JPS61140553A - ロイコトリエンとタンパク質との結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ラジオイムノアッセイにおいてロイコトリエンの結合体
（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）　　を使用する概念はり、レ
ビン、Ｒ，Ａ、モーガン、Ｒ，Ａ、　　ルイス、Ｋ、　
Ｆ、　オースチン、Ｄ、　Ａ、　　クラーク、Ａ、マー
ハツトおよびＥ、　Ｊ、　　コレイ、プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミーオブサイエンシー
ズ、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、第７８巻、第１２第７６９２頁（
１９８１年）によって記載された。

この方法は活性酸誘導体によシタンパク質に直接カップ
リングするものである。この方法は本発明より有効性が
かなり劣っている。

タンパク質ハプテン結合体の合成に有用な三官能架橋試
薬もまた製造されている。マレイミド−スクシンイミド
誘導体を記載している。（キタガワ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ第７９巻第２３３〜２３６頁およびキタガワ、　
Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ。

第２９　（４）巻、第１１３０〜１１３５頁参照）本発
明は、カップリング剤１．５−ジフルオロ−２，４−ジ
ニトロベンゼンまたは５−Ｎ−マレイミドアルカン酸ク
ロリド、好ましくは６−Ｎ−７レイミドヘキサン酸クロ
リド（アルカン部分は２〜８個の炭素原子を有する）に
よる巨大キーホールリンペットからのヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アル
ブミン、破傷風抗原、ジフテリアトキソイドまたＦｉＣ
ＲＭ１９７　（ジフテリア菌の変異菌によって産生され
るジフテリアトキソイド）から選択されるタンパク質と
ロイコトリエンＣ４，Ｂ４．　Ｄ４ま走はＥ４　　（好
適にはＣ４およびＢ４　）　　の接合体に関するもので
ある。

接合体は鋭敏で特異的なイムノアッセイに有用であシ、
また喘息、アレルギー性鼻炎、リウマチ様関節炎を包含
する皮膚、肺および気道の種々のアレルギー性および慢
性炎症疾患および乾癬および湿疹のような皮膚疾患の治
療に有用な免疫療法剤である。本発明はまたかかる結合
体を製造するための有用な試薬に関するものである。

ロイコトリエンＣ４（Ｌ　Ｔ　Ｃ４）は次の構造を有す
る。

ロイコトリエンＢ、（ＬＴＢ、）　　は次の構造を有す
る。

ロイコトリエンＤ４　（ＬＴＤ４　）は次の構造を有す
る。

ロイコトリエンＥ４（ＬＴＥ４）は次の構造を有する。

本発明はまた結合体（特にＬＴＢ、の結合体）を製造す
るのに有用な次の化合物に関するものである。

式中ｎは０〜１０、好ましくは０または２〜１０、さら
に好適にはＯまたは３である。

Ｏ 式中ｎは０〜１０、好ましくはＯまたは２〜１０、さら
に好適にはＯまたは３である。

υ 式中ｎはＯ〜１０、好ましくはθ″またけ２〜１０、さ
らに好適にはＯまたは３である。

上記の三種の化合物においてｎが１である化合物は同様
の一般式を有する他の化合物より安定が劣るであろう。

本発明の結合体の製法をＬＴＣ，およびＬＴＢ４の結合
体に関して例示することができる。

ＬＴＣ４Ｋ対してカップリング操作は反応がグルタミル
残基の遊離アミノ基に起こるように選択され、従ってＬ
ＴＣ，分子の最も重要な部分は変化しないまま保持され
た。

一般的な結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　）の操作はか
なシ特徴のある中間体を含む段階的方法で行われた。Ｌ
ＴＣ，中のトリエン発色団の強いＵＶ吸収（２８０ｎｍ
においてｔ　＝　４０，０００　）はカップリング効率
の測定と操作中のＬＴＣ，分子の゛状態を監視のための
手段として使用された。

タンパク質１００，０００ダルトンにつきＬＴＣ。

５〜１５当量の範囲のカップリング比を目標とした。

ＬＴＣ４の結合体 カップリング剤として１．５−ジフルオロ−２，４−ジ
ニトロベンゼンを用いる結合試薬、１，５−ジフルオロ
−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ　）　　はア
ミノ官能基と非常に特異的に反応し、二個のフッ素原子
をはっきりと段階的に置換させる（二番目のフッ素は非
常に緩慢な速度で置換される）。さらに試薬およびその
モノおよびジアミノ置換誘導体の強くて特徴のあるＵＶ
吸収はカップリング操作の過程を追跡しそしてＵＶ分光
法によって最終付加物を定量することができる。

ＬＴＣ，はｐ■７．２緩衝水性メタノール中で過剰のＤ
ＦＤＮＢ　　と３０分以内で実質的に定量的に反応する
ことが見出された。こうして生成された中間体はＨＰＬ
Ｃ分析１−アミノ−５−フルオロ−４４−ジニトロベン
ゼンの固有の３４５ｎｍにおける強いＵ４バンドの出現
によって特徴付けることができた。反応からメタノール
を除去した後、過剰のＤＦＤＮＢ　はエーテル抽出によ
って除去することができた。さらに中間体はＨＰＬＣに
よって精製することができるが、これはいかなる利点も
示さないものであり、一般的には粗反応混合物は次にｐ
■８．５緩衝液中のタンパク質と２日間暗所で反応させ
た。未反応ＬＴＣ４または試薬からの結合体の最終分離
は、セファデックスＧ−５０で濾過することによって達
成した。得られたカップリング生成物はそこで１．５−
ジアミノジニトロベンゼンの固有の３４２および４２０
ｎｍにおけるＵＶ吸収並びにＬＴＣ，結合体の場合には
２７１．２８２および２９１ｎｍ　　においてトリエン
系の固有の吸収を示した。この方法でＢＳＡと１０：１
モル比で反応させる場合に５−ｐ−クロロフェナシルグ
ルタチオンａ　Ｂ５Ａ１モル当たシバブテン約６モルを
有する結合体を得た。

同様に３０倍モル過剰のＬＴＣ４はＢＳＡ　１モル当た
ｆｉＬＴｃ、９〜１０モルを有するＢＳＡとの結合体を
得、約３０倍モル過剰のＬＴＣ４（蛋白質１００，００
０ダルトン当たりの計算）はＫＬＨＩＯｏ、０００ダル
トン当たシＬＴＣ４１１〜１２当量を有するＫＬＨとの
結合体を得た。

カップリング剤として６−Ｎ−マレイミドヘキサノン酸
クロリドを用いる結合 本発明は異なったスペーサー基を用いて第二のＬＴＣ４
タンパク質結合体を提供するものであるので、多くの可
能性のあるカップリング法が検討された。ＤＣＣｔたは
ＥＣＤＩ（Ｒ）のような試薬を使用する直接カップリン
グが考えられたが、付加物の不均一混合物が生成すると
予想されるために速やかに除外された。また予備実験で
はかかるカップリングの効率が低くなることが示された
。公知の薬剤、トルエンジイソシアネートおよびｍ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルは二つの結合体間のス／＜−サーｉニットに関し
て免疫交差反応性の可能性があるために使用されなかっ
た。

カップリング剤６−Ｎ−マレイミドヘキサン酸クロリド
はＬＴＣ，のグルタミルアミノ基の迅速な選択的官能化
並びに高カップリング効率を生じる。

選択される薬剤は６−アミノヘキサン酸から容易に製造
される６−Ｎ−マレイミドヘキサン酸クロリドであった
。鎖中に２〜８個の炭素原子を有する他の類似試薬、例
えば２−アミン酢酸から８−アミノオクタン酸までを使
用することができる。

