JPS61249399A - ミクロペルオキシダーゼを用いる尿酸診断アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は診断アッセイに関しそして特に過酸化物を用い
そしてミクロペルオキシダーゼが試薬として酵素の代り
に有利に用いられる診断アッセイに関する。

〔従来の技術及びその欠点〕

試薬としての酵素の使用は現在広く認められており、特
に生物学的液体例えば血液の血清、血漿、全血液、尿、
を髄液、羊水中の樵々の関心がありしかも臨床上重要な
分析物の存在及び／又は濃度の臨床上の測定に認められ
ている。

本明細書では「酵素」は、約１０，０００ダルトンより
大きい分子量を有ししかも触媒活性を示すボＩＪＪプチ
ドとして定義される。一般に、２種の基本的なアプロー
チが、このような酵素アッセイに関する技術において用
いられてきた。

その一つでは、臨床上重要な前駆物質又は基質が酵素に
より検出しうる化合物又は検出されるシグナル例えば色
又はけい光に転換される。第二では、酵素それ自体は分
析物とカップルされて酵素活性が存在する分析物の度合
として求められる。しかしどのようなアプローチが用い
られても酵素試薬は一般に良好な安定性を有しそして容
易に入手されさらに当業者のいう「高いターンオーバー
数」を有することが要求される。さらに、酵素は、容易
に入手され比較的安定でありその上安価でありそして検
出しうる生成物又はシグナルを容易に生成する基質に関
して活性であることが望ましい。

前述した如きアッセイに通常用いられる酵素の代表例は
レドックス酵素、キナーゼ及びエステラーゼである。臨
床上の化学アッセイにおける酵素の従来の使用の一つの
例は尿Ｈのアッセイであり、そのやり方は、代表的には
セイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰＯ）を用いる。その分析において、尿酸
はウリカーゼ酵素とともにＨＲＰＯｆ用いて求められる
。代表的な臨床テストのサンプルは１ｄｌ当り約ＩＺＭ
ｇ＜、ｍ９／ｄｌ）以下の濃度で尿ｆＲを含み、このよ
うな定量では細菌ウリカーゼと接触して、尿酸を７ラン
トイン及び過酸化水素に転換する。形成された過酸化水
素は用いられてＨＲＰＯにより触媒化される色原体基質
を酸化し、その基質はサンプル中の尿酸の存在及び／又
は濃度の度合として色を発する。色の発生は次に肉眼に
より、分″ｊｔ、光度的に又は他の測定器により測定さ
れ、そしてその強度は、サンプル中の尿酸の量と相関す
る。

しかし、このような従来のアッセイにおけるＨＥＰＯ又
は他の酵素の便用は、問題がある。例えば％酵素例えば
ＨＲＰＯ及びウリカーゼの最適の活性のｐＨ値は全く異
り、それ故このようなアッセイにおいて有効に用いられ
ない。

ウリカーゼは高価な酵素であるので、このようなアッセ
イの反応条件は元来調節されてウリカーゼの最も有効な
使用を助け、このような調節は、次に急速な反応応答を
達成するために、高濃度のＨＲＰＯの使用を必要とＴる
。さらに、ＨＥＰＯは貯蔵中に活性を失うことが知られ
ており、それ故制限された貯蔵寿命を有する。

ＨＲＰＯの他の従来の使用はイムノアッセイにおける酵
素のラベルである。例えば、多数の周知の酵素イムノア
ッセイは、関心のある抗原を含むと思われるサンプルと
、不動化され、吸着され又は共有的にカップルされた抗
体（抗原に対して特異的）により被覆された又は含む固
相支持体とを接触させることを含む。インキュベーショ
ン及び固相の洗滌後、ＨＲＰＯによりラベルされた抗原
に対する特異性抗原よりなるコンジュゲートを加え、モ
して固相とともにインキュベーションされる。固相を再
び洗い、そしてコンジュゲートにより固相に結合するよ
うになったＨＲＰＯの活性を、通常分光光度計により、
色原体又は他の基質よりなる指示基質の添加により求め
られる。ＨＲＰＯと接触すると、もし色原体ならば、指
示薬は分Ｘ元度計により検出しうる色を発生する。分光
光度計の読みは、次に抗原の周知の濃度から得られた同
様な読みと相関させられ、それによりサンプル中の抗原
の濃度を求める。

