−−− ＦＩＧＵＲＥ　２： ＦＩＧＵＲＥ　３・ ［＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ｌＩ　爺罠イｇｆａフイ立ＩＣ０ＯＨＮＨ２ ＦＩＧＵＲＥ　４二 Ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ 　２２０００　ｄａｌｔｏｎｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｐＰＭ４４０　ｗｉｔｈ　 ｒｅｓｐｅｃｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ。

ｐＰＭ４４１　ａｎｄ　ｐＰＭ４４２．　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　Ｔｎ １７２５１ｎｓｅｒｔｉｏｎｓ。

ｐＰＭ４４３−ｐＰＭ４４８゜ ＦＩにＵＲＥ　５： ＦＩにＵＲＥ　６： Ｃｈａｒａｃｅｅｒｉｚａｃｉｏｎ　ｏｆ　仁ｈｅ　２２０００　ｄａｌｔｏｎ 　ｐＰＭ４４０ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｍｈ　ａｎｔｉ−１ｉｖｅ−−’、ｃｈ ｏｌｅｒａｅ　５６９Ｂ　ｓｅｒｕｍ　（ｒｉｇｈｔｐａｎｅｌ　＋　。

ＦＩＧＵＲＥ　７： Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｖ　ｓｔａ ｉｎｉｎｇ　ｏｆｃｅｌｌ　ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖ、ｑｒｉｏ ｕｓ　５ｔｒａｉｎｓ　ｈａｒｂｏｕｒｉｎｇ虹ｈｅ　ｐ］、ａｓｍｉｄｓ、　 Ｔｈｅ　、ｎ−ｒｏｗ　１１）ｃ目ｃａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄ　Ｖｉｂ ｒｉ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎ、ｔｈｅ　２２０００　ｄ ａｌ仁ｏｎ　ｐｒｏｒ：ｅｉｎ。

― ＦＩＧｔＪＲＥ　８： Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ−１ ２ｄｅｒｉｖａｅｉｖｅｓｈａｒｂｏｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｐ ｌａｓｍｉｄｓ、Ｃｅ１ｌ　ｅｎｖｅｌｏｐｅｓｏｆ　ｅｈｅｓｅ　５ｔｒａｉ ｎｓ　ｗｅｒｅ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｅｄ　ｏｎ　ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｅｉ仁ｈ ｅｒ　ｓｅａｉｎｉｎｇ　ｗｉｔｈＣｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　（ｕｐｐｅ ｒ　ｐａｎｅｌ　）　ｏｒ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏセａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ　ａｎ仁１−１ｉｖｅ−５６９Ｂ　ｓｅｒｕｍ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ 　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｈａｄｂｅｅｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｎ１ｔ ｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　（ｌｏｗｅｒ　ｐａｎｅｌｌ。

ＦＩＧＵＲＥ　９： Ｒｅｓ仁ｒｉｃｅｉｏｎ　ｍａｐ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＰＭ５００．　Ｔ ｈｅ　仁ｈｉｃｋ　１ｉｎｅＦＩＧＵＲＥ　１０＋ ｉ士−４＋　＝ 嘲−■−命・＋ 象　て　ミ ＳＤＳ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｎｅｓ ｉｓ　ｏｆ　ｖｈｏｌｅｃｅｌｌ　ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ　ｏｆ　ｖ、ｃｈｏｌｅ ｒａｅ　ａｎｄ　１ｎｎｅｒ　ａｎｄ　ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ｏｂＬ ａｉｎｅｄ　ｂｙ　５ｅｐａｒａｔｌｏｎ　ｏｎ　５ｕｃｒｏｓｅ　ｄｅｎｓｉ ｔｙｇｒａｃＨｅｎｔｓ。

ＦＩＧＵＲＥ　１２： ＦＩＧＵＲＥ　１３： ｉｓ　ｓｈｏｗｎ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ。

