JPS6139036B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野 本発明はキシラン分解酵素系遺伝子を含有する
組み換え体プラスミド、それにより形質転換され
たEscherichia属菌およびこの菌を用いてキシラ
ン分解酵素を製造する方法に関する。 従来技術 農林産廃棄物の有効利用は省資源の意味からも
極めて重要である。この農林産廃棄物はセルロー
スと共にヘミセルロースを多量に含有している。
ヘミセルロースはキシラン、マンナンおよびガラ
クタン系多糖類で構成されるがキシランの含量が
特に多い。キシランを分解する酵素系を容易かつ
大量に入手しえれば、このキシランから甘味料を
生産したり、醗酵原料としての炭水化物として用
いたり、動物飼料に含まれるキシランを分解して
消化効率を上げたり、さらには果汁類や酒類のキ
シランに由来するにごりを清澄化させることが可
能となる。キシランから得られるキシロースを異
性化してキシルロースとし、これを酵母で発酵さ
せてエタノールを得ることもできる。キシランを
キシロースに分解するキシラン分解酵素を生産す
る微生物としては、アスペルギルス属などの糸状
菌やバチラス属などの細菌が知られているがいま
だ工業化されていない。 発明の目的 本発明の目的は、キシラン分解酵素系遺伝子を
有する組み換えプラスミドおよびこの組み換え体
プラスミドを導入したEscherichia属菌を提供す
ることにある。本発明の他の目的は、この組み換
え体プラスミドもしくはこれを導入した
Escheriehia属菌を使つてキシラン分解酵素を容
易かつ大量に生産する方法を提供することにあ
る。 発明の要旨 本発明の組み換え体プラスミドは、Bacillus
pumilusなどのBacillus属菌のキシラン分解酵素
系遺伝子DNAをEscherichia coliのベクタープラ
スミドpBR322に導入して得られ、これを
Escheriehia coli C600などのEseherichia属菌に
導入することによりキシラン分解酵素系遺伝子を
発現させ、そのことにより上記目的が達成され
る。組み換え体プラスミドに含まれる染色体
DNA断片はベクタープラスミドpBR322に対し方
向性を有する。特に染色体DNA上のβ−キシロ
シダーゼ遺伝子がキシラナーゼ遺伝子に関し
pBR322上のβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモー
ター側に位置するよう接続されたとき、その組み
換え体プラスミドで形質転換されたEscherichia
coliは高活性のβ−キシロシダーゼを生産しう
る。キシラナーゼについても同様である。また、
本発明のキシラン分解酵素の製造方法は、上記組
み換え体プラスミドを含有するEscherichia属菌
を培養しその菌体内もしくは培地中に蓄積される
キシラン分解酵素を採取することを包含し、その
ことにより上記目的が達成される。β−キシロシ
ダーゼおよびキシラナーゼの生産が親株Bacillus
pumilusでは誘導的であるのに対し、形質転換株
Escherichia coliでは構成的である。 本発明におけるBacillus pumilusのキシラン分
解酵素系遺伝子のEscheriehia coliへのクローニ
ングは次のようにして行われる： Bacillus pumilus IPOの対数増殖期の細胞か
らSaito−Miura法（K.Miura、Methods in
Engymology、vol.12A（L.Grossman and K.
