JPS61205488A - 電気パルスによる生物学的細胞の融合法 - Google Patents
電気パルスによる生物学的細胞の融合法Info
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- JPS61205488A JPS61205488A JP61045135A JP4513586A JPS61205488A JP S61205488 A JPS61205488 A JP S61205488A JP 61045135 A JP61045135 A JP 61045135A JP 4513586 A JP4513586 A JP 4513586A JP S61205488 A JPS61205488 A JP S61205488A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、細胞の接触が機械的に発生させた後、細胞の
融合を電気的に誘導する方法、およびこの方法をモノク
ローナル抗体の生産に適用することに関する。
融合を電気的に誘導する方法、およびこの方法をモノク
ローナル抗体の生産に適用することに関する。
細胞を融合することにより、性質の新しい組み合わせを
達成することができる。これは、最近において、例えば
、モノクローナル抗体の発現に導き、これらのモノクロ
ーナル抗体は薬品および生物学的基礎研究において多く
の新しい可能性を開いた。
達成することができる。これは、最近において、例えば
、モノクローナル抗体の発現に導き、これらのモノクロ
ーナル抗体は薬品および生物学的基礎研究において多く
の新しい可能性を開いた。
多数の異なる型の細胞を、ポリエチレングリコールまた
は適当なビヒクルを使用する細胞の化学的１融合法によ
り、互いに融合することができるが、多くの細胞につい
て、融合の頻度は比較的低い。
は適当なビヒクルを使用する細胞の化学的１融合法によ
り、互いに融合することができるが、多くの細胞につい
て、融合の頻度は比較的低い。
融合の純粋に物理学的方法は汎用な応用可能性を提供す
る。この方法において、細胞膜を高い振幅の短時間の電
気パルスにより可逆的につぶれさす、Ｍの構造が混乱さ
れたこれらの場所において、膜の接触が存在する場合、
細胞融合は起こることができる。
る。この方法において、細胞膜を高い振幅の短時間の電
気パルスにより可逆的につぶれさす、Ｍの構造が混乱さ
れたこれらの場所において、膜の接触が存在する場合、
細胞融合は起こることができる。
電気融合（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）を実施するた
めに要する細胞の接触は種々の方法で発生させることが
できる。Ｕ。ジンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）の
報告された電気融合系［ジンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍ
ａｎｎ）、Ｕ、、１９８２、バイオヒミカ・エト・バイ
オフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、、Ａｃｔａ）、６９４．２２７−２７７］において、
細胞の接触は不均質交番電場（誘電泳動）の助けにより
達成される０次いで、融合は高い振幅の短時間の電気パ
ルスにより達成される。
めに要する細胞の接触は種々の方法で発生させることが
できる。Ｕ。ジンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）の
報告された電気融合系［ジンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍ
ａｎｎ）、Ｕ、、１９８２、バイオヒミカ・エト・バイ
オフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、、Ａｃｔａ）、６９４．２２７−２７７］において、
細胞の接触は不均質交番電場（誘電泳動）の助けにより
達成される０次いで、融合は高い振幅の短時間の電気パ
ルスにより達成される。
ノイマン（Ｎｅｕｍａｎｎ）は、タマホコリカビ（Ｄｉ
ｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）ｃ７）細胞の懸濁液へ電気パ
ルスを加えた後細胞融合を達成した［ノイ−Ｆ７ （Ｎ
ｅｕｍａｎｎ）、Ｅ 、、ゲリッシ（Ｇｅｒｉｓｃｈ）
、Ｇ、およびオパッ（Ｏｐａｔｚ）、ナラ−ルビラセン
シャツテン（Ｎａｔｕｒｗｉ ５ｓｅｎｓｃｈａｆｔｅ
ｎ）６７．４１４−４１５］、これらの細胞は自己凝集
性であり。
ｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）ｃ７）細胞の懸濁液へ電気パ
ルスを加えた後細胞融合を達成した［ノイ−Ｆ７ （Ｎ
ｅｕｍａｎｎ）、Ｅ 、、ゲリッシ（Ｇｅｒｉｓｃｈ）
、Ｇ、およびオパッ（Ｏｐａｔｚ）、ナラ−ルビラセン
シャツテン（Ｎａｔｕｒｗｉ ５ｓｅｎｓｃｈａｆｔｅ
ｎ）６７．４１４−４１５］、これらの細胞は自己凝集
性であり。
その結果、懸濁液中において、細胞融合に要求される細
胞が接触する性質をすでに有する。
胞が接触する性質をすでに有する。
他の実験において、テイシエ（Ｔｅｉｓｓｉさ）は３Ｔ
３−線維芽細胞の単層培養物にパルスを加えることによ
り、細胞菌叢中に細胞融合を発生させることができるこ
とを示した［テイシエ（Ｔｅｉｓｓｉ＆）、Ｊ、ら、１
９８２、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｖｏ１、２１
６．５３７−５３８１゜この場合において、細胞（単層
）の生長の挙動のため培養物中に密接な接触がすでに存
在するので、細胞を接触させるために必要な特別の手段
を必要としない。
３−線維芽細胞の単層培養物にパルスを加えることによ
り、細胞菌叢中に細胞融合を発生させることができるこ
とを示した［テイシエ（Ｔｅｉｓｓｉ＆）、Ｊ、ら、１
９８２、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｖｏ１、２１
６．５３７−５３８１゜この場合において、細胞（単層
）の生長の挙動のため培養物中に密接な接触がすでに存
在するので、細胞を接触させるために必要な特別の手段
を必要としない。
細胞の懸濁液中に細胞の接触を発生されるための他の方
法は、ロー（Ｌ ｏ）らにより１９８４年に報告された
［ロー（Ｌｏ）、Ｍ、Ｍ、Ｓ 、ら、１９８４、ネイチ
