JPS6056474B2 - グルコ−スイソメラ−ゼの固定化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルコースをフラグドーズに異性化するのに有
用なグルコースイソメラーゼの固定化方法に関するもの
である。

フラグドーズはグルコースの異性体であつて、甘味性は
グルコースの約２倍であり、グルコースの約半分量の摂
取でグルコースと同程度の甘味を呈する。

したがつてカロリー摂取をできるだけ最小におさえなが
ら甘味をとれるという利点を有している。またグルコー
スから異性化されたフラグドーズを含む糖液は、砂糖よ
りも約１．２〜１．４倍の甘味性を呈し、近年、清涼飲
料、缶詰、冷菓などの分野に急速に使用されつゝある。
従来、グルコースからグルコースイソメラーゼを用いて
異性化して液糖を製造するには、一般に約４５〜８腫量
％の濃厚グルコース溶液に凍結されたグルコースイソメ
ラーゼ生産菌体を投入し、約７０℃の温度で長時間、異
性化反応を生じさせた後、濾過、脱色および脱イオンな
どの諸工程を経ることにより異性化された液糖を得てい
る。

ところが、上記方法では異性化反応終了時、酵素活性が
反応前に比べて約半分に低下し、新しく異性化反応を行
なうときには損失酵素量を補なわねばならないという大
きな欠点がある。このため酵素を固定化することによつ
て酵素の長期使用、および酵素反応の連続化を可能にす
ることが強く望まれている。グルコースイソメラーゼの
固定化については遊離酵素と菌体内酵素を問わす種々の
方法が従来から知られている。

遊離酵素についてはたとえば多孔性ガラスの芳香族アミ
ノ誘導体を担体として用・いる共有結合による担体結合
法、ＤＥＡＥ−セルロースあるいはデユオライトＡ７な
どのイオン交換体を担体として用いるイオン結合による
担体結合法、ポリアクリルアミドゲル、コラーゲンある
いはセルローストリアセテートなどを組材とする包、括
法などがある。これらの方法では、工業的に使われる固
定化酵素として満足すべきものが得られていない。また
菌体を５５℃以上、９０℃以下の温度に加熱してグルコ
ースイソメラーゼを菌体に固定化させる方法も知られて
いる（特公昭４７−１９０３０号）。この方法では、無
処理菌体に比べて酵素活性の低下を大幅に改良させたと
はいえ、残存活性値は初期の４０〜５０％であり、まだ
充分とはいえなかつた。本発明者等は上記事情に鑑み、
グルコースイソメラーゼの菌体内酵素の固定化について
種々鋭意検討した結果、菌体にキトサンを比較的高濃度
になるように加えて混合し、菌体表面にキトサン膜を形
成させることにより、さらに該キトサン膜を無機酸また
は有機酸もしくはその塩によソー層安定な固定化酵素が
得られることを見出し本発明に到達した。

すなわち本発明はグルコースイソメラーゼ生産菌と該菌
体の乾燥物に対して８重量％以上のキトサンとを混合す
ることを特徴とするグルコースイソメラーゼの固定化方
法ならびにグルコースイソメラーゼ生産菌と該菌体の乾
燥物に対し８重量％以上のキトサンとを混合し、次いで
無機酸または有機酸もしくはその塩と混合することを特
徴とするグルコースイソメラーゼの固定化方法である。
キトサンとはキチンを脱アセチル化して得られる白色無
定形粉末であつて、グリコサミンからなる塩基性多糖類
である。

本発明におけるキトサンは上記キトサンあるいはその溶
液、たとえば酢酸、蟻酸、燐酸、塩酸等の酸およびこれ
らの酸の酸性溶液に溶解して得られる溶液である。この
溶液の濃度は０．０５〜２．唾量％、好ましくは０．１
〜１．０．重量％てある。このキトサンもしくはその溶
液と菌体との混合量は、菌体の乾燥物に対してキトサン
が８重量％以上、好ましくは１０．０〜５０．鍾量％に
なるような量である。