Moldaveeds.）pp543、Academic Press、new
York（1967））により染色体DNAが調製される。
これを制限酵素Pst1で完全分解して２本鎖DNA
断片を得る。Pst1は（^{ＣＴＧＣＡＧ} _{ＧＡＣＧＴＣ}）の配
列のみ認識し
矢印の点で切断するため、このDNA断片は第１
図に示すような塩基配列を末端に有する。他方、
ベクタープラスミドpBR322は制限酵素pst1によ
りアンピシリン（Ap）耐性遺伝子上に１ケ所の
み切れる配列を有する。このベクタープラスミド
pBR322を切り直線状にする。次いで、アルカリ
フオスフアターゼで末端のリン酸を切り取る。こ
れにより後に加える修復酵素T4DNAリガーゼに
よりpBR322が元の環状DNAに戻るのを妨ぐ。次
いで、両DNAの末端はＡ／ＴやＧ／Ｃのペアー
を形成しうる配列を有しているため、染色体
DNA断片とpBR322との雑種DNAが形成される。
これを修復酵素T4−フアージのDNAリガーゼで
切れているリン酸結合をつなぐことにより目的の
組み換え体プラスミドを得る。これを、次いで、
あらかじめCaCl₂処理により外来DNAを受け入れ
やすくした宿主微生物のEscheriehia coli C600
へ入れる。組み換え体プラスミドpBR322のAp^r
中へ染色体DNAが入りこむため、Escherichia
coli C600はアンピシリン耐性遺伝子が分離され
てアンピシリン感受性（Ap^s）となる。pBR322
がもつもう一つのテトラサイクリン耐性遺伝子
（Tc^r）は生かされているため、Escherichia coli
C600はテトラサイクリン耐性（Tc^r）である。 Bacillus pumilus IPO由来のβ−キシロシダ
ーゼおよびキシラナーゼ遺伝子を発現する形質転
換株を選び出すために、AP^sでかつTc^rの
Escherichia coli C600のコロニーを選択し、そ
のうちでβ−キシロシダーゼおよびキシラナーゼ
遺伝子を有する株をスクリーニングする。 β−キシロシダーゼ遺伝子を持つEscherichia
coli C600の検索には、まず、上記Ap^s・Tc^rのコ
ロニーから１白金耳の細胞を取りそれをβ−キシ
ロシダーゼの基質のｐ−ニトロフエニル−β−Ｄ
−キシロシドと反応させる。β−キシロシダーゼ
活性があれば基質は分解されｐ−ニトロフエノー
ルになる。これは独特の黄色を呈するので肉眼観
察によりβ−キシロシダーゼを有する株を得るこ
とができる。キシラナーゼ遺伝子を持つ
Escherichia coli C600の検索には例えばラジオ
イムノアツセイ法が考えられるが本発明では、β
−キシロシダーゼを有する株が同時にキシラナー
ゼ遺伝子をも有していた。 このようにして本発明において得られた形質転
換株Escherichia coliは、β−キシロシダーゼ遺
伝子とキシラナーゼ遺伝子の両方を有している。
この形質転換株Escherichia coliから再びDNAプ
ラスミドを取り出しこれを種々の制限酵素で切断
することによりDNAプラスミド上のβ−キシロ
シダーゼ遺伝子とキシラナーゼ遺伝子の位置が推
定される。そして、β−キシロシダーゼ遺伝子は
pBR322上のβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモー
タの支配下に置くことにより、形質転換株Ｅ、
coli C600のβ−キシロシダーゼ活性を親株
Bacillus pumilus IPOのもつ活性の７倍に上げ
ることができる。キシラナーゼ遺伝子についても
同じくβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモータの位
置近くに配置することによりキシラナーゼ活性を
向上させることが可能となる。 形質転換株Escherichia coli C600の生産する
β−キシロシターゼおよびキシラナーゼはいづれ
も親株の生産するものと免疫的に同一である。 実施例 以下に本発明を実施例にもとづいて詳述する。 実施例 １ （組み換え体プラスミドの調製） 親株：本発明で用いる親株Bacillus pumilus
IPO（受託番号：微工研菌寄第6994号（FERM
Ｐ−6994））はタイ国の土壤より、キシラン分
解酵素高生産株として分離同定された。その同
定データは第１表に示される。この菌株は、こ
の同定データからR.E.Buchanan and N.E.
Gibbons、Bergey，ｓ Manual of
Determinative Bacteriology、8th Edition、
The Williams＆Wilkins Company、
Baltimore、1974によりBacillus pumilusと同
