JPS6118A - Ｄｎａ合成抑制物質 - Google Patents
Ｄｎａ合成抑制物質Info
- Publication number
- JPS6118A JPS6118A JP59117982A JP11798284A JPS6118A JP S6118 A JPS6118 A JP S6118A JP 59117982 A JP59117982 A JP 59117982A JP 11798284 A JP11798284 A JP 11798284A JP S6118 A JPS6118 A JP S6118A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna synthesis
- cell
- cells
- stable
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は新規なＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質に関し、自己
免疫疾患などの治療薬として利用できる。
免疫疾患などの治療薬として利用できる。
従来の技術
従来、Ｔ細胞などの免疫担当細胞における免疫活性の異
常な亢進による各種の自己免疫疾患などに対する治療に
はステロイド、イムランなどが用いられている。たとえ
ば、免疫細胞に対する抑制物質は、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、 皿１５４−１６３（１９７２） 。
常な亢進による各種の自己免疫疾患などに対する治療に
はステロイド、イムランなどが用いられている。たとえ
ば、免疫細胞に対する抑制物質は、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、 皿１５４−１６３（１９７２） 。
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 、１１６．１４５２−１４５１
１（１９７６）、ｌｎｆｌａｍａｔｉｏｎム５−２．１
（１！１７５）などに記載がある。
１（１９７６）、ｌｎｆｌａｍａｔｉｏｎム５−２．１
（１！１７５）などに記載がある。
発明が解決しようとする問題点
これらの既知物質は、特定の疾病にはある程度の治療効
果が認められるが、正常細胞に対し副腎の機能低下、白
血球数の減少などの副作用がある。
果が認められるが、正常細胞に対し副腎の機能低下、白
血球数の減少などの副作用がある。
またこれらの既知物質はいずれも高分子物質であるため
、患者の免疫的拒絶反応等の副作用を惹起する可能性が
ある。
、患者の免疫的拒絶反応等の副作用を惹起する可能性が
ある。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、自己免疫疾患の治療薬について研究を行
った結果、哺乳動物の血清、昆虫体液、昆虫細胞の培養
物などに免疫細胞（Ｔ細胞）のＤＮＡ合成を抑制する物
質が含まれており、この物質が免疫細胞の活性を抑制し
て自己免疫疾患に対する治療に有用であることを見出し
本発明を完成するに至った。
った結果、哺乳動物の血清、昆虫体液、昆虫細胞の培養
物などに免疫細胞（Ｔ細胞）のＤＮＡ合成を抑制する物
質が含まれており、この物質が免疫細胞の活性を抑制し
て自己免疫疾患に対する治療に有用であることを見出し
本発明を完成するに至った。
本発明の物質は哺乳動物に由来する低分子ペプチドであ
るため副作用が低いことが予想され、免疫疾患への応用
が期待される。
るため副作用が低いことが予想され、免疫疾患への応用
が期待される。
本物質は、また哺乳動物血清、昆虫体液または昆虫細胞
℃培養物から採取することによっても得ることができる
。
℃培養物から採取することによっても得ることができる
。
哺乳動物としては、ヒト、ウシ、ラット、マウスなどが
あげられる。昆虫としては、鱗翅類、双翅類、膜翅類な
どの昆虫類たとえばカイコガ、ヤママユガ、ニクバエ、
ミツバチなどが用いられる。
あげられる。昆虫としては、鱗翅類、双翅類、膜翅類な
どの昆虫類たとえばカイコガ、ヤママユガ、ニクバエ、
ミツバチなどが用いられる。
哺乳動物血清、昆虫体液からの本物質の採取は、これら
を遠心分離にかけ上清を回収し、それに２倍容量の飽和
硫安（ｐＨ７，５）を加え、塩析処理する。塩析処理物
を遠心分離して得た沈澱物を生理食塩水にとかし、セフ
ァデックス６１００カラムにかけ、生理食塩水で溶出す
る。低分子物質を含む画分にＴ細胞のＤＮＡ合成を抑制
する活性が認められる。その活性画分を２倍容量の蒸留
水で希釈し、ＣＭセファデックスにかける。５０ｍＭ食
塩水でカラムを洗ったのち、食塩の濃度勾配で溶出する
。
を遠心分離にかけ上清を回収し、それに２倍容量の飽和
硫安（ｐＨ７，５）を加え、塩析処理する。塩析処理物
を遠心分離して得た沈澱物を生理食塩水にとかし、セフ
ァデックス６１００カラムにかけ、生理食塩水で溶出す