セイヨウワサビ（ルオキシダーゼは、又前述のタイプの
酵素イムノアッセイにおいて不利である。例えば、抗体
−ＨＲＰＯコンジュゲートを生成するのに元来用いられ
ている、当業者に周知のカップリング条件は、抗体及び
ＨＲＰＯの両者を不活性化する傾向を有する。その上、
このようなカップリング条件は、通常それぞれの特定の
アッセイについて充分な精製及び注意深い最適化を必要
とする不均質な生成物を生成し勝ちである。又、生成さ
れたコンジュゲートは、その貯蔵寿命を制限する、貯蔵
中子安定になる顕著な傾向を有する。

〔発明の概要〕

本発明によれば、従来用いられている酵素の前述の不利
を克服する診断アッセイを行う方法が見い出された。こ
の方法を用いると、生物学的液体例えば血液の血清、全
血液、血漿、尿、骨髄液及び羊水などの中の種々の分析
物を測定するのに特別な利点を有する。本方法は、非酵
素的触媒とシテミク四ペルオキシダーゼを利用して、こ
のような定量に有利な安定性をもたらし、そして分析物
に急速な速度応答をもたらす酵素により有効に用いられ
る能力をもたらす。

好ましい態様では、本発明により改良される方法は、目
的とする分析物又はその誘導体を含むサンプルを、過酸
化的に活性な物質とペルオキシダーゼの存在下接触させ
て、過酸化物反応生成物を生成させることよりなり；反
応生成物は、それに対する検出しうる応答を生成しうる
基質の存在下、次にサンプル中の分析物の存在及び／又
は量の度合として求められつる。本発明の改良は、ペル
オキシダーゼとしてミクロペルオキシダーゼを用いるこ
とよりなる。

本発明の概念は、テストサンプル例えば血液の血清又は
血漿中の分析物の存在を測定する改良したアッセイにあ
り、その方法では過酸化的に活性な物質は、サンプル中
の分析物又はその誘導体と接触して、サンプル中の分析
物の存在及び／又は量の度合として求められつる反応生
成物を生成する。特に、本発明の方法の実施において、
ミクロペルオキシダーゼは、このようなアッセイの代表
的か例における従来用いられるＨＲＰＯ又は他の酵素に
対して同様に機能し、それ故ミクロペルオキシダーゼは
、このようなアッセイにおいてさもなければ用いられう
るこのような酵素と直接置換され、その上水明細書に記
載されるこのような酵素の使用よりも種々の利点を有す
ることが分った。

ミクロペルオキシダーゼは非酵素的触媒的な物質であり
、本発明によれば、前述の如き定量において過酸化活性
をもたらすことが分った。その上、ミクロペルオキシダ
ーゼがミクロペルオキシダーゼとともにアッセイに用い
られる酵素又は試薬（例えば尿酸アッセイにおけるウリ
カーゼ）の最適のｐＨ又はその付近で用いられるとき、
比較的高価なウリカーゼ又は他の酵素又は試薬の一層有
効な使用が達成されつる。さらに、中程度の濃度で、ミ
クロペルオキシダーゼの使用は、急速な反応応答をもた
らすことが分り、そしてミクロペルオキシダーゼは、又
臨床のアッセイ条件下で極めて安定なことが分った。そ
の上、ミクロペルオキシダーゼは、容易に抗原及び抗体
にカップルされて不均一そして均一のイムノアッセイシ
ステムに用いられる安定なコンジュゲートを有利にもた
らすことが分った。本発明によれば、ミクロペルオキシ
ダーゼは、又（ルオキシダーゼが従来用いられてきた非
イムノアッセイシステムにおいて有利な性能をもたらす
ことが分った。

当業者に周知の如く、ミクロペルオキシダーゼは、蛋白
質の酵素的開裂により生成されるチトクロームＣの７ラ
グメ／トである。このような開裂は、イプチドにチオエ
ーテル結合により共有的に結合したそのヘミ基とともに
、元のチトクロームＣアミノ酸鎖の小さな部分を残す。

