JPS61172897A - ウイリス‐特異的プロテアーゼ活性検出用ペプチド基質 - Google Patents

ウイリス‐特異的プロテアーゼ活性検出用ペプチド基質

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JPS61172897A
JPS61172897A JP61002358A JP235886A JPS61172897A JP S61172897 A JPS61172897 A JP S61172897A JP 61002358 A JP61002358 A JP 61002358A JP 235886 A JP235886 A JP 235886A JP S61172897 A JPS61172897 A JP S61172897A
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チヤールズ・エイ・ケツトナー
ブルース・デイビツド・コラント
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一般的に感染症の診断分野、および特に、特異
的プロテアーゼをコードするウィルスによる感染を検出
するための化合物および方法に関する。
プロテアーゼはタンパクを特異的なイプチド結合で分解
する酵素である。生体系においては、特異性の高いプロ
テアーゼおよび相補的プロテアーゼ阻害剤が広範囲の生
物学的機能を仲介しまたはそれを制御している。例えば
、プロテアーゼは前駆体を分解してポリペプチドの翻訳
後のプロセシングにおいて活性タンパクを形成し、酵素
原活性化カスケード反応例えば細波凝固、線維素溶解、
免疫系の補体反応などのメカニズムを与え、そして選択
されたタンパクの生物学的な膜を通しての輸送を仲介す
る。
ウィルスゲノムによりコード化されたプロテアーゼは多
くのウィルスの複製に重要な役割を果している。ウィル
スプロテアーゼは感染細胞により産生される大きな前駆
体ポリペプチドをよシ小さなタンパク成分またはサブユ
ニットに分解するか、それらはその後機能性ウィルス複
製を形成するように組立てられる。ＬｏＺｉｔａｋｉｉ
ら（Ｕｓｐ、Ｓｏｖｒｅｍ、Ｂｉｏｌ、　９３：　３５
２〜３６２　（１９８２）　）は鳥類および曙乳類ウィ
ルスの複製におけるタンパク分解の役割を論じ、またウ
ィルスプロテアーゼ阻害物質に関する文献の一部を調査
している。
ウイルス−特異的プロテアーゼ（Ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃ
ｉｆｉ社ｐｒｏｔｅａｓθ）によるウィルスポリＲゾチ
ドの翻訳後のプロセシングは、以下のものを言むいくつ
かの重要な科の動物ウィルスの複製の際に生起する。
ＡＭ肝炎ウィルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ａ　ｖｉｒｕ
ｓ）カルデイオウイルス（ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ）デ
ング熱ウィルス（ｄｅｎｇｕｅ　ｖｉｒｕｓ）（Ｍｅｎ
ｏｖｉｒｕｓｅｓノ ウ（／Ｌ／スー特異的プロテアーゼの役割はその他のウ
ィルス科、特に、ミキソウイルス（ｍｙｘｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ）、バラミキンウイルス（戸１ｑ−ｖｉｒｕｓｅａ
λパクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ
ｅｓ）、コモウィルス（ｃｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）およ
びレオウィルス（ｒｓｏｖｉｒｕｓθＢ）の複製におい
ても報告されている。
Ｋｏｒａｎｔ［”■ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖｉｒ
ａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ１ｅａ−ｖａｇｅ”　、Ａｎ
ｔｉｖｉｒａｌ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｇａｕｒ
ｉ版り（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ５ｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ、１９８１））およびＫＯｒａｎｔじＲｅｇｕｌａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｐｌ
ｉ　−ｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｐｒｏｔｏｉｎ　Ｃｌｅａ
ｖａｇｅ”、Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、（ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ７ｓ　１９７５）　）
はウィルス特異的プロテアーゼに関する文献のレビュー
である。
人間および動物における重要な病原体であるピコルナウ
ィルスはウィルス複製に包含される特異的なプロテアー
ゼをコードするウィルスの例である。
ピコルナウィルスは人間および動物における重要な病原
体である小さくて、エンベロープ無しのＲＮＡ含有ウィ
ルスである。ピコルナウィルス科のプロトタイプのもの
は、中枢Ｗｂ系のよく知られた恐しい病気であるポリオ
を髄炎（ｐｏｌｉ。
ｍｙｅｌｉｔｌｇ）の原固体であるポリオウィルスであ
る。これまでの数十年間に、ポリオウィルス流行病は何
千という子供中背少年に麻痺性の疾病を起こしその結果
研究が刺激され、西側工業国においては効果的免役が確
豆されその病気はほとんど根絶するに到っている。今日
、衛生状態が原始的な人口密度の高い地域ではポリオウ
ィルスは依然として慢延している。一部の小児は影響を
受けるがこのような地域の人口の多くは主なポリオウィ
ルス型に対する抗体を有している。しかしながら西ｇＩ
Ｕ諸国では、そのウイルスの流行式ははるかにはい。時
として臨床的に亘要な症例か免疫されていない個人に生
じる。
人間に影譬を及ぼすその池のピコルナウィルスとしては
、緩やかな腸感染と関連するコックスサラキーウィルス
；風邪やマイナーな呼吸感染と関連するライノウイルス
：Ａ屋肝炎ウィルス；および脳心筋炎において示唆され
ているカルジオウィルスなどが挙げられる。
口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）は畜牛および他の分肚蹄動
物を悩ますピコルナウィルスの一属である。
口蹄疫は極めて伝染性か高く、この病気のぼっ発かｍ認
された時には感染動吻を含む家畜群全体がだめになって
しまう。したがって口蹄疫流行の経術的影響は極めてひ
どいものとなシうる。
ＦＭＤＶ　ｉｃよる感染に対しある程度の保護を与える
ワクチンが生産されてはいるがこの病気は多くの地域に
依然として残っている。
ピコルナウィルスは一般的に類似した複製、Ｊターンを
伴う。まず感染性ウィルス粒子は標的細胞表面の特異受
容体に非共有結合的に結合する。次にウィルス粒子は細
胞膜を透過しそして一本鎖ウイルスＲＮＡ分子の外被を
除く。このプラス鎖ＲＮＡは最初、ウィルスＲＮＡポリ
メラーゼを含むウィルスタンパク合成のｍＲＮＡ鋳型と
して役立つ。そのウィルスＲＮＡポリメラーゼは以後の
付加的プラス鎖産生の鋳型として役立つマイナス鎖（ま
たは相補）　ＲＮＡの合成を触媒する。
感染過程の進行に伴い比例的により多くの新たに合成さ
れたプラス鎖が成熟ピリオン内に取込まれる。
ウィルスＲＮＡポリメラーゼのほかに、ウィルスゲノム
はまたｖｐｌ　、ｖｐ２　、ｖｐ５およびＶＦ６と称さ
れる４櫨頑の主なカプシド構逝タンパク；ｖｐ。
と称されるＲＮＡキャッピングタンパク；およびウィル
ス特異的プロテアーゼを含むいくつかの非構造タンパク
を特定する。ウイルス−特異的プロテアーゼはピコルナ
ウィルスの複製上独特な役割を果し、また本発明の診断
基買および方法の標的を提供する。
宿主細胞タンパク合成のウィルス誘発性遮断の後、ウィ
ルスｍＲＮＡはウィルスｍＲＮＡ鋳型に沿った宿主リポ
ソームの連続通過においてウィルスタンパクに翻訳され
る。得られる翻訳生成物は各々異なる機能を有するいく
つかの領域（ドメイン）ヲ甘ひポリプロティンである。
このポリプロティンはリポソーム／タン／ぞり複合体の
解［Ｃ先立ち、宿主細胞およびウィルス特異的プロテア
ーゼにより分解される。本質的に即時的に生起する発生
期分解反応は明らかに、宿生細胞翻訳装置に関連した細
胞プロテアーゼによ）仲介さｎている。次に、最終的に
はカプシドアセンブリとなって実を結ぶ三次構造におけ
るコンフォメーション変化およびその他の変化を誘起す
る一連の中間分解反応は、高度に特異的でウィルスによ
りコードされたプロテアーゼによプ触媒される。タンノ
ぞり分解はまたウィルスＲＮＡポリメラーゼを活性化お
よび不動化することによ、９　ＲＮＡ合成を調節する。
ピコルナウィルスにより感染された細胞中に独特なウイ
ルス−特異的プロテアーゼが存在することは、幾系統か
の研究により実証されている。第１に後で詳述されるよ
うくいウイルス−特異的プロテアーゼ活性は極めて部位
−特異的であ）、また正常な細胞内分解経路に関連した
タンパク分解活性に類似していない。第２にこの部位−
特異的酵素活性は未感染細胞の抽出液中ＶＣ検出されな
いが、感染過程の進行に伴い、また感染ウィルス証が増
えるに伴い増加する童として感染細胞の溶解液中に認め
られる。第３に、ウィルスｍＲＮＡでプログラム化され
た細胞不含タン・ξり合成系はカプシドポリペプチドを
もプロセシングする％微的なプロテアーゼ活性を生Ｌ６
゜第４に、ウィルスプロテアーゼは異型ウィルス゛また
は細胞タンパクの分解には効率的でないことが感染細胞
および細胞不含系において実証されている。
前述のとおり、ウイルス−特異的プロテアーゼは極めて
部位−特異的である。過去数年の間に、ウイルス−特異
的プロテアーゼにより認識される開裂部位のアミノ酸配
