JPS61243027A - リンフオカイン或いは他の血液因子を主成分とする診断或いは治療用製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリンフォカイン或いは他の血液因子を主成分と
してそのインビボ並びにインビトロ活性を高められた診
断或いは治療用製剤に関する。

リンフォカインは、抗原刺激に基づいてリンパ球から分
泌される特定の物質である。細胞媒介免疫の仲介体と呼
ばれるリンフォカインは特に炎症の場合に重要な役割を
果している。これは抗体ではなく、好ましい標的細胞に
受容体特異的に作用する、生物学的に高活性な因子（ホ
ルモン）である。これにはたとえばインターロイキン−
２、インターロイキン−３、Ｃ３Ｆ（コロニー刺激因子
）及びＢ細胞因子が属する。免疫学における概念は学問
の水準に応じて変化する。従って、「リンフォカイン」
の概念も変化す−ると考えられる。「他の血液因子」の
概念もこの意味で理解すべきである。

以前にはＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれたイン
ターロイキン−２（略称ＩＬ−２）　　［Ｌ、Ａ。

Ａａｒｄｅｎ等＝［抗原非特異性Ｔ細胞増殖因子とヘル
パー因子の改訂命名法］Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１第
１２３巻（１９７９）、１９２８〜２９２９頁：　Ｄ、
Ａ、ＨＯｒｇａｎ、　Ｆ。

Ｗ、　Ｒｕ５ｃｅｔ口とＲ，Ｃ，Ｇａ１ｌＯ：　ｒ正常
なヒト骨髄からの丁リンパ球の選択的インビトロ増殖Ｊ
　５ｃｉｅｎｃｅ第１９３巻（１９７６）　、１００７
頁参照］は、分子量約１５，０００を有し、等電点が中
性領域にある糖蛋白質である［Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓ、　Ｄ
、Ｙ、Ｈｏｃｈｉｚｕｋｉ　、　Ｐ。

、１．Ｃｏｕｌｏｎ、　Ｓ、Ｈ，Ｈｅｆｅｎｅｉｄｅｒ
ＳＣ，Ａ、Ｒａ１Ｉｌｂｔｈｕｎ、　Ａ。

Ｅ、Ｇ１１ｌｉｓ、　Ｈ，Ｂ、Ｆｒａｎｋ　、　Ｃ，Ｓ
、ＨｅｎｎｅｌｙとＪ、　Ｄ。

Ｗａｔｓｏｎ　：　「インターロイキン−２の分子特性
化」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ、Ｒｅｖ、第６３巻（１９８２
）　　、　１６７〜２０９頁参照］。

インターロイキン−２の時折述べられる分子異質性はグ
リコジル化の相違に起因されるものである［　Ｒ，Ｊ、
　Ｒｏｂｂとに、Ａ、Ｓｍ１ｔｈ　：　ｒ変化しやすい
グリコジル化によるヒトＴ−細胞増殖因子の異質性Ｊ　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、第１８巻（１
９８１）、１０８１〜１０９４頁］。

ＩＬ−２は免疫応答における「第２信号」として有効で
あり［Ｆ、Ｗ、Ｒｕ５ｃｅｔｔｉとＲ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ
　：　ｒ　ヒトＴリンパ球増殖因子：Ｔリンパ球の増殖
および機能の調節Ｊ　Ｂｆｏｏｄ第５７巻（１９８１）
、３７９〜３９４頁、およびＨ，Ｗａｇｎｅｒ、　Ｃ，
ｔｌａｒｄｔ　、に、Ｈｅｅｇ、に、Ｐｆｉｔｚｅｎ＋
＋ａｉｅｒ、　Ｗ、５ｏｌｂａｃｈ　、　Ｒ，Ｂａｒｔ
ｌｅｔ　。