ＦＩＧＵＲＥ　１５ ＦＩＧＵＲＥ　１６： ＦＩＧＵＲＥ　２０： １ｉ１ＴＳ　Ｗｄｄ− ＦＴＧＩＪＲＥ　２３： Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ 　ｔｈｅ　ＤＮＡｏｆ　ｐｌａｓｒ＋＋ｉｄ　ｐＰＭｌｏｏｌ。

）　０−ＡＮＴＩＧＥＮ ＦＩＧＵＲＥ　２に： Ｃｅ１ｌ　ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ　ｏｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２５ｔｒａｉｎ 　ＤＨＩｃｏｎｅａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｐｐｒｏｐｒｉａ仁ｅ　ｐｌａｓｍ ｉｄｓ、　Ｃｅ１ｌｅｎｖｅｌｏｐｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｓｅｄ　ｂｙ　 ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｔ　ｅｌｅｃ仁ｒｏｐｈｏｒｅｓｅ ｓ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　５ｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇＦＩＧｔＪＲＥ 　２５： Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　（ＬＰＳ）　ｏｆ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ｓセｒａｉｎ　ＤＨＩ　Ｗｉてｈ　ｔｈｅ　ａｐｐｒｏ ｐｒｉａｅｅｐｌａｓｍｉｄｓ、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＬＰＳ　ｗａｓ　ａｎａｌ ｙｓｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒ ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙ　５ｉｌｖｅｒ　５ｔａ５ｎｉ＋ｉ ｇ　ｔｏ　ｖｉｓＬＩａｌｉｚｅ　ｔｈｅ　ｂａｎｄｓ。

ＦＩＧＵＲＥ　２６： ｖｉｏｌａ仁　ｃｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｎｇ　１１ｇＭ　５ｏｕｒｃｅ 、　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｄｉｇｅｓｅｓ　ａｎｄ　ｌｉｇａｃｉｏｎｓ　ｗ ｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｒｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔ。

仁ｈｅ　ｍａｎｕｆａｃｅｕｒｅｒｓ’　ｒｅｃｏｈｍｅｎｄａｔｉｃｎｓ。

６、ＤＮＡ　ａｓ　ｉｎ　４　ｂＬｌｔ　Ｉｉｇａｔｅｄ。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） ６０．１０．−１ 昭和　年　月　日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿　国 １、特許出願ノ表示　ＰＣ”ｒ／ＡＩＪ８５１０００１５２、発明の名称　バク テリア菌株 ３６特許出願人 住　所　東京都千代田区丸の内３丁目３番１号電話（２］、Ｌ）８７４１代表 ６、添付書類の目録 、、、、１容に変更なし）　１５ｇ？６１−５０２０９３　（１Ｂ）８、導入さ 、れた遺伝学的物質が腸管毒産生性エシェｌキア　コリのに９９抗原の合成を特 性化する第１・−６項のいずれか１項記載のバクテリア菌株。

９４導入された遺伝学的物質がヒトに対して病源性であるｌｌｉ管毒産件性エシ ェリキア　コリの転移増殖因子抗原の合成を特性化する第１〜６項のいずれか１ 項記載のバクテリア菌株。

１０、導入された遺伝学的物質がＣＦＡ／■産生の腸管前産生性エシェリキア　 コリの抗原Ｃ３１、Ｃ３２又はＣＳ　’３のうちのひとつの合成を特性化する前 各項のいずれか１項記載バクテリア菌株。

１１、導入された遺伝学的物質がビブリオ　コレレの表面タンパク質の合成を特 性化する第１〜６項のいずれか１項記載のバクテリア菌株。

１２、導入された遺伝学的物質がプラスミドｐＰＭ４４０，９ＰＭ５００、ｐ　 ＰＭ５１０、ｐ　ＰＶＡ　５５＆びｐ　ＰＶＡ　３１のいずれかひとつに存在す る第１１項記載のバクテリア菌株。