列がいくつかのピコルナウィルスについて決定されてい
る。このデータは一部、ウィルスタン１１りの末端基分
析によ）与えられるがウィルスゲノムＲＮＡ　、あるい
はウィルスＲＮＡに相捕的なＤＮＡの配列決定により付
加的情報が得られている。ピコルナウィルスの開裂部位
の比較によりいくつかのクラス開裂認識部位が判明して
いる。翻訳の際本質的に即時的にプロセシングを受ける
発生期開裂部位はキモトリプシン開裂部位に類似してお
シ、また新しいカルボキシル末端は典型的には芳香族ま
たは疎水性残基により供与されている。ウイルス−特異
的プロテアーゼによりｇｍされる中間のあるいは以後に
プロセシングを受ける開裂部位は極めて明瞭である。ピ
コルナウィルスの場合、これらの部位はしばしば疎水性
（ロイシン、インロイシンまたはバリン）配列によ）囲
まれたグルタミン−グリシンまたはグルタミン酸−Ｘ連
鎖により％徴付けられる。ウイルス−特異的プロテアー
ゼにより認識される開裂部位配列１間の高い保存度は、
保存配列のＷ造に類似させるべく設計された人工基質を
、特異的プロテアーゼ活性の存在、および従ってピコル
ナウィルスによる細胞の感染の有無の検出に用いうろこ
とを示唆している。
トガウィルスは典型的には節足動物担持ＲＮＡ含有ウィ
ルスの１科であシ、黄熱病、風疹（麻疹）、デング熱、
脳炎およびある種の準臨床的状態の病原体を含む。ピコ
ルナウィルスのように、）ガウイルスはすべてのウィル
スポリペプチドの形成にタンパク開裂を用い、また特異
的プロテアーゼがそのトガウィルスゲノムによりコード
されているという証拠が存在している。
ピコルナウィルスの場合と同様に、ウィルス前躯体ポリ
ハプチドの開裂部位に高度に保存されたペプチド領域が
みられるがこのことはウイルス−特異的プロテアーゼに
対する役割を示唆している。
レトロウィルスは鳥窺および哺乳動物の生物種における
各種の肉腫、白血病、リンパ腫およびその他の癌腫に関
連した多くの属を含んでいる。アデノウィルスは時とし
て呼吸器および眼の感染の急性症状の発現に発展する、
リン／ξ様組織における潜伏感染を誘起するＤＮＡ　含
有ウィルスである。ピコルナウィルスおよびトガウィル
スと同様に、レトロウィルスおよびアデノウィルスは特
異的ウィルスプロテアーゼをコードしているものと思わ
れる。
少くとも２つの論文が感染細胞の溶解物中のピコルナウ
ィルスプロテアーゼ活性の有無の検出に標識基質を用い
ることを開示している。
Ｋｏｒａｎｔら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、Ｕ８Ａ　７６：２９９２（１９７９）　）はポリオ
ウィルス感染ＨｅＬａ細胞をプロテアーゼ阻害物質であ
るヨードアセトアミドで処理することにより　（３５Ｂ
）メチオニン−標識ウィルス前駆体タンパクを得た実験
を記載している。標識タンパクは様々なウィルス感染段
階で得られたＨｅＬａＮＪＵ胞の抽出液に添加された。
放射活性分解生成物はドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｎ２
）ゲル遡気泳動によ）分析された。ウィルスにより感染
された細胞に由来する抽出液は特徴的な低分子量標識断
片群を含有した。
ｘｏｒａｎｔ　ら（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、３４３：３０４（１９８０））はピコルナウィルスプ
ロテアーゼ活性の有無の検出に、アセチル−Ｌ−フェニ
ルアラニル−Ｌ−グリシルーＬ−アラニル−Ｌ−ロイシ
ルチオベンジルエステル（Ａｃ　−Ｐｈｅ　−Ｇａｙ−
Ａｌａ−Ｌｅｄチオベンジルエステル）を用いることを
記載している。
感染細胞は機械的に破砕され、基質は得られた細胞質画
分に添加され、そしてプロテアーゼ活性は分光光度計を
用いて監視された。
今般、特徴的なアミノ酸配列と、プロテアーゼにより触
媒される開裂を行った後に検出できるインジケータ基を
含むある櫨の合成イブチドを、ウイルス−特異的プロテ
アーゼ活性を迅速に測定するのに用いうろことを見出し
た。これらの化合物およびかかる化合物を用いた１断方
法は特異的プロテアーゼをコードするウィルス、例えば
ピコルナウィルスが原因する感染症の診断にＭ用である
。
発明の概要 本発明はウイルス−特異的ポリペプチド前駆体を開裂し
てウィルスに関連付けられたタンパクを形成するプロテ
アーゼを検出するための特異的ペプチド基質をｇＪ造す
る方法であって、ここで検出すべきプロテアーゼはピコ
ルナウィルス、トガウィルス、レトロ１ィルス、アデノ
ウィルス、コモウィルスおよびその他のウィルスプロテ
アーゼをコードするウィルスよ）なる群から選択される
ウィルスにより特定され、そして （ａ）　　ウィルスタンパク、　ＲＮＡ　、　ＤＮＡ、
ｍＲＮＡ１たはウィルスＲＮＡに相補的なＤＮＡを単離
し；（ｂ）　　そのタン／ぐり、ＲＮＡ　、　ＤＮＡ　
１ｍＲＮＡまたはａ　ＤＮＡを分析してウイルス−特異
的タンノ（りのポリペプチド前駆体のアミノ酸配列を決
定し；（ｃ）　　そのアミノ酸配列内の、ウイルス−特
異的プロテアーゼの開裂認識部位の位置を定め；そして は）　ウイルス−特異的プロテアーゼを検出するための
特異的ペプチド基質を製造する（ここで、その基質はポ
リペプチド前駆体の開裂認識部位に直接隣接して、かつ
その部位の上流に位置するアミノ酸配列に実質的に相当
する３〜５個のアミノ酸またはアミノ酸類似体のイプチ
ド配列にエステルまたはアミド結合により連結された〇
−末端インジケータ部分を含む） ことよ）なる前記方法を提供する。
本発明はまた前述の方法の生成物をも提供する。生成物
の例は、式 ％式％［） 〔式中、 Ａ１はＧｌｎ　、　ＧｌｕまたはＧｌｕのエステルおよ
びＡｇｎよ多なる群から選択されるアミノ酸残基であ）
； Ａ２はＡｌａ　％　Ｌｅｕ　％工１ｅおよびＶａｎより
なる群から選択されるアミノ酸残基であり； ム３ｉ？よびＡ４はそれぞれ独立してＡｈａ　１Ａｉｉ
ｎ　ＮＡｒｇ　ｓ　Ａｓｐ　％　ａｙｓ　１ＧＩｎ　％
　ＧＩｎ　％　Ｇ１７　％　Ｈｌｓ　、工１ｅ１Ｌｅｕ
　％　Ｌ７Ｂ　、Ｍｅ　ｔ　％　Ｐｈｅ　％　ｐｒｏ　
、ｓｉｒ　％　Ｔｈｒ　％　’ｒ７ｒ　％Ｍａｌ　、　
Ｔｒｐおよびそれらの類似体よりなる群から選択される
Ｄ−またはＬ−配置のアミノ酸残基であシ： Ｒ１は水素またはＮ−末端保護基であシ；そしＲ２は−
ＯＨまたは−Ｘ（ここでＸはアミノ酸残基Ａ１のＣ−末
端力ルボニルとアミドまたはエステル結合を形成でき、
そして更にそのアミドまたはエステル結合の加水分解的
開裂の後に遊離のＸとして砂型して検出されうる部分で
ある）である〕で示される化合物およびその生理学的に
許容しうる塩である。
本発明はまた、前記式■の範囲内の１種またはそれ以上
の化合物を用いることよりなる試料中のピコルナウイル
ス−特異的プロテアーゼ活性の検出方法をも提供する。
本発明の方法はＣ−末端インジケータ部分をＭする選択
されたトリー、テトラ−およびはンタペプチド基買を提
供する。ウイルス−特異的プロテアーゼにより開裂され
うるこれらの化合物は試ａ中のウィルスプロテアーゼ活
性の有無の検出に用いることができる。
好ましくは、ペプチド基質の配列はポリペプチド前駆体
の開裂認識部位に直接１ｉｉＩ接しかつその部位の上流
にあるアミノ酸配列に極めて類似したものとする。本明
細書において「上流」とは翻訳方向とは逆の方向の意で
ある。
個々のペプチド配列に関連して本明細書全体にわたって
用いられる「実質的に相当する」という用語は、当該ペ
プチド配列が基準配列と同様の数のアミノ酸残基を包含
し、その同一性および配列が基準配列に関連して極めて
相同しているかまたは保存的に置換されていることを示
す。本明細書に用いられる「保存的に置換される」の用
語は、所定の残基が生物学的に類似した残基により置き
換えられていることを示している。保存的置換の例には
、１個の脂肪族残基を別のもので、例えば工１ｅ　Ｘ　
ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａを相互に置き換える例、あ
るいは、１個の極性残基を別のもので、例えばＬｙｓと
Ａｒｇ　；　ＧｌｕとＡｓｐ　；またはＧｌｎとＡｓｎ
の間で置き換える例が含まれる。上で用いた「残基」は
アミノ酸またはアミノ酸類似体を意味する。
前述の如く、本発明方法により製造されるペプチド基質
のアミノ酸配列はウイルス−特異的プロテアーゼによ勺
認識される開裂部位のアミノ酸配列を基準に確豆される
。これらのデータは２つの一般的方法を用いて得ること
ができる。
第１に、ウィルスタンパクを精製ウィルス粒子または感
染細胞から単離しそして成分ポリペプチドに解離し、そ
れらを次にＮ−およびＣ−末端の両方から慣用のタン／
Ｊり配列分析方法〔例えばエドマン（ｆｆｉｄｍａｎ）
分解〕によ）配列決定する。この方法は既知の開裂部位
に直接隣接した配列データを与える。第２に、ある種の
ウィルスのＲＮＡゲノム（またはそのｃＤＮＡ転写物）
の配列を決定してヌクレオチドの一次配列を与えること
ができそれよ）翻訳の読取解読枠を用いてウィルスタン
／Ｊり配列が導かれる。次いでその導かれたアミノ酸配
列を相同のまたは関連のウィルスの既知タンノ々りのも
のと比較することにより開裂部位を決定する。
ウィルスタン／４りまたは核酸を取得および精製し、そ
してウィルス核酸の配列を決定する方法は周知であシ、
ここでは＃述しない。次のものは適切な方法に関する有
用な一般文献であシ、参考として本明細書に包含される
。
Ｍ！Ｌ！ａｍ、Ａ、Ｍ＠　、およびＧ１１ｂｅｒｔ、Ｗ
、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ａＡｃａｄ、８ｃｉ　ｌ１
ｒＳム７４：５６０〜５６４（１９７７）。
８ａｎｇｅｒ、？、　、Ｎ１ｃｋｌｅｒ　、８．　、お
よびＣａｒｉｓｏｎ、Ａ、Ｒ。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、８ｃｉ、ｔＴＳＡ　７
４：５４６３〜５４６７（１９７７）。
Ｐｅａｔｔｉｅ、Ｄ、Ａ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、８ｃｉ、ＵＳＡ　　７６二１７６０〜１７６４（