ａ、−（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｖ。
法は、ロー（Ｌ ｏ）らにより１９８４年に報告された
［ロー（Ｌｏ）、Ｍ、Ｍ、Ｓ 、ら、１９８４、ネイチ
ａ、−（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｖ。
１．３１０．７９２−７９４］ 、このため、人工的に
生産されたアビジン−抗原複合体を牌細胞と混合し、こ
の時抗原はリンパ球の膜上に位置する抗原特異的抗体と
付加物を形成する。抗原のアビジン側鎖（ｐｅｎｄａｎ
ｔ）は、骨髄腫細胞の膜へ結合しているビオチンと結合
する。これは骨髄腫細胞とリンパ球との間の特別の接触
を発生させる。
生産されたアビジン−抗原複合体を牌細胞と混合し、こ
の時抗原はリンパ球の膜上に位置する抗原特異的抗体と
付加物を形成する。抗原のアビジン側鎖（ｐｅｎｄａｎ
ｔ）は、骨髄腫細胞の膜へ結合しているビオチンと結合
する。これは骨髄腫細胞とリンパ球との間の特別の接触
を発生させる。
すでに上に述べたように、誘電泳動は多数の細胞接触を
達成する１つの方法である。この方法において、融合す
べき細胞は不均質の交番する電場の助けにより凝集し、
こうして密接な膜の接触を生ずる。
達成する１つの方法である。この方法において、融合す
べき細胞は不均質の交番する電場の助けにより凝集し、
こうして密接な膜の接触を生ずる。
しかしながら、このような細胞の凝集を達成するために
は、電流束により発生される熱を最小としなくてはなら
ない、なぜなら、熱運動およびそれに関連する混乱は細
胞の接触を乱すからである。この理由で、Ｕ、ジンマー
マン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）は、低いイオンの媒質、
例えば１等張マンニトール溶液中で研究している［ジン
マーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）、Ｕ、、１９８２、
バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ拳アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、Ａｃｔａ）、６９４，２
２７−２７７；ジンマーマン（Ｚ ｉ ｍｍｅ ｒｍａ
ｎｎ）、Ｕ 、ら、１９８１゜アンゲバンテ拳ヘミ−（
Ａｎｇｅｗａｎｄ ｔ ｅＣｈｅｍｉ ｅ）、９３．３
３２−３５１］ 。
は、電流束により発生される熱を最小としなくてはなら
ない、なぜなら、熱運動およびそれに関連する混乱は細
胞の接触を乱すからである。この理由で、Ｕ、ジンマー
マン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）は、低いイオンの媒質、
例えば１等張マンニトール溶液中で研究している［ジン
マーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）、Ｕ、、１９８２、
バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ拳アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、Ａｃｔａ）、６９４，２
２７−２７７；ジンマーマン（Ｚ ｉ ｍｍｅ ｒｍａ
ｎｎ）、Ｕ 、ら、１９８１゜アンゲバンテ拳ヘミ−（
Ａｎｇｅｗａｎｄ ｔ ｅＣｈｅｍｉ ｅ）、９３．３
３２−３５１］ 。
融合の前に、細胞をこのような培地の中に移さなくては
ならない、しかしながら、このような溶液の使用は細胞
を損傷させる。その上、誘電泳動およびパルスの適用に
用いられる融合室は、その室の大きさおよび立体的配置
のために、わずかに数１０００の細胞の融合を可能とす
るだけである。従来、この方法により抗体生産性ハイブ
リドーマの調製を立証することは不可能であった。
ならない、しかしながら、このような溶液の使用は細胞
を損傷させる。その上、誘電泳動およびパルスの適用に
用いられる融合室は、その室の大きさおよび立体的配置
のために、わずかに数１０００の細胞の融合を可能とす
るだけである。従来、この方法により抗体生産性ハイブ
リドーマの調製を立証することは不可能であった。
電気融合によりハイプリドーマ細胞を調製する方法を後
述する。この方法は電気融合に要求される細胞の接触は
機械的方法により発生されることを特徴とする特 このような方法は、濾過、透析または沈降であることが
できる。遠心による細胞の接触の発生はとくに好ましい
、これは緊密に詰められた細胞の沈降物を生ずる。
述する。この方法は電気融合に要求される細胞の接触は
機械的方法により発生されることを特徴とする特 このような方法は、濾過、透析または沈降であることが
できる。遠心による細胞の接触の発生はとくに好ましい
、これは緊密に詰められた細胞の沈降物を生ずる。
その後、細胞融合は電気パルスにより誘導される。
２種類の細胞間の電気融合のため、均質な電場が電気パ
ルスの開始時に少なくとも局所的に存在しなくてはなら
ないことが、文献から知られている［ジンマーマン（Ｚ
ｉｍｍｅｒｍａｎｎ）、Ｕｏ、１９８２、バイオヒミカ
・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉ ｏｃｈｉｍ、
Ｂｉ ｏ ｐｈｙｓ、、Ａｃｔａ）、６９４．２２７−
２７７］、細胞膜は電気絶縁体と見なすことができるが
、細胞の内部および外部の空間は導電性と見なすことが
できるので、細胞膜の強い極性化が電気パルスの発生す
る時間経過において起こり、その結果ｉｔｉ的パーフォ
レージ覆ン（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｐｅｒｆｏｒａ
ｔｉｏｎ）が起こる。このパ゛−フォレーションはそう
でなければ不均質である電場に局所的な場の歪みを生成
する。しかしながら、生物学的細胞の密な沈降物におい
て、顕著な場の歪みおよび不均質性が期待されなくては
ならない、これにより、電場の立体的構成を推定するこ
とはきわめて困難となる。これらの情況のもとで、電気
融合法を首尾よく適用して細胞の沈降物を密にできると
いうことは、驚くべきことであった。
ルスの開始時に少なくとも局所的に存在しなくてはなら
ないことが、文献から知られている［ジンマーマン（Ｚ
ｉｍｍｅｒｍａｎｎ）、Ｕｏ、１９８２、バイオヒミカ
・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉ ｏｃｈｉｍ、