る。低分子物質を含む画分にＴ細胞のＤＮＡ合成を抑制
する活性が認められる。その活性画分を２倍容量の蒸留
水で希釈し、ＣＭセファデックスにかける。５０ｍＭ食
塩水でカラムを洗ったのち、食塩の濃度勾配で溶出する
。
本物質は約８００ｍＭ食塩水で溶出されてくるので、そ
の活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、セフ
ァデックス０５０カラムにかけ、生理的食塩水で溶出す
る。分子量約１．０００ダルトンの位置に活性が認めら
れるので、活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮
しシリカゲル薄層クロマトグラフィーにスポットしメタ
ノール水溶媒系で展開する。その結果１つのニンヒドリ
ン陽性スポットが認められる。その部分のシリカゲルを
回収し、水によって本物質を抽出する。
の活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、セフ
ァデックス０５０カラムにかけ、生理的食塩水で溶出す
る。分子量約１．０００ダルトンの位置に活性が認めら
れるので、活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮
しシリカゲル薄層クロマトグラフィーにスポットしメタ
ノール水溶媒系で展開する。その結果１つのニンヒドリ
ン陽性スポットが認められる。その部分のシリカゲルを
回収し、水によって本物質を抽出する。
昆虫の細胞としては、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ
ａｎｋａｌｙｐｔｉ ）より確立した線維芽細胞（Ｇｒ
ａｃｅ。
ａｎｋａｌｙｐｔｉ ）より確立した線維芽細胞（Ｇｒ
ａｃｅ。
Ｎａｔｕｒｅ、 １９５．７８８（１９６２） ）が好
適な例としてあげられる。
適な例としてあげられる。
培地としては、動物細胞の培養に使用するものであれば
、いかなる培地をも用いることができる。
、いかなる培地をも用いることができる。
好適にはＲＰＭ１１６４０培地、ＭＥＭ培地などが用い
られる。ＲＰＭ１１６４０培地およびＭＥＭ培地の組成
については「組織培養」中井準之助ら編集、朝倉書店、
９−１１頁、１９７６年を参照。
られる。ＲＰＭ１１６４０培地およびＭＥＭ培地の組成
については「組織培養」中井準之助ら編集、朝倉書店、
９−１１頁、１９７６年を参照。
培地には牛胎児血清を１〜１０％加えてもよい。
またフォルボールエステル類を培地に添加することによ
り本物質の生成が向上する。
り本物質の生成が向上する。
フォルボールエステルとしては、フォルボールミリステ
ート、フォルボール−１３−アセテート、１２−０−テ
トラデカノイル−フォルボール−１３−アセテート（Ｔ
ＰＡ）などが好適に用いられる。
ート、フォルボール−１３−アセテート、１２−０−テ
トラデカノイル−フォルボール−１３−アセテート（Ｔ
ＰＡ）などが好適に用いられる。
フォルボールの濃度は、通常培養液１ｍｌ当り１１−１
Ｏ００ｎ、好ましくは１１０−１Ｏ０ｎの範囲で用いる
。
Ｏ００ｎ、好ましくは１１０−１Ｏ０ｎの範囲で用いる
。
培養は通常の動物細胞の培養条件に従って、液体、通気
培養を行う。通気は、５−１０％ｃｏ２．９０−９５％
空気を用いる。培養温度は２５−４０℃、好ましくは３
０−３７℃、ｐＨは７．５−８．５、好ましくは７．８
−８．０である。培養時間は２時間〜３日間が好適であ
る。培養物からの本物質の採取は、上記と同様に行う。
培養を行う。通気は、５−１０％ｃｏ２．９０−９５％
空気を用いる。培養温度は２５−４０℃、好ましくは３
０−３７℃、ｐＨは７．５−８．５、好ましくは７．８
−８．０である。培養時間は２時間〜３日間が好適であ
る。培養物からの本物質の採取は、上記と同様に行う。
採取行程中、Ｔ細胞のＤＮＡ合成活性の測定は次のとお
りに行う。
りに行う。
０．１ｍｌ（７）ＲＰＭ Ｉ １６４０−１０％牛脂児
血清中に懸濁した２、５Ｘ１０５個のｃ３Ｈ／Ｈｅマウ
スの胸腺細胞を０．１ｍｌの上清またはカラムクロマト
グラフィーの各面分と混合し、２．５μｇ ／ｍｌのコ
ンカナバリンＡを加えて２日間イン・ビトロで培養する
。最後の２０時間を１μＣｉの〔３Ｈ〕チミジンでパル
スラベルし、胸腺細胞にとりこまれた〔３Ｈ〕チミジン
を計測する。
血清中に懸濁した２、５Ｘ１０５個のｃ３Ｈ／Ｈｅマウ
スの胸腺細胞を０．１ｍｌの上清またはカラムクロマト
グラフィーの各面分と混合し、２．５μｇ ／ｍｌのコ
ンカナバリンＡを加えて２日間イン・ビトロで培養する
。最後の２０時間を１μＣｉの〔３Ｈ〕チミジンでパル
スラベルし、胸腺細胞にとりこまれた〔３Ｈ〕チミジン
を計測する。
かくして得られる本物質は低分子ペプチドであり、以下
の理化学的性質を示す。
の理化学的性質を示す。
■ 元素分析 ： ｃＳＨＳＯ，ＮおよびＳの元素を
有する。
有する。
■ 分子量 ： 約１．０００ダルトンのペプチド■