ｊ９７９）。
Ｓｉｍｏｎｃｓｉｔｓ、Ａ、、Ｅｒｏｗｎｌｅｅ、Ｇ、
Ｇ、、Ｂｒｏｗｎ、Ｒ，Ｓ、。
Ｒｕｂｉｎ、Ｊ、Ｒ，、およびＧｕｉｌｌｙ、Ｈ，、Ｎ
ａｔｕｒｅ　２６９：８３３〜８３６（１９７７）。
以下に述べる文献は個々のウィルスのゲノムまたはタン
パクの関与する配列決定実験を記載している。
１、　０ａｒｒｏｌｌ、Ａ、Ｂ、、Ｒｏｗｌａｎｄｓ、
Ｄ、、Ｔ、および０ｈａｒｋｅ。
Ｂ、Ｅ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１５　　Ｒｅｓ、１
２：２４６１（１９８４）；（口蹄疫ウィルス）。
２、　　Ｈｅｒｂａｒｔ、に、、およびＭｕｈｌｅｒ、
Ｍ、、ｌ：！ｅ１ｍ　３０：１（１９８２）；　（アル
ファウィルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ））。
ｌ　　Ｋｌｅｎｋ、Ｈ，Ｄ、、Ｇａｒｔｅｎ、Ｈ，Ｄ、
、Ｋｅｉｌ、Ｗ、、Ｎｉｅｍａｎｎ。
Ｈ，、Ｓｃｗａｒｔｚ、Ｒ，Ｔ、　＃およびＲｏｔｔ、
Ｒ，、”Ｐｒｏｃｅｓａｉｎｇｏｆ　ｔｈｅ工ｎｆｌｕ
ｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、
”Ｇ。
Ｋｏｏｈおよびり、Ｒｌｃｔｅｒ　ｉｌ　、Ｂｉｏａｙ
ｎｔｈｅｓｉｇ。
Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ　　Ｐｒｏｃｅｓｓ
ｉｎｇ　　ｏｆ　　Ｃｓ１ｌｕｌａｒａｎｄ　Ｖｉｒａ
ｌ　Ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８０）。
４、　　Ｋｏｒａｎｔ、Ｂ、、Ｏｈｏｗ、Ｎ、、Ｌｉｖ
ｅ１７＋Ｍ、＋およびＰｏｗｅｒｓ、Ｊ、、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７６：２９９
２（１９７９）；　（ポリオウィルス）。
５、　　Ｋｏｒａｎｔ、Ｅ、、Ｊ、Ｖｉｒｏ１１０ニア
５１（１９７２）；　　（ポリオウィルス）。
６、　　Ｌｅｅ、Ｔ、Ｈ，、Ｏｏｌｉｇａｎ、Ｊ、に、
、Ｈｏｍｍａ、Ｔ、、ＭｃＬａｎｅ。
Ｍ、Ｆ、　、Ｔａｃｈｉｂａｎａ、Ｎ、　、およびＥｓ
５ｅｘ、Ｍ、　、Ｐｒｏｃ。
ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８Ｃ３８５６（
１９８４）、’（ヒ　ト　Ｔ−細胞白血病ウィルス）。
７．０ｒｏｓｚｌａｎ、Ｓ、、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｌ
、に、、０ｏｐｅｌａｎｄ、Ｔ。
Ｄ、　、８ｃｈｕｌｔｚ、Ａ、Ｍ、　＃およびＲａ　ｂ
　ｉ　ｎ　、　Ｅ　、　Ｍ、　、”Ｐｒｏｃｅｅｙｓｉ
ｎｇａｎｃｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｍｕｒｉｎ
ｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓｇａｇ　ａｎｄ　ｅ
ｎｖ　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｅｄ　Ｐｏ１ｙｐｒｏｔｊ
ｉｎｓ、”Ｇ、Ｋｏｃｈおよびり、Ｒ１ｃｈｔｅｒ編、
　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　。
Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉ
ｎｇ　　ｏｆ　　０ｓｌｌｕｌａｒａｎｄ　Ｖ’１ｒａ
ＩＰｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ　　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓ＋ｓ。
工ｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８０）。
ａ　　Ｐａｌｍｓｎｂｅｒｇ慶ＡｍＣ，、Ｋｉｒｂｙ＋
に＊Ｍ、、、Ｔａｎｄａ、Ｍ、Ｒ，。
Ｄａｒｋｓ、Ｎ、Ｌ、　、Ｄｕｋｅ、Ｇ、Ｍ、　、Ｐｏ
ｔｒａｔｚ、に、Ｆ、　、および０ｏ１１ｅｔｔ、Ｍ、
Ｓ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａａｉ４ｓ　Ｒｅｅ、１２：
２９６９（１９８４Ｌ儂心筋炎ウイルス）。
９．５ｅｉｋｉ＋Ｍ、、５ｅｉａｕｋｓ、Ｈ，、Ｈｌｒ
ａｙａｍａ、Ｙ、、およびＹｏｓｈｌａ＊Ｍ−、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＳａＯ２３６８
（１９８３）；　（ヒト’Ｉ’−細胞白血病ウイルス）
。
ｊＯ，Ｓｔａｎｗａｙ、Ｇ、、ａｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１５　Ｒｅｓ。
１１：３６２９（１９８３）；（ポリオウィルス）。
１１、　５ｔｒａｕｓｅ、Ｆｉ、Ｇ、、Ｒｌｃｅ、Ｃ！
、Ｍ、、および５ｔｒａｕｓｓ　。
Ｊ、Ｈ，、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３３：９２（１９８４
）；　Ｃシンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　ｖｉｒ
ｕｓ））。
本発明の特定化合物例はＣ−末端レポータ（ｒθｐｏｒ
ｔｅｒ）ｔたはインジケータ部分を含む、ピコルナウイ
ルスポロテアーゼ開裂部位にみられる配列忙相当する選
択されたテトラペプチドである。このインジケータまた
は標識はペプチド分子の残部から開裂後独立して検出す
ることができる。かかる標識イプテドはピコルナウイル
ス−特異的プロテアーゼによ）認識される開裂部位と相
同となるように設計され、それＫよってピ；ルナウィル
スプロテアーゼ比活性を測定するための人工基質を提供
する。かかる活性の有無はピコルナウィルス感染の診断
となる。
本ＦｉＡ細書全体にわたって、アミノ酸残基またはアミ
ノ酸に対し次の省略形が用いられる。
アミノ酸　　　　　　　−文字省略形　三文字省略形し
−アラニン　　　　　　Ａ　　　　　ＡｌａＬ−アルギ
ニン　　　　　ＲＡｒｇ Ｌ−アスパラギン　　　　Ｎ　　　　　ＡｓｎＬ−アス
パラギン酸　　　Ｄ　　　　　ＡｓｐＬ−システィン　
　　　　ＯＣｙｓ Ｌ−グルタミン　　　　　Ｑ　　　　　ＧｉｎＬ−グル
タミン酸　　　　Ｋ　　　　　Ｇｌｕグリシン　　　　
　　　Ｇ　　　　Ｇ１７Ｌ−ヒスチジン　　　　　ＨＨ
ｌｓ Ｌ−インロイシン　　　　エ　　　　エ１ｅＬ−ロイシ
ン　　　　　　Ｌ　　　　　ＬｅｕＬ−リジン　　　　
　　Ｋ　　　　ＬｙｅＬ−メチオニン　　　　　Ｍ　　
　　　ＭｅｔＬ−フェニルアラニン　　Ｆ　　　　　Ｐ
ｈｅＬ−プロリン　　　　　　　Ｐ　　　　　Ｐｒ。
Ｌ−セリン　　　　　　Ｂ　　　　５８ｒＬ−）レオエ
ン　　　　　Ｔ　　　　　ＴｈｒＬ−）リプトファン　
　　Ｗ　　　　　ＴｒｐＬ−チロシン　　　　　　Ｙ　
　　　　ＴｙｒＬｏ−バリン　　　　　　Ｖ　　　　Ｖ
ａｌ”Ｄ−”が前に付しである前述の省略形はＤ−配置
のアミノ酸を示す。
本明細書全体にわたシ用いられる″Ｎ−末端保護基”と
はアリールカルボニル、アルキルカルボニル、アルコキ
シカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルアルコ
キシカルボニル、アリールスルホニル、アルキルスルホ
ニル、マタハアリールスルホニルペプチド保護基、また
はその他のペプチド合成技術分野における当業者に知ら
れた等個物を意味する。ＧｒｏｓθおよびＭｅｉａｎｈ
ｏｆｅｒ　ｉＪ！Ｉ、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｅ、ＶＯ
ｌ　３（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ、１９８１）　ｐｐ　３−８１（その開示を引用によ
）本明細書の記載の一部とする）は多くの適当なアミン
保護基を記載している。本明細書において、個別的に、
あるいはよシ大きな基の一部として用いられる”アルキ
ル”は、１〜１０個の炭素原子を有する直線状、環状ま
たは分枝鎖状脂肪族部分を意味し；″置換アルキＩはＮ
、ＯまたはＳなどのへテロ原子（１個または複数個）を
含む置換分を有するアルキル基を意味し；”アリール”
は未置換のまたは１個またはそれ以上のアルキル置換ア
ルキル、ニトロ、アルコキシ、またはハロ基で置換され
た、６〜１８個の炭素原子を有する芳香族部分、例えば
フェニルを意味し：そして１アルカリール”は脂肪族置
換分、そして所望により他の置換分例えば１個またはそ
れ以上のアルキル、置換アルキル、アルコキシまたはア
ミノ基などを有する７〜１９個の炭素原子をＭするアリ
ール部分を意味する。”アラルキル″はアリール基（１
個または複数個）を含む６〜１８個の炭素原子を有する
直線状または分枝鎖状脂肪族部分を意味する。
Ｎ−末端保護基Ｒ１の適例には、ホルミル、アセチル、
トリフルオロアセチル、ベンジルオキシカルボニル（カ
ルボベンゾキシ）、置換ベンジルオキシカルボニル、ｔ
ａｒｔ−ブチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシ
カルボニル、アリルオキシカルボニル、フタロイル、ベ
ンゾイル、アセトアセチル、クロロアセチル、フェノキ
シカルボニル、メトキシスクシニル、スクシニル、２，
４−ジニトロフェニル、タンシル、ｐ−メトキシベンゼ
ンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホ
ニルおよびフェニルチオが含まれる。
Ｎ−末端保護基Ｒ１のあるものは本明細書全体忙わた）
次のよ５に省略される。
２　　：カルボベンゾキシ Ｂｏａ　　：ｔ　−７’チルオキシカルポニルムＣニア
セチル Ｂｔ：エチル Ｓｕｃ　　ニスクシニル ＭｅＯ８ｕｃ：メトキシスクシニル ＤＮＳ　　：ダンシル ＤＮＰ　　：　２，４−ジニトロフェニル側鎖アミノ基
を有する、例えばＡ３およびＡ４がＬｙｓ　またはＡｒ