Ｂｉ ｏ ｐｈｙｓ、、Ａｃｔａ）、６９４．２２７−
２７７］、細胞膜は電気絶縁体と見なすことができるが
、細胞の内部および外部の空間は導電性と見なすことが
できるので、細胞膜の強い極性化が電気パルスの発生す
る時間経過において起こり、その結果ｉｔｉ的パーフォ
レージ覆ン（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｐｅｒｆｏｒａ
ｔｉｏｎ）が起こる。このパ゛−フォレーションはそう
でなければ不均質である電場に局所的な場の歪みを生成
する。しかしながら、生物学的細胞の密な沈降物におい
て、顕著な場の歪みおよび不均質性が期待されなくては
ならない、これにより、電場の立体的構成を推定するこ
とはきわめて困難となる。これらの情況のもとで、電気
融合法を首尾よく適用して細胞の沈降物を密にできると
いうことは、驚くべきことであった。
本発明の方法の全体は、誘電泳動を省略することができ
、こうして培養基の交換を省略することができるので、
正常の細胞培養基中で実施することができる。したがっ
て、非生理学的培地、例えば、マンニトールによる細胞
の損傷、あるいは誘電泳動の交番する場による細胞の損
傷は回避することができる。
、こうして培養基の交換を省略することができるので、
正常の細胞培養基中で実施することができる。したがっ
て、非生理学的培地、例えば、マンニトールによる細胞
の損傷、あるいは誘電泳動の交番する場による細胞の損
傷は回避することができる。
第１図は、短くかつ電気的に高い電圧パルスを発生する
ために本発明において使用する電気パルス発生器きを示
し、この発生器は高電圧装置（１）、それにより抵抗器
（３）を経て充電されるコンデンサ（２）、および手動
操作により切換え可能な水素充填サイラトロン管（４）
の形態の高速作動抗電圧スイッチから成る。
ために本発明において使用する電気パルス発生器きを示
し、この発生器は高電圧装置（１）、それにより抵抗器
（３）を経て充電されるコンデンサ（２）、および手動
操作により切換え可能な水素充填サイラトロン管（４）
の形態の高速作動抗電圧スイッチから成る。
コンデンサの容量および生理学的懸濁液の抵抗に依存し
て、発生されるパルスは５勝秒〜１００ル秒の半値幅お
よび３ｋＶまでのパルスの高さを有する。電極の装置は
、互いに２ｍｍの距離で配置された２枚の平行な大きさ
２％５ｍｍの白金板から成っていた。記載する方法は、
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の調
製するために用いた。
て、発生されるパルスは５勝秒〜１００ル秒の半値幅お
よび３ｋＶまでのパルスの高さを有する。電極の装置は
、互いに２ｍｍの距離で配置された２枚の平行な大きさ
２％５ｍｍの白金板から成っていた。記載する方法は、
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の調
製するために用いた。
この目的に骨髄腫細胞およびリンパ球を互いに融合させ
る。２つの型の細胞を細胞培養基中で混合し、混合比は
１：１０〜１０：１が適当であることが明らかにされた
。
る。２つの型の細胞を細胞培養基中で混合し、混合比は
１：１０〜１０：１が適当であることが明らかにされた
。
使用する細胞の適する培養基を媒質（ｍｅｄｉＵｍ）と
して使用することができる。
して使用することができる。
蛋白質１例えば、ウシ血清アルビミン（ＢＳＡ）１オバ
ルブミンなどを融合媒質に添加することは、融合される
細胞の収率に影響を及ぼす、媒質に蛋白質すると、蛋白
質不合媒質に比較して収率が増加する。最適な蛋白質濃
度を越えると、融合収率は再び低下する。
ルブミンなどを融合媒質に添加することは、融合される
細胞の収率に影響を及ぼす、媒質に蛋白質すると、蛋白
質不合媒質に比較して収率が増加する。最適な蛋白質濃
度を越えると、融合収率は再び低下する。
融合媒質への０．０２％〜２％のＢＳＡの添加は適当で
あることが明らかにされた。好ましくは、０．１％のＢ
ＳＡを使用溶液する。また、融合媒質へのＦＣＳ （ウ
シ胎児血清）の添加は、融合収率に影響を及ぼす、２０
〜４０％（Ｖ／Ｖ）を媒質に添加すると、融合収率は同
一のパルスのパラメーターにおいてこれより高いかある
いは低い濃度の使用に比較して増加する。融合媒質中の
０％〜１００％のＦＣＳの範囲を融合のために使用する
ことができる。０％〜５０％のＦＣＳの濃度はとくに適
当であることがわかった。好ましくは、１０％〜３０％
のＦＣＳを添加する。
あることが明らかにされた。好ましくは、０．１％のＢ
ＳＡを使用溶液する。また、融合媒質へのＦＣＳ （ウ
シ胎児血清）の添加は、融合収率に影響を及ぼす、２０
〜４０％（Ｖ／Ｖ）を媒質に添加すると、融合収率は同
一のパルスのパラメーターにおいてこれより高いかある
いは低い濃度の使用に比較して増加する。融合媒質中の
０％〜１００％のＦＣＳの範囲を融合のために使用する
ことができる。０％〜５０％のＦＣＳの濃度はとくに適
当であることがわかった。好ましくは、１０％〜３０％
のＦＣＳを添加する。
この媒質中で混合された細胞を、短い時間で高いｇ数に
おいて遠心する。１．５ｍｌ容のエッペンドルフ（Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ）容器を遠心に使用ｔ６．２００Ｘｇ
〜２２００Ｘｇ１７）ｇ数、および１０分〜５秒の遠心
時間は適当であることがわかった。好ましくは、細胞は
８秒間２０００Ｘｇでエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ）遠心機において遠心した０次いで、電極を沈降物
の中に沈め、そして電気パルスの適用により融合を発生
させた。パルスの６０秒後に、電極を注意して細胞の沈
降物から取り出す、電極はできるだけ早く除去すること
が好ましい、なぜなら、細胞の接触は、融合プロセスの
完結前に、物質の撹拌のために破壊されるであろうから
である。
おいて遠心する。１．５ｍｌ容のエッペンドルフ（Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ）容器を遠心に使用ｔ６．２００Ｘｇ
〜２２００Ｘｇ１７）ｇ数、および１０分〜５秒の遠心
時間は適当であることがわかった。好ましくは、細胞は
８秒間２０００Ｘｇでエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ）遠心機において遠心した０次いで、電極を沈降物
の中に沈め、そして電気パルスの適用により融合を発生
