KR100341451B1 - 루미노코쿠스알부스유래의베타-글루코시다제유전자 - Google Patents

루미노코쿠스알부스유래의베타-글루코시다제유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 루미노코쿠스 알부스(Ruminococcus albus) 유래의 베타-글루코시다제 유전자의 염기서열을 결정하고 이를 도입하여 구축한 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 유전공학 기법을 이용하여 베타-글루코시다제 효소를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 루미노코쿠스 알부스의 염색체 DNA를 제한효소로 절단하여 DNA 라이브러리를 제조한 후 이 DNA 라이브러리로부터 얻은 적정 크기의 DNA 단편을 pUC19 벡터에 삽입하고 이 벡터로 대장균을 형질전환시킨 후 배양하여 베타-글루코시다제 유전자를 클로닝하고 상기 클로닝한 베타-글루코시다제 유전자를 지닌E.coli형질전환체를 선별한 다음 배양하고 이 배양액의 베타-글루코시다제 효소 활성을 측정하여 베타-글루코시다제 효소 발현을 확인하므로써 루미노코쿠스 알부스의 베타-글루코시다제 유전자가 도입되어 형질전환된 대장균 배양에 의해 베타-글루코시다제 효소를 대량 생산할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

루미노코쿠스 알부스 유래의 베타-글루코시다제 유전자를 도입하여 구축한 제조합 벡터 및 이를 이용한 형질전환체
본 발명은 루미노코쿠스 알부스(Ruminococcus albus) 유래의 베타-글루코시다제 유전자를 도입하여 구축한 재조합 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 베타-글루코시다제 유전자의 염기서열을 분석하고 이를 도입하여 구축한 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하여 베타-글루코시다제 효소를대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
자연계 탄수화물의 68% 이상을 차지하고 있는 섬유소(Cellulose)는 지구상에 약 7천억톤 정도가 존재하고 있으며 매년 4백억톤 정도가 새롭게 생합성되고 있다. 섬유소는 베타-1,4 결합에 의해 글루코스가 계속 연결된 형태의 물질인데 이러한 섬유소의 이용은 전통적으로 화학적, 효소적 분해에 대해 비교적 안정한 천연상태를 직접 펄프, 건축재, 의류, 연료로 이용하였으나 최근에는 섬유소가 화석자원과는 달리 계속 축적되는 탄소원이라는 점에서 이를 효율적으로 이용하여 대체에너지 및 식량자원으로 이용하려는 연구가 전세계적으로 활발히 진행중에 있으며 섬유소를 효소적으로 가수분해에 의하여 글루코스나 그밖의 다른 물질로 전환시키려는 연구가 관심의 초점이 되고 있다. 그렇지만 섬유소의 효율적인 이용을 저해하는 여러 가지 제약으로 인하여 그 이용은 일부분에 그치고 있는 실정이다. 효율적인 섬유소 이용의 문제점으로는 (1) 섬유소성 물질의 수집과 운송료가 비싸고, (2) 섬유소성 물질의 효소적인 가수분해가 미진하며, (3) 효소적 가수분해의 촉진을 위하여 값비싼 전처리비용, (4) 섬유소성 물질의 모든 구성물질이 효율적으로 이용되지 않으며, (5) 섬유소 분해효소의 생산비가 고가이며, (6) 많은 양의 효소가 필요하며, (7) 효소의 재사용이 거의 불가능하며, (8) 섬유소의 가수분해가 천천히 일어나며, (9) 가수분해가 완전하게 일어나지 않는다는 문제점들을 안고 있다. 이러한 문제점들을 해결하기 위해서는 최우선적으로 섬유소 분해효소의 효소활성이 강력한 유전자의 클로닝이 무엇보다도 시급하다. 그리고 섬유소 분해효소자체의 이용보다는 산업적으로 유용한 미생물에 섬유소 분해효소 유전자를 형질 전환함으로써 산업미생물이 섬유소로부터 유용한 물질을 생산하는 것이 효과적인 방안일 것이다.
