JPS61226637A - 膜の透過率および拡散定数の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、水溶液中に存在する化学種、特に。

糖類、アルコール類、カルボン酸類等の有機化合物のう
ちの特定の化学種に対する膜の透過率および拡散定数を
、迅速、簡便、かつ精確に測定する方法に関するもので
ある。本発明の産業上の利用分野としては１分離膜等の
膜を製造する高分子化学工業に、膜分離工程を利用する
発酵工業１食品工業、有機化学工業に、また、膜による
有害成分除去を利用した医療、福祉分野に好適である。

従来の技術 膜の透過率および拡散定数は１通常、膜を透過した化学
種の濃度変化の時間的割合を求めることを介して測定さ
れる。このための従来の技術としては、吸光度変化、屈
折率変化、電導度変化等を利用して濃度変化を見積る方
法が知られている（例えば、高分子学会編「高分子材料
の試験法と評価」　（昭５５．１１２５　）　、培風館
、ｐ２１０）。

しかしながら、これらの方法は、特定の化学種に対して
選択性の高い方法ではなく、特に、多数の成分が共存す
る場合に、特定の化学種についての膜透過を検知するこ
とは、実際上、不可能であるという欠点を有している。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは１発酵液や体液等の多数の成分を含有する
水溶液中における特定の化学種に対する膜の透過率を、
迅速、簡便、かつ精確に測定し得る方法を開発するため
に、鋭意研究を重ねた結果。

上記化学種を基質の一つとして、これを酸素とから、少
なく共通酸化水素を生成物の一つとして与える酸化酵素
を固定化して成る膜と、酸素電極若しくは過酸化水素電
極とを組合せて成る酵素電極を利用して、この酵素電極
の応答電流出力の時間た化学種の濃度の時間的変化の割
合いを見積る方法が、その目的に適合しうることを見出
し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。

問題点を解決するための手段 すなわち９本発明は、水溶液中に存在する化学種に対す
る膜の透過率および拡散定数を測定する方法において、
上記膜で仕切られた二つの水溶液相のうちの一方の相に
、上記化学種を基質の一つとして、これと酸素とから、
少な（共通酸化水素を生成物の一つとして与える酸化酵
素を固定化してなる膜と、酸素電極若しくは過酸化水素
電極とを組合せて成る酵素電極を挿入し、他方の相に上
記化学種を含有する試料を添加し、しかる後の上記酵素
電極の応答電流の時間的変化の割合いを求めることによ
り、上記化学種に対する上記膜の透過率および拡散定数
を求めることを特徴とした膜の透過率および拡散定数の
測定方法を提供するものである。

本発明の方法の方法において用いられる酸化酵素は１国
際酵素委員会の提案（昭３６）に基づくコート番号表示
でＥｃｌ、Ｘ、３．Ｙ　（Ｘは１〜１００の自然数、Ｙ
は任意の自然数）に属する酵素またはこれに準する酵素
であって、対象とする化学種を基質とするものを任意に
選択することができる。例えば、対象とする化学種がグ
ルコースである場合には、グルコースオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ１，１，３，４）、カテコールである場合にはカテコ
ールオキシダーゼ（Ｅ　Ｃ１，１，３，１４）　、　　
ピルビン酸である場合にはピルビン酸オキシダーゼ（Ｅ
Ｃ１，２゜３．３若しくはＥＣ１，２，３，６）が、そ
れぞれ好都合に利用できる。また、対象とする化学種を
基質の一つとする酸化酵素が存在しない時は、補助的に
他の酵素を酸化酵素と共に利用しても良い。例えば、対
象とする化学種がサッカロースである場合には、インベ
ルターゼ（ＥＣ３，２，１，２６）、ムタロターゼ（Ｅ
Ｃ５，１，３，３）をグルコースオキシダーゼと併用す
ることが好都合である。

本発者の方法において用いられる酵素の固定化、方法と
しては１通店用いられる共有結合法、イオン結合法、包
括法、吸着法などのいずれの方法でも良く、上記酸化酵
素はこれらのいずれかの方法で膜上に固定化されて酸素
電極若しくは過酸化水素電極上に取付けられ、酵素電極
として構成される。本発明の方法において用いられる酸
素電極としては、白金、金、銀、ニッケル等の金属電極
。

若しくは、クラーク式の一般に用いられる電極が使用で
きる。過酸化水素電極としては、白金、金等の貴金属電
極、酸化スズ、酸化インジウム等の金属酸化物電極、若
しくはこれらの表面を多孔性ポリマー膜で被層した一般
に用いられる電極が使用できる。