ｇである本発明化合物は、所望によりその側鎖に結合し
た適当なＮ−末端保護基を含んでいてもよい。同様に、
酸またはヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸残基、例えば
Ａ１、Ａ５またはＡ４はメチル、ベンジルまたはその他
の適当なエステルまたはエーテルの形で保護することが
できる。
前述のとおシ、Ａ５およびＡ４はＤ−配置のアミノ酸ま
たはアミノ酸の類似体であってもよい。
本明細書全体にわたって用いられる「類似体」で示され
る天然アミノ酸ではない残基を意味する。前記式■のＲ
３はアルキル、置換アルキル、アリール、アラルキルま
たはアルカリール基であってもよく、そしてそれらは場
合により末端がヒドロキシ、アミン、ホスフェートまた
はチオ基となっていてもよい。かかる類似体の例にはヒ
ドロキシプロリン、を−カルボキシグルタメート、０−
ホスホセリン、カルニチン、シスｆイアｒＲ、フェニル
グリシン、α−アミノイソ酪酸およびα−アミノカプロ
ン酸などが含まれる。
式Ｉの化合物の許容しうる塩には、遊離塩基が存在する
場合にはその酸付加塩が含ｌれ、その場合その酸は有機
または無機であってもよく、例えば塩酸、燐酸、マレイ
ン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸などであってもよい。
あるいはまた、ナトリウム、カリウム、およびアンモニ
ウム塩を含む遊ＨＯプチド酸（ｐｅｐｔｉｄｉｃ　ａｃ
ｉｄ）の塩も本発明の範囲に包含される。
前記式■の置換分Ｒ２は前述のとお、り、−ＯＨまたは
ＸであってもよくここでＸはアミノ酸残基Ａ１のＣ−末
端カルボニルと共にアミドまたはエステル結合を形成し
てＸとペプチドとの接合体を与えることのできる部分で
ある。部分Ｘはまた、ウイルス−特異的プロテアーゼに
よるアミドまたはエステル結合の開裂の後、遊離の、ま
たは接合していないＸとして独立して検出されうる。す
なわち、例えば部分Ｘは、次式■Ｒ１−Ａ４Ａ３Ａ２−
ＮＨＯＨＯ−−−ＮＨ（Ｘ）　　　（ｉｌｌ）によって
示されるように、アミノ酸残基Ａ１１Ｃ対するペプチド
結合を形成するのに都合のよい位置にアミノ基またはヒ
ドロキシル基を包含する。
ピコルナウィルスプロテアーゼ活性を検出するだめのテ
トラペプチド基質の場合には、残基Ａ１はＧｌｎ　％　
Ｇｌｕ　％またはＧｌｕのエステルおよびＡｓｎよりな
る群から選択される。それ故に前記式中ｏｍ換分Ｒ４バ
ーＣＨ２（Ｈ２０００Ｈ、−０Ｈ２ＣＯＮＨ２オヨび−
ｏａ２ｃＨ２ｏｏＮａ２　、および前述の如き適当な保
護基を富む前述の基の変形よりなる群から選択される。
前述の条件が満たされる限夛、インジケータ部分Ｘの正
確な本体および性質は本発明にとって臨界的ではない。
Ｘは溶液千の特定の被分析＠　（ａｎａｌｙｔｅ）また
はりガントな検出する技術分野において知られる数多く
の方法の一つにより検出しうる色原、螢光系、化学光、
放射性、抗原またはハプテン基であってもよいと現在で
は考えられる。適切なＸについての更なる井細は以下に
記載する。
Ｘが色原基である場合、浴液中の遊離Ｘは、そのペプチ
ドの残部から開裂後に分光光度測定により検出可能であ
る。適当な色原基例には、ニトロアニリノ、ニトロフェ
ニルオキシ、２．４−ジニトロフェニルオキシ、ニトロ
フェニルアミノ、ナフチルアミノ、ニトロナフチルアミ
ノ、メトキシナフチルアミノ、キノリルアミノ、ニトロ
キノリルアミノおよび４−トリフルオロメチルクマリル
−７−アばノが含まれる。好ましい色素原基はナフチル
アミノ、特にβ−ナフチルアミノ（以下″’ＮＡ”と略
す）である。
Ｘが螢光原基である場曾、遊−Ｘはそのペプチドの残部
からインジケータ基を開裂後、ある波長で励起しそして
別の波長で検出することによ）溶液中で検出できる。適
当な螢光原基には４−メチルクマリル−７−７ミノ（以
下′″ＡＭＯ”と略す）、４−トリフルオロメチルクマ
リル−７−アばノ、ナフチルアミノ、７−オキシ−クマ
リル、４−メチルウンベリフェロンおよび５−アミノー
イソフタール酸ジエチルエステルが含まれる。前述の中
でもムＭｅが好ましい。
Ｘは化学光インジケータ基、例えばアミノイソルミノー
ルなどであってもよい。
Ｘが放射性原子（１個またはり数）、例えば〔１４の、
Ｃ５５Ｂ）または〔３Ｈ〕などを含む基である場合には
、遊離のＸを接合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）Ｘか
ら分割するための系または手順が提供される。
例えば、このような分割は有機溶液と水性溶液の分離の
Ｍ来として行うことができる。有機相中に分配されうる
インジケータ基の例には、１個またはそれ以上の（１４
０）または〔５Ｈ〕基を含有するアニリノ、ベンジルア
ミノまたは低級アルコキシ基が含まれる。放射性標識基
質を特異的プロテアーゼ活性を含有していると思われる
試料とインキュベーションした後、有機溶媒例えばトル
エンを検定混合物に添加することができる。有機溶媒へ
の遊離のＸの溶解度が比較的高いことから比較的高割合
の遊離のＸがその有機溶媒中に抽出されることになシ、
それを取り出して液体シンチレーションカクテルを含む
シンチレーションバイアルに添加しそして既知方法によ
り計数することができる。
あるいはまた、遊離の放射性インジケータ基は固体基質
上の遊離放射性インジケータ基を固定するリガンド結合
系により接合した基から分割することができ、あるいは
固定された基質を用いそして４１ｍされたインジケータ
をモニターすることができる。
Ｘが特異抗体により独立して検出しうる抗原またはハプ
テン基である場合には、遊離のＸは認識するが、ｇｊ会
されたＸは認識しないかまたは接合されたＸに対する結
合親和性の低下した抗体試薬、特にモノクローナル抗体
が必要である。適当なハプテンインジケータ基の例は０
−二トロフェノールである。その場合、いくつか知られ
ている免疫学的方法の任意のものを用いてプロテアーゼ
活性を検出することができる。
かかる方法として鉱例えば放射免疫検定またはＷ＃素免
疫検定、粒子増感濁度測定免疫検定およびアフイニテイ
力ラム介在免疫検定などが挙げられる。
慣用の放射免疫検定または酵素免疫検定においては、標
識基質のプロテアーゼ触媒加水分解によ）生成したハプ
テン（遊離ｘ）のほかに、添加された酵素−またはラジ
オアイソトープ−標識ハプテンがハプテン特異抗体上の
限られた数の結合部位を求めて拮抗する。既知の方法に
より定を化しうる抗体により結合された活性の量は特異
的プロテアーゼ活性により生じたハプテンまたは遊離の
Ｘの量に反比例する。
粒子増感濁度測定免疫検定においては、粒子ｌこ、イン
ジケータ基Ｘとして基質にも結合されるハプテンまたは
その他の分子種でコーティングする。得られたＸ−被覆
粒子は次に、Ｘ−標識ヘプチド基質と予めインキュベー
トしである試料のほか、ｘＫ対し特異的な抗体とインキ
ュベートする。特異的プロテアーゼ活性により遊離する
遊離のＸの存在により、ほかに被覆粒子に対するＸ−特
異的抗体の作用から生じるであろう濁夛形成を阻害する
。
アフイニテイ力ラム介在免疫検定においては、インジケ
ータ基Ｘに対し特異的な酵素標識抗体を、特異的プロテ
アーゼ活性を含有する、または含有すると思われる試料
、そしてＸ−標識ペプチド基質とインキュベートする。
インキュベーションの後、得られた混合物を、ハプテン
または抗原基ＸＫも結合した固体基質を含むカラムＫか
ける。試料とのインキュベーション中にＸを結合した酵
素−標識抗体はカラムを通過しそしてカラム流出液中に
果められることになる。
遊離抗体はカラムに結合されることになる。次いで、カ
ラム流出液中の酵素活性ｔを測定することができる。得
られた量は試料とのインキュベーション中に遊離した遊
離のＸの量に関係する。
本発明の範囲の化合物例を同定する特徴的ペプチド配列
は、ウイルス−特異的プロテアーゼにより認識される開
裂部位の既知アミノ酸配列を基準に確立された。このデ
ータは２つの一般的方法を用いて導かれた。第１Ｋ１ウ
イルスタンパクを精製ウィルス粒子または感染細胞から
単威し、そして成分ポリペプチドに解離した後、慣用の
タンパク配列分析法（例えばエドマン分解）によｊ５Ｎ
−末端およびＣ−末端の両方から配列決定した。この方
法により既知の開裂部位に直接Ｉｉｌ接した配列データ
が得られた。次に、ある種のウィルスのＲＮＡゲノム（
ｔたは−ｔのａＤＮＡ転写物）の配列を決定して得られ
るヌクレオチドの一次配列から翻訳の転写解読枠を用い
てウィルスタンパク配列を導いた。次いでその導かれた
アミノ酸配列を、相似または関連のウィルスの既知タン
パクのものと比較することにより開裂部位を決定した。
ある復のウィルスタンパクの開裂部位間の相同性を第２
図に示す。第２図にはポリオウィルス・タイプ１、口蹄
疫ウィルス、セムリキ森林熱ウィルス（ｓｅｍｌｉｋｉ
　ｆｏｒｅｓｔ　ｖｉｒｕｓ）およびシンドビスウイル
スのタンパクについての配列情報のほかに２２個の開裂
部位が列挙されている。ウイルス−特異的プロテアーゼ
により認識される開裂部位は斜線により示され、また完
全な相同性は黒丸で示されている。第２図に記載の情報
に示唆されるように、ピコルナウィルスについての開裂
部位の場合にはしばしば、グルタミン−グリシンまたは
グルタミン酸−グリシン配列（しばしば疎水性残基例え
ばアラニン、バリン、インロイシンまたはロイシンなど
Ｋよシ囲まれている）が目立つ。これまでＶＣ！徴付け
られているその他の開裂部位はアス、２ラギン残基を含
んでいる。残基Ａ２よ）も開裂部位から遠位にある残基
、すなわちＡ３およびＡ４は現在のところ、生成する合
成基質の特異性に著しく影響するとは考えられていない
。
トガウィルス構造タンノぞりの開裂部位における多様性
は更に大きい。アルファウィルス（トガウィルス科の部
分集合）の場合には、アラニン残基が存在する傾向にあ
る。セムリキ森林熱ウィルスとシンドウイルスを比較す
ると中等度ないし高度の個別部位の保存がみられるが、
異なる部位は実質的な化学的相異を示し、いくつかのプ
ロテアーゼが参画していることを示唆している。エンベ
ロープタンパク２と６の間で開裂する二塩基性ａｒｇ−