한편, 섬유소 분해효소의 활성은 단일효소에 의하여 나타나지 않고 몇몇 효소가 복합체 형태로 존재하여 상호협력적으로 섬유소를 분해한다(Eveleigh, in Cellulase : a perspective. Phil. Traans. Roy. Soc. Lond.A321, 435, 1987 ; Lamed와 Bayer, Adv. Appl. Microbiology33, 1, 1988; Lamed 등, J. Bacteriol.169, 3792, 1987). 섬유소 분해효소는 일반적으로 생산되는 미생물의 종류에 따라 다소간의 차이가 있으나 대부분의 경우 엔도글루카나제(endoglucanase, endocellulase EC 3.2.1.4) 엑소글루카나제(exoglucanase, exocellulase EC 3.2.1.91) 및 베타-글루코시다제(β-glucosidase, cellobiase EC 3.2.1.21)로 구성되어 있는 효소복합체로써 글루코스를 얻기 위해서는 이들 3가지 종류의 효소가 모두 필요하다.
섬유소 효소복합체가 섬유소를 분해하는 기전을 보면, 엔도글루카나제는 섬유소를 무작위로 공격하여 섬유소의 길이를 감소시키고, 엑소글루카나제가 섬유소를 더 작은 단위로 분해하기 용이한 형태로 변화시키며 이때 생성되는 분해산물은 셀로바이오스(Cellobiose)이다. 또 베타-글루코시다제는 파라-니트로페닐 베타-디-글루코피라노사이드(p-nitrophenyl β-D-glucoside, PNPG)와 셀로바이오스 및 중합률이 낮은 수용성의 셀로-올리고사카라이드(cello-oligosaccharide)로부터 글루코스를 생산한다. 그런데, 셀루바이오스에 의하여 엔도글루카나제와 엑소글루카나제시다제의 높은 활성이 요구된다.
따라서 본 발명의 목적은 루미노코쿠스 알부스(Ruminococcus albus) 유래의 베타-글루코시다제 유전자를 함유하고 있는 발현벡터 및 그 형질전환체를 배양하여 베타-글루코시다제 효소를 대량 생산함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 루미노코쿠스 알부스 유래의 베타-글루코시다제 유전자의 염기서열을 결정하여 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 루미노코쿠스 알부스의 염색체 DNA를 제한효소로 절단하여 DNA 라이브러리를 제조한 후 이 DNA 라이브러리로부터 얻은 적정 크기의 DNA 단편을 pUC19 벡터에 삽입하고 이 벡터로 대장균을 형질전환시킨 후 배양하여 베타-글루코시다제 유전자를 클로닝하고 상기 베타-글루코시다제 유전자를 지닌E.coli형질전환체를 선별한 다음 배양하고 이 배양액의 베타-글루코시다제 효소 활성을 측정하여 베타-글루코시다제 효소 발현을 확인하고 루미노코쿠스 알부스 (ATCC 27210) 균주와 베타-글루코시다제 유전자가 도입된 형질전환체가 생산하는 각각의 효소활성을 측정하여 비교하므로써 달성하였다.
이하 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다.
도 1a 및 2b는 루미노코쿠스 알부스(Ruminococcus albus)로부터 유래한 베타-클루코시다제 유전자의 염기서열이다.
도 2는 대장균 발현 벡터로의 베타-글루코시다제 유전자 클로닝 과정을 도식화한 그림이다.
도 3은 루미노코쿠스 알부스 유래의 베타-글루코시다제 유전자가 함유된 재조합 대장균이 고체 LB 배지상에 존재하는 기질(X-glu)을 분해하여 파란색 균체를 형성한 그림이며, 베타-글루코시다제 효소가 발현된다는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 클로닝한 베타-글루코시다제 유전자의 제한효소지도이다.