本発明の方法においては９通常、透過率および拡散定数
を測定すべき膜試料を二つの槽ではさむ形で測定セルが
構成されるが、この測定セルの形状。

寸法は、一方の槽に酵素電極が挿入しうるものであれば
、特に制限はない。ただし、測定セル中に入れられる水
溶液は、上記酵素電極が充分その機能を発揮でき、かつ
用いる酵素が失活しないために２０〜３７℃程度に液温
を保った中性付近の緩衝溶液であることが好ましい。

本発明の膜の透過率および拡散定数の測定方法の原理は
次の通りである。化学種を添加した一方の水溶液相より
、酵素電極を挿入した今一方の水溶液相へ膜中を拡散し
て化学種が拡散する。この拡散による酵素電極挿入側へ
の化学種の濃度増加は、ただちに酵素電極での応答電流
の変化として検出される。そこで、応答電流の時間的変
化の割合いから、拡散による化学種の濃度増加速度を求
め、膜の上記化学種に対する透過率および拡散定数を測
定する。

次に、添付図面により９本発明の方法を、さらに具体的
に説明する。

第１図は１本発明の測定方法に用いられる装置の一例を
示す概略断面図である。ある化学種に対する透過率およ
び拡散定数を測定すべき膜１を介して、二つの水溶液相
２および３が存在する。水溶液は９例えば、磁気か（は
ん子１０を用いてかくはんされる。一方の水溶液相３に
は、酸素電極若去＜は過酸化水素電極４の表面に、上記
化学種を基質の一つとする酸化酸素を固定化してなる膜
５が取付けられた酵素電極が挿入される。酵素電極から
の出力電流は、電流計６で計られ、記録計７で記録され
る。酸素電極若しくは過酸化電極４として、クラーク式
の電池形の酸素電極を用いない場合には、銀−塩化銀電
極などの参照電極１１および白金線などから成る対極１
２をも水溶液相３に挿入し、定電位電源８を用いて、酸
素電極若しくは過酸化水素電極４に適当な電位を印加し
、酸素の還元若しくは過酸化水素の酸化が充分に行い得
るようにすることが必要である。電位の値としては参照
電極として銀−塩化銀電極を用いた場合に。

酸素の還元には、参照電極に対して−０，８ｖ前後。

過酸化水素の酸化には、参照電極に対して＋０．６Ｖ前
後の値がそれぞれ適当である。水溶液相２に上記化学種
を含む試料を添加する以前には、もとより、水溶液相３
中でもこの化学種の濃度は零であるから９Ｍ！、極４と
して酸素電極を用いた場合には、水溶液相３からの酸素
の電極表面への拡散速；寡、すなわち水溶液相３中の溶
存酵素濃度に比例した一定電流値を示し、過酸イし水素
電極を用いた場合には、水溶液相に過酸化水素が存在し
ないから零に近い電流値を示す。

このように準備された装置の水溶液ｔＩ２に上記化学種
を含む試料溶液の所定量を１例えばマイクロシリンジ９
などを用いて添加すると、添加された化学種は膜１を透
過して水溶液相３に達する。

水溶液相３において、化学種は、固定化酵素膜５で酸化
され、この結果、電極４近傍での酸素濃度は減少し、過
酸化水素濃度は増加する。これに伴い、電極４として酸
素電極を用いた場合には出力？じ流は減少し、過酸化水
素電極を用いた場合には出力電流は増加する。

ここで、水溶液相２および３中の上記化学種の濃度をそ
れぞれＣＡおよびＣＢとし、膜１の断面積および厚さを
Ｓおよびｄとすると、化学種が膜１を単位時間△を当り
に通過するｍＪと、膜１の透過率Ｐおよび拡散定数りと
の関係は次式で表わされる（例えば、花卉哲也著「膜と
イオン」　（昭５３゜１１）、化学同人、　　ｐ、　　
４０）。

ＪＳΔｔ　＝　Ｐ　（ＣＡ　−Ｃａ）　ＳΔｔ＝（Ｄ、
＃）（ＣＡ−Ｃａ）　　　　　　　　　・・・・・・（
１）ここで、ＣＡは既知濃度でＣＢは零、もしくは既知
濃度でありＳおよびｄは実測可能な量だから。

Ｊを知ればＰおよびＤを求めることができる。Ｊは９例
えば９次の手順で求めることができる。酸素電極若しく
は過酸化水素電極４と酸化酵素固定化膜５とから成る酵
素電極の一定濃度（Ｃ）の化学種を添加した後の出力電
流変化（Δｉ）と、基質濃度Ｃとの比（Δｉ　／Ｃ）を
別に求めて、酵素電極を校正しておく。しかる後に２図
１に示す装置において。