ａｒｇ／ｓｅｒまたはｌｙｓ　−ａｒｇ　／ｓｅｒ部位
を除いて、すべての開裂はキモトリプシン様であると考
えられる。
本発明の範囲内の化合物として意図されるジーナｘ　（
ｇｅｎｕｓ）は、前記式Ｉ（式中Ｒ１はＢｏｃ、Ｚ　％
　ｓｕｅ　、またはＭｅＯ８ｕｃであ〕：Ｒ２は一〇Ｈ
または色原性、螢光原注、化学光性、放射性、抗原性ま
たはハプテン性のインジケータ基であシ；そしてＡ１、
Ａ２、Ａ３およびＡ４は前記定義のとおシである）の化
合物を包含する。前述の定義に係るジーナスに含まれる
ものとして意図される化合物のクラスは第１クラス（Ａ
ＩがＧｉｎであるもの）：第２クラス（ＡＩがＧｌｕあ
るいはＧｌｕのエステルであるもの）；および第３クラ
ス（ＡＩがＡｓｎであるもの）が含まれる。前述の３つ
のクラスの各々の範囲内で、サブクラス（そのクラスの
限定の各々が適用され、またＡ３およびＡ４はＡｌａ　
ｓ　Ａｒ８％　Ａｓｎ　１Ａｓｐ　Ｘ　Ｏｙｓ　１Ｇｌ
ｎ　５Ｇｌｕ　、　Ｇａｙ　５Ｈ１８ｓ工１ｓ　、Ｌｅ
ｕ　１Ｌｙｅ　％　Ｍｅｔ　％　Ｐｈｅ　ｓ　Ｐｒｏ　
Ｎ　Ｓｅｒ　、　ＴｈｒｌＴｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｎ
よプなる群から選択される）が意図される。更に１サブ
クラス（Ａ３およびＡ４は更に、Ａｈａ　ｓ　０１７　
％工１ｅ　５Ｌｅｕ　１Ｐｈ１３　Ｎ　Ｓｅｒ　ｓ　’
ｒｙｒおよびＶａｌから選択される）が意図される。
本発明の範囲内の化合物例は次のもの（以下の式の各々
におけるＲ１はＢｏａ　、Ｚ　５Ｓｕｃ　、またはＭｓ
０８ｕ（！であり；そして以下の式の各々におけるＲ２
は色原性、螢光原性、化学光性、放射性、抗原性または
ハプテン性のインジケータ基である）を包含する。
ｒｌ’−ＦＧＬＱ−Ｒ２Ｒ’−ＰＭＬＱ、−Ｒ２Ｒ’−
ＡＫＶＱ−Ｒ２Ｒ１−ＦＡＬＱ−Ｒ２Ｒ１−ＰＴＩ４−
Ｒ２Ｒ１４ＶＬＱ、−Ｒ２Ｒ１−ＦＬＬＱ−Ｒ２Ｒ１−
ＰＲＩ４−Ｒ２Ｒ１−ＶＶＶＱ−Ｒ２Ｒ１−Ｆ’工ＬＱ
−Ｒ２Ｒ１−ＡＫＬＱ−Ｒ２Ｒ１−ＬＤ工Ｑ−Ｒ２Ｒ１
−ＦＶＬＱ、−Ｒ２Ｒ１−Ａ工ＡＱ−Ｒ２Ｒ１−ＴＱＬ
Ｑ、−Ｒ２Ｒ１−ＦＧＡＱ、−Ｒ２Ｒ１−ＡＭＬＱ−Ｒ
２Ｒ１−ＴＤＶＱ−Ｒ２ｆｌ”Ｆ’Ｇ工Ｑ−Ｒ２Ｒ１−
ＡＢＬＱ−Ｒ２Ｒ１−ＲＨＬＮ−Ｒ２Ｒｊ−ＦＧＶＱ−
Ｒ２Ｒ４−ｖ工ＬＱ−Ｒ２Ｒ１−ＲＥｉＬＮ−Ｒ２Ｒ１
−ＧＧＬＱ−Ｒ２Ｒ４−ＡＬＬＱ−Ｒ２Ｒ１−ＡＬＬＥ
−Ｒ２Ｒ１−ＡＡＬＱ−Ｒ２Ｒｊ−ＡＩＩＱ−Ｒ２Ｒ１
−工ＨＬＫ−Ｒ２Ｒ１−ＬＡＬＱ−Ｒ２Ｒ１−ＡＧＬＱ
−Ｒ２Ｒ１−ＦＧＩＪ−Ｒ２Ｒ１−■ＡＬＱ、−Ｒ２Ｒ
１−ＡＱ、ＩＩＱ−Ｒ２Ｒ”０ＴＩＪ−Ｒ２Ｒ１−ＶＡ
ＬＱ−Ｒ２Ｒ１−ＫＱＬＱ、−Ｒ２Ｒ１−ＧＧＩＩＩＣ
−Ｒ２本発明により特定される化合物は一般的に次のよ
うにしてｄ造される。
まず、Ｎ−保護ペプチド箇たはアミノ酸を約１当麓のＮ
−メチルモルホリンおよび１当賃のインブチルクロロホ
ルメートと約−２０℃で反応させてペプチド−イン酪酸
混合無水グな生成させる。この標準的な方法はＡｎｄｅ
ｒｓｏｎら１Ｊ−―・Ｃｈａｍ、Ｓｏｃ、８９：５０１
２（１９６７）に記載されている。次に、生成混合無水
物を、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＩＰ）また
は他の適当な不活性非プロトン溶媒中で約１当童のアミ
ノ基言有標識化合物で処理して標識Ｎ−保鏝ベプチドま
たはアミノ酸を生成させる。
保１基のはずされた標識ペプチドを、前述の手順により
生成された他のＮ−保護ペプチドまたはアミノ酸の混合
無水物に繰返し結合することにより、よ〕大きなペプチ
ドを構築することができる。Ｎ−末端アミノ基の保護基
の除去はトリフルオロ酢酸、無水ＩＰ　、無水Ｈｏｔで
処理するか、または当業者に知られた方法により行うこ
とができる。
便用に一際しては、本発明のペプチド基質をピコルナウ
ィルスプロテアーゼ活性を苫有すると思われる試料とイ
ンキュベートする。そのインキュベーションは基質のプ
ロテアーゼ触媒加水分解を行わせるのに十分な時間進行
させる。インキュベーションの後、開裂したインジケー
タ基の臂漂をび用したインジケータに適した方法により
検出する。その他の場合には、インジケータ基の遊離は
連続的にモニターすることができる。試料は人間または
動物から採取した生理学的液体、例えば血清、血漿、リ
ンフ５液、腹腔敵、胸膜辰、唾液、背ｇｌ液、鼻分泌物
または膣または頚部分泌切などであってよい。あるいは
筐た、暦法性のピコルナウィルス感染の疑いのある人間
または動物に由来する増殖細胞から試料を調製すること
ができる。これらの細胞は組織培誉として増殖させるこ
とができ、また培養＃ｆｌ記の培養上清ｌたは溶解液の
プロテアーゼ活性を本発明の基質を用いて測定すること
ができる。
本発明の範囲の化合物の製造に適した一般的に適用可能
な手順を下記実施例の前のパラグラフＩＣ記載する。
それら合成の手順および実施例において、特記しない限
り、部および％はすべて重量に基づき、温度はすべて摂
氏温度である。
１、　混合無水物結合方法（ＭＡ） 約１〜２ｔのＮ−保睡アミノ酸またはイプチドを２０−
のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させ、そして得
られた浴液を一２０°に冷却する。
Ｎ−メチルモルホリン（１当ｔ）およびイソブチルクロ
ロホルメート（１当りを添加しそして５分後に、更に１
０−の冷ＴＨＦおよび１当量のトリエチルアミンを添加
する。得られた混合物を５−のＤＭＦに溶解させた１当
量のアミン塩酸塩またはトリフルオロアセテートに直ち
に添加する。得られる反応系を一２０°で１時間、次に
約２３°で２時間攪拌する。得られる混合物をｆ過し、
そしてそれによって得られるｆ液を次に蒸発により約５
ｔ１１ｔまで濃縮する。得られる濃縮液または残留物を
酢酸エチルに溶解させ、次いで０．２Ｎ塩酸、５係重炭
酸ナトリウム溶液、および飽和水性塩化す）　ＩＪウム
で順次洗浄する。
次に、得られた有機浴液を硫酸ナトリウムで短時間乾燥
させ、Ｃ過し、そして最後に蒸発させると粗製にプチド
生成物が残る。
２、　　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｏ８ｕ）結合
方法 Ｎ−保護アミノ酸およびイプチドのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルは、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ、Ａｍ
、Ｏｈｓｍ、１３ｏｃ、８６：　１８３９（１９６４）
に記載のものと実質的に同様の手順により製造すること
ができる。Ｏ８ｕエステルを最少容量のジオキサンに溶
解させ、そして得られた溶液を１．５当量のトリエチル
アミンおよびアミノ＃　（１，５当漬）かｔたｔｔはプ
テド（１，１当量）よりなる等容量の水性浴液に添加し
て、反応混合物を形成する。
約５分後、完全な溶液が得られない場合には、その反応
混合物の少量の試験試料を水で希釈し、そしてもう１つ
の試料をジオキサンで希釈する。
得られた結果に基づき、反応混合物を次いで完全な溶液
が得られるまで適当な溶媒（水かまたはジオキサン）で
希釈する。反応が完結するまで進行した後、反応混合物
を塩酸で酸性化し、そして得られた生成物を酢酸エチル
に抽出する。
次いで、得られた抽出液を０．２Ｎ塩酸、次いで飽和塩
化す）　ＩＪウム中のα２Ｎ塩酸で洗浄する。
次に、その洗浄した抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥させ
、ｅ過し、そして最後に蒸発乾固すると祖装イプチドが
９６゜ ３、　その他の結合方法 択フチドのダンシル、２，４−ジニトロフェニル、およ
びメトキシスクシニル誘導体を、選択されたクロライド
、フルオライドまたはＮ〜ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを適当なペプチドと反応きせることにより製造す
る。アセチルおよびスクシニル誘導体は相当する無水物
から製造できる。ペプチド塩酸塩またはトリフルオロア
セテート塩をα２５ずリモ／Ｌ／／−のレベルとなるよ
う５０％水性ジオキサンに浴解させ、そして得られた溶
液を００に冷却する。選択された結合剤（１，ｏ〜１，
２当ｔ）をジオキサンに溶解し、そして２当麓の亘炭赦
ナトリウムと共に添加する。ニンヒドリン＠注物質の消
失を追跡することによ）生成反応をモニターする。
４、　メチルエステルのけん化 Ｎ−保ｆｆｌメチルエステルをジオキサンに浴解させ（
１−／ξミリモル、そして等容量のｊ、ＱＯＮ水酸化ナ
トリウムを３０分間かけて添加する。
薄層クロマトグラフィによ）出発物質の消失をモニター
する。生じる反応が完了するまで進行した後、当量のｆ
、　ＯＯＮ塩酸を添力ＯＬ、そしてその浴液を水で１０
０４となるまで希釈する。次に生成物を酢酸エチルに抽
出し、そして得られた抽出液を０．２Ｎ塩酸で洗浄し、
次いで飽和塩化ナトリウム中のα２Ｎ埴酸で洗浄する。
次に溶媒を蒸発により除去すると粗製カルボン酸が残る
。
５、　　Ｂｏｃ基の加水分解 選択されたペプチドをトリフルオロ酢酸に溶解させ、そ
して得られた浴液な約２３ｃ′で５分間攪拌す・ること
によ）、Ｅｏｃ保護基をペプチドから除去する。次＃′
ｃ冷エーテルを添加する。ニーチル添加の際に沈殿が得
られたらそれをエーテルで磨砕しそして単離する。沈殿
が得られなければ、エーテルを蒸発させそしてトルエン
を添加して残留トリフルオロ酢酸を共蒸発させると保護
基のはずされたにプチドがトリフルオロ酢酸塩として得
られる。
あるいはまた、Ｂｏｃ−保護ペプチドをエタノール性塩
酸（２，０〜＆５Ｎ）にｍ解させそして得られる溶液を
約２６°で約３０分攪拌し、次いで溶媒を蒸発させるこ
ともできる。すべての場合に、ペプチド塩酸塩またはト
リフルオロアセテート塩を固体水酸化カリウムと五酸化
燐の存在下に一夜真空乾燥する。
６、　　ｔ−ブチルエステル（Ｂｕ）の加水分解ｔ−プ
チルヘフチドエステルをトリフルオロ酢改に浴解し、そ
して得られた溶液を約２３℃で１時間攪拌する。次に清
媒を蒸発させ、そして得られる残留物をトルエンに再溶