定された。この菌株はキシラナーゼおよびβ−
キシロシダーゼを包含するキシラン分解酵素遺
伝子を有する。キシラナーゼ（分子量約
21000）は細胞外に分泌されこれがキシランを
キシロオリゴ糖に加水分解する。このキシロオ
リゴ糖を細胞内酵素のβ−キシロシダーゼ（２
種類あるが、主酵素は分子量70000のサグユニ
ツト２個からなる）がキシロースに加水分解す
る。キシラナーゼはキシロースを生じず、β−
キシロシダーゼはキシランに作用しない。

【表】

【表】 染色体DNAの調製：100mlのLB培地（１％
バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエキ
ス、0.5％NaCl）にBacillus pumilus IPOを寒
天斜面から１白金耳植え一晩前培養を行う。次
いで、その20mlを１の同培地に植え、約３時
間培養し、得られた細胞を遠心分離にて集め
る。これをPH7.5の５ｍMEDTA／20ｍＭトリ
ス塩酸で２度洗う。洗浄細胞を50mlの同トリス
−EDTAに再度懸濁し、リゾチーム（Sigma社
製）を終濃度が１mg/mlになるように加え、30
℃で５分間保持する。次いで、硫酸ドデシルナ
トリウム（SDS）を0.5％（終濃度）加え約５
分間ゆつくり撹拌する。次いで、60℃で10分間
保ち溶菌させる。これに等容のフエノール
（0.05M Na₃PO₄で飽和）を加え、ゆつくりま
ぜながら均一なエマルジヨンにする。これを
10000＋ｇで15分の遠心にかける。水層を取り
再度同フエノールを加え抽出を行う。得た水層
に２倍容のエタノールを加え、生じた糸状沈澱
をガラス棒にまき取る。これを70％、80％およ
び90％のエタノールに順次つけ、洗つた後、デ
シケーターで乾燥する。これを0.1×SSC
（SSC：150ｍＭ NaClと15ｍＭクエン酸ナト
リウムでなる）に溶かす。これをRNase
（Sigma社製、DNase free）50μｇ/mlと共に
37℃で30分処理し、混入RNAを分解後上記処
法と同様にエタノール沈澱物を集める。最後に
0.1×SSCに溶かし0.1×SSCで透析して染色体
DNA標品を得る。 染色体DNA断片の調製：上で得た染色体
DNA100μ（８μｇ）を制限酵素pst（宝
酒造(株)製）の５倍濃度緩衝液（20ｍＭトリス塩
酸、10ｍＭ MgCl₂、50ｍＭ（NH₄）₂SO₄、100
μｇ/ml Bovine Serum Albumin、PH7.5）25
μおよびpst溶液５μと共に37℃で２時
間保持すると、pstによる染色体DNA断片が
得られる。 ベクタープラスミド：本発明で用いるベクタ
ープラスミドはpBR322である。このベクター
プラスミドは、分子量2.7×10⁶dalと小さいこ
と；アンピシリン耐性（Ap^r）とテトラサイク
リン耐性（Tc^r）という２つの選択マーカーを
もつこと；制限酵素EcoR、Hind、Bam
Ｈ、Sal、Pstによる切断個所が各１であ
ること；そして上記抗生物質耐性遺伝子内に外
来DNAが挿入されると耐性を失うこと；たと
えばPst切断点に挿入されるとAp^rの性質を
失い、BamH、Sal、Hind切断点に挿入
されるとTc^rの性質を失う、などの利点を有す
る。ベクタープラスミドpBR322はBethesda
Research Laboratories Inc.（米国メリーラン
ド州20877）から市販されているが、本実施例
ではE.coli C600株から取り出した。ベクター
プラスミドpBR322を得るために、まず、これ
を保持するE.coli C600株（世界中に分与され
ている公知の株であり、例えば大阪大学理学
部、工学部および産業科学研究所に保存されて
いる）を１のLB倍地（イーストエキス５
ｇ、バクトペプトン10ｇ、NaCl5ｇ、水１）
に50μｇ/mlのアンピシリンを加えた培地で37
℃で10⁹菌体／mlまで培養した。その培養液に
200μｇ/mlのクロラムフエニルコールを添加
し、さらに16時間培養した。遠心分離で得られ
た菌体からcleared lysate法（Y.Kuperstock
and Y.Helinski、Biochem.Biophys.Res.
Commun.、vol.54、PP1451（1973））により粗
プラスミド画分を得、BazaralとHelinskiの方
法（M.Bazaral and D.R.Helinski、J.Mol.
Biol.、vol.36、PP185（1968））によりC₅Cl−
エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離
（日立分離用超遠心80p、ローター65T、81000