ＬＴＣ４の６−Ｎ−マレイミドヘキサン酸アミドは過剰
のＥｔ３Ｎ　の存在下ＬＴＣ，三カリウム塩のメタノー
ル性溶液を試薬（乾燥ＴＨＦ中１．５轟量）と反応させ
ることによって製造した。ＨＰＬＣ分析は、実質的にア
ミドに完全に転化したことを示した（　ＲＤ−Ｉ（ＰＬ
ＣでＬＴＣ，前に溶離する）。ＨＰＬＣから分離したこ
の付加物の部分はＬＴＣ４のそれから実質的に未変化の
ＵＶ特性を有した。チオール化したタンパク質（ＫＬＨ
）と次にカップリングするために粗混合物（ｐｉ　７．
２ホウ酸塩緩衝液中）をそのまま使用した。

使用したチオール化タンパク質（この場合ＫＬＨから誘
導された）は、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物
と反応させて製造した。

ＫＬＨのチオール化の報告が文献にないためにアセチル
基の加水分解後ニレマンの方法によって定量されるタン
パク質〔チオ〕含有量１００．０００ダルトン当シ約２
０のＳ−アセチル基を有するＫＬＨを得るための条件を
決定するための試験を行なった。Ｓ−アセチルメルカプ
トスクシニル誘導ＫＬＨはさらにＮ−エチルマレイミド
（ＮＥＭ）と反応させるまでは酸素に対して非常に不安
定でおった。しかしながらいずれかの遊離ＳＨ基がこの
ように反応されれば、物質は、セファデックスＧ−５０
濾過によって取扱い精製することができた。

生成した精製タンパク質の濃縮は無水セファデックスＧ
−２００樹脂の充てん物で透析することによって達成し
た。誘導ＬＴＣ４をカップリングする直前に、チオール
基をｐＨ１１，５で充分に脱酸素した溶液の加水分解に
よって遊離させ次にｐＨを７．２に下げた。

次いでこの混合液をＬＴＣ，の６−Ｎ−７レイミドヘキ
サン酸アミドの脱酸素溶液とＫＬＨｌｏｏ、０００ダル
トンにつきＬＴＣ，８０轟量比で反応させた。ＮＥＭで
安定化させ、セファデックスＧ−５０で精製した後、タ
ンパク質結合体は、ＵＶ分析によりＫＬＨＩＯｏ、００
０ダルトンにつきＬＴＣ４７〜１０モルを示した。

タンパク質溶液は、−７８℃で凍結させた数ケ月間の貯
蔵では非常に安定であることが証明された。

さらに詳細な実施例を続ける。ＩＲスペクトルがパーキ
ン−エルマー２６７グレーテインダスペクトロフオトメ
ーターで記録したことは特に言及される。ＰＭＲスペク
トルはパリアンＥＭ−３９０スペクトロメーターで記録
された。

ＵＶスペクトルはカーリ−２１０スペクトロフオトメー
ターで記録された。スペクトルは特にことわらない限り
水中で記録された。セファデックスＧ−５０（中間グレ
ード）はファーマシアファインケミカルスから入手した
。

ウシ血清アルブミンはシグマケミカル社から結晶化凍結
乾燥品として入手し、ヘモシアニン（キーホールリンペ
ット）Ｆｉ、カルバイオケムベーリング社から凍結乾燥
米として入手した。ロイコトリエンＣ４は公知の操作（
ロカチ等、’ｐｅｔ、Ｌｅｔｔ、第２１巻、第１４８５
頁（１９８０年））を用いて我々の実験室で製造した合
成物質である。

ＬＴＢ、結合体の製法は次の反応機構によって例示され
る。

機構１ ■ この方法はＬＴＢ４　にたいする直接の前駆物質のエチ
ル５（Ｓ）ベンゾイルオキシ−１２＠−ヒドロキシ−６
、１４（Ｚ）　−８，１０（ト）−エイコサテトラエノ
エート０を使用する。我々は■と１．３−ジアミノプロ
パンのような揮発性ジアミンとの反応がすべて緩やかな
弱い塩基性条件下で、同時にベンゾエート保護基を除去
し、エチルエステルをω−アミノプロピルアミドに転化
すると判断した。次に溶媒を真空下で除去して生成物＠
）およびＮ−ω−アミノプロピルベンツアミドの混合物
だけを残存させることができた。モデル研究では、エチ
ル５−（４−オクチルフェニル）−５−ペンツイルオキ
シペンタノエートを使用するこの反応は、ニート１，３
−ジアミノプロパン中でさえも非常に緩慢であることを
見出した。しかしながら、２−ヒドロキシピリジンの触
媒量を反応混合物に添加した場合には、ジエステルは望
ましいアミノアミドに滑らかに転化した。

保護されたＬＴＢ４（ＩＩ）へ適用した場合、■へ同様
の滑らかな転化が行なわれた。■は、揮発性成分を除去
した後、次の段階で直接反応させることができた。アミ
ノアミド皿）をトリエチルアミンの存在下過剰の１．５
−　ジフルオロ−４４−ジニトロベンゼンと反応させて
、付加物■を高収量で生成した。この生成物は逆相ＨＰ
ＬＣによって精製し、ＵｖおよびＰＭＲ分光によって十
分に特徴付けられた。最終的に■はジメチルホルムアミ
ドとｐＨ８，５ホウ酸塩緩衝液の混合液中ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）（モル比−１２：１）と滑らかに反応
して結合体Ｖを生成し、セファデックスＧ−５０でクロ
マトグラフィ処理して精製した。

ＵＶスペクトル分析はトリエン発色団が変化しないこと
を示しこれによりＢＳＡ　１モルにつきＬＴＢ、５．５
〜８．３モルがカップリングするという推定される。（
カップリング効率４５〜７０％） また室温でＬＴＢ、−ラクトンを１．３−ジアミノプロ
パンと直接反応させることによってアミノアミド■を製
造することができた。この方法副生成物のない定量的収
量で■を生成した。

機構２ 他のタイプのＬＴＢ４結合体は機構２で例示した通シ製
造することができた。ラクトン■をヒドラジンと完全に
反応させてヒドラジド（■）を量的収量で生成した。さ
らに■を６−Ｎ−マレイミドヘキサン酸クロリドと反応
させてジアシルヒドラジド（■）を得た。この物質を逆
相ＨＰＬＣによって精製して過剰の試薬副生成物を除去
することができた。しかしながらＰＭＲスペクトルを得
るために生成物を濃縮すること試みたところ明らかにマ
レイミド系の水和作用またはメタツリシスによる部分的
分解をひきおこした。しかしながらこの粗反応生成物は
次のカップリング反応で使用することができることがわ
かった。■をチオール化ＫＬＨとＫＬＨｌｏｏ、０００
ダルトンにつき■５０モル比で反応させて所望の結合体
■を生成し、セファデックスＧ−５０で濾過して精製し
た。

ＵＶ分析結果はＫＬＨＩＯｏ、０００ダルトンにつきＬ
ＴＢ、　１２当量が結合することを示した。

実施例１ の結合体 メタノール（Ｒ−）中１．５−ジフルオロー２，４−ジ
ニトロベンゼン（１２０Ｉｎｇ、０．５９ミリモル）を
リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２、’０．ＩＮ）９−中５−
ｐ−クロロフェナシルグルタチオン（８８Ｉｎｇ、０．
１９ミリモル）溶液に添加した。室温で１２時間攪拌し
た後、メタノールを真空で除去し、生成した水溶液をエ
ーテルで洗浄した。水層をＣ−１８シリカゲル（メタノ
ール：水（１：１）で溶離する）でクロマトグラフィ処
理して純粋な付加中間体（１０５ｒｎＩ？）を生成した
。ＵＶ：λｍａｘ（ε）２６０（２４，０００）、３４
７ｎｍ（１９，０００）。