させた。パルスの６０秒後に、電極を注意して細胞の沈
降物から取り出す、電極はできるだけ早く除去すること
が好ましい、なぜなら、細胞の接触は、融合プロセスの
完結前に、物質の撹拌のために破壊されるであろうから
である。
電極を抜出した後、細胞培養基の層を細胞の沈殿物の上
に、細胞をかきまぜないようにして、注意して適用する
。その後、細胞を１〜６０分間約１５℃〜３８℃におい
てインキュベーションした後、再懸濁し、そして適当な
培養容器へ移す、室温（ＲＴ）において２０〜４０分の
インキュページ璽ンは最良の結果を与えた。
に、細胞をかきまぜないようにして、注意して適用する
。その後、細胞を１〜６０分間約１５℃〜３８℃におい
てインキュベーションした後、再懸濁し、そして適当な
培養容器へ移す、室温（ＲＴ）において２０〜４０分の
インキュページ璽ンは最良の結果を与えた。
雑種クローンの生長を、数日後に、この分野において知
られている適当な選択培地中で観察することができる。
られている適当な選択培地中で観察することができる。
電気融合のために細胞の接触を発生させる他の方法より
すぐれた本発明による方法の利点：融合された細胞が抗
体を生産したということは、電気融合によるハイプリド
ーマの生産について従来記載された方法のいずれも、こ
れまで開示していない、１つの例外はロー（Ｌ ｏ）ら
の研究である［ｅ２− （Ｌｏ）、Ｍ、Ｍ、Ｓ 、ら、
１９８４、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｖｏ１、３１
０．７９２−７９４］、本発明による方法は抗体の生産
に導くことが立証され、抗体の生産速度はロー（ＬＯ）
らが報告する実験におけるよりも実質的に高かった。さ
らに、ロー（Ｌｏ）と比較して１本発明による方法は実
質的にいっそう簡単な方法でかつ細胞を化学的に取扱わ
ないで実施することができる０例えば、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）またはウィルスの助けを借りる他の
方法に比較して、細胞の損傷を起こしうる、細胞に影響
を及ぼす化学物質を使用する必要がまたない、その上、
ウィルスが遊離する危険はない。
すぐれた本発明による方法の利点：融合された細胞が抗
体を生産したということは、電気融合によるハイプリド
ーマの生産について従来記載された方法のいずれも、こ
れまで開示していない、１つの例外はロー（Ｌ ｏ）ら
の研究である［ｅ２− （Ｌｏ）、Ｍ、Ｍ、Ｓ 、ら、
１９８４、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｖｏ１、３１
０．７９２−７９４］、本発明による方法は抗体の生産
に導くことが立証され、抗体の生産速度はロー（ＬＯ）
らが報告する実験におけるよりも実質的に高かった。さ
らに、ロー（Ｌｏ）と比較して１本発明による方法は実
質的にいっそう簡単な方法でかつ細胞を化学的に取扱わ
ないで実施することができる０例えば、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）またはウィルスの助けを借りる他の
方法に比較して、細胞の損傷を起こしうる、細胞に影響
を及ぼす化学物質を使用する必要がまたない、その上、
ウィルスが遊離する危険はない。
その上、本発明による使用すると、いかなる他の方法よ
りもいっそう高い生体雑種の融合頻度が達成される。提
案するこの方法は、細胞の型を無視した、汎用の融合法
である。この方法は、いっそう簡単なかついっそう効率
的な方法を提供するとうことにおいて、モノクローナル
抗体を調製する既知の方法を豊かにする。
りもいっそう高い生体雑種の融合頻度が達成される。提
案するこの方法は、細胞の型を無視した、汎用の融合法
である。この方法は、いっそう簡単なかついっそう効率
的な方法を提供するとうことにおいて、モノクローナル
抗体を調製する既知の方法を豊かにする。
実」日１」
ＨＧＰＲＴ陰性のマウスの骨髄腫細胞系統ｘ６３ Ａ
ｇ ８６５３をマウスの牌細胞と融合した。
ｇ ８６５３をマウスの牌細胞と融合した。
Ｂ ａ ｌ ／ ｃマウスを、用ヤツメウナギ（ｒｉｖ
ｅｒ ｌａｍｐｒｅｙ）のビリデン蛋白質［ランペト
ラ・フルビアチリス（Ｌａｍｐｅｔｒａ ｆｌｕｖｉ
ａｔｉｌｉｓ）（７）ビテリン］ノ腹腔内の反復注入に
より前記蛋白質に対して免疫化した。
ｅｒ ｌａｍｐｒｅｙ）のビリデン蛋白質［ランペト
ラ・フルビアチリス（Ｌａｍｐｅｔｒａ ｆｌｕｖｉ
ａｔｉｌｉｓ）（７）ビテリン］ノ腹腔内の反復注入に
より前記蛋白質に対して免疫化した。
注入毎に、各マウスに、リン酸塩緩衝化塩化す１− ！
ｊ ラム溶液（ＰＢＳ）中の３００％ｇのランペトラ・
フルピアチリス（Ｌａｍｐｅｔｒａ ｆｌｕｖｌａｔ
ｉｌｉｓ）のビテリンを与えた。最初の注入後６日に、
動物にさらに１１００ＩＬのビテリンを腹腔内に投与し
た。免疫の応答は、この第２回の投与後３日に、放射線
免疫検定法（ＲＩＡ）において抗原特異的血清抗体を決
定することにより検査した。検眼かの（ｒｅｔ ｒｏ−
ｏ ｒｂｔ ｔ ａ ｌ）静脈叢の穿刺により血液を得
た。ｌＯＯルｇのビテリンの第３回目の注入をさらに１
０日後に実施した。第３回目の抗原の注入後３〜６日に
、動物を飽和Ｃ０２雰囲気中で殺し、モして肺臓を無菌
条件下に切除し、モして磨砕より個々の細胞懸濁液に粉
砕した。細胞をＢＳＳ （均衡塩溶液）で２回洗浄し１
次いで培地ＲＰ、ＭＩ１６４０＠ （ＫＣ生物学的）培
地／１０％のＦｅ２の中に取り、モしてＸ６３細胞と混
合した。使用したすべての細胞をＲＰＭＩ １６４０＠
培地（ＫＣ生物学的）中でｉｏ％のＲＣ３，３０ＩＵ／
ｍ１（７）ペニシリン、３０ｐ、ｇのストレプトマイシ
ン（ＫＣ生物学的）および２ミリモルのグルタミン（Ｋ
Ｃ生物学的）の存在下に３７℃で５％のＣＯ２のもとに
培養した。
ｊ ラム溶液（ＰＢＳ）中の３００％ｇのランペトラ・
フルピアチリス（Ｌａｍｐｅｔｒａ ｆｌｕｖｌａｔ
ｉｌｉｓ）のビテリンを与えた。最初の注入後６日に、
動物にさらに１１００ＩＬのビテリンを腹腔内に投与し
た。免疫の応答は、この第２回の投与後３日に、放射線
免疫検定法（ＲＩＡ）において抗原特異的血清抗体を決
定することにより検査した。検眼かの（ｒｅｔ ｒｏ−
ｏ ｒｂｔ ｔ ａ ｌ）静脈叢の穿刺により血液を得
た。ｌＯＯルｇのビテリンの第３回目の注入をさらに１
０日後に実施した。第３回目の抗原の注入後３〜６日に
、動物を飽和Ｃ０２雰囲気中で殺し、モして肺臓を無菌
条件下に切除し、モして磨砕より個々の細胞懸濁液に粉
砕した。細胞をＢＳＳ （均衡塩溶液）で２回洗浄し１