熱安定性 二 −２０℃で数カ月間安定（ｐＨ６，６
〜６．７） ５６℃で１時間安定１００℃で３０
分間安定 ■ 酸性・塩基性・中性の区別 ； 強塩基性■ ｐｐ
禿＠ｆ７ ： ｐＨ４，０〜９．５テ安定■ 紫外
線吸収スペクトル ： ２２０ｎｍに吸収極大を示す
。
熱安定性 二 −２０℃で数カ月間安定（ｐＨ６，６
〜６．７） ５６℃で１時間安定１００℃で３０
分間安定 ■ 酸性・塩基性・中性の区別 ； 強塩基性■ ｐｐ
禿＠ｆ７ ： ｐＨ４，０〜９．５テ安定■ 紫外
線吸収スペクトル ： ２２０ｎｍに吸収極大を示す
。
■ 呈色反応 ： ニンヒドリン陽性反応■ 溶解性
； 水、エタノール、メタノールに易溶。
； 水、エタノール、メタノールに易溶。
■ 物質の色 ： 上記溶媒に溶かすと無色０ トリプ
シン（５０μｇ ／ｍｌ ）処理（３７℃、１時間）で
Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制活性が消失する。
シン（５０μｇ ／ｍｌ ）処理（３７℃、１時間）で
Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制活性が消失する。
■ リボヌクレアーゼＡ（５０μｇ ／ｍｌ ）および
デオキシリボヌクレアーゼ１（５０μｇ ／ｍｌ ）処
理（３７℃、１時間）ではＴ細胞ＤＮＡ合成抑制活性に
影響を与えない。
デオキシリボヌクレアーゼ１（５０μｇ ／ｍｌ ）処
理（３７℃、１時間）ではＴ細胞ＤＮＡ合成抑制活性に
影響を与えない。
本物質の生物学的活性の測定は次のとおり行う。
Ｃ３Ｈ／Ｈｅのマウスの牌細胞または胸腺細胞それぞれ
５Ｘ１０’個を１０％牛脂児血清（ギブコ社製）を含む
ＲＰＭ Ｉ １６４０培地（田水製薬社製）に懸濁し、
コンカナバリンＡ（シグマ性製、最終濃度５９ ｇ ／
ｍ＋ ）存在下で５％Ｃｏ２．９５％空気の条件下で、
３日間培養する。培養最後の１日間、細胞を１μＣ１の
〔３Ｈ〕チミジン（英国Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ社製）でラベルした後、セルハーベスタ−
を使って細胞をＣＦ／ＣまたはＣＦ／Ｆメンブレンフィ
ルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製）にトラップする。そのメ
ンブレンを水とエタノールで洗い乾燥させ、細胞中にと
り込まれた〔″Ｈ〕チミジンの活性をベックマン・シン
チレーション・カウンターで測定する。
５Ｘ１０’個を１０％牛脂児血清（ギブコ社製）を含む
ＲＰＭ Ｉ １６４０培地（田水製薬社製）に懸濁し、
コンカナバリンＡ（シグマ性製、最終濃度５９ ｇ ／
ｍ＋ ）存在下で５％Ｃｏ２．９５％空気の条件下で、
３日間培養する。培養最後の１日間、細胞を１μＣ１の
〔３Ｈ〕チミジン（英国Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ社製）でラベルした後、セルハーベスタ−
を使って細胞をＣＦ／ＣまたはＣＦ／Ｆメンブレンフィ
ルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製）にトラップする。そのメ
ンブレンを水とエタノールで洗い乾燥させ、細胞中にと
り込まれた〔″Ｈ〕チミジンの活性をベックマン・シン
チレーション・カウンターで測定する。
その他の哺乳類細胞のＤＮＡ合成の活性測定は、細胞ｌ
Ｘｌ０’個を０．１ｍｌの１０％牛脂児血清を含むＲＰ
Ｍ１１６４０培地に懸濁し、測定する分画０．１ｍｌを
入れコンカナバリンＡ非存在下で２４時間培養する。最
後の８時間細胞を１μＣｉ〔３Ｈ〕チミジンでラベルす
る。他の条件は、上記リンパ球の場合と同じである。
Ｘｌ０’個を０．１ｍｌの１０％牛脂児血清を含むＲＰ
Ｍ１１６４０培地に懸濁し、測定する分画０．１ｍｌを
入れコンカナバリンＡ非存在下で２４時間培養する。最
後の８時間細胞を１μＣｉ〔３Ｈ〕チミジンでラベルす
る。他の条件は、上記リンパ球の場合と同じである。
と久デュエΩ旦ＮＡ査處皿負至遥旦
１０μｌのバクテリア（大腸菌、シニードモナス・マル
トフィリア、枯草菌など）懸濁液（０，５Ａｓｓｏｎｍ
）を９０μｌの５％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４
０培地で希釈し、各分画０．１ｍｌを加える。〔３Ｈ〕
チミジン１μＣｉを加えた後３７℃で一晩（１６時間）
バクテリアを培養する。
トフィリア、枯草菌など）懸濁液（０，５Ａｓｓｏｎｍ
）を９０μｌの５％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４
０培地で希釈し、各分画０．１ｍｌを加える。〔３Ｈ〕
チミジン１μＣｉを加えた後３７℃で一晩（１６時間）
バクテリアを培養する。
上記方法と同じ＜ＧＦ／Ｃメンブレンフィルターにバク
テリアをトラップした後チミジンの取り込みを測定する
。