ＰＭＲ（Ｄ２０）　：δ８．６２　（Ｉ　Ｈ，ｄ、　Ｊ
＝７．５Ｈｚ　）、７．６（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ａ
ＢのＡ）、７．１（２ｆ（。

ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、ＡＢのＡ）、６．７（ＩＨ，ｄ、　Ｊ
＝１５Ｈｚ）、３．９（２Ｈ，ｓ、　　フェナシルＣＨ
ｚ）。

水（０，１ｍ　）申付加物（１，０５■、１．６３×１
０　モル）をホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，５，０，２Ｎ、
１ｍ）中ＢＳＡ（１０η、１．４９Ｘ１Ｏモル）溶液に
添加した。暗所で室温で７１時間放置した後溶液を遠心
分離し、水を溶離剤としてセファデックスＧ−５０（１
，５ｘ７５ｃＩｒＬ）で濾過しだ。ボイド・、ボリュー
ム（５５ｄ）後溶離するフラクション（１０，５＃＋７
りはタンパク質を含有し、Ｕｖで分析した。

この溶液を５倍に希釈した試料はＵＶスペクトル（Ｈ２
Ｏ中）λｍａｘ　（吸光度）３４２（０，３６９）、４
２５ｎｍ（０，１３３）を有した。タンパク質８Ｉｎｇ
が回収されると仮定し、３４２ｎｍ　で約２７．０００
（３）の１．５−ジアミノ−２，４−ジニトロベンゼン
発色団に対して３４２　ｎｍで約２７０００（３）を仮
定すれば、ＵＶばＢ５Ａ１モルにつき５−ｐ−クロロフ
ェナシルグルタチオン６モルが結合したことを示した。

Ｂ、ロイコトリエンＣ４とウシ血清アルブミンの結合 ロイコトリエンＣ４（三カリウム塩）（２，５ｍｇ　）
をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２，０，Ｉ　Ｎ”）　１−
に溶解した。メタノール（０，６ｍ）中１゜５−ジフル
オロ−２，４−ジニトロベンゼン（１〜）を添加し、混
合液を室温で３０分放置した。メタノールをＮ２気流下
で除去し、次に最後の痕跡を真空で除去し、次いでエー
テル（３Ｘ２ｍＡ’）で抽出して未反応試薬を除去した
。最後の痕跡のエーテルをＮ２下および真空で除去した
。この混合物にホウ酸塩緩衝液（０，２Ｍ、ｐＨ８，５
、ｌ−）中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１０〜）を
添加し、その混合液を暗所で２日間室温で放置した。反
応混合液を水を溶離剤とするセファデックスＧ−５０（
１，５ｘ７５ｃｒＩＬ）のカラムで沢過し、約５５−の
ボイド・ボリュームの後１８ゴ中に溶離黄色タンパク質
を収集した。約１４０−のデッド・ボリュームでのピー
クは溶離した未反応ＬＴＣ４を含有すると考えられる。

タンパク質フラクション（混合した）を直接ＵＶ分析に
かけスペクトルλｍａｘ　（Ａ）　２７１　（ｓｈ）、
２８２（３，５７）、２９１，３４２（１，８３５）お
よび４２０ｎｍ（０，９１）を得た。タンパク質的ｇ　
ｍｇが回収されると仮定し、また３　４０　ｎｍで約２
７．０００の１，５−ジアミノ−２，４−ジニトロベン
ゼンおよび２８０　ｎｍで４０，０００のＬＴＣ４とし
て仮定して２８２　ｎｍ吸収に基づく計算はＢ５Ａｌモ
ルにつきＬＴＣ４約１００モルであシ、一方３４２　ｎ
ｍの吸収に基づく計算はＢ５ＡｌモルにつきＬＴＣ４９
，１モルを示した。

の結合 ロイコトリエンＣ４（三カリウム塩）（２，１ｒｎｇ）
および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン
（８ｍｇ）を反応Ａにおけると同様に反応させた。生成
した付加物にホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，５，０，２Ｍ、
　０．８３ｆｆ１７り中ＫＬ、Ｈ（１ｓＩｎ９）を添加
し、混合液を室温で６０時間放置した。同時に変性ＫＬ
Ｈの沈殿が生成し、遠心分離によって除去した（乾燥重
量６ｍｇ）。上澄み液を前と同様にセファデックスＧ−
５０で沢過し、ボイド・ボリューム後１７−に溶離する
黄色タンパク質フラクションカ得られ、ＵＶ分析ではＫ
　Ｌ　Ｈ１００，０００ダルトンにつきＬＴＣ４１１−
１２当量を示した。

ジオキサン（２０ｄ）中ＤＦＤＮＢ（２，０４ｇ、１０
ミリモル）溶液をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５，０，Ｉ
Ｎ、５ｍＡ）中Ｌ−プロリン（０，５８１１５ミリモル
）に添加し、混合液を室温で２時間攪拌した。混合液を
乾固し、残渣をシリカゲル上（クロロホルム：メタノー
ル（９：１）で溶離させる）クロマトグラフィ処理して
Ｎ−２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニルプロリン
を泡状物として得た（　１．１９）。

ＰＭＲ（ＣＤα３）：δ９．４３（ＩＨ，幅広い、Ｄ２
０交換、Ｃ０ＯＨ）、８．５５　（ＩＨ，ｄ、　ＪＨ１
Ｆ＝７．５Ｈｚ。

フェニルのＨ−３）、６．６２（ＩＨ，ｄ、ＪＨ，Ｆ＝
１５Ｈｚ、フェニルのＨ−６）、４．５　（Ｉ　Ｈ，幅
広いｔ、　　Ｊ＝６Ｈｚ、プロリンメチン）、３．７〜
３．１　（２Ｈ，ｍ　）、２．７〜１．９ｐｐｍ（４Ｈ
，ｍ）。

−１０℃で塩化メチレン中２．４（Ｅ）、６．９（Ｚ）
−ペンタデカテトラエン−１−オール（１２３■、０．
５６ミリモル）および上記のプロリン誘導体（１７０■
、０．５７ミリモル）の混合液に１−シクロへキシル−
３−（２−モルフォリノエチル）カルボジイミドメチル
−ｐ−トルエンスルフォネート（２６６η、０．６３ミ
リモル）およびピロリジノピリジン（９η、０．０６ミ
リモル）を引続いて添加した。溶液をＮ２下室温で７時
間攪拌した。

混合液を沢過し、Ｐ液を水、５％ＮａＨＣＯ３、食塩水
で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、残渣をシ
リカゲル上（クロロホルム：エタノ−ル（９９，２５：
０．７５）で溶離する）クロマトグラフィ処理して純粋
な付加物を油として得た。

