JPS61225127A - 蛋白質からフエニルアラニンを除去する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業よ（２）程度分野 本発明は、フェニルケトン尿症の要因であるフェニルア
ラニンを蛋白質から除去する方法に関す従］をｌ支（５
） フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）患者は、生体内でフェニ
ルアラニンを代謝する酵素（フェニルアラニンヒドロキ
シラーゼ）を欠如しているため、蛋白質の摂取によりフ
ェニルケトンが体内に蓄積して障害をきたす。したがっ
て、ＰＫＵ患者は、医師の監督の下に低フェニルアラニ
ン含量の特殊粉乳と通常の食事とを組合わせて食するこ
とにより、フェニルアラニンの摂取量を厳しく管理する
必要がある。

しかしながら、上記低フェニルアラニン含量の特殊粉乳
は、フェニルアラニン以外のアミノ酸混合物に脂肪、糖
質、ミネラル及びビタミン等を配合して調製したもので
あるため、アミノ酸特有の好ましくない風味を有し、か
つ該粉乳を摂取すると体内での浸透圧が高くなるという
欠点があり、したがって、ｒ’　Ｋ　ｔＪ患者に好まし
からざるＷｅをりえることにｌ「る。

従来、この上・うな低フェニルアラニン含量の特殊粉乳
の風味を改善する目的て、Ｆｏｒｓｕｍ　ｅｔ　ａｌ、
ば元来フェニルアラニン含量の少ない牛乳ホエー蛋白質
を素（」とした特殊第４〕乳を提案しているＣＦｏｒｓ
ｕｍ、ｌｉ、ａｎｄ　Ｉｌａｍｂｒａｅｕｓ、Ｌ、：す
１′リシヨン°メタボリイ（Ｎａｔｒ、Ｍｅｔａｂ、）
１４．４８〜６２．１９７２）　、また、同様の目的て
ホエー蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）をＰＫＵ患者用特殊粉乳
の素材として用いることが開示されている（特開昭５９
−５１ｍＭ１　号）。

しかし、牛乳ホエー蛋白質並びにＷＰＣのフェニルアラ
ニン含量は３．５〜４．０％（重量）であって、有効に
利用し得る蛋白質源のうちでは最もフェニルアラニン含
量の低いものではあるものの、Ｐ　ｌ（Ｕ患者にとって
のフェニルアラニンの摂取許容口（３才以後でｌｌ３５
〜２０ｍｇ／ｋｇ／目）を考慮すると、蛋白質中のフェ
ニルアラニン含量は多くとも０．３％以下であることが
望しいことであるから、栄養上充分な量の蛋白質を摂取
させ、しかもフェニルアラニンの摂取量を上記許容量に
抑えるには、これらのホエー蛋白質やＷＰＣは到底満足
すべきものでない。

また、蛋白質中のフェニルアラニン含量を低減さ・ｌる
目的で、蛋白質をペプシン及びプロナーゼで分解し、つ
いでセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１５（フ
ァルマシア社関）を用いたゲル濾過により、上記分解で
遊離したフェニルアラニンを除去する方法も提案されて
いる（Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、：　ジャ
ーナル・フード・サイエンス（Ｊ、Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ、
）４１゜１０２９〜１０３２．１９７６）。この方法に
よると蛋白質中のフェニルアラニンの含量を０．３ｇ％
以下にすることが可能であるが、以下に述べるような欠
点があって実用的とは言えない。

すなわち、■ペプシンの作用上の最適ｐＨは２前後であ
り、一方ブロナーゼの最適ｐｌ＋は６．５前後であるた
め、蛋白質の分解に当ってｐｌ＋を調整する必要があり
、それに用いる酸やアルカリがフェニルアラニンを除去
した蛋白分解物中に混入することがＭｂＪられす、その
結果該分解物を累月として用いてＰＫＵ患者用の特殊粉
乳をｉｌ！ａ’Ｍｉする際のミネラル組成及びミネラル
含量を制御することが田ゲ「となる；■酵素処理を二段
階で行なうため、それらの酵素反応を厳密に再現性よく
制御することが実際」二極めて困難であって、生成した
ペプチド画分の分子量分布やアミノ酸組成を一定に保つ
ことができず、したがって、上記特殊粉乳中のアミノ酸
組成を一定にするにはハツチ毎及びロフト毎に調整用ア
ミノ酸の組成及び量を変更する必要があり、作業性が著
しく劣るのみならず、製品の風味、分子量分布等の品質
もハツチ毎に変化して一定のものが得られない。