次いで培地ＲＰ、ＭＩ１６４０＠ （ＫＣ生物学的）培
地／１０％のＦｅ２の中に取り、モしてＸ６３細胞と混
合した。使用したすべての細胞をＲＰＭＩ １６４０＠
培地（ＫＣ生物学的）中でｉｏ％のＲＣ３，３０ＩＵ／
ｍ１（７）ペニシリン、３０ｐ、ｇのストレプトマイシ
ン（ＫＣ生物学的）および２ミリモルのグルタミン（Ｋ
Ｃ生物学的）の存在下に３７℃で５％のＣＯ２のもとに
培養した。
骨髄腫細胞より２倍ないし２０倍多いリンパ球を使用し
て、とくに高い融合収率が得られた。１骨髄腫細胞：２
リンパ球〜１骨髄腫細胞＝８リンパ球の混合比は、非常
にとくに適当であることが明らかにされた。
て、とくに高い融合収率が得られた。１骨髄腫細胞：２
リンパ球〜１骨髄腫細胞＝８リンパ球の混合比は、非常
にとくに適当であることが明らかにされた。
後述する実験浴において、ｔ、５ｘｔｏ’のＸ６３細胞
および３．０ＸｌＯフの牌細胞を混合し、そしてエッペ
ンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機のエッペンドル
フ反応器中で２０００×ｇにおいて８秒間遠心した。上
澄み掖を完全に除去し、そして第１図の電極装置を細胞
の沈殿物の中に挿入した。
および３．０ＸｌＯフの牌細胞を混合し、そしてエッペ
ンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機のエッペンドル
フ反応器中で２０００×ｇにおいて８秒間遠心した。上
澄み掖を完全に除去し、そして第１図の電極装置を細胞
の沈殿物の中に挿入した。
示す４実験の各々において、２パルスを細胞に６０秒の
間隔で適用した。対照バッチは実験バッチと同様に処理
したが、パルスを適用しなかった。
間隔で適用した。対照バッチは実験バッチと同様に処理
したが、パルスを適用しなかった。
最後のパルス後３０秒に、電極を細胞沈降物から注意し
て除去し、そして細胞を１ｍｌのＲＰＭ１１６４０＠＋
ｌＯ％のＦｅ２で覆った。室温で６０分間インキュベー
ジ、ンした後、沈降物を注意した再懸濁させ、そして細
胞をｔｘｔｏ・細胞／ ｍ ｌに希釈し、そして培養板
［コスタ−（Ｃ。
て除去し、そして細胞を１ｍｌのＲＰＭ１１６４０＠＋
ｌＯ％のＦｅ２で覆った。室温で６０分間インキュベー
ジ、ンした後、沈降物を注意した再懸濁させ、そして細
胞をｔｘｔｏ・細胞／ ｍ ｌに希釈し、そして培養板
［コスタ−（Ｃ。
５ｔａｒ）］ に接種した。
Ｘ６３ハイブリドーマ細胞をＨＡＴ選択培地中で選択し
た。この目的に、５トモルの７ミノプテリン、１００ト
モルのハイポキサンチンおよび４０ｐモルのチミジン［
すべてはフロー拳ラボラトリーズ（Ｆｌｏｅ Ｌａｂ
、）から入手可能］を正常ＲＰＭＩ １６４０＠培地（
１０％のＦｅ２）に添加した。
た。この目的に、５トモルの７ミノプテリン、１００ト
モルのハイポキサンチンおよび４０ｐモルのチミジン［
すべてはフロー拳ラボラトリーズ（Ｆｌｏｅ Ｌａｂ
、）から入手可能］を正常ＲＰＭＩ １６４０＠培地（
１０％のＦｅ２）に添加した。
ム
振幅 パルス クローン
融合Ｎｏ、 ＫＶ／ａｍ の数 の数２゜５
２ ２３３ ３゜０ ２ １８３ ３．５ ２ ２２ ４．０ ２ ２４ ＩＬ（続き） Ｉｇ陽性（％） 抗原陽性（％） ０ ０（対照バッチ） 測定せず 測定せず 測定せず 測定せず パルスの半値幅はすべての場合において３０ＩＬ秒であ
った。
２ ２３３ ３゜０ ２ １８３ ３．５ ２ ２２ ４．０ ２ ２４ ＩＬ（続き） Ｉｇ陽性（％） 抗原陽性（％） ０ ０（対照バッチ） 測定せず 測定せず 測定せず 測定せず パルスの半値幅はすべての場合において３０ＩＬ秒であ
った。
生産されたクローンの培養物からの上澄み液を、再クロ
ーニング後に、ＲＩＡにおいて免疫グロブリンについて
試験した。
ーニング後に、ＲＩＡにおいて免疫グロブリンについて
試験した。
抗体を培地中に分泌した雑種クローンを、特異的放射線
免疫検定法（ＲＩ Ａ）において抗体特異性について試
験した。
免疫検定法（ＲＩ Ａ）において抗体特異性について試
験した。
ＲＩＡは使捨て容器（ＦＬＯＷ Ｍ １７４５１）
内で次の方法に従い実施した： −容器の丸底を１．００７ｚ Ｉのランペトラ番フルビ
アチリス（Ｌａｍｐｅｔｒａ ｆｌｕｖｉａｔｉ １
ｉ Ｓ） ｒｙ）ビテリン（１ｍｇ／ｍ１、ＰＢＳ中
）で４℃で２４時間被覆する。
内で次の方法に従い実施した： −容器の丸底を１．００７ｚ Ｉのランペトラ番フルビ
アチリス（Ｌａｍｐｅｔｒａ ｆｌｕｖｉａｔｉ １
ｉ Ｓ） ｒｙ）ビテリン（１ｍｇ／ｍ１、ＰＢＳ中
）で４℃で２４時間被覆する。
一容器をリン酸塩緩衝化塩化ナトリウム溶液（ＰＢＳ）
＋３％のＢＳＡで３回洗浄する。
＋３％のＢＳＡで３回洗浄する。
−室温においてＰＢＳ、３％のＢＳＡとともに２時間イ
ンキュベーションする。
ンキュベーションする。
−ＰＢＳ、０゜３％のＢＳＡで３回洗浄する。
一試験すべき培養物の上澄み液の１００１Ｌｌを室温で
２時間添加する。
２時間添加する。
一容器をＰＢＳ（０，３％のＢＳＡ）で３回洗浄する。
一１ｏＯＩＬｌｃ７）”’Ｉ標識抗マウス免疫グロブリ
ン（１２０，０００ｃｐｍ、ヤギ抗マウスエｇ、１００
ＩＬＣｉ／ｍｌのＮＥＸ １５９、ＮＥＮに相当する
）を室温で２時間添加する。
ン（１２０，０００ｃｐｍ、ヤギ抗マウスエｇ、１００
ＩＬＣｉ／ｍｌのＮＥＸ １５９、ＮＥＮに相当する
）を室温で２時間添加する。
−容器をＰＢＳで５回洗浄する。
一γ−カウンター（ＬＫＢ １２７０）で活性を測定
する。
する。
抗原特異性生産性を有するクローンのうちで、最大の数
の抗体を培地中に分泌する２２クローンをさらに培養し
た。生体外の１０継代培養後、これらの細胞をＢａ１ｂ
／ｃマウスの腹腔内に注入して腹水症を発生させた。こ
のマウスの継代培養後に、クローンのうち１３のクロー
ンは免疫プロプリンの生産を停止していたか、あるいは
抗体の量は無視しうるほどに少なかった。
の抗体を培地中に分泌する２２クローンをさらに培養し
た。生体外の１０継代培養後、これらの細胞をＢａ１ｂ
／ｃマウスの腹腔内に注入して腹水症を発生させた。こ
のマウスの継代培養後に、クローンのうち１３のクロー
ンは免疫プロプリンの生産を停止していたか、あるいは
抗体の量は無視しうるほどに少なかった。
残りの９のクローンを、それらの染色体の数について、
およびまたそれらにより生産された抗ビテリン蛋白質抗
体のクラス（ｃｌａｓｓ）について検査した。
およびまたそれらにより生産された抗ビテリン蛋白質抗
体のクラス（ｃｌａｓｓ）について検査した。
染色体の数は、すべての場合において、融合しない細胞