ＰＭＲ（ＣＤα３）：δ８．５７　（ＬＨ，’ｄ、　Ｊ
＝７．−５Ｈｚ）、６．５５（ＩＨ，ｄ、Ｊ−１５Ｈｚ
）、６．７〜５．２（８Ｈ，ｍ。

オレフィン）、４．６５　（２Ｈ，ｄ、　　Ｊ　＝６　
ＨＺ、　−ＣＯＯＣＨ２−）、４．４７（ＩＨ，ｔ、Ｊ
＝６Ｈｚ、プロリンメチン）、３．４５（２Ｈ，ｍ）、
２．９５　（２Ｈ，ｍ　）、２．７〜１．８　（ＲＨ，
ｍ）、１．５〜１．２　（ＲＨ，ｍ　）、０．８８（３
Ｈ，ｔ）。Ｕｖ（ジオキサン：λｍａｘ（ε）２７５（
４８，７００）、３４７ｎｍ（１８４５０）。分析Ｃ２
６Ｈ３２Ｎ３０６Ｆに対する計算値：Ｃ，６２，２６、
Ｈ，６，４３、Ｎ、８．３８、Ｆ、３．７９、測定値：
　Ｃ，６１，８８、Ｈ，６，７２、Ｎ、８．４８、Ｆ、
３．４７゜ジオキサン（１−）およびホウ酸塩緩衝液（
ｐＨｓ、　５．０．２Ｍ、３ｍＪ）申付加物（５ダ、ｌ
×１０　モル“）およびＢＳＡ（１０η、１．５ＸｌＯ
モル）のｉ濁液を暗所で４日間室温でゆっくりと攪拌し
た。混合液を遠心分離し、上澄み液をセファデックスＧ
−５０（１，５Ｘ７５ＣＩＩＬ）で濾過し、水で溶離し
た。ボイド・ボリューム後７−に溶離するタンパク質フ
ラクションはＵＶ分析結果はＢ５Ａｌモルにつきハプテ
ン約４モルを示した。

実施例２ の製法 ６−アミノヘキサン酸（２，Ｖ、０．０２モル）および
マレイン酸無水物（２ＦＸ　０．０２モルンを内部温度
が約１６５℃に達するようにディーンスターク水分離器
でキシレン（２０ｍ）中で共に還流した。混合液を冷却
し、クロロホルム−メタノールで希釈し、ＩＮ塩酸で洗
浄した。有機層を水で洗浄、乾燥、乾固して残渣（１，
！ｉ＋）を生成し、シリカゲル上（５％メタノール−ク
ロロホルムで溶離する）クロマトグラフィ処理して純粋
な６−Ｎ−マレイミドヘキサン酸、ｍ、ｐ、８４〜８５
℃を生成した。

ＩＲ（ＫＢｒ　）：　３３００〜２５００　（ＣＯＯＨ
）、１７００傭−１（マレイミドおよびＣ００Ｈ）。Ｐ
ＭＲ（ＣＤα３）：δ１１．１０　（Ｉ　Ｈ，ｓ、　Ｄ
２０交換、Ｃ０ＯＨ）、６．７２（２Ｈ，ｓ、マレイミ
ドＣＨ）、３．５３（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ　）、２．
３４　（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ　）、１．６ｐｐｍ（Ｒ
Ｈ，ｍ）。

質量スペクトル：　ｍ／ｅ　２１１　（Ｍ　　）。

分析、ＣＬ　ＯＨＩ　３ＮＯ４に対する計算値：　Ｃ，
５６，８７、Ｈ，６，２０、Ｎ、６．６３゜測定値：Ｃ
，５６，８７、Ｂ１６．２４、Ｎ、　６．６２゜ ６−Ｎ−マレイミドヘキサン酸（５０■、０．２３ミリ
モル）およびα、α−ジクロロメチルメチルエーテル（
１５０μＡ、１．５ミリモル）を無水ジクロロメタン（
１ゴ）中で一晩共に還流した。混合液を乾固し、得られ
た吸湿性のつよい固体６−Ｎ−マレイミドヘキサン酸ク
ロリド（５４〜）を新しいうちに力ツナリング反応に使
用した。

ＩＲ（フィルム）：　１７９５（Ｃｏα）、１７００ｃ
ｍ’（マレイミド）。

ＰＭＲ（ＣＤα３）：δ６．６０（２Ｈ，ｓ、マレイミ
ドＣＨ）、３．５３　（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ　）、２
．９０（２Ｈ，ｔ、　　Ｊ＝７Ｈｚ　）、１．６ｐｐｍ
（ＲＨ，ｍ）。

ＬＴＣ４三カリウム塩（５〜）を無水メタノール（１−
）およびトリエチルアミン（８０μｌ）に窒素下で溶解
し、酸クロリド（無水ＴＨＦ１００μｌ中酸クロリド１
０■溶液２５μｌ）を添加した。反応物を室温で攪拌し
、ＨＰＬＣ（ホワットマンパーティシルＭ９　　　（１
０／２５０ＤＳＸＭｅＯＨ：ＨｚＯ：ＨＯＡＣ，７０：
３０：０．０１で溶離する、４−７分）を行なった。付
加物ｔ／ｉ４．８分で溶離し、ＬＴＣ４は６．６分で溶
離した。１０および３０分後、未反応ＬＴＣ４約１５％
が残存した。酸クロリド溶液（５μｌ）をさらに加え、
１０分間反応後に５％の未反応ＬＴＣ４が残存した。反
応混合液をＮ２気流下で０．２　＃Ｉ７！に濃縮し、ホ
ウ酸塩緩衝液（ｐＨ７，２，０，１Ｍ、０．５ゴ）で希
釈し、残留メタノールを真空で除去した。この溶液Ｔｒ
ｉＬＴｃａ自体から実質的に変化しないＵＶスペクトル
を有し、そのままチオール化ＫＬＨと反応させるのに使
用した（次を参照）。

ＫＬＨ（Ｒ０Ｉｎｇ）をホウ酸塩緩衝液（０，２ＭＸｐ
ｕｓ、１．５　ｍｌ）に溶解し、遠心分離して変性タン
パク質を除去した。生成した溶液はＵ　Ｖ　ＣＥ２ｔｓ
　（１ｎｇ／ｍ／）＝１．３６　、］　Ｋ　ヨッテ２４
．６〜／−として分析した。゛溶液を脱酸素（高真空お
よび純粋なＮ２フラッシュを交互に行なうパージによる
）シ、次にＮ２下Ｓ−７セチルメルカプトコハク酸無水
物で処理した（４５ηを１時間にわたって５ダあて添加
した）。

ｐＨはＩ　Ｎ　ＮａＯＨの添加によって８に維持した（
全量４００μｌ）。さらに１時間放置した後、Ｎ−エチ
ルマレイミド（ＭｅＯＨＯ，１−中２０ｒｎｇ）を添加
してあらゆる遊離のチオール基に結合させ、溶液を空気
に安定化させた。

さらに１．５時間放置した後、溶液を遠心分離し、０．
０１　ＮｐＨ６，２リン酸緩衝液で緩衝した０、１８食
塩水で溶離するカラムセファデックスＧ−５０（ｉ、ｓ
Ｘ　７５ｃＩｒＬ）で処理した。ボイド・ボリュームの
後溶離する２つのフラクション（７−）はタンパク質体
（２，４η／７りを含有した。ｐＨ１１，５で１時間加
水分解した後チオール含有量に対して分析したアリコー
トはタンパク質１００，０００ダルトンにつき１８チオ
ール基を示した。

ング ＫＬＨ（反応Ｃからの）（１０，８■、０，０１Ｎリン
酸塩でｐＨ６，２に緩衝した０、ＩＮ食塩水４．５−中
）のＳ−アセチルメルカプトスクシネート誘導体の溶液
を正確に脱償素し、次にｐＨをＮ２下でＩＮ　Ｎａ０Ｈ
（１５０μ！　）で１１．５に上げ、混合液を室温で１
時間放置した。次いで脱酸素したＩＮＨα（１５０μｌ
）を添加することによってｐＨを７．２に低下させ、反
応ＢからのＬＴＣ４の６−Ｎ−マレイミドへ牛すン酸ア
ミド誘導体の溶液を添加した。室温で２時間放置した後
、Ｎ−エチルマレイミド（メタノール１０μｌ中１〜）
を添加し、混合液゛　を室温でさらに１時間放置した。

