JPS60260600A - 多孔性共重合体と蛋白質とからなる複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は多孔性共重合体と蛋白質とからなる新規な複合
体に関する。

蛋白質が種々の物質に、物理的に！着される事実は、古
来よりよく知られている９例えば、活性炭、多孔性ガラ
ス、酸性白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、
ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウ
ムゲル等の無機物やデンプン、グルテン等が挙げられる
。これらのものは、液の清澄化、微量の混入蛋白質の除
去、蛋白質の精製、分離等の目的のために、実験室規模
から工業的規模まで、広い範囲にわたって実用化されて
いる。しかし、これらの物質は蛋白質に対する特異性が
しばしば見られること、機械的強度が十分でないこと、
それに伴う装置的制約、操作性の悪さ、又場合によって
は蛋白質が分解を受けることがある等々の理由から、そ
の応用範囲は狭いのが実情である。

かかる事実をふまえて本発明者らは、汎用蛋白質吸着剤
に関する稜討を鋭意実施した結果、多孔性ポリアクリロ
ニトリル系共重合体が種々の蛋白質を多量に吸着させる
能力を有する事実を見出し、本発明を完成するに至った
のである。

即ち、本発明は、２０重量％ないし９８ｆ！量％の一般
式（Ａ） （ここにＲは、水素、アルキル基等） で表される含シアノ単量体及び２重量％ないし８０重量
％の架橋重合性単量体を含む単量体混合物を共重合して
得られる共重合体であって、平均孔径（ｄ）が４０にな
いし９０００にである多孔性共重合体と蛋白質とからな
る複合体に関するものでる。

本発明に用いる蛋白質吸着剤は、後に詳述する様に高度
の多孔構造を有しており、巾広い種類の蛋白質を多量に
吸着する能力を有しており、文化学的にも安定で蛋白質
を分解することなく、機械的強度も高いため、操作も簡
便となり工業的規模での使用も可能であるのみならず、
容易に製造出来るという極めて多くの利点を有している
。

本発明に用いる蛋白質吸着剤を構成する共重合体の構成
単位となる一般式（Ａ）で示される含シアノ単量体の具
体例としては、アクリロニトリル、メタクリロニトリル
、α−クロルアクリロニトリル、シンナムニトリル等が
ある。これら含シアノ単量体の含量は、２０ないし９８
！ｉ量％であり、好ましくは、３０ないし８５重量％で
ある。含シアノ単量体の含量は、ある量以下になると、
蛋白質の吸着量は著しく減少するので好ましくない。

上記共重合体は、含シアノ単量体と共重合可能の他の単
量体を含むことができる。これらの単量体としては、ス
チレン、メチルスチレン、エチルスチレン、ビニルナフ
タリン、ブタジェン、イソプレン、ピペリレン等の炭化
水素化合物：クロルスチレン、ブロムスチレン、Ｎ、Ｎ
−ジメチルアミノスチレン、ニトロスチレン、クロルメ
チルアミノスチレン フィド、フェニルビニルスルフィド等のビニルスルフィ
ド誘導体；アクリル酸：メタクリル酸ニアクリル酸メチ
ル、アクリル酸クロルメチル等のアクリル酸エステル：
メタクリル酸シクわヘキシル：メタクリル酸ジメチルア
ミノエチル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸テ
トラヒドロフルフリル、メタクリル酸ヒドロキシエチル
等のメタクリル酸エステル：メチルビニルケトン、エチ
ルイソプロペニルケトン等のビニルケトン：塩化ビニリ
デン、臭化ビニリデン等のビニリデン化合物ニアクリル
アミド、トブトキシメチルアクリルアミド、に、トジメ
チルアミノエチルアクリルアミド等のアクリルアミド誘
導体：酢酸ビニル、カプリン酸ビニル等の脂肪酸ビニル
誘導体：チオアクリル酸メチル、チオ酢酸ビニル等のチ
オ脂肪酸誘導体：さらに、Ｎ−ビニルスクシンイミド、
トビニルピロリドン、Ｎ−ビニルフタルイミド、Ｎ−ビ
ニルカルバゾール、ビニルフラン、ビニルチアゾール、
メチルビニルイミダゾール、ビニルピラゾール、ビニル
オキサゾリドン、ビニルチアゾール、ビニルピリジン、
メチルビニルピリジン、２．４−ジメチル−６−ビニル
トリアジン等の異部環状ビニル化合物がある。

本発明に用いる共重合体の構成単位となる架橋重合性単
量体としては、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、
ジビニルキシレン、ジビニルナフタリン、ジビニルエチ
ルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルジフェニル
、ジビニルジベンジル、ジビニルフェニルエーテル、ジ
ビニルジフェニルアミン、ジビニルスルホン、ジビニル
ケトン、ジビニルピリジン、ジビニルキノリン、フタル
酸ジアリル、マレイン酸ジアリル、フマル酸ジアリル、
炭酸ジアリル、シュウ酸ジアリル、アジピン酸ジアリル
、酒石酸ジアリル、ジアリルアミン、トリアリルアミン
、リン酸トリアリル、トリカルバリル酸トリアリル、Ｎ
．Ｎ’−エチレンジアクリルアミド、ｎ：　Ｎ′−メチ
レンジメタクリルアミド、工チレングリコールジメタク
リレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエ
リスリトールテトラメタクリレート、１，３−ブチレン
グリコールジアクリレート、トリメチルプロパントリア
クリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート
、トリアリルイソシアヌレート、１．３．５−トリアク
リロイルへキサヒドロ−１，３，５−）リアジン、ジア
リールメラミン等が含まれる。架橋重合性単量体の含量
は、ｚｉｉ量％ないし８０重量％であり、好ましくは５
重量％ないし７０１量％、さらに好ましくは８重量％な
いし６０重量％である。架橋重合性単量体の含量が低（
すぎると膨清収縮度が大きくなり機械的強度が低下する
。又、架橋度が増加しすぎると、蛋白質の吸着の場を与
える微少孔が形成されにくくなったり、共重合体内への
液の拡散速度の低下がみられる。