ミクロペルオキシダーゼとして特徴付けられる化合物の
構造は一般に下記に示される。

種々のミクロペルオキシダーゼは、市販されており、本
発明の使用に適している。例えば、分子量１５０２のＭ
Ｐ−８と呼ばれるミクロペルオキシダーゼそしてそれぞ
れ分子量１６３０及び１８５７のミクロペルオキシダー
ゼＭＰ−９及びｙｐ−１１は、すべて適しておりさらに
本発明の使用に実質的に同等であって例えばシグマ・ケ
ミカル・カンパ＝−（Ｓｉｇｍｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏｍｐａｎ／ｌ）ら市販されている。

本発明によればミクロペルオキシダーゼは、尿酸アッセ
イにおいてＨＲＰＯの代りに用いられるのに特に適して
いる。下記に詳しく示されるように、本発明の好ましい
態様において、通常ｌｄｌ当り１２η（ｑ／　ｄｚ）以
下の濃度の尿酸を含む臨床テストサンプルは、酸化して
発色する１種以上の酸化される又は色原体の基質の存在
下ウリカーゼ酵素及ヒミクロペルオキシダーゼの混合物
と接触される。他の分析物と同じく尿酸の分析について
本発明で有用なこのような基質は、当業者に周知であり
、そして例えばＱ−７二二レンジアミン（ＯＰＤ）、Ｚ
　、　Ｚ’−アジノージ−（３−エチルペンゾチアジレ
ン硫酸）（ＡＢＴＳ）、３．３’。

５．５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４−ア
ミノアンチピリン（４ＡＡＰ）及び２−ヒドロキシ−３
，５−ジクロロベンゼンスルホン酸を含む。このような
化合物は、ミクロペルオキシダーゼの存在下過酸化物と
反応して、存在する過酸化物の置台として、そしてサン
プルに存在する尿酸の基準として、酸化による発色の如
き検出しうる応答を生じさせる。本発明の実施において
、このような発色は、好都合には従来の技術で測定され
、そして好ましくは従来の分析機器を用いて分−ｙｔ、
光度的に測定されてテストサンプル中の分析物の定量的
数値をもたらす。又、色の応答は、例えば、分析物の存
在のためのセミアッセイスクリーンテストとしてアッセ
イを用いることが望ましいときの如く、肉眼により測定
される。

さらに、例えばルミノール又はその異性体は、化学ルミ
ネセンス検出の基質として用いられるか、又は種々のけ
い光化合物例えばフルオレセ／又はその誘導体が、もし
所望ならば基質として用いられて、分析中のサンプルの
中の分析物の存在及び／又は量と相関される測定しうる
けい光厄答を生じさせる。

尿酸の測定に用いられるのに加えて、本発明によれば、
ミクロペルオキシダーゼは、又多数の他の化合物（主と
し。

てグルコース、コレステロール及びトリグリセリドを含
む）による、酵素的反応により形成された過酸化水素の
転換用の触媒ユニットとして用いられることは理解され
よう。従って、これらの化合物は、種々の周知の酵素及
び試薬の作用の下で過酸化水素を生じさせ、そして形成
された過酸化水素は、尿酸について前述したのと同様な
比色定量又は他のアッセイにおいて、ミクロペルオキシ
ダーゼを用いて測定される。

さらに、ミクロペルオキシダーゼは、本発明によれば、
抗体とカップルされてミクロペルオキシダーゼを含むコ
ンジュゲートを形成する。この技術の例は、抗原を含む
サンプルが、抗原に対する抗体によりコーティングされ
た固相例えばポリスチレンビーズと接触して、抗原がビ
ーズに不動化される方法である。インキユベーションと
ビーズの洗滌との後に、ミクロペルオキシダーゼにより
ラベルされた抗原に対する特異的抗体がビーズと接触し
、インキュベートされ、次に洗滌される。ミクロペルオ
キシダーゼの活性は、例えば前述の如き酸化しうる色原
体基質の使用により、サンプル中の抗原の濃度の度合と
して分光光度的に又は他の装置により測定される。

