JPS61500732A - 電子移動電極における炭素↓−硼素化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 電子移動電極における炭素−硼素化合物本発明は電子移動電極への炭素−硼素化 合物の使用およびかかる電極を使用する測定（ａｓｓａｙｓ）に関する。本発明 は過酸化水素に対する特定分析に関して記載するけれども、本発明は、特に酵素 基質の広い範囲にわたって使用する測定システムおよび電極に適用することがで きる。

メタロカルボラン錯体は接触反応に、特にオレフィンの均質水素化、異性化およ びヒドロホルミル化に使用することが報告されている。米国特許第４３６３７４ ７号明細書（１９８２年１２月４日）には上述するタイプの触媒が記載されてい る。

ヨーロッパ特許出願第８２３０５５９７号明細書には電気的導電性材料からなり 、かつ少なくとも１つの外面に酵素、および酵素が触媒的に作用するときに電荷 を電極に移動するメジエイタ化合物（ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の 組合せ体を設けたセンサー電極が記載されている。

この種の電極は「電子移動電極」と称されている。この電極の目的は酵素により 触媒的に反応することのできるｌまたは２種以上の選択成分の分量の存在の検出 および／またはかかる成分のレベルのモニターを測定することである。

上記ヨーロッパ特許出願明細書にはメジェイタとしての化合物の次の分類のもの の使用が記載されているニーおよびその誘導体、および メタロセン。

金属硼素化合物は、一般に多くの文献に記載されており、本明細書の目的に特に 好ましい１つの文献はゲイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）〔エレクトロケミストリー　オ ブ　メタロボロム　ゲージ化合物〕である。この文献はメタロセン、特にフェロ センの有する遷移金属を含む、炭素−硼素化合物の電気化学と比較および対照し ている。またこの文献にはペンおよびインク記録計に対して適当な掃引速度を有 するサイクリックポルタンメトリー試験について記載されているが、しかしメジ ェイタ化学について考察されていない。

本発明は他の分類のメジェイタの特定使用を見出した。

本発明においては、電子移動電極と使用する炭素および硼素を含有するメジエイ タ化合物を提供する。

一般に、メジエイタ化合物はメタロカルボランである。

一般に、メタロカルボランは多くのメタロセン類似物より大きい熱安定性および 耐薬品性を有している。特にメタロカルボランは広範囲にわたる測定すべき電気 化学ポテンシャルに適応最近、カルボランの命名法は数回にわたって変えられて いる。

意図する体系的な命名システムが存在するけれども、混同するのを避けるために 本明細書において用いる命名法は多くの文献に見出される命名法を用いることに する。

好ましくは、次のメタロカルボランおよび錯イオンを用いることができるニー １　（ａ）　ｄ３．ｄ’、ｄ’、ｄ７．ｄ”およびｄ９遷移金属イオンのビスジ カルボリル錯体（ｄｉｓｃａｒｂｏｌｌｙｌ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）これらの化 合物は［シメトリカル（ｓｙｍｅｔｒｉｃａｌ）サンドウィッチ」の普通配置、 「スリップド（ｓｌｉｐｐｅｄ）サンドウィッチ」の付加配置（Ｃｕ（ＩＩ）、 Ｃｕ　（ＩＩＩ）、Ｎｉ　（ＩＩ）、Ｐｄ　（ＩＩ）、Ａｕ　（Ｉ［）およびＡ ｕ（Ｉ！Ｉ）のｄ８およびｄ９錯体により見出される）、およびＮ１（ＴＶ）お よびＰｄ　（ＩＶ）のｄ６錯体において見出される「ジイソイド（ｃｉｓｏｉｄ ）サンドウィッチ」配置におけるＦｅ　（ＩＩ）、Ｆｅ　（ＩＩＩ）、Ｃ。

ｍ−およびｐ−フルオロフェニル、ｂ−フェニル、ｃ、ｃ’−ジビニルおよびＣ ，Ｃ’−）リメチレンの如きリガンド置換物を有するあまり知られていないビス ジヵルボリル錯体は本発明の範囲において用いることができる。