テリアをトラップした後チミジンの取り込みを測定する
。
本物質のＴ細胞への作用機作は次のとおりである。
本物質の添加によるＴ細胞の生存率をトリパン６ブルー
を用いるｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ法によって調べる
と、無添加の系のものとあま゛り変わらない。つまり、
本物質は基本的にＴ細胞を殺さないがそのＤＮＡ合成の
みを抑制する。
を用いるｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ法によって調べる
と、無添加の系のものとあま゛り変わらない。つまり、
本物質は基本的にＴ細胞を殺さないがそのＤＮＡ合成の
みを抑制する。
各種細胞のＤＮＡ合成に対する抑制の程度は、哺乳類リ
ンパ球が最も強く、畷乳類線維芽細胞に対しても一定の
効果がある。しかし癌化した細胞には、効果は認められ
ない。バクテリアに対するＤＮＡ合成の抑制の効果は、
ダラム陰性菌である大腸菌で強く、ダラム陽性菌である
枯草菌では弱い。リンパ球ＤＮＡ合成反応に対する抑制
のメカニズムとしては、レクチン刺激後の比較的初期に
細胞膜の機能（例えばヌクレオチドの転送活性）を抑制
し、その後のＤＮＡ合成を特異的に抑制すると推定され
る。またこの物質群は、ＤＮＡ合成を強く抑制するが細
胞の生存率には、影響を与えない。
ンパ球が最も強く、畷乳類線維芽細胞に対しても一定の
効果がある。しかし癌化した細胞には、効果は認められ
ない。バクテリアに対するＤＮＡ合成の抑制の効果は、
ダラム陰性菌である大腸菌で強く、ダラム陽性菌である
枯草菌では弱い。リンパ球ＤＮＡ合成反応に対する抑制
のメカニズムとしては、レクチン刺激後の比較的初期に
細胞膜の機能（例えばヌクレオチドの転送活性）を抑制
し、その後のＤＮＡ合成を特異的に抑制すると推定され
る。またこの物質群は、ＤＮＡ合成を強く抑制するが細
胞の生存率には、影響を与えない。
さらに本物質はＴ細胞のＲＮＡ合成の抑制はおこさない
。ただ、Ｔ細胞の初期（０〜５時間）のヌクレオチドの
取り込み活性を有意に抑制する。
。ただ、Ｔ細胞の初期（０〜５時間）のヌクレオチドの
取り込み活性を有意に抑制する。
本物質による初期の細胞の機能の抑制（初期のヌクレオ
チドの取り込みの抑制）はＴ細胞ＤＮＡ合成抑制による
と考えられる。
チドの取り込みの抑制）はＴ細胞ＤＮＡ合成抑制による
と考えられる。
実施例１゜
牛胎児血清とカイコガ体液からの本物質の製造牛胎児血
清（Ｇｉｂｃｏ社製）とカイコガ体液各２５ａ＋１を、
それぞれ５ Ｑ、ｍｌの冷やした飽和硫安（ｐＨ７，５
）とよく混ぜ、４℃で１時間静置した。遠心（１６，０
００ｒｐａ＋にて１５分）をした後、沈澱物を１０ｍＭ
リン酸バッフｙ （ｐＨ７，２）５ｍｌに溶かし、セ
ファデックス０１００カラム（１，８Ｘ４３ＣＤＩ）に
かけ、同じリン酸バッファーで１分画５ｍｌにて溶出し
た。第１図に溶出パターンを示す。
清（Ｇｉｂｃｏ社製）とカイコガ体液各２５ａ＋１を、
それぞれ５ Ｑ、ｍｌの冷やした飽和硫安（ｐＨ７，５
）とよく混ぜ、４℃で１時間静置した。遠心（１６，０
００ｒｐａ＋にて１５分）をした後、沈澱物を１０ｍＭ
リン酸バッフｙ （ｐＨ７，２）５ｍｌに溶かし、セ
ファデックス０１００カラム（１，８Ｘ４３ＣＤＩ）に
かけ、同じリン酸バッファーで１分画５ｍｌにて溶出し
た。第１図に溶出パターンを示す。
セファデックスＧ１００クロマトグラフイーの活性画分
を２倍量の蒸留水で希釈し、０Ｍセファデックス（Ｃ−
２５）カラム（１，８Ｘ１０ｃｍ）にかけ７５ｍＭ食塩
を含む水約３ Ｑｍｌでカラムを洗った後、７５ｍＭか
らＩＭまでの食塩の濃度勾配を含む水で１分画２．５ｍ
ｌにて溶出した。各分画の食塩濃度はコンダクティビテ
ィーメーターで測定した。第２図に溶出パターンを示す
。その活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮しセ
ファデックス０５０カラム（１，２ｘ５６ｃｍ）にかけ
０．１Ｍ炭酸アンモニウムで１分画１．２５ｍｌにて溶
出し、その活性画分を凍結保存した。第３図に０．８Ｍ
ＮａＣＲで溶出する両分の溶出パターンを示す。
を２倍量の蒸留水で希釈し、０Ｍセファデックス（Ｃ−
２５）カラム（１，８Ｘ１０ｃｍ）にかけ７５ｍＭ食塩
を含む水約３ Ｑｍｌでカラムを洗った後、７５ｍＭか
らＩＭまでの食塩の濃度勾配を含む水で１分画２．５ｍ
ｌにて溶出した。各分画の食塩濃度はコンダクティビテ
ィーメーターで測定した。第２図に溶出パターンを示す
。その活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮しセ
ファデックス０５０カラム（１，２ｘ５６ｃｍ）にかけ
０．１Ｍ炭酸アンモニウムで１分画１．２５ｍｌにて溶
出し、その活性画分を凍結保存した。第３図に０．８Ｍ
ＮａＣＲで溶出する両分の溶出パターンを示す。
さらに精製を進めるため活性画分を水に溶かしシリカゲ