본 발명은 혐기성 반추미생물의 루미노코쿠스 알부스(ATCC 27210)를 10mL의 디호리티의 인공배지(Scott Dehority, J. Bacteriol. 89, 1965)에 접종하여 혐기적 상태하에서 배양하여 서브컬쳐한 후 서브컬쳐 1L의 디호리티 인공배지에 재차 접종하고 37℃에서 36시간정도 혐기적 상태로 정치배양한 다음 이들 균체로부터 염색체 DNA롤 분리하고 제한효소처리하여 유전자 라이브러리를 제조하는 단계; 상기 제조한 라이브러리를 제한효소Sau3AI으로 부분 절단하고 10 ~ 40% 수크로스 그레디언트원심분리(20℃, 25,000 rpm, 24 hours)하여 2 ~ 8kb 정도의 DNA 단편을 수집하는 단계; 상기 DNA 단편(0.3㎍)을BamHI으로 절단한 후 CIP 처리된 pUC19 벡터 DNA(0.1㎍)와 함께 마이크로퓨지 튜브에 넣고 혼합한 후 이차 증류수로 총부피가 7.5㎕가 되게한 다음 10 × 박테리오파지 T4DNA 리가제 완충용액 1㎕(200mM Tris-Cl, pH 7.6, 50mM MgCl250mM dithiothreitol, 500 ㎍/mL 소혈청 알부민)와 박테리로파지 T4 DNA 리가제 0.1 단위와 5mM ATP 1㎕를 첨가하여 혼합한 후 16℃에서 4시간 이상 반응시켜 재조합 벡터를 제작하고 이 벡터를 대장균에 도입하여 형질전환시키고 배양하여 유전자 클로닝하는 단계: 상기 클로닝된 유전자가 도입된E.coli형질전환체를 배양한 후 베타-글루코시다제 효소활성을 측정하여 상기 유전자가 베타-글루코시다제를 암호화하는 유전자임을 확인하고 제한효소지도를 작성하는 단계 및; 루미노코쿠스 알부스(ATCC 27210) 균주와 베타-글루코시다제 유전자가 도입되어 형질전환된 형질전환체를 각각 배양하여 얻은 효소액의 효소활성을 측정비교하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 유전자 클로닝을 위하여 사용한 벡터는 pUC19로 제한효소BamHI으로 절단한 후 송아지 장 포스파타제(calf intestine phosphatase, CIP)를 처리하여 얻은 효소액의 효소활성을 측정 비교하여 본 발명 형질전환의 베타-글루코시다제 효소 발현 및 활성을 확인하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 유전자 클로닝을 위하여 사용한 벡터는 pUC19로, 제한효소 BamHI으로 절단한 후 송아지 장 포스파타제(calf intestine phosphatase, CIP)를 처리하여 사용하였고, 형질전환을 위한 균주로는E.coliDH5α를 사용하였으나 기타의 E.coli 균주도 가능하며, 컴피턴드 세포를 만들기 위해서는 CaCl2방법을 사용하였다. 또 유전자 클로닝 단계에서 형질전환시킨E.coli중에서 외부 DNA의 삽입여부를 확인하기 위하여 알파-콤플리멘테이션(α-complimentation)을 이용한 선별방법을 사용하였다. 즉, mL당 50㎍의 엠피실린이 첨가된 LB 고체배지에 40㎕의 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)용액(20㎎/mL in dimet-hylformamide)과 4㎕의 IPTG(200㎎/mL) 용액을 도포하였다. 이렇게 만든 고체배지위에 150㎕의 형질전환체를 스프레딩한 후 37℃에서 12 ~ 16시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 후 고체배지를 수시간동안 4℃에 보관하여 콜로니 색의 변화를 더욱 뚜렷하게 하였다. 벡터만을 갖는 콜로니는 파란색을 나타내지만 재조합 DNA를 가지고 있는 형질전환체 콜로니는E.coli본래의 색인 흰색을 나타낸다. 알파-콤플리멘테이션 방법을 사용하여 선별된 흰색의 콜로니는 베타-글루코시다제 유전자의 함유 여부를 확인하기 위한 2차 선별작업에 사용하였다. 