×ｇ、40時間、20℃）で分画したプラスミド画
分をイソアミルアルコールでエチジウムブロマ
イドを抽出除去後、^１ _１０濃度のSSC（150ｍＭ
NaCl、15ｍＭクエン酸ナトリウム）に一晩透
析して精製プラスミドDNAを得た。 ベクタープラスミドpBR322の切断：上記精
製ベクタープラスミドDNA pBR322 120μ
（〜17μｇ DNA）を、５倍濃度の制限酵素
pst1緩衝液24μおよびPst溶液５μと37
℃にて２時間反応させる。反応後、PH8.0の25
ｍＭトリス塩酸で透析する。次いで、アルカリ
フオスフアターゼ（〜１ユニツト）（宝酒造(株)
製）を加え、65℃にて30分間反応させる。反応
後、前記染色体DNAのときと同様に、フエノ
ール抽出し、水層をエチルエーテル（１：
1v／ｖ）で３回抽出し、フエノールを除い
た。水層に残存するエーテルはデシケーター中
で飛ばし、0.1×SSCで透析してPstで切断さ
れ直線状になつた、アルカリフオスフアターゼ
処理pBR322を得た。 組み換え体プラスミドの調製：上記で得た
Pst切断染色体DNA100μ（〜５μｇ
DNA）と上記Pst切断されかつアルカリフオ
スフアターゼ処理されたpBR322 40μ（〜５
μDNA）を、1Mトリス５μと10ｍＭ
MgCl₂20μと13ｍＭ ATP15.4μと130ｍ
Ｍ DTT15.4μと0.1×SSC 4.2μと
T₄DNAリガーゼ（宝酒造(株)製）10ユニツトと
共に16℃にて一晩反応させ組み換え体プラスミ
ドを得た。 実施例 ２ （B.Pumilus IPOの染色体DNA上のキシラン分
解酵素系遺伝子の宿主微生物への導入） 宿主微生物：宿主微生物としてEscherichia
coli C600株（受託番号：微工研菌寄第6995号
（FERM Ｐ−6995））を用いた。その遺伝子型
はｒ_K ⁻、ｍ_K ⁻、thr−１、leu−６、thi−１、
sup E44、lac Ｙ、ton A21である。 宿主菌株の前処理：LB培地で一晩培養した
E.coli C600の培養液を同培地に２％植菌し、
２時間培養する。細胞を遠心分離で集め、100
ｍＭの冷却MgCl₂で遠心洗浄し、100ｍＭ
CaCl₂に懸濁する。次いで、０℃で20分間保
つ。そして、遠心で菌体を進め100ｍＭ
CaCl₂の15％グリセロール液に再懸濁し、−80
℃で凍結保存する。 宿主菌株への組み換え体プラスミドの導入：
前記組み換え体プラスミド180μをCaCl₂処
理された上記E.Coli C600株と共に０℃にて１
時間保持する。次いで、42℃に２分間おく。こ
れに10倍容のLB培地を添加し37℃で30分間静
置する。次いで、37℃にて90分間振とうする。
これをテトラサイクリン15μｇ/mlを含むLB寒
天平板に拡げ（200μ/plate）37℃で一晩培
養し、コロニーを得る。 組み換え体DNAプラスミドを有するE.coli形
質転換株の検索：組み換え体プラスミドを導入
され形質転換したE.coli C600株はAp感受性で
かつTc耐性を示す。それゆえ、上記Tc平板上
のコロニー（Tc^r）をAp（50μｇ/ml）および
Tc（15μｇ/ml）を含む同培地にレプリカし、
Ap・Tc平板で生えないものを組み換え体プラ
スミド保持株として選ぶ。 キシラン分解酵素系遺伝子を有するE.coli形
質転換株の検索：マイクロプレートの各ウエル
に１mg/mlのＰ−ニトロフエニル−β−Ｄ−キ
シロシド溶液（PH7.0の20ｍＭリン酸緩衝液を
100μ入れ、これに上記Ap^s・Tc^rコロニーの
各々を１白金耳加え、30℃でインキユベート
し、黄変するものを探す。これによりβ−キシ
ロシダーゼ活性を有する１株を選んだ。これを
100mlのLB培地（Tc含有）で一晩培養し得た
細胞を超音波破砕し、細胞抽出液を得た。この
抽出液についてβ−キシロシダーゼとキシラナ
ーゼを定量した結果、両酵素活性が認められ
た。β−キシロシダーゼでスクリーニングした
ものにキシラナーゼ遺伝子も含まれていたの
は、両遺伝子が近接していたためである。 β−キシロシダーゼおよびキシラナーゼ遺伝
子を含む組み換え体プラスミドpOXN29の同
定：上記形質転換株を液内培養しその細胞から
pBR322と同じ手法でプラスミドを調整する。
これを再度E.coli C600株に導入するとAp^s・
Tc^rの株は全てβ−キシロシダーゼ活性および
キシラナーゼ活性の両活性を有する。この組み
換え体プラスミドをpOXN29と命名する。第２
図は、pOXN29を種々の制限酵素で分解しアガ
ロース電気泳動後DNAをエチジウムプロマイ
ドで染色して得た制限酵素切断点のマツピング
である。DNAバンド（白く抜けている）の数
から各制限酵素の切断点の数が解る。バンドの