ル薄層プレート（メルク社、シリカゲル６０．２０Ｘ２
０ＣＩ）にスポットしメタノールと水（３：１）の混合
溶液で約２時間展開した。展開後薄層プレートにニンヒ
ドリン溶液をスプレッドした後２〜３分間バーナーで熱
し、ペプチドの位置を確かめた。結果を第４図に示す。
ル薄層プレート（メルク社、シリカゲル６０．２０Ｘ２
０ＣＩ）にスポットしメタノールと水（３：１）の混合
溶液で約２時間展開した。展開後薄層プレートにニンヒ
ドリン溶液をスプレッドした後２〜３分間バーナーで熱
し、ペプチドの位置を確かめた。結果を第４図に示す。
図中のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｈａ、Ｔｒｐは、それぞれの
アミノ酸マーカーの位置を示す。図中のＦＣ３ＩＩおよ
びＢｍＩＩが本物質に相当する。
アミノ酸マーカーの位置を示す。図中のＦＣ３ＩＩおよ
びＢｍＩＩが本物質に相当する。
ＦＣ３ＩＩ、ＢｍＩＩに相当するスポットのシリカゲル
を回収し、水で抽出し、抽出液をロータＩＪ −エバポ
レーターで濃縮後、リンパ球ＤＮＡ合成活性を測定した
。結果を第１表に示す。
を回収し、水で抽出し、抽出液をロータＩＪ −エバポ
レーターで濃縮後、リンパ球ＤＮＡ合成活性を測定した
。結果を第１表に示す。
第１表
対 照 １８９７８ＦＣ３ＩＩ
３１２５ Ｆｅ２ Ｉ［とＢｍ］Ｉの理化学的、生化学的性質を第
２表に示す。
３１２５ Ｆｅ２ Ｉ［とＢｍ］Ｉの理化学的、生化学的性質を第
２表に示す。
第 ２ 表
対 照 １６２
７３ １９８２１ｐｃｓ ｎまたはＢｍｌＩ添加
３２８１ ２６７３熱処理（５６
℃、１時間） ２９５０ ３１０６
”（１００℃、３０分間） ２６３８
３０１０凍結（−２０℃）融解（３回’）
３３８Ｂ ２９２２ｐＨ４，０（］ＯｍＭ酢
酸バッフｙ −） ３０５７ ２７８４ｐ
Ｈ９，５（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバッフｙ ）
２８９９ ３１４０トリプシン（５０ｔｔ ｇ
／ｍｌ ）処理 １１４５７ １１３６８Ｒ
ＮａｓｅＡ（５０，ｕ ｇ ／ｍ＋ ）処理
２９８２ ２１６６ＤＮａｓｅ Ｉ （５０μｇ
／ｍｌ ）処理 ３００２ ２６３８Ｆ
Ｃ５ＩＩおよびＢｍＩＩのリンパ球ＤＮＡ合成阻害への
添加時間の影響を第３表に示す。
７３ １９８２１ｐｃｓ ｎまたはＢｍｌＩ添加
３２８１ ２６７３熱処理（５６
℃、１時間） ２９５０ ３１０６
”（１００℃、３０分間） ２６３８
３０１０凍結（−２０℃）融解（３回’）
３３８Ｂ ２９２２ｐＨ４，０（］ＯｍＭ酢
酸バッフｙ −） ３０５７ ２７８４ｐ
Ｈ９，５（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバッフｙ ）
２８９９ ３１４０トリプシン（５０ｔｔ ｇ
／ｍｌ ）処理 １１４５７ １１３６８Ｒ
ＮａｓｅＡ（５０，ｕ ｇ ／ｍ＋ ）処理
２９８２ ２１６６ＤＮａｓｅ Ｉ （５０μｇ
／ｍｌ ）処理 ３００２ ２６３８Ｆ
Ｃ５ＩＩおよびＢｍＩＩのリンパ球ＤＮＡ合成阻害への
添加時間の影響を第３表に示す。
第 ３ 表
０２２５６２＋４２
ＰＣ３ｎおよびＢｍｌｌの各種細胞に対する効果を第４
表に示す。
表に示す。
第 ４ 表
３Ｔ３線維芽細胞 ４６２１’ ２１３
５ ３２６０ＩＭＲ９０（、ヒト線維芽細胞）２８９
０ １６６１ １８２３６Ｖ ４０１質転換細胞（
同上） １０５０３ ９８７５ ９６８４Ｌ
９２９（マウス フィブロリ）ｂコーマ）’
９３６１ ９５５６ ８７９１
マウス胸腺細胞 ４３６２ ５８２
６３０マウス牌細胞 １８８３０
２１９０ １５６４Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ３３６８３ ５６２１ ４９８８
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ
３１９３７ ２０８０９ ２５３６３Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ３０１１５ ３０
０６０ ２８３６７実施例２゜ Ｇｒａｃｅによって確立されたヤママユガ（Ａｎｔｈｅ
ｒｅａｅｎｋａｌｙｐｔｉ ）由来の線維芽細胞〔Ｎａ
ｔｕｒｅ、 １９５゜７８８（１９６２） ） ２．５
Ｘ １０ ’個／ｍｌを１０％牛脂児血清を含むｌ；
ｒａｃｅの培地（Ｇｉｂｃｏ社製＞１０ｍ１で２８℃、
５％Ｃ０２で３日間培養し、１回同じ培地を交換してさ
らに３日間培養し、コンフルエントの状態になった細胞
をＧｒａｃｅの培地１０ｍ１で３回洗った。その後Ｇｒ
ａｃｅの培地（無血清）で２８℃、５％Ｃ０２で３日間
培養した。培養液を回収し、アミコンダイヤフローメン
ブレン（ＹＭＩＯ：カットサイズ； １０．０００ダル
トン）に通した。その濾液をロータリーエバポレーター
で濃縮し、セファデックスＧ５０カラム（１，８Ｘ ４
