JPS60500119A - 緻密装填微生物による膜反応器内発酵にもとづく生物学的製品の迅速製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 緻密装填微生物による膜反応器内発酵 にもとづく生物学的製品の迅速製造 本発明は１９ｇ、２年／／月／乙日米国出願（≠ｌｌ−２０３６号の一部継続出 願に係る。

本発明は微生物学的植物！＠胞又は微生物学的動物細胞の培養による生物学的製 品の迅速で効率的な連続的製造の方法及び装置に関する。特に本発明は緻密に装 填された膜反応器内での発酵による乳酸の迅速で効率的な連続製造の方法及び装 置に係るものである。

固定化生菌細胞を使用する発酵についてはアボット［：　Ａｂｂｏｔｔ、　’　 １ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　’、　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓｏ ｎ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　／　、　、２０３．２２ ３　（／　９７７）；２、り７７２ｇ（／り７ｇ）〕及びメノング（Ｍｅｓｓｉ ｎｇ＋”　１ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　”　、　Ａｎｎｕａｌ 　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｏｎＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｌｌ Ｌ＋　／　９０２３ｇ　（／　９　Ｉ　Ｏ）　）による記載がある。常用の中空 線維発酵器の中で細胞群は発酵器の殻空間内の線維群の外側周辺で素直に固定化 される。中空線維の多細孔壁はこの細孔壁への自由通過による栄養素と製品との 拡散を可能とするけれども細胞群の透過（通過）を−■止する。微生物群が線維 群の周辺で非生菌、緻密充填細胞塊の状態をなす中空線維発酵器中の細胞群を使 用した実験報告はカフ等［Ｋａｎ　ｅｔ　ａｌ＝。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｉ、　Ｂｉｏｅｎｇ、、　２Ｑ　２／７．２３０　（／　９ ７１？　）　）、マチスン等ＣＭａｔｔｊａｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ−、Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ、　３　ｒ　、ｊ６／３；６乙（ｉ９ｇｉ） 〕及びインロウ等Ｃ１ｎｌｏｅｓ　ｅｔ　ａｔ　、、　ｌ　ＥＣＷｉｎｔｅｒ　 Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。

Ｂｏｕｌｄｅｒ　、　Ｃｏ１ｏｒａｄｏ　、　Ｊａｎｕａｒｙ　／７ｇ２〕によ って記載された。

発明者は中空線維発酵器の回分式再循環方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌ ｅｔｔｅｒｓ　、　ＩＡ　＋　４１Ｉ　３　（／　９　ｇ　２　）　）並びにサ ツカロミセス　セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＴＣＣ≠／２６）菌 を用いるエタノール製造用の該反応器の使用［Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｂｅｒｋｅｌ ｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｒｅｐｏｒｔ洩ＬＢＬ／、２Ａ０２　ｅｎｔｉｔ ｌｅｄ　”　Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆＣｅｌｌｕｌｏｓｅ　”　１Ｍ ａｒｃｈ　／　９　ｇ　／　）を開示しだ。従って本発明の目的は単一種の微生 物学的植物細胞又は微生物学的動物細胞特に微生物例えば細菌及び酵母を生育さ せる発酵器による新規の改良された方法の提供及び微生物学的生産物特に乳酸の 迅速で経済的で効率的な製造方法の提供にある。

本発明は少くとも２個の多細孔壁−中空線維群を具える発酵器を使用して微生物 学的製品を製造するだめの細胞群の連続式培養の方、去及び装置を提供する。各 線維は一端に７個の開放されだポー）　（ｐｏｒｔ　）及び池端に７個の密閉さ れたポートを有し、各線維の多細孔壁は線維の内部に無細胞域を形成し、且つ細 胞生育用栄養素を含有すると共に細胞からの生産物を含有する培地を透過させる けれども発酵器の殻空間内に存在する細胞群を送本発明に従えば線維群のうちの ７個の線維の無細胞域の中へ、開放ポートを経て、発酵器の殻空間内の栄養素含 有培地の圧力よりも大きい圧力の下で、栄養素含有培地液流を連続的に導入し、 かようにして該普通培地は線維壁を通って細胞含有殻空間の中へ流入する。殻空 間内で細胞群は栄養素を同化して生産物（製品）含有−栄養素消耗−培地を製造 する。製品含有及び消耗栄養素含有−培地の混合物を第二線維の無細胞域から開 放ポートを経て連続的に取出す。本発明に従えば殻空間の全体にわたり第一線維 の表面からの栄養素の質量移転及び殻空間の全体にわたって存在する細胞群から 生産された製品の第二線維への質量移転は対流（環流）によって増大され、その 結果、殻空間内で増殖しつつある細、泡群の細胞密度は約ｓｏｇ細胞詳Ｄ　Ｗ　 ／　Ｌ〜約６００ｇ細胞群ＤＷ／Ｌに達する。