発明が解決しよ１仁し４肌呵点 本発明は、」二連したようなＰＫＵ患者用特殊粉乳にの
られる問題点を解消して、該特殊粉乳の素材として適し
たフェニルアラニン含量の極めて低い蛋白質を簡易な手
段で取得し得る方法を提供することを目的とするもので
ある。

本発明者は、蛋白質からフェニルアラニンを除去してフ
ェニルアラニン含量の極めて低い蛋白質素材の調製に関
して検８）１シている過程において、上記ゲル濾過を利
用したフェニルアラニンの除去方法において、ゲル濾過
に用いる担体の分子量分画範囲及びカラムに通液する蛋
白質の上記担体のゲル容量に対する負荷量を特定し、か
つ用いるリン酸緩衝液のｐｌ＋と濃度を規定することに
より、蛋白質を予め酵素処理して蛋白質中のフェニルア
ラニンを遊離させなくても、蛋白質から直接フェニルア
ラニンを有効に除去し得ることの知見を得て、本発明を
なすに至った。

因に、蛋白質をリン酸緩衝液中でゲル濾過する手法自体
は古くから生化学分野で行なわれてきているが、蛋白質
から直接フェニルアラニンを除去してその含量を低減さ
せる目的で適用された報告し：ｒ未だめられない。

すなわち、このことば、酵素処理をしていない蛋白質を
単にゲル１慮過しただけではフェニルアラニンをはじめ
とした特定のアミノ酸は蛋白質から切断除去されないと
いうのが従来の和学常識であったことによる。したがっ
て、本発明によって蛋白質からフェニルアラニンが除去
し得ることは従来の和学常識からは予期し得ないことで
ある。なお、従来のゲル濾過では、ゲル濾過の条件に一
ついても」二連したような特定や規定か採用されていな
かった。

以下本発明の詳細な説明する。

介朋９」峰 本発明の特徴は、ｐＨ６乃至１０の０．１ｍＭ以上の濃
度のリン酸緩衝液で平衡化した、分子量分画］　、　０
００乃至２，５００を有するゲル濾過用担体を充填した
カラムに、蛋白質を該ゲル濾過用担体のゲル容量Ｌｏｏ
ｍβに対し０．１ｇ以下の負荷になるように通液し、上
記リン酸緩衝液で溶出することにより、蛋白質からフェ
ニルアラニンを除去することにある。

ここでいう″蛋白質をゲル濾過用担体のゲル容１ｍＭ１
００ｍβに対し０．１ｇ以下の負荷になるように通液す
る”とは、カラム中の担体に１回に負荷し得る蛋白質の
量を意味する。

幽叫萌炎鯖決するための手段 本発明で原料として用いる蛋白質は、１ｍＭ１６乃至１
０の０．１ｍＭ以上の濃度のリン酸緩衝液に可溶なもの
であれば広範囲の種類のものを適用し得る。

例えば、元来フェニルアラニン含量の低いホエー蛋白質
濃縮物（ＷＰＣ）の他に、カゼイン、大豆蛋白質、卵白
蛋白質、葉蛋白質、血液蛋白質及びゼラチン等が考慮さ
れる。これらの蛋白質は新鮮にｆＩＩｌｌ製したもので
も、熱処理や乾燥処理されたものでもよい。さらには、
予め酵素処理されたちのであっても差支がない。しかし
、工程の簡便性の観点からすれば、酵素処理をしない蛋
白質自体を用いることが好ましい。

また、上記蛋白質のほかに、」−記リン酸緩衝液にはそ
れ自体可溶でない蛋白質、例えば肉蛋白質でも酵素処理
などにより可溶性にしたものは適用し得る。

本発明では、このような原料蛋白質を通常上記リン酸緩
衝液に溶解した溶液としてゲル濾過に何す。

ここで適用するゲル１慮過は、ｐｌ＋６〜１０、Ｏ，１
ｍＭ以上の濃度の上記リン酸緩衝液で平衡化した、分子
量分画が１　、０００〜２，５００ダルトンの特定な濾
過用担体を充填したカラムを用いて行なうこ吉が肝要で
あって、分子量分画が上記範囲外の担体を用いたり、又
、担体の平衡化に用いるリン酸緩衝液のｐｌ＋及び濃度
が上記条件を満たさない場合には、蛋白質からのフェニ
ルアラニンの除去は有効になし得ない。