位置からそれぞれの分子量が解る。左端はλフ
アージDNAをHindで切つたもので、分子量
既知のマーカーである。第２図から明らかなよ
うに、BamHとKpmによる切断箇所は１ケ
所であるから、直線状になつたDNAの分子量
は10.4Mdalである。Pstでは7.7と2.7Mdalの
断片が生じる。pBR322の分子量が2.7Mdalで
あるから7.7Mdalは挿入染色体断片である。そ
の合計は10.4Mdalであり組み換え体プラスミ
ドpOXN29の分子量とよく一致する。それゆ
え、pOXN29は目的の組み換え体プラスミドで
あると確認される。なお、Sal、Bglおよび
Avaは２ケ所、EcoRは７ケ所（最小断片
0.09Mdalは第２図では見えない。）、Pvuおよ
びHindは８ケ所である。さらに、種々の酵
素を組み合わせて分解しその断片を解析するこ
とにより制限酵素の切断位置を決定することが
できる。第３図は組み換え体プラスミド
pOXN29の制限酵素切断地図である。pOXN29
はpBR322のPst部位に7.7Mdalの染色体DNA
が入つている。Ｂ、Ｋ、ＳおよびＰはそれぞれ
Bgl、Kpn、SalおよびPstによる切断
位置を示す。Ｘは制限酵素Xbaによる切断位
置を示す。 実施例 ３ （E.coli形質転換株によるキシラン分解酵素の
生産） E.coli形質転解株の培養条件：LB培地にテト
ラサイクリン15μｇ/mlを加えて調製した培地
１を３容坂口フラスコに入れこれにあらか
じめ斜面寒天培地で培養したE.coli形質転換株
を３白金耳植え、37℃にて一晩往復振とう培養
（120rpm）する。宿主菌株E.coli C600につい
ても同一条件で培養した。B.pumilus IPOにつ
いては、LB培地に１％キシロースを加えて調
製した培地１を同上のフラスコに入れこれに
斜面培地からB.pumilusの３白金耳を植菌し30
℃にて約40時間培養する。 第２表は各菌株のβ−キシロシダーゼとキシ
ラナーゼの活性を示す。第２表に示すように、
組み換え体プラスミドpOXN29を持たないE.
coli C600株はβ−キシロシダーゼ活性および
キシラナーゼ活性の両酵素活性を有しない。
pOXN29を保持するE.coli C600（pOXN29）
（受託番号：微工研菌寄第6996号（FERM Ｐ
−6996））はB.pumilusの約20％のβ−キシロ
シダーゼ活性を示す。キシラナーゼについては
Ｂ、pumilusは細胞外にそしてE.coliの
pOXN29保持株は細胞内に蓄積するため、両株
のキシラナーゼ活性を比較することはむづかし
いが培養液１ml当りで比較するとE.coli C600
（pOXN29）はB.pumilus IPOの約６％の活性
を示すようである。

【表】 キシラン分解酵素の生産形態：LB培地（１
％バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエ
キス、0.5％NaCl）に第３表に示すグリセロー
ル、マレート、キシロース、アラビノースなど
11種の炭素源0.1％を加えそのおのおのについ
て16時間培養を行い（B.pumilus IPOのキシナ
ラーゼのみ40時間）、酵素活性を測定した。第
３表に示すように、β−キシロシダーゼおよび
キシラナーゼはB.pumilusでは誘導的につくら
れE.coli C600（pOXN29）では構成的につく
られるB.pumilusではキシロース、キシロビオ
ース、キシランが誘導するがE.coli C600
（pOXN29）ではいずれも大差なく構成的であ
る。それゆえ、培養に際してインデユーサーを
必要としない。これはB.pumilusでは存在する
と思われる調節遺伝子が、ここでつくつたプラ
スミド上にないためであろう。遺伝子を単離す
ることにより脱感作されるということは遺伝子
操作で菌を変えることの利点である。

【表】 β−キシロシダーゼの精製：B.pumilus IPO
を100ジヤーフアーメンター（培地60）で
36時間培養し、得た細胞を連続遠心分離（シヤ
ープレス）で集め（260ｇのwet細胞）、１ｍＭ
EDTAを含む50ｍＭリン酸緩衝液で洗浄し
た。これを500mlの同緩衝液に懸濁し、Dyro
Mill（シンマルエンタープライズ）で破砕し
た。これを1000×ｇで20分間の遠心を行い細胞
抽出液400mlを調製した。次いで、細胞抽出液
の硫安濃度0.3〜0.5飽和で沈澱する画分を集め
緩衝液に溶解し透析した。このうちの半量（39
ml）を同緩衝液で平衝化したDEAE−セフアデ
ツクスＡ−50カラム（４×50cm）にかけ、０−
1M NaCl濃度勾配で溶出させた。活性画分は
0.3M NaCl付近に溶出した。活性画分（440