発酵器は通常の場合に各型の線維群、即ち一部は栄養素流用であり、他席は製品 流用である線維群の夫々の複数を収容しており、該発酵器は密閉された・・ウソ ングの中に設けられ、該・・ウノングは加圧下での栄養素流導入の手段及び発酵 器内の流体の取出手段を具える。

本発明の好適態様は乳酸菌り、デルブリュキ［Ｌ。

ｄｅｌｂｒｅｕｃｋｉｉ　（ＮＲＲＬ　Ｂ４Ｚ４ｔｊ　）　）を用いる乳酸製造 である。

本発明方法の開始に当り中空線維群を取巻く空間の中へ菌細胞群を接種し、他方 において栄養素流−収容一中空線維群の入口を通って栄養素流を導入する。栄養 素と基質とを中空線維壁の細孔群を経て殻空間内の周囲容積中へ導入する。栄養 素流は発酵器内圧力よりも大きい圧力の下で発酵器内へ導入されるので線維群の 長手方向にそう栄養素流は外方へ流れる。製品含有流は中空線維の出口を介して 該中空線維（単数又は複数）から取出される。出口具備（製品流−含有）線維群 の内腔から製品流を取出す結果として出口具備線維の表面へ向って内部流動が起 る。かようにして入口具備（栄養素流−含有）線維からの外方への流動及び出口 具備線維へ向う内部流動、及び細胞反応器（発酵器）内部における入口具備線維 並びに出口具備線維の相互の並置は栄養素の細胞群への流れと細胞群からの製品 の流れとを達成させる対流（環流）を起し、かようにして殻空間の全体が細胞群 によって利用されると共に占拠され、その結果として発酵器は更に効果的に操業 され得ることとなる。

本発明において使用される多細孔中空線維群は膜の全体にわたって均一なしつか りした口筒構造を有する。好適な中空線維群は疎水性、親水性、正荷電又は負荷 電、中性又はそれらの組合であり得る重合性物質から構成され得る。この中空線 維は陶磁性（セラミック）又は金属性の物質をも包含し得る。一般に該線維の外 径は少くとも７５ミクロン、好ましくは約７５０ミクロンであって通常は／　！ ；００　ミクロン以下であってよい。該線維の内径は好ましくは全直径の少くと も、２ｊ％であるがこの寸法範囲は全直径のおよそり０係の太さであり得る。該 中空線維の壁厚ば／ｊミクロン以上ｓｏｏ　ミクロン以下であり得る。該線維の 例としてセラニーズ社（ＣｅｌａｎｅｓｅＣｏｍｐａｎｙ）製造によるＸ１０型 セルが−ド（ａｅ１ｇａｒｄ■）〔商標名〕長細孔性ポリグロビレン中空線維が ある。本発明に従えば各線維の一端は便宜の手段例えば熱硬化性接着剤によって 密封される。通常使用の場合にこの微生物学的反応器（発酵器）は複数の入口具 備線維と出口具備線維とを各線維単位に設けている。通常の場合に各単位に約ｊ θ〜乙００の線維群が使用され、好ましくは線維群の半数が栄養素流のために、 他の半数が製品流のために使用される。

広範囲の種類の細胞群例えば細菌、酵母、カビ及び哺乳類並びに植物の細胞群を 本発明に従って使用し得る。

該細胞群は天然存在の菌株又は系統、或は接合により若しくはその池の公知の遺 伝工学技術により修飾された菌株又は系統であり得る。発酵器内で使用される特 定の普通培地及び生育環境は培養される特別の型に依存する。