更に、本発明では、上記ゲル濾過に際して濾過用担体に
負荷する蛋白質の量を厳密に管理する必要があり、濾過
用担体のゲル容量１００ｍ７！に対し０．１ｇ以下、好
ましくは０．０５以下になるように通液する。この場合
蛋白質量が０．１ｇを越えると蛋白質からのフェニルア
ラニンの除去は全く行ない得なくなる。

本発明において、用いられるゲル濾過用担体としては分
子量分画が１　、０００〜２，５００ダルトンのもので
あればデキストラン系のもの、例えば５ｅｐｈａｄｅｘ
　Ｇ−２５（ファルマシア社製）、セルロース系のもの
、例えばＣｅ１ｌｕｌｏｆｉｎｅ　Ｇ旧２５（生化学工
業壮語）等を使用し得る。なお、分子量分画が１　、０
００〜２，５００ダルトン以外のゲル濾過用担体、例え
ば、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０、Ｇ−５０、Ｇ−７５
などを用いてもフェニルアラニンは除去し得ない。これ
ら担体ゲルは再生することなく繰返して使用できる。

本発明で用いる緩衝液はリン酸緩ｉＩｉ液であって、そ
の濃度は０．１ｍＭ以」−であることが必要であり、好
ましく　［：ＩＯ，１５＋ｎＭ以上の濃度である。リン
酸緩衝液の濃度か０．１ｍＭより低いと蛋白質からのフ
ェニルアラニンの有効な除去はできない。

なお、」上記濃度ｉｌｌ：　Ｏ，１ｍＭ以上であればど
んなに高くてもフェニルアラニンの除）には差支えない
が、除去して１７られる低含量フェニルアラニンポリブ
チｌ’（ＬＰＰと略記される）中のリン含Ｍが高くなる
ので、実際上は０．２ｍＭ以下の濃度のリン酸緩衝液を
用いることが好ましい。

また、リン酸緩衝液のｐＨは６〜１０、好ましくは７〜
８であることが必要であって、ｐｌ＋が１０より高くな
ると蛋白質が変性してリシノアラニンのような好ましか
らざる物質を生成するのみならず、フェニルアラニンを
除去した後のＬ　Ｐ　Ｐにアルカリ臭がつくので好まし
くない。また、ｐｌ＋が６より低いとフェニルアラニン
の有効な除去がなし得なくなる。

因に、リン酸緩衝液以外の緩衝液を用いてはフェニルア
ラニンを除去し得ない。例えば、本発明で用いるリン酸
緩衝液と同−ｐｌ＋及び同一イオン強度になるように調
整した水、又は他の緩衝液、例えばトリス緩衝液を用い
た場合にはフェニルアラニンは除去しｆｆｆない。

なお、本発明では、上記リン酸緩衝液に防腐剤、例えば
アジ化すトリウムなどを添加したものは使用上差支えが
ない。

本発明に従って、」二連したような特定な範囲の分子量
分画を有するケル濾過用担体を用い、特定なｐＨの濃度
のリン酸緩衝液中で、かつ該担体に対して特定負荷条件
下での通液を行なうことにより、フェニルアラニンが実
質上除去されたＬ　Ｐ　Ｐの９５％以上をカラムのν□
ｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ画分に溶出させることができる。

このようにして溶出させて得られるＬ　Ｐ　Ｐの画分を
限外濾過、逆浸透圧もしくはエバポレータ等の手法を用
いて濃縮したのち、噴霧乾燥、真空乾燥又は凍結乾燥等
により乾燥すると、フェニルアラニン含量の極めて少な
い、フェニルケトン尿症患者に適した低フェニルアラニ
ン含量の特殊粉乳用蛋白質素材が得られる。また、この
蛋白質素材は苦味やアミノ酸特有の好ましからさる風味
は全くなく、分子量も大きいので＆法王の点でも全く問
題はない。加うるに、ｐＨ調整などをしないのでミネラ
ル含量も低い。。

対ｑ訣果 叙」二のとおり、本発明によると、蛋白質を予め酵素処
理することなく、ゲル濾過するのめで蛋白質からフェニ
ルアラニンを実質的に除去し得るので、簡易な操作で短
時間に低フェニルアラニン含量の蛋白質素材を得ること
が可能となる。特に、上述のように蛋白質を再現性の乏
しい酵素処理を行なっていないので得られる蛋白質素材
のＬＰＰの分子量分布、アミノ酸組成が常に一定であり
、加うるに各種の蛋白質を原料として用いることが可能
であり、したがって１、アミノ酸組成の異なった蛋白質
から得られるＬ　Ｐ　Ｐを組合わせることにより、好ま
しくない風味のアミノ酸粉末を添加することなく、所望
のアミノ酸組成を有するＬ　ＰＰを製造することが可能
となる。