ml）を限外過（アミコン：UK50）で濃縮脱
塩した（64ml）。この濃縮液を再度同じDEAE
−セフアデツクスＡ−50にかけ溶出を０−
0.4M NaCl濃度勾配で行い活性区分を集めた。
これを濃縮脱塩し46mlとした。これをCM−セ
フアデツクスＣ−50カラム（４×30cm）にかけ
た。活性はEDTA−リン酸緩衝液溶出の非吸着
区分に回収された。これを同様の処法で6.7ml
に濃縮した。これをセフアデツクスＧ−200カ
ラム（2.5×100cm）でゲル過し活性画分を集
めた。2.7mlに濃縮したこの段階でβ−キシロ
シダーゼは単一たん白にまで精製された。この
β−キシロシダーゼ活性の測定は次のようにし
て行われた。１ｍＭ EDTAを含有するPH7.0
の50ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で１mg/mlの
濃度のｐ−ニトロフエニール−β−Ｄキシロピ
ラノシド（Koch Light Laboratories Ltd.、
Colnbrook Bucks）１mlと酵素液１mlとを37℃
で10分間反応させ、0.4M Na₂CO₃2mlの添加に
より反応を停止させた。生じたｐ−ニトロフエ
ノールを405nｍの吸収で測定した。１単位
（unit）は１分間に１μmolのｐ−ニトロフエノ
ールを生ずる酵素量である。 キシラナーゼの精製：B.pumilusの36時間培
養液を遠心して得られる上澄液２を0.2〜0.6
飽和の硫安で沈澱させる。この沈澱画分を遠心
分離で集め、PH6.5の50ｍＭリン酸緩衝液200ml
に溶かす。これを同緩衝液で透析する。生じた
沈澱は遠心で除去する。透析酵素液（210ml）
を同緩衝液で平衝化したDEAE−セフアデツク
スＡ−50カラム（３×50cm）にかけ、同緩衝液
で抽出すると、活性画分は非吸着区分に溶出す
る。活性画分（260ml）を、同緩衝液で平衡化
したCM−セフアデツクスＣ−50カラム（３×
50cm）にかけリン酸緩衝液中の０−0.3M NaCl
の濃度勾配で溶出する。活性は0.22M NaClで
溶出した。これは単一たん白に精製されてい
た。ポリアクリルアミド電気泳動、SDS−ポリ
アクリルアミド電気泳動および平衡密度超遠心
にてその純度を確認した。キシラナーゼ活性の
測定は次のようにして行われる。１mlの１％キ
シラン（Sigma製）溶液（PH6.5の50ｍＭリン
酸緩衝液）と0.5ml酵素溶液を40℃で10分間反
応させ、生成する還元糖をSomogyi法で定量す
る。１単位（unit）は、１分間に１μmolキシ
ロース相当の還元糖を生ずる酵素量である。 プラスミドpOXN29上のβ−キシロシダーゼ
遺伝子、キシラナーゼ遺伝子およびプロモータ
ー遺伝子の位置：第４図に示すように、数種の
プラスミド、pOXN29；pOXN29R（pOXN29
の染色体DNAの方向を逆にしたもの）；
pOXN291（pOXN29のBgl部位で狭まれた
DNAを除いたもの）；pOXN291R（pOXN291
のDNAを逆向きにしたもの）；pOXN391
（pOXN29のBgl断片（3.0〜6.7Mdal）を切り
出しこれをpBR322のTc遺伝子上のBamH部
位に組みこんだもの）；そしてpOXN391R
（pOXN391のDNAを逆向きにしたもの）を調製
した。調製法の一例を挙げれば、例えば、
pOXN29Rを調製するには、まず、pOXN29を
保持するE.coli C600（pOXN29）から前記ベ
クタープラスミドpBR322のの場合と同様な処
法によりプラスミドpOXN29を得る。これを同
じく制限酵素pstで分解しそのままT4DNAリ
ガーゼで接合し再度E.coli C600を形質転換さ
せる。これにより、染色体DNAのpBR322への
挿入方向が反対になつたプラスミドを有する
E.coli C600（pOXN29R）株が50％の確率で得
られることになる。形質転換したE.coli数株を
ランダムに選び再びそのプラスミドを抽出す
る。これを制限酵素EcoRで切断（EcoR用
緩衝液として100ｍＭトリス塩酸、50ｍＭ
NaCl、100ｍＭ MgCl₂、PH7.5を用いること以
外はすべてpBR322のPst切断と同じ）し、ア
ガロースゲル電気泳動によりDNA断片のサイ
ズを測定した結果、大きさが二種のパターンに
別れた。これにより挿入方を決定し、pOXN29
の染色体DNAが逆向きに入つたプラスミドを
pOXN29とした。 上記各々のプラスミドを有するE.coliの酵素
活性をも同時に第４図に示す。この活性値表示
は、pOXN29保持株の菌体たん白当りの活性値
を1.0としたときの種々のプラスミド保持株の
相対活性値である。図中の矢印はmRNAの読