３ｃｍ）にかけ、０．１ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７
，２）で溶出した。溶出液は２．５ｍｌずつ分画した。
５ ３２６０ＩＭＲ９０（、ヒト線維芽細胞）２８９
０ １６６１ １８２３６Ｖ ４０１質転換細胞（
同上） １０５０３ ９８７５ ９６８４Ｌ
９２９（マウス フィブロリ）ｂコーマ）’
９３６１ ９５５６ ８７９１
マウス胸腺細胞 ４３６２ ５８２
６３０マウス牌細胞 １８８３０
２１９０ １５６４Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ３３６８３ ５６２１ ４９８８
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ
３１９３７ ２０８０９ ２５３６３Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ３０１１５ ３０
０６０ ２８３６７実施例２゜ Ｇｒａｃｅによって確立されたヤママユガ（Ａｎｔｈｅ
ｒｅａｅｎｋａｌｙｐｔｉ ）由来の線維芽細胞〔Ｎａ
ｔｕｒｅ、 １９５゜７８８（１９６２） ） ２．５
Ｘ １０ ’個／ｍｌを１０％牛脂児血清を含むｌ；
ｒａｃｅの培地（Ｇｉｂｃｏ社製＞１０ｍ１で２８℃、
５％Ｃ０２で３日間培養し、１回同じ培地を交換してさ
らに３日間培養し、コンフルエントの状態になった細胞
をＧｒａｃｅの培地１０ｍ１で３回洗った。その後Ｇｒ
ａｃｅの培地（無血清）で２８℃、５％Ｃ０２で３日間
培養した。培養液を回収し、アミコンダイヤフローメン
ブレン（ＹＭＩＯ：カットサイズ； １０．０００ダル
トン）に通した。その濾液をロータリーエバポレーター
で濃縮し、セファデックスＧ５０カラム（１，８Ｘ ４
３ｃｍ）にかけ、０．１ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７
，２）で溶出した。溶出液は２．５ｍｌずつ分画した。
第５図に示すようにかなりのリンパ球ＤＮＡ合成抑制活
性が分子量約５、０００ダルトンの位置（１２〜１４両
分）に、また主要活性が約ｉ、 ｏ ｏ ｏダルトンの
位置（１７〜１９両分）に認められた。第５図中、白丸
はリンパ球へのチミジンの取り込み、黒丸は各画分の２
８０ｎｍにおける吸収を示す。分子量１．０００ダルト
ンの活性をＣＭセファデックスクロマトグラフィー（１
０ｍｌ）にかけた。すなわち、遠心管中の０Ｍセファデ
ックス（ゲルペット： １０１１＋１）を１００ｍＭ
ＮａＣ１で平衡化し、第５図の１７〜１９両分を加え
て懸濁した。４℃で１５分間静置後、上清を捨て、１０
ｍ１の０．ＩＭ ＮａＣ１でゲルを３回洗った。同じ
操作を異なる塩濃度を含んだ水１０ｍ１（０，１〜１．
ＯＭ ＮａＣ１）で繰り返した。リンパ球のＤＮＡ合
成の測定には、各分画を水で４倍に希釈して用いた。０
Ｍセファデックスの結果を第６図に示す。図中、矢印は
ＮａＣ１濃度を示す。第６図に示すように、約０，８Ｍ
ＮａＣ１で溶出される活性が認められた。この活性をＡ
ｅｌｌと名付けた。この活性は、さらにセファデックス
Ｇ２５クロマトグラフイーで精製すると、第７図のよう
に分子量約ｉ、 ｏ ｏ ｏダルトンを示した。次にこ
の因子の精製度をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで
確かめた。すなわち、第７図の活性画分ＡｅＩ［を凍結
乾燥後、水に溶かし、シリカゲル薄層プレート上にスポ
ットした。メタノール−水（３：１．）溶液で展開後、
ニンヒドリン溶液をプレートにかけ、バーナで３分間炙
り発色させた。結果を第８図に示す。図中Ｌｙｓ、 Ａ
ｒｇ。
性が分子量約５、０００ダルトンの位置（１２〜１４両
分）に、また主要活性が約ｉ、 ｏ ｏ ｏダルトンの
位置（１７〜１９両分）に認められた。第５図中、白丸
はリンパ球へのチミジンの取り込み、黒丸は各画分の２
８０ｎｍにおける吸収を示す。分子量１．０００ダルト
ンの活性をＣＭセファデックスクロマトグラフィー（１
０ｍｌ）にかけた。すなわち、遠心管中の０Ｍセファデ
ックス（ゲルペット： １０１１＋１）を１００ｍＭ
ＮａＣ１で平衡化し、第５図の１７〜１９両分を加え
て懸濁した。４℃で１５分間静置後、上清を捨て、１０
ｍ１の０．ＩＭ ＮａＣ１でゲルを３回洗った。同じ
操作を異なる塩濃度を含んだ水１０ｍ１（０，１〜１．
ＯＭ ＮａＣ１）で繰り返した。リンパ球のＤＮＡ合
成の測定には、各分画を水で４倍に希釈して用いた。０
Ｍセファデックスの結果を第６図に示す。図中、矢印は
ＮａＣ１濃度を示す。第６図に示すように、約０，８Ｍ
ＮａＣ１で溶出される活性が認められた。この活性をＡ
ｅｌｌと名付けた。この活性は、さらにセファデックス
Ｇ２５クロマトグラフイーで精製すると、第７図のよう
に分子量約ｉ、 ｏ ｏ ｏダルトンを示した。次にこ
の因子の精製度をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで
確かめた。すなわち、第７図の活性画分ＡｅＩ［を凍結
乾燥後、水に溶かし、シリカゲル薄層プレート上にスポ
ットした。メタノール−水（３：１．）溶液で展開後、
ニンヒドリン溶液をプレートにかけ、バーナで３分間炙
り発色させた。結果を第８図に示す。図中Ｌｙｓ、 Ａ
ｒｇ。
Ａｌａ、 Ｔｒｐはアミノ酸マーカーのそれぞれの位置
を示す。Ａｅｎは、Ｔｒｐより少し遅い移動度を示した
。
を示す。Ａｅｎは、Ｔｒｐより少し遅い移動度を示した
。
第８図中＾ｅｎ が本物質に相当する。
Ａｅｎに相当するスポットのシリカゲルを回収し水で抽
出し、抽出液をロータリーエバポレーターで濃縮後、リ
ンパ球ＤＮＡ合成活性を測定した。
出し、抽出液をロータリーエバポレーターで濃縮後、リ
ンパ球ＤＮＡ合成活性を測定した。
結果を第５表に示す。
第 ５ 表
対照■（水） １９８５６
Ａ、ｅ ｎ ：、、、２０１？
Ａｅｎの理化学的性質を第６表に示す。
第 ６ 表
対照 ２０３．１２
ＡｅＩＩ 添加 １２９６熱処理
（５６℃、１時間） １５９６”（１００
℃、３０分間） １４２２凍結（−２０℃）
、融解 １６５１ＡｅＩｔへの酵素の影響を
・第７表に示す。
（５６℃、１時間） １５９６”（１００
℃、３０分間） １４２２凍結（−２０℃）
、融解 １６５１ＡｅＩｔへの酵素の影響を
・第７表に示す。
第 ７ 表
対 照 ２７３６６
ＡｅＩＩ ２２３０ ＲＮａｓｅ Ａ、 （５０μｇ ／ｍｌ ）処理
２６１３０Ｎａｓｅ Ｔ （５（ｌｕｇ／ｍｌ）処
理 ２４８３ＡｅＩＩの各種細胞に対する効果を
第８表に示す。
ＡｅＩＩ ２２３０ ＲＮａｓｅ Ａ、 （５０μｇ ／ｍｌ ）処理
２６１３０Ｎａｓｅ Ｔ （５（ｌｕｇ／ｍｌ）処
理 ２４８３ＡｅＩＩの各種細胞に対する効果を
第８表に示す。
第８表
０Ｍ２５８（ヒト線維芽細胞） ’１４６７’
３５５ＩＭＲ９０（同上 ） ５５１２ １
８２３ＳＶ４０形質転１１１細胞＜ｔト胚ｔａｍ芽細ｍ
＞ ９６８９ ９０２６ＰＣＩＯ（ｔ：）肺カル
シ／ 、’／） ９０６５ ８８６４Ｌ
９２９ （マウス フィブロサルコーマ＞、
’ ４３６７ ４１４
６ＭａＬａ ３ （ヒトメラノー？）” ５９
７８ ５０９７マウス胸腺細胞
３４１５ ３２４マウス騨細胞
１６８５０ ］、５３２Ｂｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ・３９８２１ １９３３
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ
２６５８７ １６８５９発明の効果 本発明物質は、細胞のＤＮＡ合成を抑制する。
３５５ＩＭＲ９０（同上 ） ５５１２ １
８２３ＳＶ４０形質転１１１細胞＜ｔト胚ｔａｍ芽細ｍ
＞ ９６８９ ９０２６ＰＣＩＯ（ｔ：）肺カル
シ／ 、’／） ９０６５ ８８６４Ｌ
９２９ （マウス フィブロサルコーマ＞、
’ ４３６７ ４１４
６ＭａＬａ ３ （ヒトメラノー？）” ５９
７８ ５０９７マウス胸腺細胞
３４１５ ３２４マウス騨細胞
１６８５０ ］、５３２Ｂｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ・３９８２１ １９３３
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ
２６５８７ １６８５９発明の効果 本発明物質は、細胞のＤＮＡ合成を抑制する。
抑制の程度は、哺乳類のリンパ球が最も強く、また哺乳
類の線維芽細胞に対しても一定の効果がある。しかし、
癌化した細胞には効果が認められない。また細菌に対す
るＤＮＡ合成抑制効果は、ダラム陰性である大腸菌（口
５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）で著しく、ダラム
陽性菌の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
）では弱い。
類の線維芽細胞に対しても一定の効果がある。しかし、
癌化した細胞には効果が認められない。また細菌に対す
るＤＮＡ合成抑制効果は、ダラム陰性である大腸菌（口
５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）で著しく、ダラム
陽性菌の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
）では弱い。
以上の結果から、本発明物質は、異常な免疫反応の亢進
の抑制剤として、またダラム陰性閑に対する抗菌物質と
して応用できる。
の抑制剤として、またダラム陰性閑に対する抗菌物質と
して応用できる。
第１図は、実施例１における本物質精製のためのセファ
デックス６１００カラムクロマトグラムを示す。矢印ａ
、ｂ、ｃは牛血清アルブミン〔６７キロダルトン（以下
Ｋｄという）〕、チトクロームＣ（１３Ｋｄ）およびバ
シトラシン（１，５Ｋｄ）分子量マーカーをそれぞれ示
す（以下同じ）。 Ａは仔牛脂児血清、Ｂはカイコガ体液を示す（以下同じ