この溶液を０、ＯＩＮリン酸塩でｐＨ６に緩衝した０、
１８食塩水で溶離するセファデックスＧ−５０カラム（
１，５Ｘ　７・５ＣｒｒＬ）で処理した。タンパク質フ
ラクションはボイド・ボリュームの後１１−中（オの８
５チが溶離した。未反応試薬はデッド・ボリューム（１
５０ｍｇ）で溶離した。タンパク質溶液を貯蔵のためＩ
ＮのＮ　ａ　ＯＨでｐＨ７，２に調節した。

ＵＶによるタンパク質溶液の分析結果は、タンパク質　
１００，０００ダルトンにつきＬＴ０４７〜ｌＯ当量が
カップリングしたことを示した。

タンパク質ＢＳＡおよびＫＬＨとＬＴＣ４の結合体をウ
サギ約１ｋＬｊ当シ２００μＩ投与量でウサギを用いて
抗体を生じさせるために使用した。抗体はロイコトリエ
ンＣ４、Ｄ４およびＥ４を特異的に見分ける。ロイコト
リエンのイムノアッセイにおける抗体産生、特異性およ
びこれらの結合体の用途の詳細な説明は後に述べる。

使用したＬＴＣ４および特異的タンパク質のほかにＬＴ
Ｄ４およびＬＴＥ４のような他のロイコトリエンをテタ
ナス抗原、ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）、並びにシフ
テリアトキシド、テタナス抗原およびＣＲＭ１９７（ジ
フテリア菌からの）および類似の抗原物質のような他の
抗原タンパク質と結合することができることが認められ
る。

実施例３ 次は免疫原としてＫＬＨ−マレイミドＬＴＣ４を使用す
ることを用いた免疫法である。

３匹の生後４ケ月のニュージランドホワイト系ウサギに
各々完全フロインドアジュバンド中ＫＬＨ−ＬＴＣ４２
００μＩを多重部位に皮下注射し、３週間後に不完全フ
ロインドアジュバント中ＫＬＨ−ＬＴＣ４１００μｓを
多重部位に皮下注射した。ウサギは２回目め注射および
その後の３週間毎の注射の１０日後に採血した。抗体レ
ベルに非常な減退が観察された時、動物を不完全フロイ
ンドアジュバント中ＫＬＨＬＴＣ４２００μｇを追加刺
激し、動物は再び同じスケジュールで採血した。

抗原Ｂ　Ｓ　Ａ−ＤＮＰ−ＬＴＣ４をロイコトリエン検
出に使用するだめにソリッド−フェーズ−イムノ−ラジ
オアッセイ（ＳＰＩＲＡ）で使用した。

ＰＢＳ中０．１１Ｖタンパク質／ゴの抗原の７リコート
ｌＯＯμｌを４℃で１８時間培養することによってポリ
塩化ビニル−９６ウエルマイクロタイタープレート（ダ
イナチックラボラドリース）に抗原（ＢＳＡ−ＤＮＰ−
ＬＴＣ４）を被覆した。ウェルをＰＲ８２００μｌで３
回洗浄し、次にウェル中でＰＢＳ中１０％ウマ血清の２
００μｌアリコートを２２℃で２時間培養することによ
ってウェル中の未反応部位を遮断（ｂｌｏｃｋ）　Ｌだ
。次にウェルをＰＢＳ−１，５Ｈ，Ｓ、ＣＰＢＳ中１．
５％ウマ血清）で３回洗浄した。免疫または前免疫性ウ
サギ血清の希釈を含有する反応混合液１００μｌをウェ
ルに添加し、プレートを２２℃で４時間培養した。ウサ
ギ血清の力価測定に対して使用される１００μ１反応は
ＰＢＳ−１，５Ｈ，Ｓ、中血清の希釈５０μｌおよびＰ
　Ｂ　Ｓ　−１，５Ｈ，Ｓ、５０μｌからなる。競合分
析（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　）に
対してこの反応混合液はロイコトリエン特異的抗体の限
定量および種々の濃度のロイコトリエンまたは化学的に
関連した化合物を含有するＰＢＳ−１，５Ｈ，Ｓ、５０
μｌを含有したＰＢＳ−１，５Ｈ，Ｓ、中免疫血清希釈
５０μｌからなる。この１００μ１反応混合液はマイク
ロタイタープレートのウェルに添加する前に２２℃で１
時間予備培養した。

次にマイクロタイタープレートのウェルをＰ　Ｂ　Ｓ　
−１，５Ｈ８，２００μｊで３回洗浄し、次いで１０％
ウマ血清を含有するＰＢＳ中１２５Ｉ−標識ウサギ抗マ
ウス〔ウサギ抗マウスｘｇａ　（Ｈ十Ｌ　）のＦ（発ｂ
）ｚ：１１００μｊをウェルに添加しプレートを２２℃
で４時間培養した。

ヨウ化試薬約２Ｘ１０　　　ｃｐｍを各ウェルに添加し
た。培養期間の後、ウェルをＰＢＳ−１，５Ｈ，Ｓ、で
５回およびＰＢＳ２００μｌで１回洗浄した。次にウェ
ルをプレートから切断し、各ウェルの放射活性をガンマ
カウンターで定量した。

この分析の利点は、ウサギがＫＬＨ−マレイミド−ＬＴ
Ｃ４で免疫し、それ故抗体はこれらの動物中にＫＬＨに
対してマレイミドリンカ−に対しておよびハプテン−Ｌ
ＴＣ４に対して存在するが、しかしながら抗体はＫＬＨ
に対して指向されそしてマレイミドリンカ−はウェルの
表面に被覆された物質のＢＳＡまたはＤＮＰリンカ−に
交差反応または結合しないことである。それ故ウェルに
被覆された物質（ＬＴＣ４−ＤＮＰ−Ｂ　Ｓ　Ａ　）に
結合する抗体だけがＬＴＣ４に対して指向される。

これらのウサギＬＴＣ４抗体は結合体のＬＴ０４部分に
結合し、順次抗体の第２次種（１２５（−標識ヤギ抗ウ
サギ抗体）を添加することによって検出した。抗体をヨ
ウ素で放射線標識し、ウサギ抗体に結合し、順次ＬＴＣ
４に結合する。

正味の成績としては抗体がＬＴＣ４に対・して指向され
る１１ど、放射能はウェルと結合する。

遊離ＬＴＣ４が生物試料中にある場合には、定量するた
めに７リコートはプラスチックウェルに添加される。こ
の遊離ＬＴＣ４のあるものは表面に結合される抗原被覆
からとすれば置き換わるウサギ抗ＬＴＣ４に結合する。

これはウェルの表面に結合したカウント（１２５１）の
数の減少の結果となり、この減少を遊離ＬＴＣ４の公知
量が添加される場合の標準曲線での減少に比較すること
によって試料のＬＴ　ＣＪ量を定量することができる。

実施例１および２に記載される他の化合物は試薬として
分析系で同様に使用することができる。

これらの結合体で免疫することによつヤウサギに産生さ
れる抗血清もまたロイコトリエンＣ４、Ｄ４およびＥ４
に対するラジオイムノアッセイの主成分として放射線標
識ロイコトリエンＣ４、Ｄ４またはＥ４と併用して使用
することができる。

これらの結合体は喘息、アレルギー性鼻炎、リウマチ性
関節炎を包含する皮膚、肺および気道の様々なアレルギ
ー性および慢性炎症疾患および乾癬および湿疹のような
皮膚疾患の治療に化学免疫療法剤として有用である。