この点から環境選択は特定の型の微生物細胞育成技術分野の通常技術者によって 容易に決定され得る。

本発明の実施によって得られる生物学的製品には天然製品例えば分泌又は非分泌 のタンパク質が包含される。

例を挙げると酵素、ポリ波７″チド、ホルモン、リンフ才力イン、抗生物質、ト キ／ン、免疫グロブリン、アミノ酸、有機酸、アルコール、ケトン、アルデヒド 及び類似物である。

本発明における特に好適な態様は単発酵性乳酸菌し、デルブリュキ（ＮＲＲＬ　 Ｂｌｊｔｔａｓ　）の使用（（よる乳酸製造である。本発明に従い該菌使用によ り高生産度乳酸製造を達成し得る。し、デルブリュキの細胞塊密度としておよそ １７−００〜６００　ｇ／Ｌの達成が可能である。

本発明によるその血の利益は細胞塊の収量を減じ得ること、従って消費基質にも とづく製品最高収量の達成の利益を得ることである。これは微生物学的反応器の 制限容積内では望ましいことである。その理由は継続的細胞分裂は線維に破損を 来す個所への圧力を増加するので過剰な細胞生育に根ざす問題が存在することに ある。細胞塊収量の減少は副産物による阻害にもとづくか又は細胞溶解にもとづ いて天然に起り得るし、又は生育に関係する栄養素を培養から選択的に停止する ことにより、或は細胞群をストレス生成環境例えば高温、低度のＰＨ又は生長阻 止剤使用環境に置くことにより更に細胞塊収量が減ぜられ得る。

添付図面の第１図を参照すると発酵器は主栄養素入口（１１）と主製品出口（１ ２）とを具えるー・ウノング（１０）から成る。発酵器は栄養素流用の線維群（ １３）と製品流用の線維群（１４）との複数線維群を有する線維単位を具備して いる。線維群（１３）及び（１４）の各線維は７個の開放端と７個の密閉端とを 有し、密閉端は密封手段（１５）によって密閉され、密封手段は便宜には熱硬化 性接着剤であってよい。線維群（１３）及び（１４）は線維単位端部（複数）（ １６）にはめ込まれている。該単位は線維群（１３）及び（１４）並びに端部（ １６）を有し、発酵器内の一単位として“取替え可能である。該単位は円環密封 部（１７）及び発酵器差（１８）により発酵器内（（支持される。細胞群は、接 種口（２０）を経て発酵器の殻空間（１９）内へ導入される。細胞群（２１）は 発酵器の殻空間内で増殖し、本質的にすべての使用可能の殻空間を占拠する。微 生物学的反応器（発酵器）の操作に当り栄養素流は主栄養素入口（１１）を経て 加圧下に導入され該栄養素流は栄養素用線維群（Ｌ３）の各線維へ入る。栄養素 は線維群（１３）の長手方向にそって線維壁（複数）を通過して殻空間の中へ流 入する。細胞群（２１）は殻空間（１９）内で増殖して高維胞密度を達成し、製 品は製品用線維群（１４）へ向って流動し、主出口（１２）を経て取出される。

第２図の微生物学的製品の連続製造装置を参照するとこの装置は第１図に関する 上文記載のものと類似の単一の発酵器（３０〕を使用している。貯蔵栄養素は槽 （３１）内に保持され、該槽はチッ素通入線（３２）及び通気！（３’３）並び に（３４）の下に保持される。栄養素は線（３５）及び（３６）を介しポンプ（ ３７）及び予備濾過器（３８）を通って発酵器（３０）へ入る。

発酵器（３０）を出る製品流は監視手段（３９）により監視され、該監視手段は 製品流の品質分析のために用Ｇ・８ られる適宜の補助手段例えばＰＨを監視する。製品流の流れは通気ｆｉ！１（４ ２）を具える製品収納槽（４１）へ流入する際にこれも又流量計（４ｏ）の監視 を受ける。図示の通り予備ア過器（３８）、発酵器（３ｏ）及び分析手段（３９ ）は恒温槽（４３）内に保持され発酵器内の生育条件維持のための適温を保つ。