이어서 행해지는 2차 선별작업은 베타-글루코시다제 유전자를 가진E.coli형질전환체를 선별하기 위하여 먼저 mL 당 50㎍의 앰피실린이 첨가된 LB 고체배지에 40㎕의 X-glu(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 용액(20mg/mL in dimethylformamide)을 도포한 후 1차 선별과정에서 선별된 흰색 콜로니를 X-glu를 도포한 고체 LB 배지에 접종하여 파란색을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 이렇게 선별된 미생물군이 베타-글루코시다제 효소를 발현시키는지의 여부를 확인하기 위하여 다시 액체 LB배지에 접종하여 37℃에서12시간 정도 진탕하면서 배양하여 베타-글루코시다제 효소활성을 조사하여 베타-글루코시다제 유전자의 클로닝 유무를 확인하였다. 클로닝된 베타-글루코시다제 유전자의 제한효소지도를 작성하기 위하여 베타-글루코시다제 유전자를 함유한 재조합 플라스미드를 분리한 다음 약 20여 종류의 제한효소를 이용하여 삽입 DNA의 길이와 제한효소 결단부위를 확인하여 제한효소지도를 작성하였다. 그리고 베타-글루코시다제 유전자에 의하여 발현된 베타-글루코시다제효소가 이용하는 기질을 규명하기 위하여 셀로바이오스, PNPC(P-nitrophenol cellobioside), 카르복시메틸셀룰로스(carboxymethylcellulose)를 기질로 사용하여 기질로의 이용유무를 조사하였다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니며 아래의 실시예에서 사용된 실험방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예에 따라 실시하였다.
참조예 1: 제한효소의 DNA의 절단
사용된 제한효소의 반응 완충용액은 코스코 바이오텍사(KOSCO Biotech Co., Korea)로부터 구매하였으며, 멸균된 1.5mL 마이크로퓨지 튜브에서 보통 반응부피가 10㎕에서 100㎕가 되도록 하였으며 반응온도는 37℃에서 1시간 내지 2시간 반응시켰고, 반응이 완료된 후에는 65℃에서 15분간 열처리하였다. 10배 완충액 조성은 다음과 같다.
10배 완충용액 A: 6mM트리스-HCl, 6mM NaCl, 6mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.5
10배 완충용액 B: 6mM트리스-HCl, 50mM NaCl, 6mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.5
10배 완충용액 C: 10mM트리스-HCl, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.9
10배 완충용액 D: 6mM트리스-HCl, 150mM NaCl, 6mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.9
EcoRI을 위한 10배 완충용액: 100mM 트리스-HCl, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, pH 7.5
SamI을 위한 10배 완충용액: 10mM 트리스-HCl, 50mM KCl, 7mM MgCl2, pH 7.5
참조예 2: 페놀추출과 에탄올 침전
페놀추출은 효소반응이 완료된 후 효소를 불활성시키거나, 헥산을 추출할 때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA 용액으로 포화시켰다. 페놀추출은 시료와 페놀을 1:1(v:v)의 비율은 섞은 후 강하게 흔들어 혼합시킨 후 원심분리(15,000g, 5min)시켜 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 동일부피의 페놀-클로로포름 용액(페놀과 클로로포름의 비율이 1:1(v/v)인 용액)을 첨가하여 추출한 후 상층액을 새로운 튜브에 옮긴다. 이 상층액의 0.1부피의 3M 나트륨 아세테이트와 2부피의 에탄올(-20℃)을 가하고 -20℃에서 12시간정도 정치한 후 원심분리(15,000g, 20min, 4℃)하여 핵산을 침전시켰다.