本発明に用いる蛋白質吸着剤を構成する共重合体は、平
均孔径が４０人〜９０００人の範囲内にある多数の孔を
有する構造体であるが、その平均孔径は５０λ〜４００
０　人の範囲にあるものがより好ましく、６０λ〜２５
００５．の範囲にあればさらに好ましい。平均孔径が小
さすぎると孔内に蛋白質が侵入吸着出来なくなったり、
拡散速度の著しい低下をみたりするために不都合であり
、孔径が大きすぎると吸着に寄与する表面積が小さくな
ることや機械的強度が低下する等の欠点が生じてくる。

その孔径分布も蛋白質吸着能に関して重要な因子であり
、平均孔径をａとする時、孔径が０．５ｄ以上２ｄ未満
である孔の体積が全孔量の６０％以下、好ましくは５０
％以下であるのが望ましい。この値の下限には特に制限
はないが、平均孔径付近の孔が最も多い故必然的に２０
％以上となるが、一般的には３０％である。このように
広い孔径分布を有する多孔を含む共重合体は、後に述べ
る如（、特に大きな蛋白質吸着能を有するものとなる。

さらに、乳量も蛋白質吸着能に重要な関係がある。即ち
、全単量体に対する架橋重合性単量体の重量分率をＸ％
とする時、乾燥重合体１ｇ当たりの全気孔量がｏ、ｏｓ
、／ｒ　１１１以上１．臥／Ｙ＋＋＋を以下であること
が好ましく、さらにｏ、ｔｉ　ｍ１以上１．３五ｍｌ以
下であることが望ましい、乳量が少なすぎると十分な吸
着表面を提供することが出来ず、又過大な乳量は、共重
合体の機械的強度を低下させるのみならず、単位体積の
共重合体当たりの吸着量を却って低下させる。

次に、本発明で採用した多孔特性の測定法について述べ
る。

平均孔径、孔径分布、乳量比表面積の測定法は、水銀圧
入式ポロシメーターによった。この方法は多孔性物質に
水銀を圧入していき、侵入した水銀量から気孔量をめる
とともに、細孔の直径とその孔に水銀を圧入するに要す
る圧力は反比例するという原理に基づいて孔径を測定す
るものでる。

この方法の詳細は、放置ファイン・パーティクル・メジ
ャラメント（Ｆｉｎｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｍｅａｓｕ
ｒｅ＋５ｅｎｔ　）クライト・オア・ジュニア及びジエ
・エム・ダアラアバアル（Ｃ１ｙｄｅ、　Ｏｒｒ、　Ｊ
ｒ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍ、　Ｄａｌｌａｖａｌｌｅ）共著
、ザ・マクミラン・カンバニイ、二ニー・ヨーク（Ｔｈ
ｅ　Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｃｏｓ＋ｐａｎｙ＋　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ　）１９５９に記載されている。この方法で
は、３５〜４０Ａまでの孔を測定することが可能である
０本発明において、孔とはその孔径が４０Å以上の表面
からの連通孔と定義し、乳量、表面積もその孔に由来す
る値である。又、平均孔径は、ｄＶ／ｄｌｏｇｒの値が
最大値となるｒの値と定義する。ここでｒは孔径、■は
ポロシメーターで測定した累積気孔量である。もう一つ
の多孔性の指標となる値は、カサ比重である０発明者等
は、次の方法でカサ比重を測定した。即ち、まずガラス
フィルター付きカラムに樹脂を充填して水を十分流し、
その時の樹脂が充填されている部分のカラムの体積をめ
る。

その後試料を十分乾燥して重量を測定し、両者の値から
カサ比重を計算した。

次に、本発明に用いる吸着剤共重合体の製造法について
述べる０本発明者の一部は、既に高度に多孔性の架橋重
合体の製造方法を見出しているが、本発明に用いる多孔
共重合体の製造にもこの技術を用いることが出来る。

その一つの方法は、共重合性単量体の混合物であって、
その内の２重量％以上が架橋重合性単量体である混合物
を、該混合物中の少なくとも一種の単量体の単独重合体
には親和性であり、且つ少なくとも一種の他の単量体の
単独重合体には非親和性であり、しかも単量体混合物を
溶解し且つ各単量体とは反応しない単一液体の存在下で
共重合させて共重合体を得、次いで該共重合体の内部よ
り前記液体及び未反応単量体を除去することを特徴とし
ており、もう一つは、共重合性単量体の混合物であって
、その内の２重量％以上が架橋重合性単量体である混合
物を、該混合物中の少なくとも一種の単量体の単独重合
体に親和性で、しかも単量体混合物を溶解し且つ各単量
体とは反応しない液体と、該混合物中の少なくとも一種
の単量体の単独重合体に非親和性で、しかも各単量体を
溶解し且つ各単量体とは反応しない液体とからなる混合
液体の存在下で共重合させて共重合体を形成させ、その
後該共重合体の内部より前記の混合液体及び未反応単量
体を除去することを特徴とする方法である。