水溶液相２および３中の化学種の濃度差が（ＣＡ−Ｃａ
）で与えられる場合の酵素ｔｉの出力電流の時間的変化
の割合（Δｔｘ／Δｔ）を求める。水溶液相３の体積を
Ｖとすると、この時、Ｊは次式で表わされる。

Ｊ＝　（ｌｉｔ　／　Ｃ）−’　（ｌｉｔ　／　ｊｔ）
　・Ｓ−’　Ｖ　−−（２）したがってＰおよびＤは次
式で与えられる。

Ｐ＝ｌｉｌ−１ｌｉｔ　Ｃ（ＣＡ−Ｃａ）−１Ｊｔ−１
１ｔ−Ｉ　Ｓ−Ｉ　Ｖ・・・・・・（３） Ｄ＝ｌｉｔ−”１ｉ２Ｃ（ＣＡ　　Ｃ５）−’Δｔ−’
　Ｓ−’　Ｖｄ−（４）このようにして化学種に対する
膜の透過率および拡散定数を測定することができる。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ 乳酸に対する光架橋性ポリビニルアルコール膜の透過率
および拡散定数の測定 ラクテートオキシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社
、　　ＥＣ１，１３，１２，４，１５Ｕ／■をｐＨ７，
０の０．０２Ｍ！ｊン酸緩衝溶液０．３　ｒｒＬｌに溶
液し、光架橋性ポリビニルアルコール（市村国宏、［ジ
ャーナル・オプ・ポリマー・サイエンス、ポリマー・ゲ
ミストリー・エディジョンＪ　　（Ｊ　−Ｐｏｌｙｍ、
　Ｓｃｉ、。

Ｐｏｌｙｍ、　Ｃｈｅｔｉ　Ｅｄ　）　２２巻、Ｐ２８
１７−２８２８．１９８４年）Ｑ、７ｍＡ！と混合し、
これを約６ｄの面積に展開した後風乾し、さらに２０　
ｍ　Ｗ　／　ｃＩＴｔのキセノンアークランプ光を１０
分間照射して水に不溶のラクテートオキシダーゼ固定化
膜を得た。固定化膜を直径約１ｃｌｒＬに切り抜き、こ
れを面積約０．０６ｄの白金電極を陰極とし、多孔性ポ
リテトラフルオロエチレン膜を隔膜とするクラーク型の
電池式酸素電極（石川製作所ＤＧ−１型）の隔膜上に載
せ、０リングで締めつけて固定し、ラクテートオキシダ
ーゼ固定化酵素電極を得た。これとは別に、同一の光架
橋性ポリビニルアルコールのみを展開、風乾。

光照射し、試料膜を得た。試料膜の厚さは、１）ｉ１１
ｉ潤状態で０．００８ｃ１ｒｔである。有効表面積１ｄ
の試料膜を介して成る二つの水溶液相は、それぞれ、０
．１Ｍリン酸緩衝溶液１０−を含み、一方の水溶液相に
上記のようにして得た酵素！！＠を挿入した。二つの相
の溶液は、共に、磁気かくはん子を用いてか（はんし、
その温度は２５′Ｃに保った。

第２図は、上記測定系の酵素電極を挿入した側の水溶液
相に０．０５ｍＭの乳酸を加え、この２分後に他方の側
の水溶液相に・０．２Ｍの乳酸を加えた時の酸素電極に
おける出力電流の時間変化を示すグ亨）である。最初に
酵素電極を挿入した側の水溶液相に乳酸を加えた後、約
１分後の定常電流値全初期電流値から差し引いた値と、
この時加えた乳酸濃度との関係から酵素電極を校正する
ことができる。次いで、他方の水溶液相に乳酸を加えた
後の酵素電極の出力電流が１時間と共に直線的に減少す
る部分での出力電流減少の晴間的割合を求めれば、　＋
３１．　（４１式に従って試料膜の乳酸に対する透過率
および拡散定数として、それぞれ、３．ｌＸ１０−’　
ａｒｒ　ｓ−’および２．５　Ｘ　１０−’　ｃｌ　ｓ
−’の値を得ることができる。上記測定系を用いて、乳
酸含宵溶液として３種の乳酸飲料を用い、この中の乳酸
に対する試料膜の透過率および拡散定数を求めた結果。

それぞれ２．８〜３．Ｉ　Ｘｌ０−’ｃＷＬｓ−”、　
　２．２〜２．５　Ｘ１０”　ｃｎｌ　ｓ−’の値を得
た。

実施例２ クルコースに対するトリアセチルセルロース含有膜の透
過率および拡散定数の測定。

グルコースオキシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社
、　ＥＣ１，１，３，４，２５０″Ｕ　／　ｍｐ）　１
０ｍｇを実施例１と同様の方法により、光架橋性ポリビ
ニ約１．５儂に切り抜き、これを面積約０．２　ｃＩ／
ｌの白金電極表面に載せ、ＯＩＪングで締めつけて固定
し。