）。 第２図は、実施例１にふける本物質精製のためのＣＭセ
ファデックスカラムクロマトグラムを示す。 第３図は、実施例１における本物質精製のためのセファ
デックスＧ５０カラムクロマトグラムを示す。図中矢印
ｄはマイトマイシンＣ（０，３Ｋｄ＞の分子量マーカー
を示す（以下同じ）。 第４図は、実施例１における活性画分およびアミノ酸マ
ーカーのシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。 第５図は、実施例２におけるカイコガ線維芽細胞の培養
上清の噌ファデックス０５０クロマトグラムを示す。図
中ｅはインシュリン（５，７Ｋｄ）の分子量マーカーを
示す。 第６図は、実施例２におけるＣＭセファデッタスクロマ
トグラムを示す。 第７図は、実施例２におけるＡｅＩＩのセファデックス
Ｇ２５クロマトダラムを示す。 −゛第８図は、実
施例２におけるＡｅｌＩのシリカゲル薄層クロマトグラ
ムを示す。 第１図 令画番号 第ｚ図 第３図 ４ｊ−画番号 第４図 第７図 ｅｃａ Ｊｉ 今ａｌ−４号 第δ図
デックス６１００カラムクロマトグラムを示す。矢印ａ
、ｂ、ｃは牛血清アルブミン〔６７キロダルトン（以下
Ｋｄという）〕、チトクロームＣ（１３Ｋｄ）およびバ
シトラシン（１，５Ｋｄ）分子量マーカーをそれぞれ示
す（以下同じ）。 Ａは仔牛脂児血清、Ｂはカイコガ体液を示す（以下同じ
）。 第２図は、実施例１にふける本物質精製のためのＣＭセ
ファデックスカラムクロマトグラムを示す。 第３図は、実施例１における本物質精製のためのセファ
デックスＧ５０カラムクロマトグラムを示す。図中矢印
ｄはマイトマイシンＣ（０，３Ｋｄ＞の分子量マーカー
を示す（以下同じ）。 第４図は、実施例１における活性画分およびアミノ酸マ
ーカーのシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。 第５図は、実施例２におけるカイコガ線維芽細胞の培養
上清の噌ファデックス０５０クロマトグラムを示す。図
中ｅはインシュリン（５，７Ｋｄ）の分子量マーカーを
示す。 第６図は、実施例２におけるＣＭセファデッタスクロマ
トグラムを示す。 第７図は、実施例２におけるＡｅＩＩのセファデックス
Ｇ２５クロマトダラムを示す。 −゛第８図は、実
施例２におけるＡｅｌＩのシリカゲル薄層クロマトグラ
ムを示す。 第１図 令画番号 第ｚ図 第３図 ４ｊ−画番号 第４図 第７図 ｅｃａ Ｊｉ 今ａｌ−４号 第δ図
Claims (4)
- （１）下記理化学的性質を有し、Ｔ細胞のＤＮＡ合成を
抑制する新規Ｔ細胞合成抑制物質。 元素分析：Ｃ、Ｈ、Ｏ、ＮおよびＳの元素 を有する 分子量：約１，０００ダルトンのペプチド 熱安定性：５６℃で１時間、１００℃で ３０分間安定 酸性・中性・塩基性の別：強塩基性 ｐＨ安定性：ｐＨ４．０〜９．５で安定 紫外線吸収スペクトル：２２０ｎｍに最大吸収呈色反応
：ニンヒドリン陽性 溶解性：水、エタノール、メタノールに 易溶 物質の色：上記溶媒に溶かすと無色 - （２）哺乳動物血清、昆虫体液または昆虫細胞の培養物
から採取して得られる特許請求の範囲第１項記載のＴ細
胞ＤＮＡ合成抑制物質。 - （３）哺乳動物が、ヒト、ウシ、ラットまたはマウスか
ら選ばれる特許請求の範囲第２項記載のＴ細胞ＤＮＡ合
成抑制物質。 - （４）昆虫が、カイコガ、ヤママユガ、ニクバエまたは
ミツバチから選ばれる特許請求の範囲第２項記載のＴ細
胞ＤＮＡ合成抑制物質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59117982A JPS6118A (ja) | 1984-06-08 | 1984-06-08 | Ｄｎａ合成抑制物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59117982A JPS6118A (ja) | 1984-06-08 | 1984-06-08 | Ｄｎａ合成抑制物質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6118A true JPS6118A (ja) | 1986-01-06 |
Family
ID=14725080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59117982A Pending JPS6118A (ja) | 1984-06-08 | 1984-06-08 | Ｄｎａ合成抑制物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6118A (ja) |
-
1984
- 1984-06-08 JP JP59117982A patent/JPS6118A/ja active Pending
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