この方法をさらに今ＡＳＢ二種のモノマーの共重合によ
り共重合物を合成する場合について具体的に述べるなら
ば、有機液体を以下の様に分類する時、次の（１）から
（４）の組み合わせの液体を、単量体混合物と混合し、
共重合反応を行うことにより多孔性構造を得ることがで
きる。即ち、（１）少なくとも１種の液体Ｘ （２）少なくとも１種の液体Ｘと、少なくとも１種の液
体Ｙの混合物 （３）少なくとも１種の液体Ｘと、少なくとも１種の液
体Ｚの混合物 （４）少なくとも１種の液体Ｙと、少なくとも１種の液
体２の混合物 ここで、液体ｘ、ｙＳｚとはそれぞれ次の性質を有する
ものである。

液体Ｘ：ポリマーＡ（モノマーＡの単独重合体）とポリ
マーＢのいずれか一方に親和性があり、他には親和性の
ない液体 液体Ｙ：ポリマーＡ、ポリマーＢに対し共に親和性を示
す液体 液体Ｚ：ポリマーＡ１ポリマーＢいずれに対しても親和
性を示さない液体 なおここでは、ある単量体の線状重合体で平均分子量が
１ｏｏｏｏ以上のものがある液体に１％以上溶解する場
合、該液体は該重合体に対して親和性があると定義する
。架橋重合性単量体の場合には、単量体５部、アゾビス
イソブチロニトリル０．１部液体１００部からなる混合
物をガラス管に封入し、行わうとする重合反応と同じ温
度、時間スケジュールで加熱する。生成物が透明である
場合、該単量体の重合体は該液体に親和性があると定義
する。

以上の様に、（１１ないしく４）の方法で多孔性架橋共
重合体を容易に合成することが可能であるが、本発明で
開示されている共重合体を得るには、特に（２）ないし
く４）の方法が適している。即ち、これらの方法では共
重合体に対し親和的である液体と非親和的である液体の
混合物の共存下、共重合反応を行うこととなる。その結
果中広い孔径分布の共重合体が得られるからである。又
この様に溶解性の異なる二種の液体を用いる場合には、
その混合比を変えることにより、生成する共重合体の孔
径を連続的に変化させることが可能となる。効果的な多
孔性構造の設計のためには架橋性単量体の全単量体に対
する割合が増加するにつれ加える有機液体の量を増加さ
せることが必要である。即ち、全単量体に対する全液体
の重量％をＤ、全単量体に対する架橋重合性単量体の重
量％をＸとする時、式１０１°’１Ｍ　＜　Ｄ　＜　１
ｃ？”ｙ　を満足することが好ましく、式　ｒｄ”ｆ　
＜　Ｄ＜　１０”’５　を満足することが更に好ましい
。多孔性共重合体の気孔量は基本的には、加える液体の
相対量によって決められる。

次に、さらに具体的な場合について用いられる液体名を
列挙する。

アクリロニトリル−ジビニルベンゼン−エチルスチレン
の共重合においては、液体Ｙとしてジメチルホルムアミ
ド、Ｎ−メチルアセトアミド、ニトロメタン、ジメチル
スルホキシド、ベンゾニトリル、Ｔ−ブチロラクトン、
Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトフヱノン等、液
体Ｘとしては、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、
テトラリン等芳香族炭化水素、シクロヘキサノン、アニ
ソール、クロルベンゼン、ジクロルベンゼン、安息香酸
メチル、安息香酸エチル、ベンジルアルコール、二塩化
メチレン、クロロホルム、ジオキサン等が、液体２とし
ては、ヘプタン、デカリン等の脂肪族炭化水素、ｎ−ブ
タノール、シクロヘキサノール、イソオクチルアルコー
ル等脂肪族アルコール、酢酸アミル、フタル酸ジブチル
、フタル酸ジオクチル等が挙げられる。

アクリロニトリル−エチレングリコールジメタクリレー
トの共重合においては、液体Ｙとしてジメチルホルムア
ミド、ジメチルスルホキシド、Ｔ−ブチロラクトン、Ｎ
、Ｎ−ジメチルアセトアミド等が、液体Ｘとしては、ト
ルエン、メチルエチルケトン、ジオキサン、シクロヘキ
サノン、塩化メチレン、クロルベンゼン等が、液体Ｚと
しては、ヘプタン、オクタン、ｎ−ブタノール、イソプ
ロパツール等から選ぶことが出来る。

メタクリロニトリルージビニルベンゼンーエチルビニル
ベンゼンから共重合体を合成するに際して用いるべき液
体の例は、液体Ｙとして、ピリジン、ニトロメタン、ベ
ンゾニトリル、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン
、γ−ブチロラクトン等が、液体Ｘとしては、トルエン
、エチルベンゼン、テトラリン、酢酸ブチル、プロピオ
ン酸エチル等が、液体Ｚとしては、ヘプタン、ブタノー
ル、イソオクタツール、シクロへ革すノール、フタル酸
ジオクチル等がある。以上は一例にすぎず、溶解性を調
べる事により中広（種々の液体を用いることが可能であ
る。