Ｈ，ＳｔｏｃｋｉｎｇｅｒとＨ，Ｒｏｌｌｉｎｏｈｏｆ
ｆ　　：　［インターロイキン−２のインビボおよびイ
ンビトロ効果」１１１ｕｎ０１．ＲｅＶ、第５１巻（１
９８０）、２１５〜２３６頁参照］、調節因子を意味し
ており、これによって正常に活性化された腫瘍性Ｔ細胞
をインビトロで連続的に培養することが可能になる。Ｉ
Ｌ−２の添加によってクローン化され、長期間培養で保
持されるエフェクター細胞には、ヘルパーＴ細胞、サプ
レッサーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞およびナチュラルキラ
ー細胞（Ｎに細胞）がある。

免疫防御の多くの障害（免疫学的疾患）はイン、ターロ
イキン−２産生細胞の欠損もしくはＩＬ−２産生が非常
に少ないこと、あるいはＩＬ−２受容体が形成されない
こともしくはＩ　Ｌ−２受容体の形成が非常に少ないこ
とに起因するものであり、多くの場合にインターロイキ
ン−２の投与によって改善される。

さらに、新しい研究はインターロイキン−２産生が年令
の増加とともに強く低下することを示している。従って
、インターロイキン−２産生障害によって惹起される疾
患を治癒または軽減するような治療剤が、インターロイ
キン−２によって提供される。

Ｉ［−２は癌治療にもその用途を見い出すことができる
。例えば癌のような症状を診断するためには、例えばイ
ンターロイキン−２に対するモノクロ−犬ル抗体を製造
し、それによって放射線免疫検定法または酵素免疫吸着
検定法に基づく診断用キットを提供することができる。

プテリンは文献において、トリプトファン、フェニルア
ラニン及びチロシン（これが欠乏すると重度の神経障害
、高フェニルアラニン血症が生ずる）のヒドロキシル化
の際の補助因子（テトラヒドロビオプテリン）としての
動物色素として、細胞増殖調節体（ウシ胎児血清の部分
的代用）として、ならびに免疫系に影響を与える因子と
して述べられている［Ｒｏｉ＋ｐｐｓ　Ｃｈｅｍｉｅ　
Ｌｅｘｉｋｏｎ　。

第　７版、２８３１〜２８３２頁；　Ｓ、Ｈｉｌｓｔｅ
ｉｎとＳ、にａｕｆｍａｎ：［テトラヒドロビオプテリ
ン生合成の中間体としてのテトラヒドロセピアプテリン
］Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａｌ　ｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ　ｔｏ
ｎｓ第　１１５巻、第３号（１９８３年９月３０日）、
　８８８〜８９３頁；　Ｉｒｍｇａｒｄ　Ｚｉｅｇｌｅ
ｒ　　。

Ｕｌｒｉｋｅ　Ｈａｆｆｉｌ　Ｓｌ、Ｂｅｒｒｉｄｊ　
：　ｒ刺激およびリンパ芽球増殖の関与Ｊ　Ｃａｎｃｅ
ｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、第４２巻、５３５６〜５３５
９頁（１９８３）参照］。

ごく少量存在する場合には、リンフォカインの生物学的
検出がしばしば非常に困難であるので、診断が困難にな
る。さらに、リンフォカインを治療的に用いた場合の有
効性を高めることは、追求する価値のあることと考えら
れる。

本発明は、生物学的リンフォカイン試験の検出度を高め
、リンフォカインおよび他の血液因子のインビトロおよ
びインビボ活性を高めるという課題に基づくものである
。

この課題は本発明によると、リンフオ力イン或いは他の
血液因子を主成分とする製剤にプテリンを添加すること
によって解決される。

リンフォカインにプテリンを添加することによってリン
フォカインの活性が３〜５倍に高められること、従って
プテリンがリンフォカインの免疫調節体として作用する
ことが、意外にも発見された。

インターロイキン−２の場合には、インターロイキン−
２実験室用製剤に本発明によってプテリンを添加するこ
とによって、検出度を高めると同時に試験系の感受性を
高めることが可能になる。さらに、プテリンの添加は活
性化Ｔ細胞の増殖に有利な影響を与える。インターロイ
キン−２診断テストの場合にも、インターロイキン−２
に対するＥＬＩＳＡテストキットまたはＲＩＡテストキ
ットへの添加物としてプテリンを本発明に従って用いた
場合には、検出度が増大する。