（ｂ）ジカルボリル　リガンドがメタロセンにおけるシクロペンタジェニル　リ ガンドと置換する混合錯体ジカルボリド　イオン（ｄｉｃａｒｂｏｌｉｄｅ　１ ｏｎ）およびシクロペンタジェニル　イオンを有する金属塩の処理において、多 くの場合においては相当するＭ（ｎ）錯体の空気酸化から生ずる中性Ｍ（ＩＩＩ ）錯体を生ずる。

このタイプの錯体はＦｅ　（ＩＩ）、Ｆｅ　（ＩＩＩ）、［Ｔｏ　（ＩＩＩ）、 Ｎｉ　（ｍ）およびＣｒ　（ＩＩＩ）のために作られている。Ｐｔ（ＩＩ）を含 む少なくとも１種の錯体が作られており、またＰｄ（ｎ）を含む少なくとも２種 の錯体が作られている。

（Ｃ）　ジカルバ力ナステッド　リガンド（ｄｉｃａｒｂａｃａｎａｓｔｉｄｅ ｌ　ｉｇａｎｄ）を含有する二座配位子および多座配位子錯体、および（ｄ）１ または２個以上のシクロペンタジェニル　リガンドを含有する三核および多核錯 体。

上述するメジエイタ化合物におけるように、これらの化合物は、酵素が触媒的に 作用する場合に、電荷を酵素または酵素錯体から電極表面に移動することができ る。

メジエイタ化合物との共同による電気化学挙動について、本出願人により研究さ れた酵素／基質対としては次のものを包含するニー 酵素　基質 フラビンタンパク質 ピルベートオキシダーゼ　ヘルヘート Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ　し−アミノ酸アルデヒド　オキシダーゼ　アルデヒ ドキサンチン　オキシダーゼ　キサンチングルコース　オキシダーゼ　グルコー スグリコレート軸１ｙｃｏｌｌａｔｅ） オキシダーゼ　グリコレート サルコシン　オキシダーゼ　サルコシンガラクトース　オキシダーゼ　ガラクト −スジアポラーゼ　ＮＡＤＨ グルタチオン　レダクターゼ　ＮＡＤＰＨＰＱＱ酵素 グルコースデヒドロゲナーゼ　グルコースメタノール　デヒドロゲナーゼ　メタ ノールおよび他のアルカノール メチルアミン　デヒドロゲナーゼ　メチルアミンチトクロームＢ−結合酵素 ラクテート　オキシダーゼ　ラクテート金属フラビン　タンパク質 一酸化炭素　−酸化炭素 酸化還元酵素 これらの酵素−基質対の多くは、当業者において明らがな測定条件に若干の制限 を与えて本発明のメジェイタと共同して用いることができる。これらの対のうち 、挙動を予期する測定範囲にわたって良く、好ましくは線状に応答するもっとも 精細に達成する酵素／基質対を用いるのが明らかに有利である。

本発明をより明らかに理解するために、本発明を例および添付図面を参照して説 明する。

第１図は本発明の範囲内における適当なメジェイタからなる化合物を示し、 第２図は本発明の方法に使用する実験セルを示し、第３図は西洋ワサビ　ペルオ キシダーゼの存在におけるカルボラン錯体のサイクリック　ポルタモグラ基を示 し、第４図は過酸化水素の存在におけるカルボラン錯体のサイクリック　ボルタ モダラムを示し、 第５図は燐酸塩緩衝液におけるカルボラン錯体のサイクリック　ボルタモダラム を示し、 第６図はカルボラン／西洋ワサビ　ペオキシダーゼに過酸化水素を添加する電流 ／時間応答過程を示し、および第７図はカルボラン／西洋ワサビ　ペルオキシダ ーゼ　システムについての検量グラフを示している。

例１　適当なメジエイタ 第１図は本発明の範囲内における適当なメジエイタからなる化合物を示している 。化合物の上記分類特定例を次に示す二側１　（ａ）Ｃ（１、２−ＢｓＣＪＩＩ ）Ｊｅ（ＩＩ）　〕またはクロムまたニッケル類似物、すなわち、第１ａ図に示 すタイプの化合物。