キトサンの混加量が菌体の乾燥物に対；して８重量％未
満であると、キトサン膜が微弱過ぎて固定化酵素の安定
性が悪くなるという欠点がある。すなわち菌体からの酵
素の脱離が生じやすく、また機械的衝撃による破壊など
が生じやすい。
ぅグルコースイソメラーゼ生産菌体として
は、たとえばストレプトマイセス・フエオクロモゲネス
（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｐｈａｅＯｃｈｒＯｍｇｅ
ｎｅｓ）、ストレプトマイセス●フラジアエ（Ｓ．ｆｒ
ａｄｉａｅ）、ストレプトマイセス ロゼオクロモゲナ
ス（Ｓ．ｒＯｓｅＯｃｈｉＯｍＯｇｅｒｌｅｓ）、スト
レプトマイセス●オリバセウス（Ｓ．Ｏｌｌｖａｃｅｕ
ｓ）、ストレプトマイセス●カリフオルニカス（Ｓ．ｃ
ａｌｌｆＯｍｉｃａｓ）、ストレプトマイセス●ベヌセ
ウス（Ｓ．ｖｅｎｕｃｅｕｓ）、ストレプトマイセス●
バアジニア（Ｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）などの放線菌、
シュードモナス●ハイドロヒイラ（ＰｓｅｕｄＯｍＯｎ
ａｓｈｙｄｒＯｐｈｉｌａ）などのシュードモナス属菌
、バチルス●ムガテリウム（ＢａｃｉｌｌｕｓノＭｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍ）などのバチルス属菌、ブレビバクテリ
ア属菌、ラクトバチルス属菌、アエａ／＜クテリウム属
菌のようなバクテリアなど広範囲の微生物菌体が挙げら
れる。

これらの菌体は窒素源としてコーンステープリカー単独
または脱脂大豆を併用し、炭素源として澱粉、キシロー
ズなどの炭水化物類、無機塩としては燐酸カリウム、塩
化コバルトおよび塩酸マグネシウムなどを含んだ培地に
培養して取得するものである。

本発明において用いる菌体は、特に上記菌体を培養後、
培養液から分離した菌体そのままかあるいは加熱処理さ
れたものが好ましい。

また、この菌体はＰＨ５〜９、特に５〜７．０の緩衝溶
液に分散もしくは懸濁されていてもよい。菌体の濃度は
通常０．１〜５０重量％、好ましくは０．５〜４踵量％
である。本発明方法はグルコースイソメラーゼ生産菌と
該菌体に対して８重量％以上のキトサンとを混合する。

菌体とキトサンとを混合する方法には具体的には菌体を
含む液体にキトサンもしくはその溶液を添加し混合する
方法。キトサン溶液に菌体を添加して混合する方法など
がある。固定化酵素製造の操業性から見て、キトサン溶
液に菌体を添加してよく攪拌するか、あるいは混練りし
て菌体を上記キトサン溶液に分散させることが好ましい
。上記方法により得られる混合物から必要により濾過、
遠心分離などの操作により菌体を分離する。本発明方法
ではグルコースイソメラーゼ生産菌とキトサンとの混合
を無機酸または有機酸もしくはその塩の存在下において
行なつてもよい。

ここでいう無機酸または有機酸もしくはその塩としては
、グルコースイソメラーゼを失活させない範囲のＰＨを
有するもの、特にＰＨ４．５〜７．０であつて緩衝作用
を有するものが好ましい。このような無機酸としては燐
酸、塩酸、硫酸などがあり、有槻酸としてはコハク酸、
酒石酸、クエン酸、酢酸、乳酸、フマール酸、マレイン
酸、リンゴ酸などがあり、これらの酸の塩としてはアン
モニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム
塩などがある。上記無機酸または有機酸もしくはその塩
の濃度はその種類によつて異なるが、一般には１〜１鍾
量％溶液であることが好ましい。

また本発明方法ではグルコースイソメラーゼ生産菌とキ
トサンとを混合して後、上記無機酸または有機酸もしく
はその塩を混合してもよい。

後から添加する上記酸もしくは塩の濃度は、その種類に
よつて異なるが、一般に１〜ｌ唾量％であることが望ま
しい。このように無機酸または有機酸もしくはその塩と
混合することにより菌体に形成されたキトサン膜は一層
強固になり、グルコースイソメラーゼの菌体内包括を強
靭にして安定化させると同時に固定化酵素としての物理
的強度も向上させる。

本発明方法では上記酸処理された菌体を必要により成型
し、次いて乾燥することによつて固定化酵素製品とする
。酸処理後、成型した菌体をＰＨ８〜１０のアルカリで
処理するとキトサン膜が一層硬化して、なお耐久性が向
上するので好ましい。乾燥条件は酵素が失活しない温度
範囲、特に５０℃以下で行なうことが好ましい。乾燥方
法としては真空乾燥、天日乾燥、凍結乾燥など種々の方
法が採用される。本発明方法により得られる固定化酵素
は、従来の単に加熱処理された菌体に比べて著しく失活
が少なく耐久性があり膨濶性がほとんどない。

さらに成型性がきわめてよい。したがつて長期間使用が
可能であり、酵素反応を連続して行なうことができる。
特にキトサンを菌体に対して比較的多量に用いることに
より、菌体表面に形成されるキトサン膜は菌体相互の接
着剤的役割を果し、菌体の成型性を向上させるものであ
る。

以下実施例を用いて本発明を説明する。

なお、グルコースイソメラーゼ活性はグルコース溶液（
グルコース濃度０．１Ｍ１硫酸マグネシウム０．０１Ｍ
１リン酸塩緩衡液０．０５Ｍ．．ＰＨ７．２）を用い、
反応温度７０℃、１分間で１ｍｇのグルコースを異性化
し、フラクトースを生成する酵素活性を１単位とする。