生物学的製品の連続的製造のための代表的操作条件はアミコン社のビタファイバ ーンエル（Ａｍｉｃｏｎ　Ｖｉｔａｆｉｂｅｒ■５ｈｅｌｌ）Ｃ９，！ｒ　ｃｍ 　Ｘ　Ｏ，乙５σ（直径）〕及びセラニーズ社のセルガード多細孔ポリプロピレ ン中空線維［：　Ｃｅ１ａｎｅｓｅ。ｅｌｇａｒｄｏｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　 ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｈ。１１゜イｆｉｂｅｒｓ　（ｔｙｐｅ　Ｘ／（ １：ｌ　、　１００　ｍ１ｃｒｏｎ　ｉｄ、／　３０ｍ１ｃｒｏｎ　ｏｄ　）　 ：）を使用する第１及び２図に関して上文に記載された装置を用いて設定され得 る。典型的な中空線維単位は７０ど、２／乙、３００又はａｏｇ個の線維群から 成る。乳酸菌Ｌ１デルブリュキ（ＮＲＲＬ　Ｂ　４Ｌ４Ｌｊ）使用の場合に発酵 器を恒温器中で典型的知は１ｌ−５℃に保つ。培地を予備濾過して線維群を妨害 する恐れのあるすべての粒子群を除去する。

Ｌ１デルプリュキ用の代表的普通培地の組成を表Ａに示す： 表　Ａ イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ　）　３Ｍｇ５○４７Ｈ２０ ０，乙 Ｍｎ５Ｏ４Ｈ２００，０３ ＦｅＳＯ４７Ｈ２００，０３ コハク酸　７７８ｇ ＮａＯＨ７３ 代表的操業の一例において中空線維発酵器を酸化エチレンで殺菌し、使用前に５ ０％ｖ　／　ｖエタノール滅菌溶液で湿潤させた。生育中の細胞群懸濁液を接種 口（複数）のうちのひとつを介して殻空間内へ注入することにより発酵器へ接種 した。Ｌ１デルブリュキの場合に供給流のＰＨは約４０が典型的であり、流出流 のＰＨを連続的に監視する。代表的な培地流速は毎時約７０〜７００〜！、２０ −の範囲内である。供給流と流出流とのグルコース含量２０を酵素化学的に、例 えば分析器（ｌｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔ　１ｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒ　ｉｅｓ　 ｍｏｄｅｌ　９　／　９　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎａｌｙｚｅｒ　）ヲ用いるグル コースオキシダーゼ　パーオキシダーゼ使用技術により測定し得る。ングマケミ カル社技報［Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｔｅｃｈｎｉｃ ａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（７，２４（ＪＶ／１２乙　ｕｖ））記載の操作に従ッ テＬｃ＋）及びＤ（−）型乳酸を酵素化学的に測定し得る。

第１及び２図に関して記載された装置を用いる代表的な操業において１０♂９． ２／乙、３００及び≠ｏＩ？個の線維群を有する線維単位を使用した場合に細胞 密度として少くとも２００ｇ細胞群ＤＷ／Ｌの高量を期待し得ることは表Ｂに示 される通りである。

表　８ 連　続　式　培　養 表面積（ｃｎＬ２）　、２ｇ　７２　９３　／２７殻側容積−３）　、２．９　 、．２．、ｒ　ノ、タ　ｘ、を乳酸最高生成率（ｇ／Ｌ／ｈ） 殻容積基準　、２９　７３　７７　２７発発酵器積（３，乙ｍう基準　、２３　 ！；７　ｇ、？、ｌり７．９−ＤＷ−ｈ　、／≠　、／３　、．２≠　、、２． ２最終細胞密度 殻容積基準、２０≠　３ｇ０３．２３−　≠ＳＯ収　量　細胞群ＤＷｇ−，り乙 士、／、、２．９乙士、３１１−Ｊｌ±、ｏｇ流　’ｆｌ　（６ｍ３／ｈ）　３ ０　／、２０　／９０　／３；０　２．２０操業偏差（ｈ）　４＃０　／４’！ ；　３１１−０　１０図面の簡単な説明 添付図面の第１図は本発明に従う有用な微生物学的反応器（発酵器）の例示であ る。第２図は本発明に従う微生物学的製品の連続的製造に使用される装置の図示 である。