참조예 3: 접합반응
접합효소는 T4DNA 접합효소(T4DNA 리가제, KOSCO Biotech Co)와 10배 접합 완충용액(0.5M 트리스-HCl(pH 7.8) 0.1M MgCl2, 0.2M DTT, 10mM ATP)을 사용하였으며 보통 10㎕ 부피에 100단위체의 접합효소를 사용하였으며 평찰말단(blunt end)를 갖는DNA 접합은 1,000 단위체의 접합효소를 사용하였다. 반응조건은 15℃에서 12시간 이상 반응시켰다.
참조예 4: 대장균 형질전환
본 발명 대장균 숙주 세포로는 E.coli DH5α를 사용하였으나 기타의 대장균 균주도 가능하다. 숙주세포를 50mL의 액체배지(1% 박토트립톤, 0.5% 박토효모추출물, 1% NaCl)에 접종한 후 37℃에서 650nm에서의 광학밀도값이 0.25에서 0.5에 도달할 때 까지 배양한 후 얼음위에서 10분간 정치시킨 후 원심분리(4℃, 10mins, 3,000g)하여 세포들을 분리하고 10mL의 0.1M CaCl2용액을 첨가하여 얼음위에서 10분간 정치시킨 후 원심분리(3000g, 10분, 4℃)에 의하여 세포를 분리하고 2mL의 0.1M CaCl2를 첨가하여 균일하게 분산시켜 4℃에 보관시킨 후 24시간 후에 사용하였다. 형질전환은 위에서 얻은 200㎕세포에 접합 반응액 10㎕를 가하여 얼음위에서 1시간동안 정치시킨 후 42℃에서 90초간 열처리를 한 다음 0.8mL의 액체 LB 배지를 가하여 37℃에서 45분간 배양한 후 50㎍/mL의 앰피실린을 함유하고 있는 고체 LB 배지가 있는 페트리 디쉬(petri dish)에 도포한 후 37℃에서 밤새 배양하였다.
실시예 1: 혐기성 미생물인 루미노코쿠스 알부스로부터 염색체 DNA 추출
혐기성 미생물인 루미노코쿠스 알부스(ATCC 27210, 27211)를 10mL의 디호리티의 인공배지(Dehority's artificial medium)에 접종하여 혐기적 상태하에서 서브컬쳐로 이용하였다. 서브컬쳐를 1L의 디호리티의 인공배지에서 재차 접종한후 37℃에서 36시간 정도 혐기적 상태로 정치배양하였다. 이들 균체를 원심분리(4℃, 5,500 rpm,10min)하여 수집한 후 300mL의 샐라인-Tris용액 (0.15M NaCl, 0.1M EDTA, pH 8.0)에 2회 세척하고 40 mL의 샐라인-Tris 용액(0.1M NaCl, 10mM EDTA, 0.1M Tris-HCl, pH 9.0)에 용해하였다. 용해시킨 후 라이소자임을 1.8mg/mL의 농도로 첨가하여 37℃에서 10분동안 온화하게 흔들었다. 12mL의 Tris-SDS 용액 (5%(w/v)) SDS, 0.14M NaCl, 1mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 7.5)을 한방울씩 천천히 첨가한 후 60℃에서 20분동안 온화하게 흔들었다. 프로테이나제 K를 1mg/mL의 농도로 첨가한 후 3℃에서 3시간동안 정차시킨 후 페놀추출과 에탄올 침전에 의하여 염색체 DNA를 침전시킨 후 유리막대로 DNA를 건져서 70%(v/v) 에탄올 용액에 세척한 다음 30mL의 SSC 용액 (0.1M NaCl, 0.015M Na3citrate)에 용해시켰다. DNA가 용해된 SSC 용액에 30μL의 RNAase 용액 (50mg/mL)을 첨가하여 37℃에서 1시간동안 배양하여서 RNA를 제거한 후 다시 페놀 추출과 에탄올 침전을 시켰다. 유리막대로 침전된 DNA를 건져서 70%(v/v) 에탄올 용액에 세척하여 3mL의 TE 완충용액 (10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA)에 용해시킨 후 0.1배 TE 완충용액을 넣고 투석을 시켜서 순수한 염색체 DNA를 얻었다.