について期待されるものよりも大きい。
について期待されるものよりも大きい。
Ｉｇのクラスの決定は、特異的抗血清を使用するオウチ
ターロニイ（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散試験に
より実施した。
ターロニイ（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散試験に
より実施した。
表２が示すように、２つのクローンはクラス■ｇＭの抗
体を生産し、そして７つのクローンはＩｇＧ１抗体を生
産した。
体を生産し、そして７つのクローンはＩｇＧ１抗体を生
産した。
友ヱ
クローンの番号 Ｉｇのクラス 染色体の数７
Ｇｌ ７９ ８ Ｍ ７８ ９ Ｇ１ ７６ １１ Ｇ１ ８８ １８ Ｇｌ ６４１９
Ｍ ７４２０ Ｇ１
７６ ２１ Ｇｌ 測定せず２２
Ｇｌ ９４Ｘ６３ 融合せず
４６マウスのリンパ球 ４０
支電１」 マウス ヒト ヘーロハ ブリ′−マ ヘテ０ハイブリドーマ（ｈｅｔｅｒｏｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａｓ）を生産するために・、ネズミの骨髄腫系統Ｘ６３
Ａｇ ８６５３をヒト抹消血管リンパ球（ｈＰＢ
Ｌ）と融合した。ｘ６３細胞系統は酵素に欠乏するため
に、得られるヘテロハイブリドーマはＨＡＴ培地中で選
択することができる。
Ｇｌ ７９ ８ Ｍ ７８ ９ Ｇ１ ７６ １１ Ｇ１ ８８ １８ Ｇｌ ６４１９
Ｍ ７４２０ Ｇ１
７６ ２１ Ｇｌ 測定せず２２
Ｇｌ ９４Ｘ６３ 融合せず
４６マウスのリンパ球 ４０
支電１」 マウス ヒト ヘーロハ ブリ′−マ ヘテ０ハイブリドーマ（ｈｅｔｅｒｏｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａｓ）を生産するために・、ネズミの骨髄腫系統Ｘ６３
Ａｇ ８６５３をヒト抹消血管リンパ球（ｈＰＢ
Ｌ）と融合した。ｘ６３細胞系統は酵素に欠乏するため
に、得られるヘテロハイブリドーマはＨＡＴ培地中で選
択することができる。
ｈＰＢＬは淡黄色コート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｌ）（
全血の遠心分離後に赤血球上に静止するリンハ球層）か
ら、フィコール・ハイバーク（Ｆｉｃｏ ｌ Ｉ Ｈ
ｙａｑｕｅ＠）を使用する勾配遠心により単離し、そし
て、単離後、ＢＳＳで２回洗浄した。
全血の遠心分離後に赤血球上に静止するリンハ球層）か
ら、フィコール・ハイバーク（Ｆｉｃｏ ｌ Ｉ Ｈ
ｙａｑｕｅ＠）を使用する勾配遠心により単離し、そし
て、単離後、ＢＳＳで２回洗浄した。
細胞を１０％のＦｅ２を含むＲＰＭ１１６４００培地中
に取り、ｘ６３細胞と２：１の牌で混合し、細胞の合計
数は１．５ＸＩＯ？細胞／実験であった。この細胞混合
物をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機のエ
ッペンドルフ反応器中２０００Ｘｇにおいて１０秒間沈
降させた。
に取り、ｘ６３細胞と２：１の牌で混合し、細胞の合計
数は１．５ＸＩＯ？細胞／実験であった。この細胞混合
物をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機のエ
ッペンドルフ反応器中２０００Ｘｇにおいて１０秒間沈
降させた。
遠心後、上澄み液の培地を完全に除去し、そして第１図
に示す電極装置を細胞沈降物中に挿入した。
に示す電極装置を細胞沈降物中に挿入した。
各々３．５ｋＶ／ｃｍおよび３０ル秒の期間の３パルス
を６０秒の間隔で適用して、細胞沈降物中で細胞融合に
導いた。
を６０秒の間隔で適用して、細胞沈降物中で細胞融合に
導いた。
最後のパルスの適用後６０秒に、電極を細胞沈殿物から
注意して除去し、そして細胞をＲＰＭ１１６４０＠培地
／１０％のＦｅ２で覆った。室温で３０分のインキュベ
ーション後、細胞を再懸濁させ、そしてコスタ−板の中
に１×１０・細胞／ｍｌのＲＰＭＩ＋ｌＯ％のＦＣ３＋
ＨＡＴ（７）最終濃度でまいた。
注意して除去し、そして細胞をＲＰＭ１１６４０＠培地
／１０％のＦｅ２で覆った。室温で３０分のインキュベ
ーション後、細胞を再懸濁させ、そしてコスタ−板の中
に１×１０・細胞／ｍｌのＲＰＭＩ＋ｌＯ％のＦＣ３＋
ＨＡＴ（７）最終濃度でまいた。
１１日後、最初の雑種クローンが培養板の中に発現した
。１４日後、合計７０のクローンを選択培地において検
出することができた。
。１４日後、合計７０のクローンを選択培地において検
出することができた。
同様に増殖したリンパ球から形態学的に良好に分化した
雑種細胞は、約１０００〜２０００細胞のクローンの集
団に生長した。融合後２０〜２５日に、細胞は不規則に
発生する細胞分割を示し、そして死亡した。
雑種細胞は、約１０００〜２０００細胞のクローンの集
団に生長した。融合後２０〜２５日に、細胞は不規則に
発生する細胞分割を示し、そして死亡した。
酵素に欠乏する（ハイホキサンチン−ホスホリボシルト
ランスフェラーゼ陰性）ヒト骨髄腫細胞系統Ｗ Ｉ −
Ｌ ２ ｃ ｌ ３を電気融合およびハイブリドーマの
培養に使用できるかどうかについて試験するために、１
０’の骨髄腫細胞をＢａ１ｂ／ｃマウスの４ＸｌＯ”７
の牌細胞と融合した。このため、細胞を、−緒に沈降さ
せた後、４ｋＶ／ｃｍの電気パルスに６０秒の間隔で２
回暴露させた。第２回目のパルス後６０秒に、電極を注
意して除去し、そして細胞をＲＰＭＩ１６４０’＠／１
０％のＦｅ２で覆った。室温において１時間インキュベ
ーションした後、細胞を再懸濁させ、モして１０−５細
胞７０．２ｍｌの濃度でマイクロプレート （ｍｉｃｒ
ｏｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）の中にまいた。ウ
ェルには１日前にｉｏｓのマウス牌細胞／マイクロプレ
ートのウェルがフィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅ
ｌｌ）として導入されていた。ハイブリ・ドーマの培養
に使用した選択培地はＲＰＭＩ１６４０＠＋ｌＯ％のＦ
ＣＳ＋５０１ＬモルのハイポキサンチンおよびｌＯｐモ
ルのアザセリンであった。１３日後、１０マイクロプレ
ートのウェル当り４クローンの比が見出された。これら
のクローンはそれ以上詳しく研究しなかった。
ランスフェラーゼ陰性）ヒト骨髄腫細胞系統Ｗ Ｉ −
Ｌ ２ ｃ ｌ ３を電気融合およびハイブリドーマの
培養に使用できるかどうかについて試験するために、１