１３、ｐＰＭ４３１の中ヘコードされた遺伝学的物質の全部又は一部が城毒化又 は下痢減少化の目的で欠失を受けたビブリオ菌株。

１４゜導入された遺伝子がビブリオ　コレレの〇−抗原の合成に有効である請求 の範囲第１項記載のバクテリア菌株。

１５、合成された〇−抗原がエシェリキア　コリの表面上に存在する前各項のい ずれかに記載バクテリア菌株。

３０、請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項記載の特性を示す生菌のバクテリ ア菌株を含有するワクチン製品を経口投与して腸疾患に対する免疫を哺乳動物に 施すために有用なワクチン。

３１、コスミソドベクターを用いる〇−抗原集団のクローン化方法。

３２、導入された遺伝学的物質がプラスミドｐＰＭ４７４、ｐＰＭ４７６、ｐ、 ＰＭ４７７、ｐ　ＰＶＡ　８３のいずれかひとつの中に存在する請求の範囲第１ １項記載のバクテリア菌株。

１、事件の表示　ＰＣＴ／ＡＵ８５１０００１５２、発明の名称　バクテリア菌 株 ３、補正をする者 事件との関係　出願人 へ 手続補正書く方式〉 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＡＵ８５１０　Ｏ０１５２、発明の名称　バクテリア 菌株 ３、補正をする者 事件との関係′　出願人 名　称　エンテロヴアックス　リサーチプロプライエタリー　リミテッド ５、補正命令の日付　昭和６１年４月１日国際調査報告