（（１、２−８３Ｃ２□Ｉ（１１）２Ｐｅ（ｎ）　）を使用する例としては電極 をデヒドロゲナーゼに結合するのに用いられ、特にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ）ｌ を使用する例のように補助因子再生を必要とする。この化合物は＋０．５９０ボ ルトにおいてフェロセンに匹敵する−０．１７４ボルトの低い還元電位を有して いる。

ニッケル（ＩＶ）ビスジカルボリル錯体は＋０．５００ボルトＥ’　Ｖｓ。

Ｎ、Ｈ，Ｅ（水素電極）に結合することができる。また、クロム類似物は電気化 学的活性および空気安定性であることから特別の用途を有している。

例１　（ｂ）　［（１、２−Ｂ、Ｃ２１１，）（ＣｓＨｓ）Ｆｅ　（Ｉｌｌｒ） 　］および次に示す一般的なタイプの他の化合物。

混合錯体［（１、２８＝ＣＪ、）（Ｆｅ（Ｉｎ）　］を使用する例としてはメジ エイタ化合物としてフラビンタンパク質、グルコ−スス　オキシダーゼ、ジアホ ラーゼおよびキノンタンパク質グルコース　デヒドロゲナーゼと使用する。

この化合物は、生理学的測定システムに存在する汚染物または付加物質からの干 渉を回避する助けをすることを示す＋０．１３９例１　（ｃ　）　Ｃ（１、２” Ｂ、Ｃ２１１，）Ｃｏ　（ＩＩ）（Ｂ、Ｃ２Ｈ，ａ）Ｃｏ　（ＩＩＩ）（１。

２−ＢｓＣＪｚ））　”−；すなわち、第１Ｃ図に示すタイプの化合物。

例１　（ｃｔ　）　ＣＤ　、　２−ＢｓＣＪｚ）ｚＰｅｚ（１）（ＣＯ）ｎ〕’ 　；すなわち、第１ｄ図に示すタイプの化合物。

同じ（（Ｃ）の場合のように）または異なる（（ｄ）の場合のように）原子番号 の１以上の金属イオンを含有する化合物は、特定酵素反応に対しメジエイタを細 く調整するのに用いることができる。

例２　混合錯体メジエイタ混合物の使用［（１、２−Ｂ３Ｃ２Ｈ１，）（Ｃ５Ｈ ５）Ｐｅ　（ＩＩＩ）　１　、すなわち、第１ｂ図に示すタイプの化合物。

Ｐｉ−シクロペンタジェニル−Ｐｉ−ジカルポリルー鉄錯体、ＣｐＦｅＣＪｓＨ Ｉ　＋を西洋ワサビ　ペルオキシダーゼと金電極との間のメジエイタについて研 究した。後述するシステムにおいて、過酸化水素は西洋ワサビ　ペルオキシダー ゼに対する基質として作用しくタイプｉｖ）　（シグマ）、後者は酸化中間体（ ｏｘｉｄｉｚｅｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）に転化する。

過酸化水素（アリスター　グレード（Ａｒｉｓｔａｒ　Ｇｒａｄｅ）　、３０％ Ｗ／Ｖ溶液）はＢＤＨ（ブリプッシュ　ドルグ　ハウセス（ＢｒｉｔｉｓｈＤｒ ｕｇ　Ｈｏｕｓｅｓ）から得、および強さ約１０−３モルの原料溶液を調製し沃 素還元滴定により測定した。

使用する前に、原料西洋ワサビ　ペルオキシダーゼの濃度をペイ　ユニカム（Ｐ ｙｅ　Ｕｎｉｃａｍ）ＳＦ３−２００１１ν／可視分光光度計および４０３ｍｍ で９．１９１０’Ｍ−’ｃｍ−’の分子吸光係数（口、ケイリンおよびＥ、　Ｆ 、ハルドリー氏ｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　Ｊ　１９５１．４９．８８−１０ ４）を用いて評価した。

ＤＣサイクリック　ポルタンメトリーを２区分ガラス　セル（第２図に示す）で 行った。このセルは白金ガーゼ対電極および標準カルメロ参照電極（５ＣＥ）並 びに全作用電極を有している。