ＬＴＣａ抗体検定 モルモット−腸標準検定において４片の組織をアトロピ
ンおよびピリルアミンを両方１０　　Ｍを含むクレブス
緩衝液の１０−浴に置いた。

標準収縮を最終濃度２．７　Ｘ　１０　　Ｍｆ）ＬＴＣ
４に対して１〇−浴中２．７　Ｘ　１０　”ＭｔＱ乙丁
Ｃ４溶液１０μｌを用いて観察しだ。

標準応答張力は１．１〜２．０ｇであった。

ＬＴＣ４原液２０μｌを抗ＬＴＣ４血清（ウサギ）の変
化量（１０μｌ、４０μ／、１００μｌおよび４００μ
ｌ）と混合した。

（血清１−け抗−ＬＴＣ４特異抗体７．９×１０　　Ｍ
を含有した。） 血清を使用前に氷上（暗所で）で１／２時間培養した。

対照試料を正常なウサギ血清の同量を用いて行なった。

混合試料（各々１５μ１１３０μｌ、６０μｌおよび２
１０μｌ）を浴に添加し、応答を記録した。

結果 抗体血清の容量　　　　コントロール応答のチ５μｍ　
　　　　　　　１００．０ ２０μ７　　　　　　　　７２．７ ５０μ７　　　　　　　　９２．３ ２００μ／　　　　　　　　　６４．７正常血清の容量 ５μｍ　　　　　　　　１０８．６ ２０μｌ　　　　　　　　　８５．７ ５０μｍ　　　　　　　　１０２．６ ２００μｌ　　　　　　　　１１４．３上記の結果から
抗ＬＴＣ４が各試料においてＬＴＣ４の効果を減少する
ことは明白であった。

このように結合体はヒトの（ウサギで使用したと類似の
方法で）ＬＴＣ４、ＬＴＤ４　、ＬＴＥ＜に対する抗体
を上げるために使用することができる。生成した抗体の
循環レベルは喘息性アナフィラキシ一応答中に放出され
るＬＴＣ４およびＬＴＤ４およびＬＴＥ４の血漿レベル
を減少するために働き、従って症状を緩和するために働
く。抗体は長時間存在することから、これは長期の喘息
治療を示すことになる。

ＰＭＲスペクトルをパリアンＥＭ−３９０またはプルカ
ーＷＭ−４００分光計で記録した。ＵＶスペクトルをカ
ーリ−２１０分光光度計で記録した。旋光をパー牛ンエ
ルマーモデル２４１旋光計を用いて測定した。セファデ
ックスＧ−５０（媒質グレード）はファーマシアファイ
ンケミカルズから入手した。

ウシ血清アルブミンはシグマケミカル社から結晶化およ
び凍結乾燥グレードとして入手し、ヘモシアニン（キー
ホールリンペット）はカルバイオケムベーリング社から
凍結乾燥グレードとして入手した。

５　（ｓ）、　　１２　（Ｒ）−ジヒドロキシ−６，１
４（Ｚ）−８，１０（ト）−エイコサテトラエノエート
（１２ｒｎ９）を窒素下で炭酸カリウム（２２１ｎｇ）
を有するメタノール（１，５ｍ）および水（０，４祠）
中、周囲温度で２．５日間攪拌した。窒素気流下でメタ
ノールのほとんどを除去（約０．４−容量残存する）し
、混合液を０．　Ｉ　ＮｐＨ６，２リン酸塩緩衝液（２
，５７りで希釈した。混合液をエーテル（５Ｘ２−）で
抽出し、合わせたエーテル抽出液を乾燥（Ｎａ　２Ｓ０
４　）　Ｌ　、乾固した。生成した油のＵＶ分析はＬＴ
Ｂ４遊離酸８ダがこうして得られたことを示した。油を
無水エーテル（５７りに溶解し、窒素下０℃で２４時間
ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２０ｒｎ
ｇ）で処理した。ＴＬＣ分析（酢酸エチル：ヘキサン２
：３）は、ＬＴＢ４がδ−ラクトンに約５０％転化した
ことを示した（　ＲｆＬＴＢ４＝０、ＲｆＬＴＢ４ラク
トン＝０．６）。

さらにＤＣＣ（３０η）を添加し、０°で２８後ＴＬＣ
はδ−ラクトンに実質的に完全に転化したことを示した
。混合液をＮｚ下で１ｄに濃縮、濾過、乾固し、酢酸エ
チル：ヘキサン（２：３）（１ｍＪ）に取り、同一溶媒
で溶離するシリカゲルカラム（１０，９）でクロマトグ
ラフィ処理して少量のジシクロへキシルウレアを不純物
として含むδ−ラクトンを生成した。さらにこの物質を
ＨＰＬＣ（ウォータースｌＯμ、μｍポラシル、酢酸エ
チル：ヘキサン（１：２）、４−７分）で精製して５．
７分で溶離する純粋なＬＴＢ、δ−ラクトン（Ｖｌ）を
生成した（Ｒ．３！ｎｇ、■からの収率７７％）。ラク
トンをエーテル：へキサンで微細な針高として結晶化し
た、ｍｐ５０．０〜Ｔ ５０．５°〔α〕Ｄ＝　＋２３１．０’　（Ｃ＝０．３
．　ＣＨα３）Ｕｖ：λｍａｘ（ε）（ＭｅＯＨ）　２
６０　（３７，２００）、２７０（５０，０００）、２
８０ｎｍ（３９，４００）。　”δＰＭＲ（４００ＭＨ
ｚ）（ＣＤα３）　：　０．８７　（３Ｈ。

ｔ）、１．：２〜１．４　（ＲＨ，ｍ　）、１．６５（
２Ｈ，ｍ）、１．９３（２Ｈ，ｍ）、２．０３　（２Ｈ
，ｑ、　ＣＨ２，Ｃ−１６）、２．３２　（２Ｈ，ｍ、
　ＣＨ，Ｃ−１３）、２．４８　（Ｉ　Ｈ，ｄｔ。

Ｊ＝１７．５．７Ｈｚ、　ＣＨ２の１つ、Ｃ−２）、２
．６２ＣＩＨ。

ｄｔ、Ｊ＝１８，５Ｈｚ、ＣＨ２の１つ、Ｃ−２）、４
．２２（ＩＨ，ｍ、　メチン、Ｃ−１２）、５．２３（
ＩＨ，ｄｔ。

Ｊ＝１０．５．２Ｈｚ、　メチン、Ｃ−５）、５．３５
ＣＩＨ。

ｄｄ）、５．４５（ＩＨ，ｔ）、５．５８（ＬＨ，ｄｄ
）、５．８１（ＩＨ，ｄｄ）、６．１５　（ＩＨ，ｔ　
）、６．２９（２Ｈ。

ｍ）、６．４１（ＩＨ，ｄｄ）。

方法１、　ＬＴＢ４δ−ラクト：／　（Ｗ）（１，７５
Ｉｎ９）を再蒸留した１、３−ジアミノプロパン（０，
５−）に溶解し、混合液を室温で１８時間放置した。過
剰のジアミノプロパンを高真空下で除去し、アミド■を
得た、量的収量、〔ａ〕ＲＴ＝−２°（Ｃ＝０．１７．
ＣＨα３）。

Ｕｖ：λｍｉｘ　（ｇ）（ＭｅＯＨ）　２５９．５　（
２９，８００）、２６９．５（４６，５００）、２８０
（３６，５００）。δＰＭＲ（４００ＭＨｚ）：２．０
３（２Ｈ，ｑ、ＣＨ２Ｃ−１６）、２．２１　（２Ｈ，
ｔ、−ＣＨ２−Ｃ０ＮＨ−）、２．３１　（２Ｈ，ｍ。