０’の骨髄腫細胞をＢａ１ｂ／ｃマウスの４ＸｌＯ”７
の牌細胞と融合した。このため、細胞を、−緒に沈降さ
せた後、４ｋＶ／ｃｍの電気パルスに６０秒の間隔で２
回暴露させた。第２回目のパルス後６０秒に、電極を注
意して除去し、そして細胞をＲＰＭＩ１６４０’＠／１
０％のＦｅ２で覆った。室温において１時間インキュベ
ーションした後、細胞を再懸濁させ、モして１０−５細
胞７０．２ｍｌの濃度でマイクロプレート （ｍｉｃｒ
ｏｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）の中にまいた。ウ
ェルには１日前にｉｏｓのマウス牌細胞／マイクロプレ
ートのウェルがフィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅ
ｌｌ）として導入されていた。ハイブリ・ドーマの培養
に使用した選択培地はＲＰＭＩ１６４０＠＋ｌＯ％のＦ
ＣＳ＋５０１ＬモルのハイポキサンチンおよびｌＯｐモ
ルのアザセリンであった。１３日後、１０マイクロプレ
ートのウェル当り４クローンの比が見出された。これら
のクローンはそれ以上詳しく研究しなかった。
１０？の対数期のＷＩ−Ｌ２ｃ１３細胞および抹消血管
からの刺激されていない単核細胞［フィコール（Ｆｉｃ
ｏｌｌ）分離後］を混合した。２パルスの５ｋＶ／ｃｍ
を細胞沈殿物に適用しく１分の間隔で）次いで１ｍｌの
培養基（ＲＰＭＩＩｓａｏｅ＋ｔｏ％んＰＦＣ３）を添
加した。１時間後、細胞をマイクロプレートのウェル（
培養容ｆｉ０．２ｍｌ／ウェル）の中にまいた。培養基
の組成は次の通りであった：ＲＰＭＩ１６４０＠＋ペニ
シリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｌｏ
ｏＪＬｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ミリモル）、へ
ペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液（４ミリモル）、２−メルカ
プトエタノール（５０ＪＬモル）および１０％（Ｖ／Ｖ
）のウシ胎児血清（Ｆｅ８）ならびにハイポキサンチン
（５０ｐモル）およびアザセリン（１０ＩＬモル）［プ
ッチン（Ｂｕｔｔｉｎ）ら：Ｆ、メルチャーズ（Ｍｅｌ
ｃｈｅｒｓ）、Ｍ、ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）およびＮ
、ワーナー（Ｗａｒｎｅｒｒ）、リンパ球のハイブリド
ーマ（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
）、スプリンガー・フェルラーグ・ベルリン−ハイデル
ベルグ−ニューヨーク、１９７９．２７−３６１．培養
物のインキュベーションを湿気飽和空気中で３７℃およ
び７．５％のＣ０２で実施した。
からの刺激されていない単核細胞［フィコール（Ｆｉｃ
ｏｌｌ）分離後］を混合した。２パルスの５ｋＶ／ｃｍ
を細胞沈殿物に適用しく１分の間隔で）次いで１ｍｌの
培養基（ＲＰＭＩＩｓａｏｅ＋ｔｏ％んＰＦＣ３）を添
加した。１時間後、細胞をマイクロプレートのウェル（
培養容ｆｉ０．２ｍｌ／ウェル）の中にまいた。培養基
の組成は次の通りであった：ＲＰＭＩ１６４０＠＋ペニ
シリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｌｏ
ｏＪＬｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ミリモル）、へ
ペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液（４ミリモル）、２−メルカ
プトエタノール（５０ＪＬモル）および１０％（Ｖ／Ｖ
）のウシ胎児血清（Ｆｅ８）ならびにハイポキサンチン
（５０ｐモル）およびアザセリン（１０ＩＬモル）［プ
ッチン（Ｂｕｔｔｉｎ）ら：Ｆ、メルチャーズ（Ｍｅｌ
ｃｈｅｒｓ）、Ｍ、ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）およびＮ
、ワーナー（Ｗａｒｎｅｒｒ）、リンパ球のハイブリド
ーマ（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
）、スプリンガー・フェルラーグ・ベルリン−ハイデル
ベルグ−ニューヨーク、１９７９．２７−３６１．培養
物のインキュベーションを湿気飽和空気中で３７℃およ
び７．５％のＣ０２で実施した。
２０〜２６日後、マイクロプレートのウェルをクローン
の生長について検査し、そしてクローンが生長している
ウェルを培養物の上澄み液中の抗体の存在について次の
ようにしてサンドイッチのエリザ（Ｅｌｉｓａ）により
試験した：ヤギからの抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒ） Ｉ
ｇＭ抗体［メダック（Ｍｅｄａｃ）社、ハンブルグ］を
ＰＢＳでｌ：１００に希釈し、マイクロエリザ（ｍｉｃ
ｒ。
の生長について検査し、そしてクローンが生長している
ウェルを培養物の上澄み液中の抗体の存在について次の
ようにしてサンドイッチのエリザ（Ｅｌｉｓａ）により
試験した：ヤギからの抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒ） Ｉ
ｇＭ抗体［メダック（Ｍｅｄａｃ）社、ハンブルグ］を
ＰＢＳでｌ：１００に希釈し、マイクロエリザ（ｍｉｃ
ｒ。
ｅｌｉｓａ）板［イムノロン（Ｉｍｍｕｎ ｏ ｌ 。
ｎ）■］中で４℃において（１００ｇｌ／ウェル）−夜
インキュベーシオンすることにより結合し、そして形成
的な表面を１％のオバルミン溶液で飽和した０次いで、
５０ＩＬ１の細胞培養物の上澄み液またはヒト対照Ｉｇ
ＧまたはＩｇＭ（メダック）または培養基を添加し、４
℃で一夜インキユベーションした。
インキュベーシオンすることにより結合し、そして形成
的な表面を１％のオバルミン溶液で飽和した０次いで、
５０ＩＬ１の細胞培養物の上澄み液またはヒト対照Ｉｇ
ＧまたはＩｇＭ（メダック）または培養基を添加し、４
℃で一夜インキユベーションした。
特異的結合を明らかにするために、物質を５０ｐｔの抗
と）ＩｇＧまたは抗ヒ） Ｉ ｇＭヤギ抗体（これらの
抗体にはペルオキシダーゼが複合している）［ＰＢＳ／
ツイ−ｙ （Ｔｗｅ ｅ ｎ） ２０＠（２０００：
１）で１ ： ２００に希釈されている；メダック社］
で覆い、そして３７℃で２時間インキュベーションした
。
と）ＩｇＧまたは抗ヒ） Ｉ ｇＭヤギ抗体（これらの
抗体にはペルオキシダーゼが複合している）［ＰＢＳ／