数多くの抗体は、ホモ及びヘテロニ官能性カップリング
試薬を用いて、ミクロペルオキシダーゼとカップルされ
る。

このような抗体は、例えば、カルジノ・エンブリオニッ
ク（Ｃａｒｃｉｎｏ　Ｅｍｂｒｙｏｎｔｃ）抗原（ＣＩ
Ａ）に対するモノクローナル抗体を含む。さらに、ミク
ロペルオキシダーゼは、又例えば均一イムノアッセイに
おける如き抗原のラベルにおける本発明で用いられ、そ
してミクロペルオキシダーゼは、従来の技術を用いて用
いられて、周知の技術に従って種々の他の抗体及び抗原
と同じく医薬品例えばテオフィリンをラベルする。

本発明によれば、ミクロペルオキシダーゼを用いるアッ
セイの感度は、重合体分子（例えばデキストラン又はポ
リアミノ酸を含む）へミクロペルオキシダーゼを共有的
にカップリングさせることにより、増大することが分っ
た。又、ミクロペルオキシダーゼは、それ自体カップル
される。このようなコンジュゲート及びマルチプルミク
ロペルオキシダーゼ分子は、次にカップルされて前述の
如くアッセイに用いられる。

〔実施例〕

本発明の基本的な概念を記述したが、下記に実施例を示
す。それらは本発明の詳細な説明であって、それを限定
するものではない。

実施例１、 本実施例は、置数アッセイにおける触媒としてのミクロ
ペルオキシダーゼの使用を説明する。試薬組成物は、下
記の如く処方される。

ミクロペルオキシダーゼ　　　　　　　１０■ウリカー
ゼ　　　　　　　　　　　　　２６０国際単位４−アミ
ノアンチピリン　　　　　　　２７０ｍ９２−ヒドロキ
シ−３，５−ジ−クロロ ベンゼンスルホン酸　　　　　　　　　１．３３ｇカリ
ウムフェロシアニド２．１■ エリスロマイシン　　　　　　　　　　　ＩＪｏ、１Ｍ
ボレート緩衝液（ｐＨｓ、ｚ）　　　９ＱＱｍ２５１１
１１）のグリセロールを次に加えそして追加の緩衝液を
加えて試薬溶液を１ノとした。

１２．５μノの血清のサンプルを１１の前述の試薬溶液
に加え、混合物を５分間３７℃でインキュベートした。

１２．５μ！の血清又はボレート緩衝液を１１の試薬に
加えそして５分間３７℃でインキュベートすることによ
りブランクを作った。５分間のインキュベーシヨン後、
５１５　ｎｒｎの吸収をブランクについて測定し、その
値をサンプルの吸収から引いた。尿酸の濃度の増大に対
する応答を下記の表に示す。

１０　　　　　　　　　０．０２５ ３０　　　　　　　　　０．０７６ ６０　　　　　　　　　０．１５５ ９０　　　　　　　　　０．２１５ １２０　　　　　　　　　０．２８５ 本発明のこれらのアッセイで用いられるとき、ミクロベ
ルオキシダーゼの発色の速度は、ミクロペルオキシダー
ゼよりむしろＨＲＰＯが用いられた従来のアッセイのそ
れらよりも、同量の尿酸について実質的により早いこと
が分った。本発明によりミクロペルオキシダーゼを用い
るアッセイにおいて、ミクロペルオキシダーゼの代りに
ＨＲＰＯを用いる本発明に従って行われた同様なアッセ
イにおける９〜１０分に比べて、発色は約２〜３分で最
大に達した。

さらに、ミクロペルオキシダーゼ及びＨＲＰＯの溶液が
８０℃で別々に加えられるとき、ＨＲＰＯが１時間以内
で完全に不活性化されるのに対して、ミクロペルオキシ
ダーゼは、その温度で３時間後もその元の活性の約９０
％を保持した。

実施例２゜ 本実施例は、ミクロペルオキシダーゼをラベルしり抗体
の製造を示す。

ミクロペルオキシダーゼ（１１，５＃７）をｐＨ６，８
の０．１Ｍホスフェート緩衝液２鱈に溶解し、そしてゲ
ルタールアルデヒドを加えて１．２５％とした。溶液を
１晩振とうし、生成物を０．１５Ｍ　ＮａＣ１中のバイ
オ・ゲル（Ｅｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ−２のクロマトグラフィ
にかけ、褐色の両分を集めた。