解させる。
２回目のトルエン蒸発工程後、残った残留物を固体水酸
化カリウムで真空乾燥する。粗製生成物を適当な醗媒、
例えばトルエンまたは酢酸エチルなどから結晶化させる
。
Ｚ　薄層クロマトグラフィ（ＴＬＯ）　手順ＴＬＯを螢
光インジケータを用いて５×１０ｃＩＬシリカゲルプレ
ートで行う。慣用の技法により、ＵＶ光または沃素ジャ
ーを用いてスポットを可視化する。Ｂｏｃ基により保護
された遊離アミン基をＭするにプテドをＨＣ２蒸気にさ
らし次いでニンヒドリンで染色する。次の溶媒系がクロ
マドグ２フイに有用である。すなわち、 メタノール：クロロホルム（１：９） ブタノ−／’：Ｉ！ｒＦ酸：水（４：１：１）酢酸エチ
／Ｌ／：ヘキサン（８：２） 笑厖例１　：　Ｓｕｅ−Ｐｈ８−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｎ−ＡＭＣの製造既に概説した混合無水物結合方法によ
り無水Ｂｏａ−Ｇｌｎ−ＯＨ（１０３ｆ、２ａ５　ｆリ
モル）を７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭりに結
合することによりＢｏ　ｃ　−Ｇｉｎ−ＡＭＣを製造し
た。まず、Ｂｏ　ｃ　−Ｇｌｎ−ＯＨを幽ｔのＮ−メチ
ルモルホリンおよび車量のイソブチルクロロホルメート
と反応させることによＦ）　、Ｂｏａ−Ｇｉｎ−ＯＨの
混合無水物の溶液を製造し、そして得られた溶液を３０
−のＤＭｙＫｍ解サセタＡすｃ　（５，Ｏｏｓ’１２ａ
５　＜リモル）に添加した。生じる反応が完了後、反応
混合物を戸通し、そしてＰ液を凝縮した。生成物（５？
）をＰ液から分離し、そして７５−の熱メタノールに溶
解させた。次にこの溶液を約３０−１で＃縮しそして冷
却した。固体ＡＭＣを一過により浴液から分離し、そし
て得られたｆ液を更に、約５−の答ｉまで改縮した。次
にこの濃縮溶液を３０−のりｃ１０ホルムで希釈し、そ
して得られた浴液を約３０２のシリカゲルを含む４偲カ
ラムにかけた。残留ＡＭＣを別にクロロホルムを用いて
カラムから浴出させ、次いで生成物のＢｏｃ−Ｇｌｎ−
ＡＭＣ（Ｑ、　９７　Ｓ’　）を′クロロホルム中２係
メタノールで浴出させることによりカラムから回収した
。生成物をメタノールから再結晶して０．４６Ｆの精製
Ｂｏｃ−Ｇ］−ｎ−ＡＭＣ、ｍ＋ｐ＋　２０６．５〜２
０７６を得た。メタノール：クロロホルム（１：９）を
用いたＴＬＣは単一のスポット（Ｒｆｏ、２８）を示し
た。
分　　析 ０２０Ｈ２５Ｎ３０６　Ｉ／ｃついての計算値：Ｃ，５
９，５５；ＨＳ６．２６；Ｎ、　１０．４実測値： ０、５９．７０；Ｈ，６，１７；Ｎ、　ＩＱ、５６約２
３°で５分間トリフルオロ酢酸で処理することにより、
Ｂｏａ　−Ｇ’ｌｎ−ＡＭＯの保護基をはずした。
過剰のトリフルオロ酢酸を減圧で蒸発させ、そして得ら
れる残留物であるＨ−Ｇｉｎ　−ＡＭＣ）　！Ｊフルオ
ロアセテートを固体水酸化カリウムで真空乾燥した。次
に得られた生成物をエーテルで洗浄し、そして固体水酸
化カリウムで再乾燥した。
混合無水物結合方法によすＢｏａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−ＯＨ（Ｄ、５９ｆ、　　　α　９０　　ミ　　リ
　モ　ル　）　　を　Ｈ−Ｇｌｎ−ＡＭＣ）　　　リ　
　７３−１ｒ　ｏ　７　＊　ｆ−ト（Ｑ、４１ｆ、（Ｌ
９９９９ミリ）に添加することによＰ）　Ｂｏａ−Ｐｈ
ｅ−Ｇ：Ｌｙ−Ｌｓｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＮを製造して０．
４９ｆの粗製生成物を得た。生成物を酢酸エテルから再
結晶してα２７１のＢｏ　ｃ　−Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＣ（ｍ、ｐ、２３４〜２３６°、分
解）を得た。メタノール：クロロホルム（１：９）を用
いたＴＬＣは単一スポット（ＲｆＱ、２０）を示した。
分　析゛ Ｃ５７Ｅ（４８Ｎ６０９についての計算値；Ｑ、　６１
．６４；Ｈ，６，７２；Ｎ、　１１．６６実測値： ０．６１．４４；Ｈ，６，５３；Ｎ、１１５６約２３°
でトリフルオロ酢酸で処理することによｊ）　Ｂｏａ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＣ（０，６３ｆ
　）の保護基を除去した。得られた反応混合物にトルエ
ンを添加し、次いでそれら合した溶媒を減圧蒸発させる
と残留物が残る。この残留物をトルエンに再溶解させ、
そして次に、溶媒を再度蒸発させ、残った残留物を固体
水酸化カリウムで一夜真空乾燥してｃＬ６９ｆの白色固
体Ｈ−Ｐｈｅ−Ｇ１ｙ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＣ）リ
フルオロアセテートを得た。
１−ブタノール：酢酸：水（４：１：１）を用いたＴＬ
Ｑは２つのスポット（Ｒｆα５８およびＲｆＱ、５１）
を示した。
４−の５０％（Ｖ／ｖ　）水／ジオキサン中でＨ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＯトリフＡ／オロア
セテート（（Ｌ６５１．０．９４ミリモル）の溶液を調
製しそして００ＶＣ冷却した。この浴液に固体重炭酸ナ
トリウム（０，１６Ｆ、１．８７ミリモル）および、コ
ハク酸無水物（α１１Ｆ、１．１２ミリモル）のジオキ
サン１−中の浴液を添加した。得られた反応混合物な０
６で１時間攪拌した。付加的な重炭酸ナトリウム（α１
６Ｆ、１９ミリモル）およびコハク酸無水物（１１１ミ
リモル）をその反応混合物に添加し、次にそれを約２３
°まで加温しそして１時間攪拌した。次に塩酸（α２Ｎ
、３０ｍ）をその反応混合物に添加し、そして得られた
混合物を酢ばエチルで抽出した。会−された水相および
有機相中に残留する不浴注吻貞を１別し、α２Ｎ塩酸で
洗浄し、次いで乾燥して０．．５６ｆの粗製Ｓｕｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｕｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＣを得た。前記酢
酸エチル抽出物から残留している有機相を分離し、付加
的な０．２１２　ｆｆｌ酸で洗浄し、そして無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した。溶媒を減圧蒸発し、た後に残る残
留物（０，１９ｔ）の粗製Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＯを前記の既に得られている分の粗
製生成物と合一した。合一した粗製生成物（全部で０．
５５ｆ）をメタノール／酢酸エチルから結晶化して０．
５８ｔの精製１３ｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｎ−ＡＭＣ。
ｍ−ｐ−２２４〜２２５°（２１５°で予め軟化）を得
た。
分析 ０５ｏＨ５５Ｎ５０９についての計算値：ｃ、　５９．
２９；Ｈ，５，４８；Ｎ、　１１．５３実測値： ｏ、５９．３７；Ｈ％　６．１７；ＩＪＮ　１１．３１
実施例２　：　５ｕｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｉ
ｎ−ＮＡ混合無水物結合方法によｊ）　Ｂｏａ−Ｐｈｅ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１，４２ｒ、ｉ２５２５ミリ
）をＨ−Ｇｌｎ−ＮＡ　ＨＯＬ（ｔＯｃ１％五２５ミリ
モル）に結合することによＦ）　Ｂｏａ−Ｐｈｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＡを製造した。全部で１０−の
ＤＭＩＦ　７ｆ！：用いてＨ−Ｇｌｎ−ＮＡ　ＨＣＬｆ
：溶解させた。混合無水物結合方法によυ得られる有機
相の後処理の際、一部の生成物が結晶化し、これを分離
し、水洗しそして乾燥させて０．９１ｆのＢ□ｃ−Ｐｈ
ｓ−Ｇｕｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＡ　、　ｍ、ｐ、２３
８〜２３９°を得た。残った有機相を飽和塩浴液で洗浄
し、そして結晶性生成物の第２収獲物（Ｑ、６２ｆ　）
を得た。ｍ、ｐｅ２３８〜２３９°。第１収獲物の試料
を分析した。
分　　析 ０！５７Ｈ４８Ｎ６０７についての計算値：ｃ、６４．
５０；Ｈ，７，０４；Ｎ１１２．２０実測値： ０．６４．６４；Ｈ，６，９６；Ｎ１１２．２１エタノ
ール性ＨＣ１で処理することによりＢｏａ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＡ（１９ｏ　ｒ　）の保護基
をはずして０．７９　ｔのＨ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｓｕ
−Ｇｌｎ　−ＮＡ　ＨＯＬを得た。１−ブタノール′：
酢＃Ｒ：水（４：　１：　１）を用いたＴＬＯは主スポ
ツ）　（Ｒｆα６１）および２つの微ｔスポツ）　（Ｒ
ｆα７１およびＲｆα５１）を示した。
４ＴＲｔのＤＭＦ中で１（−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−ＮＡ　１１０１（［Ｌ７２ｔ、　ｔ１５　ｉ　
９モル）の浴液を調製しそして０６に冷却した。コノ１
り酸無水物（ｃＬ１４ｆ。
１．３８ミリモル）およびトリエチルアミン（α３２ｄ
、２．３０ミリモル）をこの溶液に添加し、そして得ら
れた反応混合物を０°で３０分攪拌し、０．２Ｎ塩酸で
希釈し、そして酢酸エチルで抽出した。
得られた酪酸エチル抽出液を［１，２Ｎ塩改で洗浄し、
次に冷却してα５２ｆの５ｕｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｎ−ＮＡ。
ｍ、ｐ、２３０〜２３２°を沈殿させた。残ったＰ液か
ら生成物結晶の第２収獲物（α２７Ｆ）、ｍ、ｐ。
２６０〜２３２．５°が得られた。生成物結晶の両収獲
物を合一し、そしてメタノールから再結晶してα５３２
のｌｆｌ　製５ｕｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−ＮＡ　１ｍ、ｐ。