실시예 2: 베타-글루코시다제 유전자 염기서열 결정
상기 실시예 1에서 얻은 베타-글루코시다제의 순수한 염색체 DNA를 DNASIS 프로그램을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 실험결과, 루미노코쿠스 알부스의 β-클루코시다제의 유전자는 전기영동에 의해 약 3100bp로 나타났으나 본 실험결과 정확한 길이는 3225bp로 확인되었으며 이 3225bp의 유전자를 분석한 결과 430-2712bp 사이에 존재하는 전체 2282 bp의 오픈-리딩 프레임이 존재하며 추정되는 분자량은 760개의 아미노산으로 구성된 84,613Da이였다. 전체 유전자중에서 베타글루코시다제를 구성하고 있는 부위는 430-2709bp에 해당하는 총 2280bp이고 이부분의 염기구성은 A가 734개(32.1%), T가 601개(26.3%), G가 498개(21.8%), C가 447개(19.6%)였으며 또 총 760개로 구성되어 있는 베타글루코시다제의 아미노산 조성은 Ala 60개, Cys 12개, His 17개, Met 25개, Thr 26개, Arg 26개, Gln 20개, Ile 52개, Phe 31개, Trp 7개, Asn 37개, Glu 68개, Leu 65개, Pro 27개, Tyr 23개, Asp 52개, Gly 49개, Lys 54개, Ser 63개, Val 46개였다. 이 유전자의 프로모터 지역에 대한 -35 염기서열은 331-336부위에 존재하였고 -10 염기서열은 354-360bp 부위에 존재하며 전사 초기부위는 367bp 부위에 존재하였다.(도 1a 및 1b)
실시예 3 : 베타-글루코시다제 유전자의 클로닝
제 1공정: 유전자 라이브러리(gene library)의 제조
실시예 1에서 얻은 염색체 DNA 용액 70μL과 10배 완충용액 B 10μL, 이차증류수 19μL, 3단위의 제한효소Sau3AI을 혼합하여 8분동안 37℃에서 반응시킨 후 10분동안 열처리하여 제한효소를 불활성시켰다. 제한효소Sau3AI으로 부분절단되어 생성된 유전자 라이브러리로부터 2 ~ 8kb의 DNA 단편을 얻기 위하여 10 ~ 40% 수크로스 그레디언트 원심분리(20℃, 25,000rpm, 24 hours)한 후 400μL씩을 마이크로센트리퓨지 튜브에 받은 후 5M NaCl 용액을 30μL 첨가한 다음 2부피의 에탄올을 첨가 후 -20℃에서 12시간 이상 방치하였다. 4℃에서 20분동안 14,000 rpm으로 원심분리한 다음 70% 에탄올로 세척후 30μL의 TE 완충용액에 용해시켰다. 각 분획에서 1μL씩을 전기영동하여 2 ~ 8kb DNA 단편을 함유한 분획 3번과 4번을 선별하였다.
제 2공정: 클로닝을 위한 벡터의 준비
클로닝을 하기 위하여 사용한 벡터는 pUC19으로 제한효소Sau3AI의 절단부위와 동일한BamHI으로 절단하였다. 제한효소BamHI으로 절단한 pUC19 벡터 30μL (5μl), 이차증류수 103μL, 1M 트리스-HCl(pH 8.0) 15μL, 송아지 장 포스파타제(KOSCO Biotech Co) 2단위를 첨가하여 혼합하고 37℃에서 30분동안 배양한 후 페놀추출한 다음 동일 부피의 에테르 (증류수로 포화시킨 에테르)로 2회 추출하고 에탄올로 침전시킨 후 20μL TE 완충용액에 용해시켰다.