本発明における共重合体を得るための重合方法は、ラジ
カル重合、イオン重合を問わないが、一般にはラジカル
開始剤を単量体液体混合物に溶解して加熱することによ
り重合を行うことが推奨される。適当なラジカル開始剤
としては、液体と単量体の混合物に溶解し、反応温度で
分解が起こるラジカル開始剤から選ばれ、その例として
は過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル等の過酸化アシ
ル類、アゾビスイソブチロニトリル、２，２”−アゾビ
ス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾニトリ
ル類、過酸化ジターシャリ−ブチル、過酸化ジクミル、
メチルエチルケトンパーオキシド等の過酸化物、クメン
ヒドロペルオキシド、ターシャリ−ヒドロペルオキシド
等のヒドロペルオキシド類がある。反応温度は１０℃な
いし２００℃、好ましくは、２０℃ないし１５０℃、さ
らに好ましくは、３０℃ないし１００℃であるが、アク
リロニトリルを含むモノマーを開放系で重合する場合に
はアクリロニトリルの沸点が低いため重合温度を低くす
る必要がある。そのため、重合開始剤の一部又は全部に
低温分解型の開始剤を用いることが望ましい。

例えば、２．２′〜アゾビス（２，４−ジメチルバレロ
ニトリル）　、２．２’−アゾビス（４−メトキシ−２
，４−ジメチルバレロニトリル）、過吉草酸ターシャリ
ーブチル、ペルオキソ炭酸ジイソブチル等が適当である
。

本発明で用いる共重合体を合成する場合の好ましい重合
法の一つは、水中での懸濁重合であり、この場合は、粒
状樹脂を容易に得ることが出来る。

アクリロニトリルは水に若干の熔解性を示すが、水に不
溶性の液体や単量体を加えると水への溶解度は著しく減
少する。

しかし、水溶性の有機液体を添加して重合を行う場合に
は、懸濁重合法は採用出来ず、溶液重合により塊状物を
得て、それを適当な粒度に粉砕して用いる方法をとるべ
きである。

本発明で用いられる懸濁剤としｆは、澱粉、トラガント
ゴム、ゼラチン等の天然高分子物質：ヒドロキシエチル
セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロース等の加ヱ天然高分子物質：ポリアクリル酸：ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、一部分ケ７
．１４ヒされたポリ酢酸ビニル等の水溶性合成高分子物
質：硫酸バリウム、タルク、ヒドロキシアパタイト、ベ
ントナイト、無水ケイ酸、炭酸カルシウム等の無機物が
用いられる。

又、アクリロニトリルを用いる場合はその若干の水溶性
を抑制する意味から、塩化ナトリウム、塩化カルシウム
等の無機塩を懸濁液に添加することは広く推奨される。

以上が代表的な製造法であるが、この様な方法で得られ
た含シアノ多孔性架橋共重合体は、蛋白質吸着剤として
極めて優れた性質を有していることが明らかとなった。

以下順次説明を行う。

■本発明で用いられる共重合体は、任意に調節可能な多
種の多孔構造を包含している。即ち、平均孔径は４０人
〜９０００　人の範囲で任意の値をとり得るし、孔径分
布も任意に広くとり得る。孔径分布は成る程度広いのが
望ましい。即ち、概念的に言って、被吸着物質が速やか
に共重合体内部にまで浸透して行くためのチャンネルの
役割を果たす大孔径の孔と、表面又はチャンネルから分
岐して存在して吸着座席を提供する多数の小孔径の孔の
二種類の孔の存在が望ましく、このような場合、成る程
度広い孔径分布となるからである。

又、被吸着蛋白質の大きさによって、最適の平均孔径と
云うものが存在することが見出される。

例えば、実施例１〜５で用いた蛋白質では、分子量が約
８万以下のものは２ｏｏ′Ａの平均孔径を有する共重合
体に最も吸着されやすいのに対し、分子量が約１０万以
上の蛋白質は１２００Åの平均孔径の共重合体への吸着
量が大きいことを示唆している。この結果は、蛋白質が
大きい程、拡散するに必要なチャンネルや吸着座席を提
供する孔の孔径は大きい必要があることを教えている。

即ち、目的とする被吸着蛋白質の大きさ、形状によって
適切な孔特性を設計することによって効果的な多孔構造
を得ることが出来、場合によっては、複数の蛋白質の中
からある種の蛋白質のみを選択的に吸着させることも可
能となる。

又、一般に乳量が少なくなるにつれて、蛋白質の吸着量
は減少する。吸着量と乳量との関係は、蛋白質の種類に
依存しているので一般的な記載は出来ないが、その−例
を実施例１４に示す。本発明においては、架橋度（Ｘ）
が増加するにつれて気孔量を増加させることが好ましい
ことは既に示唆したが、一般に架橋度が増加するに従っ
て三次元構造が密になり蛋白質の吸着座席を提供する細
孔が形成しにくくなるため合成時に添加する液体を増加
させて気孔量を増大させることが推奨される駅である。