みとり方向を示す。 pOXN29RとpOXN291Rとのβ−キシロシダ
ーゼ活性がいづれも元のpOXN29とpOXN291
の50倍まであり、そしてキシラナーゼ活性も
pOXN29Rでは元のpOXN29の４倍である。こ
れは、染色体DNA断片を逆向きにすることに
よりpBR322上のβ−ラクタマーゼ遺伝子のプ
ロモーター（p₃・p₁）からのmRNA合成がβ−
キシロシダーゼおよびキシラナーゼにおよんで
いるからである。本発明者らは、β−キシロシ
ダーゼ遺伝子の位置をpOXN29上０〜2.2Mdal
内にあると推定している。pOXN291R保持株
のβ−キシロシダーゼ活性は、親株B.pumilus
IPOの７倍にも相当する。 pOXN29Rではキシラナーゼ活性がpOXN29
のせいぜい４倍しか増大しないのは、
pOXN29R上でこの遺伝子がβ−キシロシダー
ゼの左側つまりプロモーターより遠い位置にあ
るからであろう。 pOXN291とpOXN291Rとについてはいづれ
もキシラナーゼ活性がないこと、そして
pOXN391とpOXN391Rとにキシラナーゼ活性
がありその活性はpOXN29およびpOXN29Rよ
りも高いことから、pOXN29の3.0〜6.7Mdalの
Bgl断片上にキシラナーゼ遺伝子があること
が明らかである。さらに、pOXN391のHind
断片欠失プラスミドを解析して、キシラナーゼ
遺伝子はpOXN29上の4.0〜4.8Mdal内にあるこ
とがわかつた。pOXN391はpOXN29Rの３倍の
キシラナーゼ活性を示す。これはプラスミドを
小型化したためにE.coli内でのコピー数が増大
したためと考えられる。このように必要最小限
の遺伝子をとり出し、それを強力なプロモータ
ー支配下に置くことにより活性は大巾に増大し
うる。強力なプロモーターとしては、例えばラ
クトースオペロンのプロモーターも利用可能で
ある。 プラスミド保持株E.coliのつくるβ−キシロ
シダーゼおよびキシラナーゼの免疫的証明：B.
pumilus IPOのβ−キシロシダーゼおよびキシ
ラナーゼ両酵素を純粋に精製し、これをウサギ
に注射して各々の抗血清を調製する。その調製
にはまず、精製酵素約２mgをFreund
Complete Adjuvantと等容混ぜ計３mlをエマ
ルジヨン化して後、３回に分けて１週間毎にウ
サギに皮下注射する。４週間目に全採血し、37
℃で１時間インキユベートし、次いで、これを
10000×ｇで10分間遠心する。その上澄みを粗
抗血清とした。 他方、ゲルをPH7.0の10ｍＭリン酸カリウム
緩衝液、150ｍＭ NaClおよび１％アガロース
（Sigma製タイプ）で作り、これに第５図ａ
に示すように、ウエルを設ける。このウエルの
中へ下段左からそれぞれ約50μの精製キシラ
ナーゼ（XN）、プラスミド保持株E.coli C600
（pOXN29）の細胞抽出液、そして精製β−キ
シロシダーゼ（XD）を入れる。同様に、上段
左からキシラナーゼの抗血清（Anti−XN）、そ
してβ−キシロシダーゼの抗血清（Anti−
XD）を入れる。４℃にて一晩おくと、Anti−
XNに対し、XNとE.coli抽出液は沈降線を作り
かつXNとE.coli抽出液との沈降線は交らず融
合する。Anti−XDに対しても、E.coli抽出液
とXDは融合する沈降性をつくる。E.coli抽出
液とAnti−XN間の線およびE.coli抽出液と
Anti−XDの間の線は図中中央付近で交差して
いる。以上の事実からE.coli C600
（pOXN29）株は親株B.pumilus IPOと同一の
酵素β−キシロシダーゼおよびキシラナーゼを
生産していると結論される。 第５図ｂは、形質転換株E.coli C600
（pOXN29R）（受託番号：微工研菌寄第6997号
（FERM Ｐ−6997））およびE.coli C600
（pOXN291R）のβ−キシロシダーゼの免疫試
験結果を示す。pOXN29RおよびpOXN291Rを
保持するこれらE.coliは、pOXN29および
pOXN291を保持するE.coliと同一のβ−キシロ
シダーゼを生産することがわかる。ここに図示
されていないがキシラナーゼについても同様に
実験を行つたところ、E.coli C600
（pOXN29R）株はE.coli C600（pOXN29）と
同一のキシラナーゼを生産することが確認され
た。 また、形質転換株E.coli C600（pOXN29）
のつくるβ−キシロシダーゼはB.pumilus IPO
のものと電気泳動的に同一であつた。 発明の効果 本発明により得られる組み換え体プラスミド
pOXN29およびpOXN29R、およびこれにより形
質転換されたE.coli C600（pOXN29）およびE.