제 3공정: 유전자 클로닝
상기 Sau3aI으로 절단한 베타-글루코시다제 유전자를 pUC19 벡터에 클로닝하기 위해 도 2에 도시한 바와 같은 과정에 의거 상기에서 제조된 분획 3QJSER과 4번의 DNA를 각각 1μL,BamHI으로 절단한 pUC19 벡터 1μL, 10배 접합 완충용액 1μL, 이차 증류수 5μL, T4DNA 접합용액 1μL를 첨가혼합하여 15℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 반응종료후 참조예 4에서와 같이 대장균을 준비한 후 접합반응 용액 10μL와 200μL의 대장균 분산용액을 혼합하여 얼음 위에서 1시간동안 정치시킨 후 42℃에서 90초간 열처리를 한 다음 0.8mL의 액체 LB 배지를 가하여 37℃에서 45분동안 배양하였다. 형질전환시킨E.coli중에서 외부 DNA의 삽입여부를 확인하기 위하여 알파-콤플리멘테이션을 이용한 선별방법을 사용하였다. 먼저 mL당 50μg의 앰피실린이 첨가된 고체 LB 배지에 40μl의 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 용액 (20mg/mL in dimethyl formide)과 4μL의 IPTG (200mg/mL) 용액을 도포하였다. 이렇게 만든 고체 LB 배지위에 150μL의 형질전환시킨E.coli를 도말한 후 37℃에서 12-16시간 동안 배양하였다. pUC19 벡터만을 가지는 콜로니는 파란색을 나타내지만 벡터와 외부 DNA가 재조합된 경우는 콜로니가 흰색을 나타낸다(도 2참조). 알파-콤플리멘테이션 방법을 사용하여 선별된 흰색의 콜로니는 베타-글루코시다제 유전자의 함유여부를 확인하기 위하여 2차 선별작업에 사용하였다.
실시예 4 : 베타-글루코시다제 유전자를 지닌 E.coli 형질전환체의 선별 및 제한효소지도 작성
베타-글루코시다제 유전자를 가진E.coli형질 전환체를 선별하기 위하여 먼저 mL당 50μg의 앰피실린이 첨가된 고체 LB 배지에 40μL의 X-glu(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-gluco-pyranoside) 용액 (20mg/mL in dimethylformamide)을 도포한 후 1차 선별과정에서 선별된 흰색 콜로니를 X-glu를 도포한 고체 LB 배지에 접종하여 파란색을 나타내는 콜로니를 선별하였다(도 2 참조). 이렇게 선별된 미생물 군이 베타-글루코시다제 효소를 발현시키는지의 여부를 확인하기 위하여 다시 액체 LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 정도 진탕하면서 다음과 같이 효소활성을 측정하였다. 액체 LB 배지에서 배양한 배양용액을 초음파 처리하여(4℃, 4min, duty cycle 50%) 미생물을 파괴한 후 5500rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 효소액으로 이용하였다. 기질은 PNPG (P-nitrophenol glucopyranoside)로서 50mM 포타슘 포스페이트 완충용액(potassium phosphate buffer)에 1mL당 0.5mg의 농도로 용해시킨다. 효소액 1.5mL와 기질 0.5mL를 혼합한 후 37℃에서 10분동안 반응시킨 후 2%(w/v) Na2CO3용액 2mL를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 410nm에서 흡광도를 측정하고 표준물질로 파라-니트로페놀을 사용하였다. 베타-글루코시다제 효소활성을 조사하여 베타-글루코시다제 유전자의 클로닝 유무를 확인한 결과 총 5개의 파란색 클로니중 베타-글루코시다제 유전자를 함유하고 있는 콜로니는 1개임을 확인하였다. 제한효소 지도작성을 위하여 베타-글루코시다제 유전자를 함유한 형질 전환체로부터 재조합 플라즈미드 벡터 핵산 추출정제는 통상의 방법에 따라서 추출하였다. (Sambrook. 등, in mol. Cloing, Vol. 1.pp 1.25-1.28, Cold Spring Harbor LAB, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)). 추출한 재조합 플라즈미드 벡터를 각종 제한효소 (PEtI,SmaI,EcoRI,SphI,KpnI,SacI,XmaI,HindIII,BamHI,XbaI,SalI,AccI,ApaI,MluI 등)로 절단하여서 제한효소지도를 작성하였다