さらに、治療用インターロイキン−２製剤にプテリンを
添加すると、結果として活性上昇すなわち免疫予防の向
上が見られる。このような効果には次のようなものが属
する。

即ち、活性化Ｔ細胞の増殖、ナチュラルキラー細胞活性
の上昇、Ｉｔ−２依存性キラー細胞の誘導、ガンマ−イ
ンターフェロンの誘導及びＤ１０ｒ抗原の表現への影響
等である。

８細胞にもおそらく有利な影響が及ぼされると思われる
。

活性化リンパ球におけるプテリン分析およびその他の研
究は、特定の理論にしばられること　′なく、糖蛋白質
の存在がプテリン作用の前提であり、通常に形成された
リンパ球では、インターロイキン−２がプテリン作用の
前提であることを示している。

本発明によると、テトラヒドロビオプテリンが特に好ま
しいプテリンとして用いられるが、これの生合成はＢ１
０ＣｈｅｌｉＣａ１　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｃ０ｆｌｌｌｕｎｉＣａｔｉＯｎＳ第
　１１５巻第３号（１９８３年）８９２頁に示されてい
る。

プテリンの活性増強作用に関するテストのために用いた
リンフォカイン製剤は、未精製インターロイキン−２（
西ドイツ公開特許明細書第３１４９３６０号、実施例１
参照）、部分的に精製したインターロイキン−２（同上
特許明細書、実施例４参照）高純度インターロイキン−
２（ＲｏＪ、　Ｒｏｂｂ等：　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
Ｄｈｙｓ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＣＯＨ１４第１１６巻（
１９８３）、１０４９〜１０５５頁参照、但し、この文
献では、他の抗体すなわち西ドイツ特許出願明細書筒Ｐ
　　３３２９４４９．６号に記載されている、インター
ロイキン−２に対する抗体を用いている）及び不活性化
インターロイキン−２、すなわち前述の方法で製造した
活性インターロイキン−２を凍結乾燥して不活化した材
料である。

本発明によると、活性製剤の活性上昇が得られるのみで
なく、意外にも、製造の際に不活化された生成物も再活
性化される。

リンフォカイン、特にインターロイキン−２の活性上昇
は、マウスのインターロイキン−２依存性細胞毒性■細
胞インジケーターラインならびに、インジケーター細胞
としての、Ｃｏｎ　ＡもしくはＰＨＡによって刺激され
るマウス牌臓リンパ球もしくはヒトリンパ球（単核細胞
）において確認されている。３■−チミジン組込み度が
活性上昇の徴候とみなされる。

実施した全ての実験から、約１〜２０単位／ｍｌのイン
ターロイキン−２８度では約１０（〜１０″Ｓモル（８
０１）のプテリン濃度で最適作用が得られるという結果
になった。

インターロイキン−２活性の単位数は、暫定的な国際標
準との比較から算出される。インターロイキン−２の暫
定的な国際基準単位はＬｌ／ｍ１）ｈＯｃｉｎ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ第５ｅａｒｃｈ８４）に述べられている。

リンフォカインの作用に対するプテリンの影響を立証す
るために、次の実験を行った。

実施例１ Ａ、　ＰＨＡ芽細胞 全血１００ｄにＮａ−ヘパリン２００（ＩＩＥを添加し
て、凝血を阻止した。Ｆｉｃｏｌｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ　
（１：１）上での勾配遠心法によって、単核細胞（ＨＮ
Ｃ）を申離した（　４００Ｘ　Ｑ　、　２０分間）。細
胞を洗浄した後、これをＰＨＡｏ、５．１１　／ｍｅに
よって１２時間刺激した。