ＣＨ２，Ｃ１３）、２．７６　（２Ｈ，ｔ　、　　−Ｃ
Ｈｚ　−ＮＨｚ　）、３．３３　（２Ｈ，ｑ、　　−Ｃ
ＯＭＨ−ＣＨｚ　　）、４．２０　（ＩＨ，ｑ。

メチン、Ｃ−１２）、４．５８　（ＩＨ，（１，メチン
、Ｃ−５）、５．３〜５．４３　（２Ｈ，ｍ）、５．５
５（ＩＨ，ｄｄ）、５．７８（ＩＨ，ｄｄ）、６．０５
（ＩＨ，ｔ）、６．１８〜６．３１（２Ｈ，ｍ）、６．
３６（ＩＨ，幅広いＮＨ，アミド）、６．４７　（ＩＨ
，ｄｄ　）。

方法２．　エチル５　（Ｓ）−ベンゾイルオキシ−１２
（Ｒ）−ヒドロキシ−６，１４体）−８，１０（Ｒ）−
エイコサテトラエノエート（２，５〜）および２−ヒド
ロキシピリジン（１，５１ｎｑ）を１゜３−ジアミノプ
ロパン（０，５ｄ　）に溶解し、混合液を室温で窒素下
３日間放置した。過剰のジアミノプロパンを高真空下で
室温で除去し、粗■を生成し、そのままを次の反応で使
用したＣＵＶ：λｍａｘ２２７．２６０，２７０．２８
０．１９８ｍｎ）。

無水メタノール（４００μｌ）およびトリエチルアミン
（８μｌ）中、段階Ｂ、方法２からの粗アミノアミド（
［［Ｄ（２■）をメタノール（２００μｌ）中１，５−
ジフルオロ−２゜４−ジニトロベンゼン（４ｒｎ９）で
室温で１５分間処理し、その時逆相Ｔ　Ｌ　Ｃ（ＲＰＴ
ＬＣ）（アセトニトリル：水、８５：１５）は■の反応
完了（Ｒｆ＝ｏ、１）および新しい黄色生成物（Ｒｆ＝
０．７）の出現を示した。混合液をＲ′ＰＨＰＬＣでク
ロマトグラフィ処理して（ウォータース、１０μ、μボ
ンダパック、Ｃ−１８、アセトニトリル：水、７０：３
０．１ｍ／分）、生成物ＩＶ（１，８■）を生成した、
〔α娼”＝１８．９゜（Ｃ＝０．３７　、　ＭｅＯＨ）
。

Ｕｖ：λｍａｘ（ＭｅＯＨ）　２６０．２７０．２８０
．３３５．３８０　（ｓｈ）。ＰＭＲ（４００ＭＨｚ）
（アセトン−ｄ６：δ３．３４　（２Ｈ，ｑ、　−ＣＯ
ＮＨ−ＣＨｚ　）、３．６１　（２Ｈ，ｍ。

泗２−）、３．６１　（２Ｈ，ｍ、　−ＣＨ２ＮＨＡｒ
　）、３．８４（２Ｈ，ｍ、２−０Ｈ）、４．１４（Ｉ
Ｈ２ｍ、メチン、Ｃ−１２）、４．５８（ＩＨ，ｍ、　
メチン、Ｃ−５）、５．４２（３Ｈ，ｍ）、５．７８　
（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝１４．６Ｈｚ。

Ｈ−１１）、６．００（ＩＨ，ｔ、　Ｊ＝１１Ｈｚ、　
Ｈ−７）、６．２１　（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝１４．１１
Ｈｚ、　Ｈ−１０）、６．３０（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝１
４．１１Ｈｚ、　Ｈ−９）、６．５７　（ＩＨ，ｄ　ｄ
、　Ｊ＝１４．１１Ｈｚ、　Ｈ−８）、７．１５（ＩＨ
，ｄ、ＪＨＦ＝１５Ｈｚ）、７．２７（ＬＨ，幅広い、
　ＮＨ，アミド）、９．００　（ＩＨ，ｄ、　ＪＨ，Ｆ
＝８Ｈｚ八　９．１５（ＩＨ，幅広い、ＮＨ，アミン）
。

ジメチルホルムアミド（０，５ｄ）中の化合物■（段階
Ｃからの）（１，５Ｉｎ？）の溶液を０．２ＮｐＨ８，
５ホウ酸塩緩衝液（０，７５ｍ）中のＢＳＡ（１５ｒｎ
？）溶液に添加し、混合液を窒素上暗所でおよび室温で
４日間放置した。

混合液を遠心分離し、澄明な上澄み液を水で溶離するセ
ファデックスＧ−５０のカラム（１，５Ｘ７５ｃｍ）で
処理した。約５５ｍｇのボイド・ボリュームの後、黄色
タンパク質フラクションが２０−できれいに溶離した。

約１４０ｒＩＬｇのデッド・ボリュームで未反応■およ
び副生成物を含有するピークが溶離した。

タンパク質フラクションのＵＶ分析結果はスペクトルｍ
ａｘ２６６、（ＳＨ）、２７３．２８３．３３６．４２
０ｎｍを示した。カラムからＢＳＡが１００チ回収する
と仮定すれば、ＢＳＡおよびジニトロベンゼン発色団の
寄与に対する補正後の２７３　ｎｍのピークに基づく計
算値はＢ５Ａ１モルにつきＬＴＢ４５．５モルがカップ
リングすることを示した。３３６　ｎｍの吸収は（約２
７．０００の１．５−ジアミノ−２，４−ジニトロベン
ゼン発色団として仮定すれば）　Ｂ５Ａ１モルにつきＬ
Ｔ８４８．３モルがカップリングすることを示した。

ＬＴＢ４δ−ラクトン（Ｍ）（４■）をＴＨＦ（ｌｙ）
および９９％ヒドラジン水和物（０，５−）の混合液に
溶解し、混合液を窒素下室源で０．５時間激しく攪拌し
た。混合液をエーテル（３Ｘ２ｍ／）で抽出し、合わせ
た有機層を乾燥（ＮａｚＳＯ４）　Ｌ、窒素流れ下で次
に真空下で蒸発乾固してヒドラジド■（４，２ｒｎｇ）
を生成した。〔α〕ＲＴ＝８．９°（Ｃ＝０．２８．　
ＭｅＯＨ）。

ＵＶλｍａｘ（ε）＝２６０（３７，０００）、２６９
．５（５０，０００）、２８０（３９，０００）。ＰＭ
Ｒ（４００ＭＨｚ、、アセトン−ｄ６　）：δ２．１　
（２Ｈ，ｔ　）、２．２７　（２Ｈ，ｍ　）、３．８２
（ＬＨ，ｍ、　ＮＨｚ　）、３．９９（ＩＨ，幅広いＮ
Ｈ，）、４．１４（ＩＨ，ｍ、メチン、Ｃ−１２）、４
．５６　（ＩＨ，ｍ。

メチン、Ｃ−５）、５．３〜５．５　（３Ｈ，ｍ　）、
５．７７（ＩＨ。

ｄｄ、Ｊ＝１４．６Ｈｚ、Ｈ−１１）、６．００（ＩＨ
，ｔ。

Ｊ−１１Ｈｚ）、６．２２（ＩＨ，ｄｄ、’Ｊ＝１４．
１１Ｈｚ。

Ｈ−１０）、６．３１　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝１４．１１
Ｈｚ、Ｈ−９）、６．５６（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ−１４，１
１Ｈｚ、Ｈ−８）、８．２２（ＩＨ，幅広イ、　−ＣＯ
−ＮＨ−）。