グルコースオキシダーゼ固定化酵素電極を得た。

一方、試料膜としては１文献記載の方法（小山愚夫ら、
　「アナレティカ・シミ力・アクタ」　１１６巻、Ｐ２
Ｏ３，１９８０年）に従って、トリアセチルロース、１
．８−ジアミノ−４−アミノメチルオクタン、およびグ
ルタルアルデヒドから成る膜を作製し、さらにこの膜を
水素化ホウ素ナトリウム水溶液中で還元処理して試料膜
とした。試料膜の厚さは、膨潤状態で０．００３３ｃＲ
である。有効表面積１ｃｄの試料膜を介して成る二つの
水溶液相はそれぞれ、０．１ＭＩＪン酸緩衝溶液１０ｍ
から成り、一方の水溶液相に上記のようにして得た酵素
電極。

銀−塩化銀電極（東亜電波工業Ｈ３−９０７型）および
白金ワイヤ電極を挿入し、これら電極をそれぞれ定電位
電源（北斗電工　ＨＡ−５０１型）の作用極、参照極お
よび対極のコネクターに接続し９作用極の電位を参照極
に対して＋０．６５Ｖに真正した。二つの相の溶液は、
共に、磁気かくはん子を用いてか（はんし、その温度は
２５°Ｃに保った。

第３図は、上記測定系の酵素電極を挿入した側の水溶液
相に０．１ｍＭのグルコースを加え、この２分後に他方
の側の水溶液相に５０ｍＭのグルコースを加えた時の酵
素電極における出力電流の時間的変化を示すグラフであ
る。本実施例においては、実施例１と異なり、過酸化水
素を電極で検出しているので、酵素電極の出力電流はグ
ルコースの添加に伴い増加しているが、実施例１と同様
の手法により、試料膜のグルコースに対する透過率およ
び拡散定数として、それぞれ、１．９Ｘ１０−″儒ｓ−
１および６．３　Ｘ　１０−’　ｃｗｔ　ｓ−’の値が
得られる。

第４図は、グルコースを適宜加えて、濃度２０　ｍＭと
した１／４ｆ＃釈の血清を酵素電極を挿入せぬ側の水溶
液相に入れ、上記の方法により、上記試料膜のグルコー
スに対する拡散定数をくり返して測定した結果を示すグ
ラフである。測定回数をふやす毎に、試料膜表面へのタ
ンパク質吸着により。

【図面の簡単な説明】

第１図は２本発明の膜の透過率および拡散定数の測定装
置の一例を示す概略断面図、第２図は。 本発明の方法により、試料膜の乳酸に対する透過率およ
び拡散定数を求めることを目的とした。ラクテートオキ
シダーゼ固定化酵素電極における出力電流の時間的変化
を示すグラフ、第３図は９本発明の本法により、試料膜
のグルコースに対する透過率および拡散定数を求めるこ
とを目的としたグルコースオキシダーゼ固定化酵素電極
における出力電流の時間的変化を示すグラフ、第４図は
。 本発明の本法により、試料膜の血清中のグルコースに対
する拡散定数をくり返して測定した結果を示すグラフで
ある。 第１図中の符号１は試料膜、２，３は試料膜で隔てられ
た水溶液相、４は酸素電極若しくは過酸化水素電極、５
は酸化酵素固定化膜、６は電流計。 ７は記録計、８は定電位電源、９は化学種供給用φマイ
クロシリンジ、　１０は磁気かくはん子、１１は参照電
極、１２は対極である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水溶液中に存在する化学種に対する膜の透過率およ
   び拡散定数を測定する方法において、上記膜で仕切られ
   た二つの水溶液相のうちの一方の相に、上記化学種に応
   答性を示す酵素電極を挿入し、他方の相に上記化学種を
   含有する試料を添加し、しかる後の上記酵素電極の応答
   出力の時間的変化の割合いを求めることにより、上記膜
   の透過率および拡散定数を測定することを特徴とした膜
   の透過率および拡散定数の測定方法。 ２、上記酵素電極が、上記化学種と酸素とを基質として
   、少なく共、過酵化水素を生成物の一つとして与える酸
   化酵素を固定化してなる膜と、酸素電極若しくは過酸化
   水素電極とから構成されるものである特許請求の範囲第
   １項記載の膜の透過率および拡散定数の測定方法。