ゲルタールアルデヒド処理ミクロペルオキシダーゼの集
めた画分は、４ａ０２ｎｍの吸収分光度計により測定し
て、０．７１８〜／Ｉｌｔのａ度でミクロペルオキシダ
ーゼを含んだ。

カルジノ・エンブリオニック抗原（ＣＥＡ）に対するモ
ノクローナル抗体（２，１１１Ｗ）をｐＨ９，５の５０
ｍＭ炭酸ナトリ９ム／重炭酸ナトリウム緩衝液３ｄに溶
解した。

７００μＥの量のミクロペルオキシダーゼ溶液を次に抗
体溶液に加えて、混合物を１晩撹拌した。

次の朝、１００ｐＪの１０％グリシン溶液を加え、１時
間撹拌した。生成物を次に０．１５　Ｍ　ＮａＣ１中の
セフアゾ゛ックス（Ｓｇｐｈａｄａｚ　）　Ｇ　−５０
−４００１０マ’ｔ’１５フイにかけた。個々の両分を
吸収分光器により調べた。初めの３個の褐色画分を集め
、ｐＨ７，０の１０ｍＭホスフェート緩衝液により充分
に透析した。ミクロペルオキシダーゼ対抗体の比は、４
．８であった。

ラベルした抗体を１０ｍｕ＃’！う酸ナトリウムに投じ
て希釈し、次にｐＨ９，０の１０ｍＭ　＜えん酸ナトリ
ウムに投じて１０倍の希釈金した。１００μｊのこの溶
液に１０　ｐｇの１．３ｍＭルミノール溶液を加えた。

サンプルを、シグナル「カウント」（シグナル密度の相
対的指示をもたらす、度合の予め選択された個有の単位
）により示されるような、化学ルミネセンスの量を測定
しうる光度計に入れた。シグナルは、０．１８５Ａｆ過
酸化水素溶液をポレート／＜えん酸塩緩衝液に注入する
ことにより、開始された。結果を下記に示す。

化学ルミネセンス密度シグナル ８．２３ミ／Ｉ！！／ＩＬｔ　　　　　　　　６．４４
Ｘ１０＠３２．２す／ｇ／ｊｌｊ　　　　　　　　　　
Ｌ３０　Ｘ　Ｉ　Ｏ’３２３ピコ９／ｌｕｔ　　　　　
　　　　　　６．８０　Ｘ　１０４３２３ピコ９／ｌｉ
ｅ　　　　　　　　　　　５．４３　Ｘ　１０’０　　
　　　　　　　　　　　　　４．０２ＸｌＯ’実施例８
゜ 本実施例は、ミクロペルオキシダーゼをラベルした抗原
の製造及び使用を示す。

２３４■の８−カルボキシ、メチルテオフィリン及び１
２５■のＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＦ）のサ
ンプルを、３−の乾燥ジメチルホルムアミドに懸濁した
。ジシクロへキシルカルボジイミド（２２７■）を５１
の乾燥ジメチルホルムアミドに溶解させ、そして撹拌し
つつ混合物へ加えた。黄色の溶液が得られ、それは１時
間で濁った。混合物を１５分間超音波処理し、そして大
量の沈でんをＰ去した。テオフィリンＮＨ３−エステル
を含む溶液を精製することなく用いた。

ミクロペルオキシダーゼ（１■／ｊｌｊ）及び過剰のテ
オフィリンＮＨ３−エステルを混合しそして週末を室温
で放置した。この物質を次に水（５Ｎ）により希釈し有
機モディファイア−としてのアセトニトリル（アセトニ
トリルの相対的含量を毎分２．５％の速度で０％から２
５％へ増大させた）並に水中の０．１％トリフルオロ酢
酸とともにＣ１８逆相カラム〔マグナム（Ｍａｇｎｕｍ
）　９　＊　４．６　Ｘ　２５ｃｌＲ］の高速液体クロ
マトグラフィを用いて精製した。毎分１ｄの流速で、４
個のピークが３９８　ｎｍで、１８．６分、２２．８分
、２４．９分及び３０．２分において検出された。２４
．９分の画分をその高い過酸化活性釜に抗テオフィリン
域により阻害されるべきその能力について選んだ。