coli C600（pOXN29R）は、キシランの分解に必
要なキシラナーゼとβ−キシロシダーゼの両遺伝
子を含有する。クローニングすべき遺伝子をベク
タープラスミドpBR322上のβ−ラクタマーゼ遺
伝子のプロモーターの近傍に導入することにより
酵素活性を増大させることができる。さらに、必
要最小限の遺伝子のみを取り出して強力なプロモ
ーターと連結することによりコピー数を増大させ
生産性を上げ、それにより両酵素活性を増大させ
ることができる。有力プロモーターを複数個直列
につなぐことにより酵素生産をさらに増大させる
ことも可能である。形質転換株は両酵素を構成的
に生産するため、培養が著しく容易かつ安価に行
なわれうる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の組み換え体プラスミドおよび
これを保持する形質転換株の調製を説明する模式
図、第２図は制限酵素処理した組み換え体プラス
ミドpOXN29のアガロース電気泳動分析による制
限酵素切断点のマツピング、第３図はpOXN29の
制限酵素切断地図、第４図はプラスミド
pOXN29、pOXN29R、pOXN291、pOXN291R、
pOXN391およびpOXN391Rの制限酵素切断地
図、第５図ａはE.coli C600（pOXN29）の生産
するキシラン分解酵素と親株B.pumilus IPOの生
産するキシラン分解酵素との免疫的同一性を示す
図、第５図ｂはE.coli C600（pOXN29）および
E.coli C600（pOXN291）の生産するβ−キシロ
シダーゼとE.coli C600（pOXN29R）およびE.
coli C600（pOXN291R）の生産するβ−キシロ
シダーゼとがそれぞれ免疫的に同一であることを
示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Bacillus pumilus IPO由来のキシラン分解
   酵素系遺伝子DNAをベクタープラスミドpBR322
   に連結した組み換え体プラスミドであつて、該キ
   シラン分解酵素系遺伝子が制限酵素Pst Ｉ切断で
   生じた分子量7.7Mdalの染色体断片内にあること
   を特徴とする組み換え体プラスミド。 ２ 前記キシラン分解酵素系遺伝子がキシラナー
   ゼ遺伝子とβ−キシロシダーゼ遺伝子とを含有す
   る前記特許請求の範囲第１項に記載の組み換え体
   プラスミド。 ３ 前記キシラナーゼ遺伝子がベクタープラスミ
   ドpBR322上のβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモ
   ーター側に位置する前記特許請求の範囲第２項に
   記載の組み換え体プラスミド。 ４ 前記β−キシロシダーゼ遺伝子がベクタープ
   ラスミドpBR322上のβ−ラクタマーゼ遺伝子の
   プロモーター側に位置する前記特許請求の範囲第
   ２項に記載の組み換え体プラスミド。 ５ Bacillus pumilus IPO由来のキシラン分解
   酵素系遺伝子DNAをベクタープラスミドpBR322
   に連結した組み換え体プラスミドで形質転換され
   たEscherichia属に属する微生物であつて、該キ
   シラン分解酵素系遺伝子が制限酵素Pst Ｉ切断で
   生じた分子量7.7Mdalの染色体断片内にあること
   を特徴とする微生物。 ６ 前記キシラン分解酵素系遺伝子がキシラナー
   ゼ遺伝子とβ−キシロシダーゼ遺伝子とを含有す
   る前記特許請求の範囲第５項に記載の微生物。 ７ 前記キシラナーゼ遺伝子がベクタープラスミ
   ドpBR322上のβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモ
   ーター側に位置する前記特許請求の範囲第６項に
   記載の微生物。 ８ 前記β−キシロシダーゼ遺伝子がベクタープ
   ラスミドpBR322上のβ−ラクタマーゼ遺伝子の
   プロモーター側に位置する前記特許請求の範囲第
   ６項に記載の微生物。 ９ 前記キシラン分解酵素を構成的に生産する前
   記特許請求の範囲第５項に記載の微生物。