■本発明で用いる共重合体の他の特長は、その良好な親
水性にある。

蛋白質の処理は殆ど水溶液で行われるので、吸着性樹脂
は水に不溶性で且つ親水性である必要がある。一般に重
合により親水性吸着剤を合成するには、重合後視水性基
を導入するか、もしくは親水性モノーマを一成分として
共重合することが必要である。後者の方法を用いる場合
は、モノマーが親水性であることが多いので懸濁重合に
より粒状共重合体を製造することが困難な場合がしばし
ばある。それに対し、アクリロニトリル類は水にさほど
溶解しないので懸濁重合を行うことが出来、゛シアノ基
の強い極性のため、相当量の非親水性モノマーを含む場
合にも、生成した共重合体は良好な親水性を示すことが
明らかとなった。前者の後反応により親水性基を導入す
る方式に比して本発明共重合体の製造は一回の重合工程
及び洗浄工程のみで構成されており非常に簡単であるの
みならず、後反応の反応率のバラツキによる性能の再現
性の低下といった問題も生じない。

■本発明で用いる共重合体は物理的強度が大きい特長を
有している。従来、蛋白質の分離精製や固定化の担体と
して澱粉、セルローズ、デキストラン等を出発原料とし
たポリマーが汎用されている。デキストランの架橋体で
あるセファデックスや架橋アガロースのセファローズＡ
（その代表例であるが、これらの天然物から得られる担
体は膨潤度が太き（、又機械的強度が劣るため、大規模
に使用することが困難となる。”これに如し、本発明で
用いる共重合体は三次元架橋重合体特有の大きな機械的
強度を有しており、カラム内に充填してクロマトグラフ
を行う時に有利である。

■吸着剤の形状としては、吸着性能の点や強度的な面か
らも又溶液を流通させる時の抵抗といった面からも球状
のものが最も好ましいことは周知であるが、本発明の共
重合体は水中で懸濁重合をすれば、容易に球状に製造す
ることが出来る。

■吸着性樹脂の好ましい条件の一つに、不活性でかつ広
いｐＨの範囲で使用が可能であることが挙げられるが、
ポリアクリロニトリルやポリジビニルベンゼン等は、こ
の条件を満足するため、特に反応性の高い七ツマ−を加
えない限り、本発明の共重合体はこの条件を満足する。

汎用の無機吸着剤である活性アルミナやシリカゲルが時
として被吸着物を分解することがあるのに対して、本発
明の共重合体は巾広い条件で巾広い基質に対して使用出
来る長所を有している。

■本発明で用いる共重合体は、種々の蛋白質を極めて多
量に吸着する能力を有していることが明らかとなった。

即ち、分子量１０００程度のペプチドから、分子量数１
０万の高分子量蛋白質まで乾燥共重合体１ｇ当たり１０
０ａ＋ｇ前後と云う極めて高い吸着量が記録されたこと
が実施例から明らかである。更に、分子量のみならず、
蛋白質を特徴づけるための重要な因子とされている等重
点も本発明に用いる共重合体による蛋白質の吸着には全
く影響を与えず、例えば実施例１〜５には、等電点４．
７〜１０．４の広範囲にわたって、高い蛋白吸着量を有
していることが示されている。

又、本発明で用いる共重合体は一般の単純な蛋白質のみ
ならず、酵素に対しても高い吸着能を示すことも明らか
になった。

■さらに本発明で用いる共重合体は、反復使用が可能！
あり、その性能が長時間維持され劣化が少ないと云う実
用上の大きな特長を有している。

以上述べた様な多くの特長を有する為、本発明に用いる
共重合体からなる蛋白質吸着剤は次に記す様な種々の用
途に用いることが出来た。

（１）蛋白質の精製・分離 本発明に用いる吸着剤は、蛋白質に対して極めて優れた
選択吸着性を有することから、水性媒体中に含まれる蛋
白質を、効率的かつ選択的に吸着することが可能であり
、換言すれば、糖質、ビタミン類、色素類、無機塩類、
金属化合物、界面活性剤等の水溶性物質と共存している
蛋白質を分離することが出来る。

本発明における吸着剤を用いての蛋白質溶液よりの蛋白
質の吸着操作はｐＨ１ないし１１の範囲で行うことがで
きるが、吸着に好適なｐＨは蛋白質の種類によって選ば
れる。又有機性溶液、例えば７０％アルコール溶液中の
ツエインなどに対しても適用することができる。

吸着時の温度は２℃ないし５０℃が用いられるが、室温
付近特に２０℃ないし４０℃が好ましい。

吸着操作は蛋白質溶液に本発明で用いる吸着剤を添加す
ることににって行われ、必要ならば攪拌又は振とうする
ことによって吸着をより容易にし、吸着時間を短縮する
ことが出来る。又吸着剤をカラム或いは濾過器上につめ
、蛋白“質墳液を流すことによって吸着させることもで
きる。

吸着時間は蛋白質溶液の状態、濃度、吸着の方法、温度
等によって異なる適切な時間を選ぶことができる。

近年蛋白質の工業的応用技術が重要な新技術として多方
面で研究されており、このような機能的にあらゆる面か
ら革新的な吸着方法の開発は工業的に極めて重要な寄与
をなすものでありその応用範囲は極めて広い。

又、現在実験室規模の天然有機化合物の分離、精製法の
代表例である吸着クロマトグラフィーは、被分離物質、
吸着剤、溶媒分子相互間の吸着力の差を利用しているが
、現在使用されている吸着剤としては、活性炭、アルミ
ナ、シリカ、リン酸カルシウ＾、ケイ酸マグネシウム等
の無機物か用いられている。これらの無機吸着剤ば比べ
、本発明に用いる吸着剤は、良好な球状のものを得るこ
とが出来、又機械的強度も大きく、繰り返しの使用も可
能であるため、大規模の吸着クロ゛マドグラフィーを実
施することも可能であることや、無機吸着体においてし
ばしば遭遇する、被分離物質を分解する性質を有してい
ないため、特に不安定な蛋白質の取扱が出来ると云う利
点を有している等の理由から吸着クロマトグラフィー用
担体として利用することが出来る。又、すでに述べた様
な孔径と蛋白質の吸着量の関係を利用して、さらに選択
的な蛋白質の分離が可能となる。