作用電極は使用する前に、および各試験の間において約０．３ｍｍの粒度の水／ アルミナ　スリラーで研磨し、電極表面にコツトン　ウールを付着した。研磨後 、電極を蒸溜水で洗浄した。

ＤＣサイクリック　ポルタンメトリーのために、ブリアンス（Ｂｒｙａｎｓ）Ｘ 　−Ｙ２６０００　Ａ３チャート記録計をオックスフォート電極ポテンショスタ ットと組合せて使用した。電流一時間曲線をブリアンスＹ　−ｔ　２８０００記 録計で記録した。

脱イオン（ミリボア）蒸留水のアルゴン飽和不活性溶液を全体を通して使用した 。走査する電位の範囲を一２２０ｍｖ〜＋６０ｍＶにした。

カルボランはＨａｖｔｈｏｒｎｅ氏らにより報告された文献に記載された方法に よって作った（Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ、　Ｙｏｕｎｇ　、　Ａｎｄｒｅｗ　、　Ｈ ｏｗｅ。

Ｐｉｌｌｉｎｇ　、　Ｐｉｔｔｓ　、　Ｒｅ１ｎｔｊｅｓ、　Ｗａｒｒｅｎおよ びＷｅｇｎｅｎ氏「ジャーナル　オブ　ザ　アメリカン　ケミカル　ソサエティ ｊ　１９６８゜９０、８７９〜８９６）。

水における錯体の溶解度が欠乏するために、ｐＨ６，４３において０．０５モル 燐酸塩緩衝液で稀釈する前に音波処理により固体を少容量のライ−７２０（ポリ オキシエチレン　ソルビタン　モノラウレート）（シグマ）中に分散する必要が ある。

３つの試験を行った。この場合、セルにおける試薬の最初の濃度を次のようにし た； 西洋ワサビ　ペルオキシダーゼ　７°１０−６モル（（ａ）および（Ｃ）におい て） 過酸化水素　２°１０−４モル ツイーン２０　最終容量で約１％ すべての場合において、支持電解液をｐＨ６，４３に緩衝した。

０．０５モル燐酸塩溶液にした。メジエイタの濃度は測定しなかった。

例２（ａ） カルボラン、緩衝液および西洋ワサビ　ペルオキシダーゼ混合物を電気化学セル に入れた。酸素の存在しないアルゴンによる脱酸素により、サイクリック　ポル タモグラムを遅い走査速度（２ｍＶ／Ｓ）で得た。次いで、５μｌの過酸化水素 を注入し、走査を再開した。ポルタモグラムの明らかな変化がピークの消失によ り生じ、大きい接触電流（ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｃｕｒｒｅ口Ｓ）が還元電位に おいて流れた。サイクリック　ポルタモグラムを第３図に示す。

例２（ｂ） カルボラン、緩衝液および過酸化水素混合物を電気化学セルに入れ、酵素を注入 する以外は、上記例２（ａ）におけると同様に行った。結果を第４図に示すよう にポルタモグラムにおいて同じ効果が得られた。

例２（ｃ） 対照試験を、過酸化水素をカルボラン−緩衝液混合物に添加して行った（酵素は 測定混合物に存在させなかった）。第４図に示すように、ポルタモグラムにおけ る変化は観察できなかった。

例３ 基質（この場合、過酸化水素）の定量測定にカルボラン−西洋ワサビ　ペルオキ シダーゼを用いることについて説明するために、作用電極を一１３８ｍＶ　ｖｓ 　ＳＣＥの一定電位で平衡させ、システムの応答をカルボラン−酵素システムに 過酸化水素を添加して調整した。

電気化学セルにおける成分の最初の濃度は次に示すようにした： 西洋ワサビ　ペルオキシダーゼ　３”ｌＯ−’モル過酸化水素　１°１Ｏ−７〜 １°１０−６モル他の試験条件は上述するようにした。