このようにして本発明により得られるＬＰＰ又はＬＰＰ
の組合わせたものは、ＰＫＵ患者用特殊粉乳の素材とし
て極めて好適であるのみならず、このＬＰＰの分子量分
布も原料として用いた蛋白質のそれと殆んど変らず、原
料蛋白質が本来具有している物理的、化学的及び生理的
機能特性及び栄養価をそのまま保有しているので、ＰＫ
Ｕ患者用のクツキー、ケーキ類、ドレッシング類等の食
品素材としても好適に用い得るものである。

さらに、本発明によると、フェニルアラニンのほかにヒ
スチジン、チロシン、メチオニン等の含量も低減される
ので、これらのアミノ酸をｅｌ、Ｆｔさ−ｕた特殊粉乳
や特殊食品、例えばヒスチジン血症患者用の食品素利に
適したものが得られる。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

丈−絶倒」− ３ｅｐｈ、１ｄｅｘ　Ｇ−２５（ファルマシア社製）を
、ｐＨ７，８，０，１５ｍＭ１度のリン酸緩衝液で平衡
化したものを、直径２　、２　ｃｍ、高さ４５ｃｍのカ
ラムに充填した（ゲル容量　１６０ｍ　ｌ　）。このカ
ラムに硫酸ポエ−ＷＰＣ（ＳＱＬΔＣ、ニューシーラン
ト−ランギタイキ社　蛋白質含量的７５％）　２０ｍｇ
を２ｍｌｆの上記緩衝液に溶解し、同ｔＵｆΦｉ液を用
いて１５ｍ！ｌ／Ｉｆの流速で室温にてケル７１ｖ過し
た。カラム中のｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ画分を集めアミ
ノ酸分析を行なったところ、ゲル濾過前には３．５％含
まれていたフコ：ニルアラニンが０．０４％に減量され
ていた。原料ＷＰＣ並びにｉＵられた画分のそれぞれの
アミノ酸絹成を表１に示す。

表　　１ （注）　Ｃｙｓ及びＴｒｐに関しては、専用の分解を行
なっていないので分析値は不正確である。

１ｉｉ！ｉ［２ Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ　Ｇｌｌ−２５ｍ　（生化学工
業社製）を、ｐＨ８，５，０，１５ｍＭｆｉ度のリン酸
緩衝液で平衡化したものを直径６ＣＩ１ｍＭ、高さ２５
ｃｍのカラムに充填した（ゲル容量６００ｍ　ｌ　）。

このカラムにチーズボエ−ＷＰ　Ｃ（ＡＲＭＯＲ−ＰＲ
Ｏ、フランス　アーマ−プロティン社、蛋白質含量的８
０％）０．２ｇを２０ｍ　ＩＩの上記緩衝液に溶解し、
ゲル担体に負荷した。ついで上記緩衝液を用いて室温に
て３００ｍ　ｌ　／　Ｉｆの流速でゲル濾過し、カラム
中のｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ画分を集めた。

この両分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾
燥し、０．１５ｇの粉末を得た。ゲル濾過前３．７％含
まれていたフェニルアラニンがこの粉末では０．０９％
に減量されていた。

失扁男ｌ 実施例１に記載したと同一条件で、大豆蛋白質（八ＲＤ
ＥＸ−Ｆ　、アメリカ、ＡＤＭ社、蛋白質含量的９０％
）をゲル濾過した。ゲル濾過前に約５．５％含まれでい
たフェニルアラニンが０．０１％に減量されていた。

実甚考江 実施例２に記載したと同一条件で、ソーダカゼインにュ
ージランド　エディプルカゼイン）をゲル濾過し、フェ
ニルアラニンが０．１％の両分を得た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｐＨ６乃至１０の０．１ｍＭ以上の濃度のリン酸
   緩衝液で平衡化した、分子量分画１，０００乃至２，５
   ００を有するゲル濾過用担体を充填したカラムに、蛋白
   質を該ゲル濾過用担体のゲル容量１００ｍｌに対し０．
   １ｇ以下の負荷になるように通液し、上記リン酸緩衝液
   で溶出することを特徴とする蛋白質からフェニルアラニ
   ンを除去する方法。
2. （２）蛋白質を、ｐＨ６乃至１０の０．１ｍＭ以上の濃
   度のリン酸緩衝液の溶液として通液する特許請求の範囲
   第（１）項記載の方法。