さらに一方では本発明で用いる吸着剤に吸着された蛋白
質は酸性または塩基性に調整された水溶液、各種塩類溶
液、温水、又はメタノール、エタノール、アセトン等の
水と混和し得る有機溶媒を含む水等から適切に選ばれた
水性溶媒により効率良く溶出することが可能であり、溶
出の方法は溶出される蛋白質の種類、用途により適宜組
み合わせればよい。

（２）固定化酵素等の担体 生体内には特異的な相互作用を示す一対の物質が多く存
在する。酵素と基質、酵素と阻害剤、抗原と抗体等はそ
の代表的な例である。これらの組合わせで一つの複合体
が形成され。この複合体が非常に安定な場合もあれば、
中間体として存在するのみで直ちに反応分解をする場合
もある。酵素−基質複合体は後者の場合に対応する。こ
れらの化合物の中には蛋白質であるものが多いが、それ
らを本発明で用いる吸着剤に吸着固定することにより種
々の用途に使用することが出来る。

酵素を水不溶性担体に固定させたものは固定化酵素とし
てよく知られている。化学結合法とは異なり、従来物理
的吸着法による固定化酵素の製造方法は、酵素の変性が
殆ど起こらずかつ酵素を補充しながら連続使用が可能で
あると云う大きな利点を有しながら、その吸着力が弱く
、吸着量が少ないため実用化が遅れていた。

一方、本発明で用いる吸着剤の蛋白吸着量は、１ｇの蒐
燥体当たり１００＋ｗｇ以上の成績を示しており、又一
旦吸着された酵素等は、薫溜水、脱イオン水、水道水に
よって殆ど溶離されないので、酵素を吸着させた状態で
酵素反応に使用することも可能である。

又、アフィニティークロマトグラフィーは、担体に生理
活性物質を固定し、それとの相互作用を利用して（ｔの
生理活性物質を分離すると云う原理に基′づく方法で、
近年非常に注目を集めているものであるが、この目的の
ための担体としても本発明における吸着剤を使用するこ
とが可能である。

吸着剤に吸着固定される蛋白質としては、酵素、抗原、
抗体等が代表的なものである。なおこれらの蛋白質を吸
着させる際に、蛋白質の架橋剤として知られるグルタル
アルデヒド等の二官能性反応試薬を用いることは本発明
の方法を何ら妨害することがないばかりでなく、吸着体
と蛋白質同士の結合を一層強め、その適用範囲を拡大す
ることが出来る。

次に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、これ
により本発明の範囲が制限されるものではない。

参考例１ 還流冷却器、ステンレススチール製二枚羽攪拌器、温度
針を備えた３ｊ！の三ロフラスコに蒸溜したばかりのア
クリロニトリル５５ｇ１ジビニルベンゼン（純度５６％
、不純物として４４％のビニルエチルベンゼンを含む、
以下５６％ジビニルベンゼンと記す）　４５ｇ　、アセ
トフェノン１３０ｇ、デカリン１２０ｇ。

アゾビスイソブチロニトリル１　ｇ　、２＋２’−アゾ
ビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）　１　ｇ　
ヲ加ｔ、均一溶液にする。さらに部分ケン化ポリビニル
アルコール（粘度２３ｃｐｓ　、ケン化度８８％）　６
．２５ｇ　。

塩化ナトリウム１２．５ｇを熔解した蒸溜水１２７０ｇ
を加え、３００ｒｐｍの回転数で攪拌を行いながら、４
５℃で１時間、５０℃で２時間、６０℃で２時間、さら
に７０℃で４時間加熱した。反応中一定時間毎に反応混
合物をサンプリングしてそのベンゼン抽出物をガスクロ
マトグラフにより分析して、残存単量体を定量し重合率
を測定したところ、上記の条件で９８％以上の重合率で
あることが確認された。なおアクリロニトリルは沸点が
低いたあ還流冷却器は内部に冷水を流通させる等して効
率を高める必要がある。生成した共重合体は良好な球状
をしており直径６０〜１２０μの範囲にあった。ｉを用
いて湿式分級を行った後、メタノールで未反応単量体、
液体等を除去した。その一部をとり減圧下６０℃で１８
時間乾燥しポロシメーター用の試料とした。残りの共重
合体は十分水洗を繰り返した。

このもののカサ比重は０．２１、平均孔径１２００Ｘ、
気孔率２．２８ｍ１／ｇ　、表面積２２０ｒｒｒ／ｇと
測定された。又、孔径が６００８から２４００にの間の
乳量は０．８７ｍ１／ｇであった。以下これをＲ−１と
称する。

参考例２ アセトフェノンとデカリンの添加量がそれぞれ２００ｇ
、５０ｇである以外は、参考例１と全く同様の方法で粒
状共重合体を得た。その粒径範囲は８０〜１４０μ、カ
サ比重は０．２５、平均孔径は２０ＯＮ、気孔量は１．
８３ｍ１／ｇ　、又１００＾から４ｏｏ′Ａまでの乳量
は０゜８６ｍ１／ｇ　、表面積は３２０　ｒｒｒ／ｇと
測定された。以下これをＲ−２と呼ぶ。