第６図に示すタイプの電流対時間曲線を得た。このデータを２つの方法で処理し た。

第１において、接触電流を示すピーク高さを計算し、注入により添加した過酸化 水素の電位に対してプロットした。

第２において、通電する全電流を示す電流／時間曲線におおわれる面積を計算し 、過酸化水素濃度に対してプロットした。

上述する方法によって得た２つの校正曲線を第７図に示す。

本発明を特定のメジエイター酵素について、および特定の例について記載したけ れども、本発明は次の範囲にわたって適応することができる：　゛ （ａ）種々のメジエイタおよび酵素組合せを有する上述する電極。

ら）液体チャンバーを画成し、かかる電極および参照電極を設けたセル、 （Ｃ）かかるセルを有する装置、 （ｄ）カルボランを含有するメジエイター酵素の使用を含む測定方法、および （ｅ）化学結合したメジエイター酵素の組合せ、メジエイター酵素−抗体の組合 せ、 メジエイター酵素−抗原の組合せ、 またはメジエイタをカルボランまたはカルボラン誘導体にメジエイターＤＮＡの 組合る。

国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＥＡ　ｒＮＴＥＲＮＡ？ＺＯＮＡｆ、５ＥＡｊｌＣＨＲＥ ＰＯＲτＯＮ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．電子移動電極と組合せて使用する炭素および硼素を含有するメジエイタ化合 物。
2. ２．化合物をメタロカルボランとした請求の範囲第１項記載のメジエイタ。
3. ３．メジエイタをｄ３，ｄ５，ｄ６，ｄ７，ｄ８およびｄ９遷移金属イオンのビ スジカルボリル錯体からなる群から選択した請求の範囲第１または２項記載のメ ジエイタ。
4. ４．ジカルボリルリガンドをメタロセンにおけるシクロペンタジエニルリガンド と形式的に置換させた請求の範囲第２項記載のメジエイタ。
5. ５．メジエイタをジカルバカナステツドリガンドを含有する二座配位子または多 座配位子錯体とした請求の範囲第２項記載のメジエイタ。
6. ６．メジエイタを１または２個以上のシクロペンタジエニルリガンドを含有する 二核または多核錯体とした請求の範囲第２項記載のメジエイタ。
7. ７．化合物〔（１，２−Ｂ９Ｃ２Ｈ１１）２Ｆｅ（ＩＩ）〕またはクロムまたは ニツケル類似物からなる請求の範囲第３項記載のメジエイタ。
8. ８．化合物〔（１，２−Ｂ３Ｃ２Ｈ１１）（ＣｓＨ５）Ｆｅ（ＩＩＩ）〕からな る請求の範囲第４項記載のメジエイタ。
9. ９．化合物〔（１．２−Ｂ９Ｃ２Ｈ１１）Ｃｏ（ＩＩＩ）（Ｂ８Ｃ２Ｈ１０）Ｃ ｏ（ＩＩＩ）（１，２−Ｂ３Ｃ２Ｈ１１）〕２−からなる請求の範囲第５項請求 のメジエイタ。
10. １０．化合物〔（１．２−Ｂ９Ｃ２Ｈｌｌ）２Ｆｅ２（１）（ＣＯ）４〕２−か らなる請求の範囲第６項記載のメジエイタ。
11. １１．化合物ＣｐＦｅＣ２Ｂ９Ｈ１１からなる請求の範囲第６項記載のメエイタ 。
12. １２．酵素が触媒的に作用する時に、電荷を酵素とメジエイタとの間に移動でき るように酵素と関連させた特許請求の範囲第１項〜１１項のいずれか一つの項記 載のメジエイタ化合物。
13. １３．電気的導電性表面に関連させた請求の範囲第１２項記載のメジエイタ化合 物。
14. １４．西洋ワサビペルオキシダーゼを含む測定試薬とする請求の範囲第１１項記 載のメジエイタ。
15. １５．請求の範囲第１〜１１項のいずれか一つの項において請求するメジエイタ および酵素からなる測定試薬。
16. １６．請求の範囲第１〜１１項記載のいずれかの一つの項において請求するメジ エイタおよび電気的導電体からなり、電荷をメジエイタから電気的導電体に移動 できるように構成したことを特徴とする測定に用いる電極。