出発物ｌ　：　ＨＮＣ０，８ｘ　１Ｇ’　／ｍｌＰＨＡ
　　　　　Ｏ，５ＩＬｇ／ ｍｌＦＣ８１０％ ヘニ？／ＩＪ、、／　　１０００／ｍ ｌストレプトマイシン　１００／１１！ＩＩ　／ｍｌ３
７℃ ００２６％ ＲＰＭＩ　　１６４０に装入 ［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ第５ｅａｒｃｈ５６
〜５３５９頁（１９８３）参照］ 次に芽細胞を遠心分離し、洗浄し、上述のように新たに
６時間インキュベートした。次に再度遠心分離した。

Ｂ、Ａ段階によって得られた細胞をＡ段階と同じ培地に
入れ、この培地にざらに１０％ＦＣ３を添加した。西ド
イツ公開特許明細書第３１４９３６０号、実施例４に従
って製造したインターロイキン−２調製物にテトラヒド
ロビオプテリン水溶液（培地１０ｇ　１もしくは１１−
２１１０．ｕ　１につきテトラヒドロビオプテリン１ａ
ｇ）１０１ｔｌを加え、連続的に培地でその都度１／２
の濃度になるように稀釈した細胞１ｏｏａ　ｆＬに培地
中もしくはインターロイキン−２中のテトラヒドロビオ
プテリン連続稀釈物１００ｍを混合した。前記調製物を
３７℃、００２５％において１２時間インキュベートし
た。最後に　３１−チミジン２Ｂ　Ｃｉずつを３時間送
給し、回収して、β−カウンター内で計測した。

このテストで得られた結果は、テトラヒドロビオプテリ
ンを培地に単独添加した場合にはインジケーター細胞に
対して不活性であることを示した。インターロイキン−
２とテトラヒドロビオプテリンを組合わせた場合には、
３Ｈ−チミジン組入れ度がインターロイキン−２基準値
の５倍までに上昇した。種々な濃度のインターロイキン
−２と種々な濃度のテトラヒドロビオプテリンを組合わ
せると、最適の協同作用は両者の濃度に明白に依存する
ことがわかった。暫定的な国際標準に基づいて１〜２０
単位／ｍｌのインターロイキン−２１度である場合に、
最適作用はテトラヒドロビオプテリン濃度１０（〜１０
−５モルにおいて得られた。

実施例２ Ａ　マウス牌臓細胞を前記文献に述べられた方法に従っ
て、ｃｏｎ＾によって刺激した。

ＢＡＡ段階よって得られた細胞を実施例１、Ｂ段階と同
様に再処理した。

これによって得られた結果は、実施例１の結果と質的に
同じであった。

実施例３ インターロイキン−２依存性細胞毒性Ｔ細胞インジケー
ターラインを実施例１Ｂに述べた培地と同じ培地に入れ
、実施例１Ｂと同様に再処理した。

これによって得られた結果は実施例１の結果と殆ど同じ
であった。

実施例４ 実施例１．２．３と同様に処理したが、リンフォカイン
調製物としてそれぞれ高純度インターロイキン−２、未
精製インターロイキン−２及び不活性インターロイキン
−２を用いた。

添附の図は全ての実施例を外挿して示すものであり、実
施例１に関連して詳述したことを立証している。

テトラヒドロビオプテリンが光感受性であるために、全
ての実験は赤色光線下で実施した。

尚、図中−Ｃａｐはカウント７分を表わし、Ｕはは暫定
的国際標準と比較した単位を示す。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明製剤の活性を示す特性線図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プテリンの添加を含むことを特徴とするリンフォカ
   イン或いは他の血液因子を主成分とする診断或いは治療
   用製剤。 ２、リンフォカインはインターロイキン−２から成るこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製剤。 ３、プテリンはテトラヒドロビオプテリンから成ること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載
   の製剤。 ４、プテリンの濃度が約１０＾−＾６〜１０＾−＾５モ
   ルであることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第
   ３項の何れか１項に記載の製剤。 ５、リンフォカイン或いは他の血液因子の濃度が約１〜
   ２０単位／ｍｌであることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項乃至第４項の何れか１項に記載の製剤。