２３８〜２３９５°を得た。１−ブタノール：酢酸：水
（４：１１）を用いたＴＬＣはＲｆα７４に主たるスポ
ット、またＲｆα８２に従たるスポットを示した。
分析 ０５６Ｈ４４Ｎ６０Ｂについての計算値：ＯＮ　６２．
７６；Ｈ，６，４５；Ｎ、　１２．２０実測値： ｃ、　６２．７１　；Ｈ，６，７５；Ｎ％　１２．０１
実施例３〜５：標識テトラペプチドゾロテアーゼ基質を
用いたウイルス−特異 的プロテアーゼの検定 下記実施例３〜５はウィルス感染細胞の抽出液中のウィ
ルスプロテアーゼ活性を検定するための本発明の４ｓ−
テトラペプチドプロテアーゼ基質の便用な示すものであ
る。実施例３では、Ｓｕｅ−Ｐｈｉ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−ＡＭＯを基質として用いた。
実施例４および５においては、Ｓｕｃ　−Ｐｈｅ　−Ｇ
ｌｙ−Ｌｌｉｌｕ−Ｇｌｎ−Ｎムおよび８ｕｃ−Ｐｈｅ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＣの両方を角いた。実
施例４および５はＮムー標識およびムＭｅ−標識基質に
よ勺測定されるプロテアーゼ活性を相関させることがで
きることを示すものである。
実施例３ Ａ、　　ａ胞抽出液の調製 Ｈ＠Ｌａ−０ａ胞の６０總プレートを全面増殖させそし
て６Ｘ　１０８ｐｆｕ／プレートのポリオウィルス・タ
イプ２（ワクチン株）で感染させた。１時間後に、マツ
コイ（ＭａＯｏｙ’ｓ）増殖培地を各プレートに添加し
、そしてそれら細胞を更に４時間インキエベートした。
次に細胞をプレートから取出し、１０ｍＭ塩化ナトリウ
ムおよび１．５　ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭ
）リス（ヒドロキシメチル）アばツメタン１Ｍ衝液（声
７．３　）　Ｋ懸濁させた。得られた懸濁液を機械式細
胞ホモジナイザーで均質化し、次いで４ｏｏｏｘｒで１
０分関連心分離して、不溶細胞破片を除去した。
次にその上清を３１１０００　Ｘ　ｔで１時間再度遠心
分離してミクロソーム（ベレット）およヒシトソル（上
清）画分を得、それらを検定用に貯えた。対照用画分を
未感染Ｈ・Ｌａ　−ＯＩｖｉ１１１胞を用いるほかは実
質的に同様にして調製した。
Ｂ、プロテアーゼ検定 全タンパク濃度をクーマシー・プリリアｙ）・ブルー　
（Ｏｏｏｍａａａｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ
）Ｇ−２５０を用いた色素結合法により測定した（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙ）。牛鹿清アル
ブミンを標準として用いた。
基質Ｓｕｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＣ
をジメチルスルホキシド中の２Ｘ１０″″２Ｍ原液とし
て貯蔵した。
検定用溶液の構成は５ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸
ＴＡ）　、５　ｍＭジテオトレイトール（ＤＴＴ）　、
α１゜Ｍ塩化ナトリウムおよび１％ジメチルスルホキシ
ドを含有する５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，
０）中の２．ＯＸｌｏ−４Ｍ基質とした。各検定反応は
前述の如く調製した細胞抽出液の７リコート（α０１〜
α１０−）を２．００１Ｒ１の検定用溶液に添加するこ
とにより開始させた。遊離ＡＭＯの放出として測定され
るウィルスプロテアーゼ活性を、３８０ｎｍで励起しモ
して４６０ｎｍで螢光発出を測定することＫよシ測定し
た。フルオロメータはフルスケールの振れが１．０Ｘ１
０″″７　Ｍ　Ｋ等しくなるように標準化しそしてフル
スケールを任意に１００単位に対応させた。これらの検
定結果を下記第１表に記載する。細胞抽出液調製上の変
動を相殺するために全タンＡり１１１９あたルの活性（
単位７分）を報告することｋよシ結果を正規化した。
第■表：　８ｕｃ−Ｐｂ＋５−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　−Ｇｌ
ｎ−ＡＭＣの加水分解によ）測定されたポリオウィルス
Ｐ２感染細胞におけるプロテアーゼ活性 感染細胞　　　４１　　　　３８ 対照細胞　　　　１６　　　　２２ 英施例４ ポリオウィルス・タイプ２に感染した■θＬａ−０細胞
および未感染対照の細胞抽出液を実質的ンζ実施例３に
記載されているとおりに調製した。
細胞をローラーびん内で増殖させ、そして試験培養物を
、培地５−中の５　Ｘ　１０”　ｐｆｕのウィルスで感
染させた後５時間インキュベートした。
得られた細胞抽出液中のプロテアーゼ活性をＳｕｅ　−
Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ−Ｌａｕ　−Ｇｌｎ−ＡＭＯを基質と
して用いて測定した。検定手順は実質的に実施例５に記
載のものと同様としたが、ただし使用した検定用緩衝液
は５　ｍＭ　ＤＴＴに代えて１　ｍＭ　ＤＴＴを含有し
た。
これらの抽出液中のプロテアーゼ活性はまた５ｕＣ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＡを基質として用い
て測定した。これらの検定において、各検定混合物は５
０ｍＭ燐酸ナトリウム（−６，０）、α１Ｍ塩化ナトリ
ウム、５　ｍＭＥＤＴム、１　ｍＭ　ＤＴＴおよび２，
５％ジメチルスルホキシドを含有する検定用緩衝液２−
中に２Ｘ１０″″４Ｍ基質を含有した。検定混合物にジ
メチルスルホキシド中に２ＸｆＯ−２Ｍ基質を含む原液
から基質を添加した。活性は３３５ｎｍで励起しそして
４１０ｎｍで射出を測定することによ）測定した。
これらのプロテアーゼ検定の結果を下記第■表忙記載す
る。
第Ｈ表：　Ｓｕｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−
ＡＭＣおよび５ｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−ＮＡの加水分解により測定されたポリオウィルスＰ２
−感染細胞のシトンル画分のプロテアーゼ 活性 感染細胞　　　２２．５　　　　　　五２４対照細胞　
　　１１．４　　　　　　１．８６実施例５ ＨｅＬａ−〇細胞を含む６０ｒａプレートを全面に増殖
させ、仄いで１．２Ｘ１０８ｐｆｕのポリオウィルス・
タイプ２に感染させた。１時間のインキュベーションの
後、マツコイ増殖培地を各フレートに添加しそしてそれ
ら細胞を更に２時間または４時間インキュベートした。
採取後、１０！ＩＩＭ塩化ナトリウムおよび１．５　ｍ
Ｍ　塩化マグネシウムを含有する１０ｍＭ）リス（ヒド
ロキシメチル）アミンメタン緩衝液（ｐＨ７，３）に細
胞を懸濁し、均質化しそして６，００ＱＸｆで１０分間
遠心分離した。対照細胞はウィルスを添加する点を除き
実質的に同様に処理した。
得られた細胞抽出液のプロテアーゼ活性を実質的に前記
実施例３の記載のとおり、８ｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｎ−ＡＭＣを基質として用イテ検定シタ。
更に、抽出液を次のようＫして、８ｕｃ　−Ｐｈｅ　−
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＡを用いた比色測定手順に
より検出シた。ジメチルスルホキシド中２Ｘ　１０−２
　Ｍ　濃度の５ｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｓｕ−Ｇｌｎ
−ＮＡの原液を調製し、そして４０μを基質原液、６０
μｔジメチルスルホキシド、および、５　ｍＭ　ＩＩＣ
ＤＴＡ　、　１　ｍＭ　ＤＴＴおよび０．１０Ｍ塩化ナ
トリウムを含む４−の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（
ＰＩ−１５，０）を含む検定溶液の調製に用いた。細胞
抽出液の細胞抽出液アリコート５０μｔを５０μｔの検
定浴液とインキュベートし、そしてＥａｒｒｅｔｔ、Ａ
ｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、　７６：　５７４−５７６（１
９７６）に記載の試薬および手塩を用いて呈色させた。
得られた試料の赤色を肉眼的に格付けした。
これらの検定の結果を下記第■表に記載する。
＄１ｆｆ　表：　Ｓｕｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎ−ＡＭＣおよび＋３ｕｃ　−Ｐｈｓ　−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＡの加水分解により測定されたポリオ
ウィルスＰ２に感染させた細胞の粗製抽出液のプロテア ーゼ活性 感染細胞（２時間）　　　ａ２５　　　　　１２．１　
　　　　　　＋＋感染禰胞（４時間）　　　７．９７　
　　　　　２２．２　　　　　　＋＋十十対照＋艶（４
昨司）　　＆９７　　　１α５　　　　＋
【図面の簡単な説明】
第１図は個々のピコルナウィルスタンパクに対応するＲ
ＮＡ領域の相対的位置を示す一般化されたピコルナウィ
ルスのＲＮＡゲノムの概略地図である。翻訳方向は左か
ら右である。 第２図は、いくつかの知られたウイルス−特異的フロテ
アーゼ開裂認識部位間のアミノ酸配列相似性を示す概略
図である。 特許出願人　　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド・コンパニー 外２名 ピコルナウィルス ａｌａ　ｇ１７ ０ト橋Ａθ ＦＩＣ）Ｖ　　　　　　　　　　　　ａｌｍ　ｌ＠ｕ（
ｆｆｉ　　熟） アルファウィルス １　Ｇ、　２

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）ウイルス−特異的ポリペプチド前駆体を分解してウ
    イルス−関連タンパクを形成するプロテアーゼを検出す