試薬 （１）　　０．０１％ウシガンマ−グロブリン（ＥＧＧ
緩衝液）を有する０、１Ｍりん酸ナトリ９ム緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）。

（２）　　テオフィリン標準溶液。テオフィリン標準溶
液の２倍の連続した希釈物。ＢＧＧ緩衝液中のテオフィ
リンの２倍の連続した希釈物（２０ｍＭ　７０２Ｍ）。

（３）ＥＧＧ緩衝液中で希釈されたミクロペルオキシダ
ーゼ・テオフィリンコンジュゲート（前述の如く製造）
。

（４ウシ血清アルブミンへカップルされたテオフィリン
の注射の繰返しにより得られた、テオフィリンに対する
ウサギ抗血清。

（５）　　０．Ｉ　Ｍｆｆ−酸ナトリウム及び０．００
１５Ｊ／＜えん酸ＣｐＨ６，０）中の０．０１％３．３
’、５．５’−テトラメチルベンジジン、０．００４４
％過酸化水素の新しく作られた色原体基質の溶液。

５０μ！の量のテオフィリンの標準溶液を、３０分間室
温で抗血清の２１５倍希釈物５０μｊとインキュベート
した。ミクロペルオキシダーゼ・テオフィリンコンジュ
ゲートの０．４８μＥ溶液５０μｇを加え、室温で３０
分間インキュベートした。１１の色原体基質溶液を加え
、そして混合物を３０分間室温でインキュベートした。

反応を次に０．２５１の２Ｍｍ酸の添加により停止し、
４５Ｑｙｃｍの吸収を測定した。結果を次に示す。

Ｓｏ　　　　　　　　　　　　Ｏ，１３５１００，１２
３ ５０，１８０ ２，５０，１９６ １，２５０，２０３ ０，２６５０，２３５ ０，３１３０，２２５ ０，１５６０，２３４ ０，０？８　　　　　　　　　　　０．２３３０　　　
　　　　　　　　０．１９に のデータは、ミクロペルオキシダーゼが分離工程の必要
なしに、液体中の抗原を計量するこのタイプの競争アッ
セイに用いられることを示す。テオフィリン及びミクロ
ペルオキシダーゼにより形成されたコンジュゲートの代
りに、他の抗原がテオフィリンを置換しそして本発明の
前述の技術に従って、同様なやり方で用いられることは
理解されるべきである。

実施例４゜ 本実施例は、デキストランへのミクロペルオキシダーゼ
のカップリングを示す。

４１１９の量のデキストラン（平均分子量４（ＬＯＯＯ
ダルトン）を０．０５Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ１２
，０）　０．１１ｄ゛に溶解した。５μＥのアセトニト
リル中の臭化シアノゲン１０■を加えた。氷上で３０分
後、０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨｏ、ｓ）中のミクロ
ペルオキシダーゼ１０１ｖを加え、そして混合物を１晩
インキユベートした。エタノールアミン（３０ｐｉ）１
に加え、そして溶液を２時間室温で貯蔵した。

サンプルを、足置前に０．ＯＩＭりん酸ナトリウム及び
０６１５Ｍ塩化ナトリウムの緩衝液（ｐＨ７，４）によ
り充分に透析した。

実施例５゜ 本実施例は、ポリリシン及びミクロペルオキシダーゼの
コンジュゲートの製造を示す。

ミクロペルオキシダーゼ（２■）及び１５■のポリリシ
ン（平均分子ｔｚｏｏ、ｏｏｏ）を０．ｌＡｆりん酸す
）　ＩＪウム（ｐＨ７，０）　０．５ｍに溶解した。こ
の溶液に、緩く振とうしつつ１時間かけて水中の２１ｍ
Ｍゲルタールアルデヒド溶液０．２５μ！−滴下した。

サンプルを１晩室温でインキュベートし、次にＰＢＳに
より充分に透析した。

実施例６゜ 本実施例は、ミクロペルオキシダーゼ自体の共役化を示
す。

０．６８１１ｕｉの量のミクロペルオキシダーゼを、０
．３６２ミクロモルのグルタールアルデヒドヲ含む０．
１Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ７，ｏ）に溶解した。ゲ
ルタールアルデヒド対ミクロペルオキシダーゼの比はＬ
Ｏ４であった。反応物を１晩４５℃に置き、次に水中の
グリシンの１Ｍ溶液１００μｌを加え、１時間室温にお
いた。生成物をセファクリル（！Ｉｇｐｈａｃｒ／ｌ　
）　：Ｅ　−３００のりＣ１−ｒトグラフイにかけ、見
掛は分子量１４４００のピークを集めた。