参考例３ アセトフェノンとデカリンの混合液体の代りにベンゾニ
トリル２５０ｇを添加した以外は、参考例１と全（同様
の方法で粒状共重合体を得た。その粒径範囲は７０〜１
５０μ、カサ比重は０．２８、平均孔径ハ８０１！、　
気孔１ハ１．１８ｍ１／ｇ　、４０　Ｘすし）　ｔ、１
ｓｏＸの孔に基づく乳量は０．５０ｍ１／ｇ　、表面積
は２７０Ｍ／ｇと測定された。以下これをＲ−３と呼ぶ
。

比較参考例１ 参考例１と同様の装置にアクリロニトリル１１０ｇ、５
６％ジビニルベンゼン９０ｇ、アゾビスイソブチロニト
リル２ｇ　、２．２’−アゾビス＝　（２，４−ジメチ
ルバレロニトリル）２ｇを加え、さらに参考例１と同じ
部分ケン化ポリビニルアルコール５ｇ、塩化ナトリウム
１５ｇを溶解した純水１０００ｇを加え、３５０　ｒｐ
ｍの回転数で攪拌を行いながら、参考例１と同じ温度ス
ケジュールで重合を行った後、同様な後処理を行った。

重合率は９７％であった。又、カサ比重は０．６２と測
定された。ポロシメーターによる多孔構造の測定では孔
は存在しないことが確認された。以下、このものをｃ−
ｉＬ呼ぶ。

参考例４ 液体としてアセトフェノン１００　ｇ−デカリン５０ｇ
を用いる以外は参考例１と全く同し方法で共重合体を製
造した。粒径１００〜１８０μ、カサ比重は０．３１、
平均孔径１１００　Ｋ、気孔量０．９７ｍ１／ｇ　、５
５０Ｘ〜２２００ｈの孔に基づく乳量は０．４０ｍ１／
ｇ　、表面積は１７０　ｒｄ／ｇ　、以下これをＲ−４
と呼ぶ。

参考例５ 参考例１で用いたフラスコに、ヒドロキシアパタイト１
０ｇ１ヒドロキシエチルセルロース１０ｇ、塩化カルシ
ウム２０ｇ、蒸溜水２０００　ｊｌ！を加え、７０℃で
攪拌し溶液を均一にした後、液温を３０℃に下げる。こ
の水溶液を３０Ｏｒｐｍで攪拌しながらその中にアクリ
ロニトリル５０ｇ１エチレングリコールジメタクリレー
ト１０ｇ、スチレン４０ｇ１クロルベンゼン３００ｇ、
過吉草酸ターシャリーブチル０．２５ｇ　、過酸化ベン
ゾイル０．７５ｇの均一溶液を一気に加えた。

３０℃で３０分、４０℃で１時間、５０℃で２時間、６
０℃で２時間、さらに７０℃で２時間、８０℃で２時間
反応を行う。十分な洗浄後得られた共重合体の性能は次
の通りであた。粒径９０〜２６０μ、平均孔径５０ｏ′
Ａ、気孔量２．０２ｍ１／ｇ　、　２５０〜１０００＾
の孔に基づく気孔量は１．０３ｍ１／ｇ　、表面積２６
０　ｒｄ／ｇ　、以下この重合体をＲ−５と呼ぶ。

参考例６ 参考例１と同じフラスコに、メタクリロニトリル５０ｇ
　、Ｍ度８０％のジビニルベンゼン５０ｇ、エチルベン
ゼン２００ｇ、イソオクタツール１００ｇ、過酸化ラウ
ロイル１ｇの混合溶液を入れ、別に調製した懸濁液（２
％の水溶液の粘度が１００　ｃｐｓのメチルセルロース
８ｇ、食塩４８ｇの水溶液１６５０ｇ　）を加えて２０
０ｒｐｍの速度で攪拌をしながら、６０℃で１時間、７
５℃で４時間、さらに９０℃で３時間加熱を続けた。洗
浄後の共重合体は次の構造を有していた。

粒径１５０〜２５０μ、カサ比重０．２０、平均孔径３
０００λ、全気孔量２．６８ｍ１／ｇ　、孔径ｔ５ｏｏ
１１から６０００１ｔの気孔量は１．０５ｍ１／ｇ　、
表面積は１９０　ｒｄ／ｇ　、このものを以下Ｒ−６と
称する。

参考例７ １００ｍ１の耐圧ガラス容器内にアクリロニトリル２０
ｇ　、　Ｎ、Ｎ’−エチレンジアクリルアミド５ｇ、２
゜２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）
０゜２ｇ、ジメチルホルムアミド３０ｇ　、）ルエン２
０ｇを加え封じた後、溶液を均一にし、４０℃で２時間
、６０℃で４時間、さらに８０℃で２時間加熱を続ける
。

封管を冷却後破壊し、共重合体を取り出した。これを粉
砕し、８０〜２００メソシユの篩で湿式分級した後、十
分量のアセトンで洗浄して添加液体を除去した。得られ
た共重合体はポロシメーターによって、次の構造を有し
ていることが分かった。カサ比重０．２６、平均孔径８
０〇八、気孔量１．６５ｍ１／ｇ、孔径が４００″ｈり
よ１６００″Ａまでの孔に由来する乳量は０．７３ｎ＋
１／ｇ　、表面積２２５　ｒｄ／ｇ　。