ツイ−ｙ （Ｔｗｅ ｅ ｎ） ２０＠（２０００：
１）で１ ： ２００に希釈されている；メダック社］
で覆い、そして３７℃で２時間インキュベーションした
。
すべての工程の間において、物質をＰＢＳ／ツイーン２
０＠で３〜５回洗浄した。５０１ＬｌのＨ２Ｏ２／クロ
モゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）溶液を添加した［１ｍｌ
のＡＢＴＳ溶液（２、２’−アジノージー３−エチルー
ベンゾチアゾリン−スルホン酸）当り２５終ｌのＰＢＳ
中のＨ２ｏ２の０・１％の溶液；１ｍｇ／ｍｌのクエン
酸緩衝液、ＰＨ４］。
０＠で３〜５回洗浄した。５０１ＬｌのＨ２Ｏ２／クロ
モゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）溶液を添加した［１ｍｌ
のＡＢＴＳ溶液（２、２’−アジノージー３−エチルー
ベンゾチアゾリン−スルホン酸）当り２５終ｌのＰＢＳ
中のＨ２ｏ２の０・１％の溶液；１ｍｇ／ｍｌのクエン
酸緩衝液、ＰＨ４］。
この反応を１５０１Ｌｌ ｃ７） ０ 、５％ｃｙ）Ｎ
ａＮ３溶液で停止させ、そして吸光を４０５ｎｍにおい
てマイクロエリザ読取器で測定した。
ａＮ３溶液で停止させ、そして吸光を４０５ｎｍにおい
てマイクロエリザ読取器で測定した。
表３は、ａ）１つの実験においてクローンが生長したマ
イクロプレートのウェルの数、およびｂ）上澄み液中で
抗体が検出可能であったクローンの比率を示す。
イクロプレートのウェルの数、およびｂ）上澄み液中で
抗体が検出可能であったクローンの比率を示す。
１】
ヒ ハ ブリ ′−マ びウェル クロー
ンを ＩｇＭ陽性の ＩｇＧ陽性含むウェル 上澄み液
の上澄み液選択培地中で生長した細胞は、融合相
手の細胞よりも顕著に大きい、核学的研究によると、こ
れらの細胞の染色体の数はリンパ球または骨髄腫細胞中
の染色体の数よりも大きいが、２つの融合相手の染色体
の合計よりも小さいことが示される。
ンを ＩｇＭ陽性の ＩｇＧ陽性含むウェル 上澄み液
の上澄み液選択培地中で生長した細胞は、融合相
手の細胞よりも顕著に大きい、核学的研究によると、こ
れらの細胞の染色体の数はリンパ球または骨髄腫細胞中
の染色体の数よりも大きいが、２つの融合相手の染色体
の合計よりも小さいことが示される。
第１図は、短くかつ電気的に高い電圧パルスを発生する
ために本発明において使用する電気パルス発生器きを示
し、この発生器は高電圧装置（１）、それにより抵抗器
（３）を経て充電されるコンデンサ（２）、および手動
操作により切換え可能な水素充填サイラトロン管（４）
の形態の高速作動抗電圧スイッチから成る。 ｌ 高電圧装置 ２ コンデンサ ３ 抵抗器 ４ サイラトロン管
ために本発明において使用する電気パルス発生器きを示
し、この発生器は高電圧装置（１）、それにより抵抗器
（３）を経て充電されるコンデンサ（２）、および手動
操作により切換え可能な水素充填サイラトロン管（４）
の形態の高速作動抗電圧スイッチから成る。 ｌ 高電圧装置 ２ コンデンサ ３ 抵抗器 ４ サイラトロン管
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、電気融合の実施に要求される融合すべき細胞間の細
胞の接触を機械的に発生させることを特徴とする電気融
合によりハイブリドーマ細胞系統を調製する方法。 ２、細胞の接触は遠心により発生させることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、細胞の接触は濾過により発生させることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、細胞の接触は透析により発生させることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法
により調製されたことを特徴とするハイブリドーマ細胞
系統。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853507398 DE3507398A1 (de) | 1985-03-02 | 1985-03-02 | Methode zur fusionierung biologischer zellen mit hilfe elektrischer impulse |
| DE3507398.5 | 1985-03-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61205488A true JPS61205488A (ja) | 1986-09-11 |
Family
ID=6264002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61045135A Pending JPS61205488A (ja) | 1985-03-02 | 1986-03-01 | 電気パルスによる生物学的細胞の融合法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0193769A1 (ja) |
| JP (1) | JPS61205488A (ja) |
| DE (1) | DE3507398A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4752284A (en) * | 1986-12-05 | 1988-06-21 | Biscar Jean P | Artificial gravity intracellular molecular extraction |
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Family Cites Families (2)
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- 1986-03-01 JP JP61045135A patent/JPS61205488A/ja active Pending
Also Published As
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| EP0193769A1 (de) | 1986-09-10 |
| DE3507398A1 (de) | 1986-09-04 |
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