実施例７゜ 本実施例は、実施例４〜６で製造されたミクロペルオキ
シダーゼコンジュゲートの活性の比較を示す。

ミクロペルオキシダーゼ（ＭＰ）のコンジュゲートの活
性を、色原体基質及び過酸化水素を用いてテストし、結
果を次の表に示す。

コンジュゲート活性　　ＭＰ／分子　　相対的活性ＭＰ
　　　　　　　　　　　　１．０　　　　１．０デキス
トラン−ＭＰ　　　　８．９　　　　３．９”ポリリシ
ン−ＭＰ　　　　　　２．４　　　　２．５’ポリ−Ｍ
Ｐ　　　　　　　　　　？、３　　　　　２．８１）０
１５０μｊのミクロペルオキシダーゼ溶液を１ｇの０．
０１％ＴＭＢ並びに０．１Ｍ酢酸す）　ＩＪウム中の０
．００４４％過酸化水素（ｐＨ６，０）へ加えた。３０
分のインキュベーション後、反応を０．２５ｊｌＪ？０
２Ｍ硫酸により停止し、４５０ｎｍの吸収を測定した。

料ミクロペルオキシダーゼ溶液をｐＨ’！、５でＰＢＳ
中で希釈し；溶液１ｄへ０．ＺＭ　　ＤＨＢ；及び０．
５４Ｍ　　４ＡＡＦを含む溶液２５μｊを加えた。反応
を１０μ！の０．１％過酸化水素溶液の添加により開始
した。５１２ｎｍの吸収をモニターした。　　　″ 前述からミクロペルオキシダーゼは、それ自体又は他の
　　゛分子例えば前述のものヘカツプルしてその元の活
性の全て又は実質的な量を保つことが分る。従って、こ
のような分子へのそのカップリングは、従来の技術（セ
イヨウワサビ又は他の酵素が用いられる）との比較によ
り、酵素イムノアッセイなどにおける分析物の検出の感
度を増大させる。

前述した如き本発明の方法、処方及び実施の詳細におけ
る種々の変化は、本発明の範囲から離れることなくなさ
れうることは、理解されよう。

特許出願人　　アボット　ラボラトリーズ代　理　人　
弁理士　　斉　藤　武　彦代　理　人　弁理士　　川　
瀬　良　治手続補正書 昭和６１年４月１１日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第５９６５０号 ２、発明の名称 ミクロペルオキシダーゼを用いる診断アッセイ３、補正
をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　アボット　ラボラトリーズ ４、代理人 氏名　弁理士　（７１）５）　　斎　藤　武　彦１１′
１．　’、−）゛　・−′ ５、補正の対象 願書に添付の手書き明細書の浄書 ６、補正の内容 別紙のとおり、ただし明細書の内容の補正はない。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）分析物又はその誘導体を含むサンプルを過酸化的
   に活性な物質とペルオキシダーゼの存在下接触させて過
   酸化物並びにサンプルに存在する分析物の基準として過
   酸化物の存在下検出しうる応答を生成しうる物質を生成
   させることよりなる方法においてペルオキシダーゼとし
   てミクロペルオキシダーゼを用いることを特徴とするサ
   ンプル中の分析物の存在及び／又は量を求める方法。
2. （２）検出しうる応答を生成しうる物質が色原体である
   特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）検出しうる応答を生成しうる物質が化学ルミネセ
   ンス化合物である特許請求の範囲第（１）項記載の方法
   。
4. （４）検出しうる応答を生成しうる物質がけい光化合物
   である特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
5. （５）分析物が抗原及び抗体よりなる群から選ばれた特
   許請求の範囲第（１）項記載の方法。
6. （６）サンプルが生物学的液体である特許請求の範囲第
   （１）項記載の方法。
7. （７）生物学的液体が血液の血清である特許請求の範囲
   第（６）項記載の方法。