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．非病源体から又は病源体が非病源化された菌体から実質上誘導された一組の 遺伝子であって哺乳動物の小腸のリンパ様組織に侵入し、増加し、短期間内に転 移増殖し得る該一組の遺伝子を有し、それと共に“小腸表面及び他の分泌器管表 面におけるＩｇＡ抗体産生にもとづく防御的免疫応答を有効に誘発する抗原又は 抗原群を特性的に合成する効果を与える導入された遺伝子又は遺伝子群又はそれ らの一部分”をも有することを特徴とするバクテリア菌株。
2. ２．産生されるＩｇＡ抗体が下記の病源性の属即ちエシェリキア、ロタウイルス 、ビブリオ、アエロモナス及びボルデテラのいかなる一属に対しても有効である 請求の範囲第１項記載のバクテリア菌株。
3. ３．導入された遺伝学的物質が菌株の染色体中に存在する請求の範囲第１項記載 のバクテリア菌株。
4. ４．導入された遺伝学的物質がバクテリア菌株の中のプラスミド上に存在する請 求の範囲第１項記載のバクテリア菌株。
5. ５．非病源性バクテリウムが下記の属即ちエシエリキア、サルモネラ及びシゲラ の中から選ばれる前各項のいずれか１項記載のバクテリア菌株。
6. ６．導入された遺伝学的物質が病源体のアドヘシン、外膜タンパク質又はリポポ リサッカライドのいずれかの合成を特性化する前各項のいずれか１項記載のバク テリア菌株。
7. ７．導入された遺伝学的物質が腸管毒産生性エシエリキアコリのＫ８８抗原の合 成を特性化する前各項のいずれか１項記載のバクテリア菌株。
8. ８．導入された遺伝学的物質が腸管毒産生性エシエリキアコリのＫ９９抗原の合 成を特性化する第１〜６項のいずれか１項記載のバクテリア菌株。
9. ９．導入された遺伝学的物質がヒトに対して病源性である腸管毒産生性エシエリ キアコリの転移増殖因子抗原の合成を特性化する第１〜６項のいずれか１項記載 のバクテリア菌株。
10. １０．導入された遺伝学的物質がＣＦＡ／ＩＩ産生の腸管毒産生性エシエリキア コリの抗原ＣＳ１、ＣＳ２又はＣＳ３のうちのひとつの合成を特性化する前各項 のいずれか１項記載のバクテリア菌株。
11. １１．導入された遺伝学的物質がプラスミドｐＰＭ４４０、ｐＰＭ５００、ｐＰ Ｍ５１０、ｐＰＭ４５５及びｐＰＭ４３１のいずれかに存在する前各項のいずれ か１項記載のバクテリア菌株。
12. １２．ｐＰＭ４３１の中へコードされた遺伝学的物質の全部又は一部が減毒化又 は下痢減少化の目的で欠失を受けたビブリオ菌株。
13. １３．導入された遺伝学的物質がビプリオコレレの表面抗原の合成を特性化する 請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のバクテリア菌株。
14. １４．導入された遺伝子がビプリオコレレのＯ−抗原の合成に有効である請求の 範囲第１項記載のバクテリア菌株。
15. １５．合成されたＯ−抗原がエシエリキアコリの表面上に存在する第１４項に記 載のバクテリア菌株。
16. １６．合成されたＯ−抗原がサルモネラの表面上に存在する第１４項記載のバク テリア菌株。
17. １７．合成されたＯ−抗原がシゲラの表面上に存在する第１４項記載のバクテリ ア菌株。
18. １８．非病源性の担体バクテリアの中に適切なベクターを介して選択された遺伝 子を導入する工程を含むことを特徴とする前項のいずれか１項記載の特性を示す バクテリア菌株の製造方法。
19. １９．ビプリオコレレのＯ−抗原の合成を決定する遺伝子を含有するＤＮＡのフ ラグメント。
20. ２０．コスミッドベクターとビプリオコレレのＯ−抗原の合成に有効な遺伝子（ 複数）との組合せ。
21. ２１．コスミッドベクターｐＨＣ７９とビプリオコレレのイナバ血清型のＯ−抗 原の合成に有効な遺伝子（複数）との組合せであって、コスミッドｐＰＭｌ００ １の全部又は一部を含有する該組合せ。
22. ２２．コスミッドベクタ−ｐＨＣ７９とビプリオコレレのオガワ血清型のＯ−抗 原の合成に有効な遺伝子（複数）との組合せであってコスミッドｐＰＭｌ００２ 、ｐＰＭｌ００３の全部又は一部を含有する該組合せ。
23. ２３．ビブリオＤＮＡフラグメントとコスミッドｐＰＭｌ００１、ｐＰＭ１００ ２及びｐＰＭｌ００３から選ばれるコスミッドとベクター又は非病源性菌株の染 色体の中へ導入されたベクターとの組合せ。
24. ２４．ビプリオコレレのＯ−抗原の合成に有効な遺伝子（複数）とコスミッドベ クター即ちｐＨＣ７９との組合せ。
25. ２５．請求の範囲１〜６及び１１〜１７のいずれか１項記載の特性を示す生菌の バクテリア菌株を含むワクチン製品を経口投与してビプリオコレレにもとずく腸 疾患に対する免疫を哺乳動物に施すために有用なワクチン。
26. ２６．ビプリオコレレのＯ−抗原のひとつを発現させるために有効なバクテリア 菌株の製造方法において、ビプリオコレレの染色体ＤＮＡの分別及び濃縮の工程 を含み、染色体ＤＮＡを同一容器内に保持したままで溶剤抽出と濃縮とを行うこ とを特徴とする方法。
27. ２７．明細書中の記載に従って同定されたコスミッドｐＰＭ１００１、ｐＰＭｌ ００２及びｐＰＭ１００３。
28. ２８．染色体ＤＮＡに対してプロナーゼを添加する工程を更に含む請求の範囲第 ２６項記載のバクテリア菌株の製造方法。
29. ２９．ビプリオコレレのＤＮＡフラグメント（複数）のうちの少くとも或るフラ グメントが少くとも約３２ｋｂの塩基対合を保持するように該フラグメントを抽 出し濃縮し、該フラグメントを適切なコスミッドベクターと結合させ、次にかよ うにして形成されたコスミッドクローン担持遺伝子即ちビプリオコレレのＯ−抗 原（複数）のうちのひとつを発現させ得るように配置された該コスミッドクロー ン担持遺伝子を単離する各工程を包含することを特徴とするバクテリア菌株の製 造方法。
30. ３０．請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項記載の特性を示す生菌のバクテリ ア菌株を含有するワクチン製品を経口投与して腸疾患に対する免疫を哺乳動物に 施すために有用なワクチン。
31. ３１．コスミッドベクターを用いるＯ−抗原集団のクローン化方法。