実施例１ストレプトマイセス●フエオクロモゲス （ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｐｈａｅＯｃｈｒＯｍＯｇ
ｅｎｅｓ）（微工研菌寄第２２１号）をコーンステープ
リカー、キシロース、燐酸カリウム、硫酸マグネシウム
、塩化コバルトを含む培地で通気培養して後、遠心分離
して菌体を取得した。

一方、キトサンを下記第１表に示される濃度になるよう
にＰＨ６．５のＭ／５酢酸緩衝液１００ｍ１に溶解し、
次いで上記培養菌体１０ｙ（固形物１０％）を加え攪拌
し、５時間放置した後、遠心分離してキトサン膜を有す
る菌体を得た。

次いでこの菌体を４０℃で乾燥した。このようにして得
られた菌体の酵素活性を第１表に示す。

上記方法により得られた菌体の乾燥物を用いてグルコー
スの異性化反応を繰り返し行ない、異性化率を測定した
。

その結果を第２表に示す。なお、異性化反応はグルコー
ス溶液（グルコース５０Ｗ／Ｖ％、リン酸塩緩衝液０．
０５Ｍ１硫酸マグネシウム０．００５Ｍ１塩化コバルト
０．００１Ｍ）５０ｍ１に菌体の乾燥物（グルコースイ
ソメラーゼ活性６００単位）を加え、ＰＨ６．８〜７．
２に維持しながら６０℃で２ＣＲ間反応を行なつた。反
応終了後、遠心分離しｌて菌体を回収し、再び同じ組成
のグルコース溶液に加えて異性化反応を繰り返した。ノ
′Ｖｉノｌ′ノ／Ｌ第１表および第２表から明らかなよ
うに、菌体に対するキトサンの量が８重量％以上である
場合にはじめて固定化酵素は長期間グルコースの異性化
反応に使用しうる。

実施例２キトサンを酢酸に溶解して種々の濃度のキトサ
ン溶液（ＰＨ６．５）を調製した。

一方、実施例１と同様に培養して得た菌体を８０゜Ｃで
２分間加熱処理した。上記キトサン溶液２ｅに加熱処理
菌体を乾燥菌体として４．７Ｖ添加し、よく攪拌した後
、遠心分離して菌体を分離した。この分離された菌体に
各々５％コハク酸溶液（ＰＨ７．Ｏ）１００ｍ１を加え
２時間放置した後、再び遠心分離し、水で２回洗滌をく
り返した。次いで菌体を３０℃で乾燥した。このように
して得られた乾燥物の酵素活性を第３表に示す。上記方
法により得られた菌体の乾燥物を用いて、グルコースの
異性化反応を繰り返し行ない、異性化率を測定した。

その結果を第４表に示す。実施例３バチルス コアギユ
ランス（ＢａｃｉｌｌｕｓｃＯａｇｕｌａｎｓ）をコー
ンステープリカー、グルコース、燐酸カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガンを含む培地に培養し、菌体を
培養液から分離した。

この菌体を水に懸濁させたものを８０℃で２分間加熱処
理して固形分１５．５％の菌体を得た。この菌体２０ｙ
（乾燥菌体として３．１ｙ）を０．０５％キトサン溶液
、０．２５％キトサン溶液および０．４５％キトサン溶
液それぞれ２００７７！ｌに添加してよく攪拌した後、
遠心分離して菌体を分離した。次いで、この菌体を５％
コハク酸１００ｍｔに２時間浸漬した後、再び遠心分離
して菌体を分離し、２回水洗してから減圧乾燥を行なつ
た。比較のため上記加熱処理された菌体２０′（乾燥菌
体として３．１ｙ）にキトサン溶液を添加することなく
減圧乾燥した。

このようにして得られた菌体の酵素活性を第５表に示す
。

．上記方法により得られた菌体の乾燥物を用いて）グル
コースの異性化反応を繰り返し行ない、異性化率を測定
した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グルコースイソメラーゼ生産菌と該菌体の乾燥物に
   対して８重量％以上のキトサンとを混合することを特徴
   とするグルコースイソメラーゼの固定化方法。 ２ グルコースイソメラーゼ生産菌とキトサンとを無機
   酸または有機酸もしくはその塩の存在下に混合すること
   を特徴とする特許請求の範囲１に記載されたグルコース
   イソメラーゼの固定化方法。 ３ グルコースイソメラーゼ生産菌と該菌体の乾燥物に
   対して８重量％以上のキトサンとを混合し、次いで無機
   酸または有機酸もしくはその塩と混合することを特徴と
   するグルコースイソメラーゼの固定化方法。