１０・・・・・ウジング、１１・・・栄養素入口、１２・・・製品出口、　１３ ・・・栄養素流用の線維群、１４・・・製品流用のｍ維詳、 １５・・・密封手段、　１６・・・線維単位端部、１７・・・円環密封部、１８ ・・・発酵器差、１９・・・殻空間、２０・・・接種口、２１・・・細胞群、３ ０・・・反応器（発酵器）、３１・・・栄養素貯槽、３２・・・チッ素通入線、 ３３．３４・・・通気線、 ３５．３６・・・栄養素送給線、 ３７・・・ポンプ、　３８・・・予備濾過器、３９・・・監視（分析）手段、 ４０・・・流量計、４１・・・製品収納槽、４２−・通気線、　４３・・・恒温 槽、っ特許庁長官　業 １、事件の表示　ＰＣＴ／１Ｊｓ８３／＠　１７８□６３、Ｍ正をする者 事件との関係　出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付　昭和５９年１０月２３日■ ！ ノ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号０発　明　者　ウイルキ　チャー ルズ　アール　アメリフ　ニ ０発　明　者　ロイ　ティ　ブルース　ヴイツ　アメリフ　−８４ ツ力合衆国　カリフォルニア州　９４５３０　エルセリト　コントコスタ　ドラ イブ　１３２７ ノカ合衆国　カリフォルニア州　９４７０６　アルバニー　ナンバライリー　ド ライブ　８４８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　多細孔壁を持つ中空線維の少くとも２個を有する反応器であって、該線 維群の夫々がその一端に開放ポートを具えると共に他端に密閉ポートを具え；該 線維群の夫々の多細孔壁が該線維群の夫々の内部に無細胞域を形成し、且つ細胞 生育用栄養素含有−細胞生産製品含有−培地を透過させるけれども該反応器内の 細胞含有域中の細胞群を透過させない多細孔性障壁を形成する上記の反応器を使 用して細胞群を連続的に培養する方法において、 反応器内の栄養素含有培地の圧力よりも大きな圧力の下で該線維群の第一線維群 の開放ポートを介して無細胞域の中へ普通培地流を連続的に導入し、かようにし て第一線維の多細孔壁を通って該普通培地を細胞群含有域へ流入させ： 細胞群が栄養素を同化して製品含有−栄養素消耗−培地を該”栄養素含有培地と 混合された細胞含有域。 内で生成するようにすると共に細胞群が細胞含有域内で更に増殖するようにし； 物を連続的に取出し； かようにして細胞群への栄養素の質量移転及び細胞群から製品の質量移転を細胞 含有域内での第一線維と第二線維との夫々の間の対流によって増大させること（ ２）線維が重合性、陶磁性又は金属性物質から選ばれる請求の範囲第１項記載の 方法。 （３）細胞群が微生物、植物又は動物の細胞群から選択される請求の範囲第２項 記載の方法。 （４）細胞群が乳酸生産性細菌を包含する請求の範囲第３項記載の方法。 （５）細胞群がＬ１デルブリュキ（ＮＲＲＬＢ≠４Ｌｊ）を包含する請求の範囲 第１項記載の方法。 （６）　細胞含有域内で達成される細胞密度が、、５′Ｏ〜乙００Ｉ細胞群ＤＷ ／Ｌである請求の範囲第５項記載の方法。 （７）細胞群を培養するだめの微生物学的反応器において、細胞群と細胞育成用 の普通培地とを有するハウジング： 多細孔壁を持つ中空線維の少くとも２個、但し該線維群の夫々はその一端に開放 、ｊｅ−）を具えると共に他端て密閉ポートを具え、該線維群の夫々の多細孔壁 が該線維の内部に無細胞域を形成し、且つ細胞生育用栄養素含有−細胞生産製品 含有−培地を透過させるけれども細胞群を透過させない多細孔性障壁を形成する 上記の中空線維の少くとも一個； 第一線維群の夫々に具えられた開放ホードに連結されていて細胞生育用の栄養素 含有培地を加圧下に導入するだめの手段、及び第二線維群の夫々の開放端に連結 されていて反応器から排出される製品含有流体を収集するための手段 を具備したことを特徴とする前記の微生物学的反応器。 （８）線維が重合性、陶磁性又は金属性物質から選ばれる請求の範囲第７項記載 の反応器。 （９）細胞群が微生物、植物又は動物の細胞群から選択される請求の範囲第ｇ項 記載の反応器。 ００　中空線維群の夫々がポリオレフィンから成る請求の範囲第り項記載の反応 器。 αめ　ポリオレフィンがポリプロピレンである請求の範囲第７０項記載の反応器 。