無水メタノール（１−）およびトリエチルアミン（２０
μｌ）中ＬＴＢ４ヒドラジン（■）２．５■、７×ｌθ
　モル）を窒素下室源で無水ＴＨＦ　（１００μ））中
６−Ｎ−マレイミドヘキサン酸クロリド（８）　（３，
３〜、１．４Ｘ１０−５モル）の溶液で処理した。ＴＬ
Ｃ分析（クロロホルム：メタノール、８５：１５）は極
性の低い生成物に転化が完了したことを示した。

混合液を乾固し、残渣を脱酸素メタノール（１，２ｍ）
に取り、そのまま次の反応に使用した。所望により生成
物を逆相ＨＰＬＣ（ウォータース１０μ、μｍボンダパ
ックＣ−１８、メタノール：水、７５：２５．２−７分
）で精製して４，５分で溶離する純粋な付加物■を得た
。ＵＶλｍａｘ　（ＭｅＯＨ）　（ε）：２６０（３６
，３００）、２７０（５０，０００）、２８０．５（３
９，４００）。

ＰＭＲスペクトルを得るだめに濃縮する際い°くらかの
分解がおこることがＴＬＣによって認められた。しかし
ながらスペクトル（４００ＭＨｚ）（アセトンｄａ　）
はマレイミド単位が部分的に反応されるが存在している
ことを示す６．８２　ｐｐｍで弱いシグナルを含有した
。

リング Ｓ−７セチルメル力プトコハク酸ＫＬＨ結合体を前に記
載した通シ調製した。０．０１ＮｐＨ６，２リン酸塩緩
衝液ＣＰＢＳ）（ｓｙ）で緩衝した０、ＩＮ食塩水中誘
導されたタンパク質（ＫＬＨ８Ａ　Ｃ−）　（１０ｒｎ
９）をつよく脱酸素し、次に０．　Ｉ　ＮのＮａＯＨを
添加することによってｐＨを１１．５に上げた。窒素下
室温で１時間放置した後、０．ＩＮのＨαを添加するこ
とによってｐＨを７．２に下げた。上記の反応Ｂからの
メタノール（１，２ｍｇ）申付加物■を添加し、混合液
を窒素下で１８時間ゆつくシと捕拌した。メタノール（
０，１−）中Ｎ〜エチルマレイミド（５〜）を添加し、
混合液をさらに１時間攪拌した。メタノールを窒素流れ
下で１時間除去し、混合液を遠心分離して、上澄み液を
ｐＨ６，２Ｐ　Ｂ　Ｓで溶離するセファデックスＧ−５
０で濾過した。蛋白質はボイド・ボリュームの後１９−
中にその９５％力蕃離し、Ｕｖスペクトル：λｍａｘ　
２６４　（ＳＨ）、２７３．５．２８３．５ｎｍを得た
。タンパク質９ｍｇがカラムから回収されたと仮定し、
ＫＬＨＩＯｏ、０００につきカップリングしたため２７
３．５ｎｍの吸収を寄与に対して補正した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カツプリング剤１，５−ジフルオロ−２，４−ジニ
   トロベンゼンまたは６−Ｎ−マレイ ミド−アルカン酸クロリド（アルカンは２ 〜８個の炭素原子を意味する）による、 ＫＬＨ、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、破傷風抗原、ジ
   フテリアトキソイドまたはＣＲＭ １９７と、ＬＴＢ＿４、ＬＴＣ＿４、ＬＴＤ＿４または
   ＬＴＥ＿４の結合体。 ２、カツプリング剤１，５−ジフルオロ−２，４−ジニ
   トロベンゼンまたは６−Ｎ−マレイ ミド−アルカン酸クロリド（アルカンは２ 〜８個の炭素原子を意味する）による、 ＫＬＨ、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、破傷風抗原、ジ
   フテリアトキソイドまたはＣＲＭ １９７とＬＴＣ＿４、ＬＴＤ＿４またはＬＴＥ＿４との
   特許請求の範囲第１項に記載の結合体。 ３、カツプリング剤１，５−ジフルオロ−２，４−ジニ
   トロベンゼンまたは６−Ｎ−マレイ ミド−アルカン酸クロリド（アルカンは２ 〜８個の炭素原子を意味する）によるＫＬＨまたはＢＳ
   ＡとＬＴＣ＿４の結合化合物である特許請求の範囲第１
   項記載の結合体。 ４、６−Ｎ−マレイミドヘキサン酸クロリドを用いる特
   許請求の範囲第２項記載の結合 体。 ５、カツプリング剤１，５−ジフルオロ−２，４−ジニ
   トロベンゼンまたは６−Ｎ−マレイ ミド−アルカン酸クロリド（アルカンは２ 〜８個の炭素原子を意味する）によるＫＬＨまたはＢＳ
   Ａと、ＬＴＢ＿４の結合化合物である特許請求の範囲第
   １項記載の結合体。 ６、６−Ｎ−マレイミドヘキサノン酸クロリドを使用す
   る特許請求の範囲第５項記載の 結合体。 ７、喘息、アレルギー性鼻炎、リウマチ様関節炎を含む
   皮膚、肺および気道のアレルギ ー性または慢性炎症疾患および乾癬および 湿疹のような皮膚疾患の治療または予防方 法において、カツプリング剤１，５−ジフルオロ−２，
   ４−ジニトロベンゼンまたは６−Ｎ−マレイミド−アル
   カン酸クロリド（ア ルカンは２〜８個の炭素原子をもつ）によ る、ＫＬＨ、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、破傷風抗原
   、ジフテリアトキソイドまたは ＣＲＭ１９７と、ＬＴＢ＿４、ＬＴＣ＿４、ＬＴＤ＿４
   またはＬＴＥ＿４との結合体を、ＬＴＢ＿４、ＬＴＣ＿
   ４、ＬＴＤ＿４および／またはＬＴＥ＿４にたいして患
   者に抗体を生じさせるのに十分な量だけ該 治療を必要とする患者に投与することを特 徴とする治療または予防方法。 ８、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中ｎは０〜１０である を有する化合物。 ９、ｎが０または２〜１０である特許請求の範囲第８項
   記載の化合物。 １０、ｎが３である特許請求の範囲第９項記載の化合物
   。 １１、該化合物が ５（Ｓ）、１２（Ｒ）−ジヒドロキシ−６，１４（Ｚ）
   −８，１０（Ｅ）−エイコサテトラエン酸δ−ラクトン
   、 ５（Ｓ）、１２（Ｒ）−５，１２−ジヒドロキシ−６，
   １４（Ｚ）、８，１０（Ｅ）エイコサペンタエン酸ヒド
   ラジド、 ５（Ｓ），１２（Ｒ）−Ｎ′−（α−オキソ−ゼータ−
   （２′，５′−ジ−オキソ−２′，５′−ジヒドロピロ
   ロ）ヘキサン）−５，１２−ジヒドロキシ−６，１４（
   Ｚ）、８，１０（Ｅ）−エイコサテトラエン酸ヒドラジ
   ド、 Ｎ−（３−アミノプロピル）−５−（ｓ），１２（Ｒ）
   −ジヒドロキシ−６，１４（Ｚ）−８，１０（Ｅ）−エ
   イコサテトラエン酸アミドおよびＮ−（３−〔２，４−
   ジニトロ−５−フルオロフエニル〕アミノプロピル）−
   ５（ｓ），１２−（Ｒ）−ジヒドロキシ−６，１４（Ｚ
   ）−８，１０（Ｅ）−エイコサテトラエン酸アミド から選択される特許請求の範囲第８項記載 の化合物。