실시예 5 : 루미노코쿠스 알부스(ATCC 27210)과 베타-글루코시다제 유전자를 도입한 형질전환체의 효소활성비교
루미노코쿠스 알부스(ATCC 27210)을 1L의 디호리티의 인공배지에 접종한 후 37℃에서 36시간 정도 혐기성 상태로 정치배양하였다. 배양한 배양용액을 5500rpm에서 10분간 원심분리하여 균제를 수집한 후 50mM 포타슘 포스페이트 완충액 20mL에 분산시킨 후 초음파 처리에 의하여 (4℃, 4min, duty cycle 50%) 미생물을 파괴한 후 5500rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 효소액으로 이용하였다. 베타-글루코시다제 유전자를 도입한 E. coli 형질전환체는 1L의 액체 LB 배지(앰피실린50μg/mL)에 접종한 후 37℃에서 12시간 정도 진탕하면서 배양하였다. 배양한 배양용액을 5500rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 분리하여 균체를 수집한 후 50mM 포타슘 포스페이트 완충액 50mL에 분산시킨 후 초음파처리에 의하여 (4℃, 4min, duty cycle 50%) 미생물을 파괴한 후 5500ppm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 효소액으로 이용하였다. 기질은 PNPG(p-niprophenol glucopyranoside)로서 50mM 포타슘 포스페이트 완충용액에 1mL당 0.5mg의 농도로 용해시켰다. 효소액 1.5mL와 기질 0.5mL를 혼합한 후 37℃에서 10분동안 진창하면서 반응시킨 후 2%(w/v) Na2CO3용액 2mL를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 410nm에서 흡광도를 측정하고 표준물질로 파라-니트로페놀을 사용하였다. 효소활성 1 단위는 기질로부터 1분동안에 해리된 파라-니트로페놀 물질 1 μmole equivalent로 정의한다. 발현되는 베타-글루코시다제 효소활성은 루미노코쿠스 알부스(ATCC 27210)의 경우 0.0467 units/mg 단백질이었고, 베타-글루코시다제 유전자(도 4a, 4b, 4c 참조)가 도입된E.coli형질전환체 0.5mL를 혼합한 후 37℃에서 10분 동안 진창하면서 반응시킨 후용액 2mL를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 410nm에서 흡광도를 측정하고 표준물질로 파라-니트로페놀을 사용하였다. 효소활성 1 단위는 기질로부터 1분동안에 해리된 파라-니트로페놀 물질로 정의한다. 발현되는 베타-글루코시다제 효소활성은 루미노코쿠스 알부스 7의 경우 0.0467 units/mg 단백질이었고, 베타-글루코시다제 유전자 (도 1a 및 1b 참조)가 도입된 E.coli형질전환체인 경우 1.959 units/mg 단백질로 형질전환을 시켜서 베타-글루코시다제를 발현시킬 경우본래 균주가 가진 활성보다 41.95배 더 높아졌다.
상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 섬유소를 분해하는 베타-글루코시다제 효소를 암호화하는 베타-글루코시다제 유전자의 염기서열을 분석하고 이를 삽입한 재조합 벡터 및 이를 도입한 형질전환체Escherichia coliDH5α/pUC19를 제조한 결과, 상기 균주는 베타-글루코시다제 효소를 발현할 수 있고, 그 배양액은 베타-글루코시다제 효소활성이 우수한 뛰어난 효과가 있으므로 섬유소 분해를 필요로 하는 펄프, 건축재 의류 및 연료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

  1. 하기 서열의 베타-글루코시다제 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pBG1이 도입된 형질전환체(기탁번호 KCTC 8613P)를 배양함을 특징으로 하는 베타-글루코시다제의 생산방법.
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