実施例１ 表１に示した蛋白質を各々３０ｍｇ含む水溶液１０ｍ１
にそれぞれ０．５ｇの湿潤共重合体（Ｒ−１）を入れ、
３０℃にて３時間振とうした。遠心分離にて沈降物を除
去した後、上澄液中の蛋白質濃度をローリイ等の方法（
Ｌｏｗｒｙ＋０．Ｈ，ｅｔ　ａｌ＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　ＣｈｅＩｌｌ、＋１９３Ｓ２６５頁、１９５１年）で
測定し共重合体（Ｒ−１）を入れない系の値との差を吸
着量とした。ウレアーゼ、カタラーゼ、α−キモトリプ
シン、ペプシンについては上澄液中の残存酵素活性も併
せて測定した。

又、共重合体に吸着された酵素についてもその力価を通
常の方法によって測定し犬。

結果はまとめて表１に示した。なお、蛋白質吸着量は、
乾燥共重合体１ｇ当たり吸着した蛋白質の重量で示した
。

ウレアーゼの活性測定はデー・デー・パンスリーク　（
Ｄ、Ｄ、Ｖａｎｓｌｙｋｅ）らの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
　、Ｃｈｅｍ、　＋　１５４巻、６２３頁、１９４４年
）、タカラーゼはエイチ・ニー・ベルグマイヤ−（Ｈ，
Ｕ、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　）の方法（ＢｉｏｃｈｅＴ＠
、　Ｚ、＋３２７巻、２５５頁、１９５５年）、α−キ
モトリプシンはジ・ダブリュ・シュベルト（Ｇ。

Ｗ、Ｓｃｈｗｅｒｔ　）らの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ、、１６ｔ！、５７０頁、
１９５５年）、ペプシンはエル・エム・バーカー（Ｌ、
Ｍ、Ｂａｋｅｒ　）らの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅａ
＋、＋　２１１巻、７０１頁、１９５４年）でそれぞれ
行った。

実施例２ 実施例１に示したと同様の方法で、トリプシン（分子量
２万、等電点１０．０）を吸”着させた共重合体の蛋白
質吸着量は１３０ｍｇ　、上澄中の残存酵素は４５％で
あった。この共重合体と蛋白質の複合体をカラムに充填
し、基質ベンゾイルアルギニンエチルエステル塩酸塩の
０．０５Ｍ　ｌ−リス・バフファー溶液（３４ｇ／Ｊ、
ｐＨ８，０）を５Ｖ＝２（７）流速で流した。

その相対活性は９６時間後７０％であった。

なおトリプシンの活性測定はジー・ダブリュー・シュベ
ルト（Ｇ、Ｗ、Ｓｃｈｗｅｒｔ　）等の方法によった（
Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、、
　１６巻、５７０頁、１９５５年）。

実施例３・比較例１ 実施例１に示したと同様の方法で表１に示した蛋白質及
びトリプシンのＲ−２、Ｒ−３に対する吸着量を測定し
た。その結果を表２に示す。

なお、比較のために非多孔性樹脂Ｃ−１への吸着量を表
２に併記する。

表２ 実施例４ 実施例１に示したと同様の方法で表３に示す蛋白質を吸
着させた共重合体Ｒ−１をカラムに充填し、Ｒ−１の３
倍容の水で水洗後、５倍容の溶出剤で吸着蛋白質を溶出
した。結果をまとめて表３に示す。

表３ 実施例５、比較例２ 実施例１に示した方法と同様に、表３に示す蛋白質の共
重合体Ｒ−２、Ｒ−３に対する吸着量を測定した。結果
を表４にまとめる。さらに比較例としてＣ−１に対する
吸着量も併せて載せた。

実施例６ ６．７のトリプシン吸着量をめた。結果シよそれぞれ乾
燥樹脂１ｇ当たり８０ｍｇ、１２０ｍｇ　、１００１１
ｇ−。

１５０　ｍｇであった。

特許出願人　旭化成工業株式会社 代理人　弁理土星野選

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１２０重量％ないし９８重量％の一般式（Ａ）（こ
   こにＲは、水素、アルキル基等） で表される含シアノ単量体及び２重量％ないし８０重量
   ％の架橋重合性単量体を含む単量体混合物を共重合して
   得られる共重合体であって、平均孔径（ｄ）が４０スな
   いし９０００λである多孔性共重合体と蛋白質とからな
   る複合体。 （２）　多孔性共重合体の孔径が０．５ｄ以上２６未満
   である孔の体積が全孔量の６０％以下である特許請求の
   範囲第１項記載の複合体。 （３）　多孔性共重合体の全単量体に対する架橋重合性
   単量体の重量分率をＸ％とする時、乾燥重合体１ｇ当た
   りの全気孔量が０．０反又“−１以上１．５Ｊ５ｒＩＩ
   １１以下である特許請求の範囲第１項記載の複合体。 （４）　多孔性共重合体１ｇに対し蛋白質２０ｍｇ以上
   からなる特許請求の範囲第１項記載の複合体。 （５）　多孔性共重合体１ｇに対し蛋白質４０ｍｇ以上
   からなる特許請求の範囲第４項記載の複合体。