    るための特異的ペプチド基質を製造する方法であつて、
    その検出すべきプロテアーゼはピコルナウイルス、トガ
    ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、コモウイ
    ルスおよびウイルスプロテアーゼをコードするその他の
    ウイルスよりなる群から選択されるウイルスにより特定
    され、そして（ａ）ウイルスタンパク、ＲＮＡ、ＤＮＡ
    、ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡに相補的なＤＮＡを単
    離し；（ｂ）そのタンパク、ＲＮＡ、ＤＮＡ、、ｍＲＮ
    ＡまたはｃＤＮＡを分析してウイルス−特異的タンパク
    のポリペプチド前駆体のアミノ酸配列を決 定し、 （ｃ）そのアミノ酸配列内にウイルス−特異的プロテア
    ーゼの開裂認識部位の位置を定め；そして （ｄ）ポリペプチド前駆体の開裂認識部位に直接隣接し
    て、かつその部位の上流に位置す るアミノ酸に実質的に相当する３〜５個の アミノ酸またはアミノ酸類似体のペプチド 配列にエステルまたはアミド結合により連 結されたＣ−末端インジケータ部分を包含 するウイルス−特異的プロテアーゼ検出用 特異的ペプチド基質を製造する ことよりなる、前記方法。 ２）Ｃ−末端インジケータ部分が色原性、螢光原性、化
    学光性、放射性、抗原性またはハプテン性のインジケー
    タ基である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）基質のペプチド配列が４個のアミノ酸またはアミノ
    酸類似体よりなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４）基質のペプチド配列がポリペプチド前駆体の開裂認
    識部位に直接隣接して、かつその部位の上流に位置する
    アミノ酸と厳密に相同である特許請求の範囲第１項記載
    の方法。 ５）ウイルスがピコルナウイルスである特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 ６）ウイルスがライノウイルスである特許請求の範囲第
    ５項記載の方法。 ７）ウイルスが口蹄疫ウイルスである特許請求の範囲第
    ５項記載の方法。 ８）ウイルスがトガウイルスである特許請求の範囲第１
    項記載の方法。 ９）ウイルスがレトロウイルスである特許請求の範囲第
    １項記載の方法。 １０）ウイルスがヒトＴ−細胞リンパ向性ウイルスであ
    る特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１）特許請求の範囲第１項記載の方法により製造され
    た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
    プチド基質。 １２）特許請求の範囲第２項記載の方法により製造され
    た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
    プチド基質。 １３）特許請求の範囲第４項記載の方法により製造され
    た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
    プチド基質。 １４）特許請求の範囲第５項記載の方法により製造され
    た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
    プチド基質。 １５）特許請求の範囲第８項記載の方法により製造され
    た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
    プチド基質。 １６）特許請求の範囲第９項記載の方法により製造され
    た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
    プチド基質。 １７）式 Ｒ＾１−〔Ａ＾４Ａ＾３Ａ＾２Ａ＾１〕−Ｒ＾２〔式中
    、 Ａ＾１はＧｌｎ、ＧｌｕまたはＧｌｕのエステル、およ
    びＡｓｎよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり
    ； Ａ＾２は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌよりな
    る群から選択されるアミノ酸残基であり； Ａ＾３およびＡ＾４は、それぞれ独立してＡｌａ、Ａｒ
    ｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ
    、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
    Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌおよ
    びそれらの類似体よりなる群から選択されるＤ−または
    Ｌ−配置のアミノ酸残基であり； Ｒ＾１は水素またはＮ−末端保護基であり；そして Ｒ＾２は、−ＯＨまたは−Ｘ（ここでＸはアミノ酸残基
    Ａ＾１のＣ−末端カルボニルとアミドまたはエステル結
    合を形成しうる、そして更にそのアミドまたはエステル
    結合の加水分解的開裂後に遊離のＸとして独立して検出
    されうる部分である）である〕で示される化合物および
    その生理学的に許容しうる塩。 １８）Ｒ＾２がＸであり、そしてＸが色原性、螢光原性
    、化学光性、放射性、抗原性またはハプテン性のインジ
    ケータ基である特許請求の範囲第１７項記載の化合物。 １９）Ａ＾１がＧｌｎである特許請求の範囲第１８項記
    載の化合物。 ２０）Ａ＾１がＧｌｕまたはＧｌｕのエステルである特
    許請求の範囲第１８項記載の化合物。 ２１）Ａ＾１がＡｓｎである特許請求の範囲第１８項記
    載の化合物。 ２２）Ｒ＾１がＺ、Ｂｏｃ、Ｓｕｃ）およびＭｅＯＳｕ
    ｃよりなる群から選択される特許請求の範囲第１９項記
    載の化合物。 ２３）Ａ＾３およびＡ＾４が、それぞれ独立してＡｌａ
    、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、
    Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐ
    ｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、また
    はＡｓｎよりなる群から選択される特許請求の範囲第２
    ２項記載の化合物。 ２４）Ａ＾３およびＡ＾４がそれぞれ独立してＡｌａ、
    Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒおよ
    びＶａｌよりなる群から選択される特許請求の範囲第２
    ３項記載の化合物。 ２５）Ｒ＾１かＭｅＯＳｕｃまたはＳｕｃであり；Ａ＾
    ２がＬｅｕであり、Ａ＾３がＧｌｙであり、Ａ＾４がＰ
    ｈｅであり、Ｒ＾２がナフチルアミノまたは４−メチル
    クマリル−７−アミノ基である特許請求の範囲第２４項
    記載の化合物。 ２６）Ｒ＾１がＺ、Ｂｏｃ、ＳｕｃおよびＭｅＯＳｕｃ
    よりなる群から選択される特許請求の範囲第２０項記載
    の化合物。 ２７）Ａ＾３およびＡ＾４がそれぞれ独立してＡｌａ、
    Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈ
    ｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒ
    ｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐまたはＡ
    ｓｎよりなる群から選択される特許請求の範囲第２６項
    記載の化合物。 ２８）Ａ＾３およびＡ＾４がそれぞれ独立してＡｌａ、
    Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒおよ
    びＶａｌよりなる群から選択される特許請求の範囲第２
    ７項記載の化合物。 ２９）Ｒ＾１がＺ、Ｂｏｃ、ＳｕｃおよびＭｅＯＳｕｃ
    よりなる群から選択される特許請求の範囲第２１項記載
    の化合物。 ３０）Ａ＾３およびＡ＾４がそれぞれ独立してＡｌａ、
    Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈ
    ｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒ
    ｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐまたはＡ
    ｓｎよりなる群から選択される特許請求の範囲第２９項
    記載の化合物。 ３１）Ａ＾３およびＡ＾４がそれぞれ独立してＡｌａ、
    Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒおよ
    びＶａｌよりなる群から選択される特許請求の範囲第３
    ０項記載の化合物。 ３２）（ａ）ある量の試料を特許請求の範囲第１８項記
    載の化合物と接触させることにより検定 用混合物を形成し； （ｂ）その検定用混合物を、プロテアーゼ活性が存在す
    る場合にインジケータ基の加水分 解を行わしめるのに十分な時間インキュベ ートし；そして （ｃ）その検定用混合物中の遊離インジケータ基の有無
    を検出する ことよりなる、試料中のピコルナウイルスプロテアーゼ
    活性の検出方法。
JP61002358A 1985-01-11 1986-01-10 ウイリス‐特異的プロテアーゼ活性検出用ペプチド基質 Pending JPS61172897A (ja)

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