JPS60248165A - スクリ−ニング用プレ−ト - Google Patents

スクリ−ニング用プレ−ト

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JPS60248165A
JPS60248165A JP10540384A JP10540384A JPS60248165A JP S60248165 A JPS60248165 A JP S60248165A JP 10540384 A JP10540384 A JP 10540384A JP 10540384 A JP10540384 A JP 10540384A JP S60248165 A JPS60248165 A JP S60248165A
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JP
Japan
Prior art keywords
plate
hydrophilic polymer
polymer layer
enzyme
colonies
Prior art date
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Pending
Application number
JP10540384A
Other languages
English (en)
Inventor
Takashi Kawasaki
隆志 川崎
Kenjiro Mori
健二郎 森
Yasuo Kihara
木原 康夫
Keiichi Ushiyama
敬一 牛山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nitto Denko Corp
Original Assignee
Nitto Electric Industrial Co Ltd
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Publication date
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  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (技術分野) 本発明は微生物の酵素活性および/もしくは微生物の生
産物を簡単かつ容易に検出するためのスクリーニング用
プレートに関する。
(従来技術) 種々の微生物の酵素活性や微生物の生産物の検出は多く
の生化学的実験において必要不可欠な事項である。例え
ば、WI生物の遺伝子組み換え操作において、その微生
物に新たに導入された酵素活性遺伝子の発現能の検出が
ある。このような検出は1例えば、寒天などの培地に微
生物のコロニーを生育させ、この上から酵素反応を受け
ると発色する試薬を含有する寒天を流し込み発色を目視
観察することにより行われる。生成される酵素が菌体内
酵素である場合にはコロニー上に流し込む寒天中にリゾ
≠−ムなどの溶菌酵素が含有される。
発色剤を加えた寒天をコロニー上に流し込む代わりに1
発色剤をコロニー上に直接噴霧することも行われる。寒
天をコロニー上に積層させて発色状況を観察する上記従
来方法によれば、55℃以上の寒天溶液を凝固させるこ
となく液状でコロニー培地上に流し込むため、その熱の
ために寒天培地が部分的に熔り出し、その部分のコロニ
ーが浮き上がって移動することがある。コロニーが移動
してしまうと、上層寒天に発色が認められてもその発色
がどのコロニーに起因するのかが判定できない。
コロニーを浮き上がらせることなく寒天溶液をコロニー
上に流し込むことは至難であり高度の熟練を要する。し
かも、試料ごとに寒天を流し込みqれが50℃〜55℃
に冷えて凝固するまでに極めて長時間を要する。
他方1発色剤を噴霧する上記従来方法においては、適量
の噴霧量を培地上のコロニーに均一に噴霧することが至
難である。噴霧量が不足して発色しなかったり発色むら
が生じ2反対に、噴霧量が多すぎてコロニーが培地から
浮き上がって流れることが多い。
(発明の目的) 本発明の目的は、微生物の酵素活性や微生物の生産物を
簡単な操作で容易、迅速かつ正確に検出できるスクリー
ニング用プレートを提供することにある。
(発明の構成) 本発明は、被検出酵素や被検出生産物と反応して発色し
うる発色剤を含有もしくは塗布したプレートを微生物の
コロニーに密着させ得られる発色を観察すれば節中に微
生物の酵素活性や生産物が検出されうる。との発明者の
知見にもとづいて完成された。それゆえ9本発明のスク
リーニング用プレートは発色剤、もしくは発色剤および
酵素を有する親水性高分子層を備え、そのことにより上
記目的が達成される。
本発明のスクリーニング用プレートの親水性高分子層は
発色剤、酵素、溶菌酵素などを保持することが可能で、
かつ寒天などの培地と接触したときそれらを簡単に溶出
させ得る特性を有する。このような親水性高分子は含水
性で、かつゲル層を形成でき得る化合物である。通常、
90−へ%以上の水を担持できる化合物が使用される。
この親水性高分子は発色剤と反応しないことが必要であ
り。
透明性に優れていることが望ましい。このような親水性
高分子としては、寒天、アルギン酸ソーダ。
に−カラギーナン、アクリルアミド、親水ウレタン、ア
クリル酸ソーダ、ポリビニルアルコール。
スターチ、ゼラチンなどがある。このような化合物は架
橋処理して用いられてもよい。特に、寒天。
アルギン酸ソーダおよびに一カラギーナンが好んで用い
られる。
親水性高分子層に含まれる発色剤としては、p−二トロ
フェノール系化合物、2・3・5−トリフェニルテトラ
ゾリウム、螢光性ヒドラジドなどの合成基質やフェノー
ルレッド、チモールブルー。
フェノールフタレインなどのpl+支持薬が用いられる
。発色剤の使用量はその種類や検出したい菌の種類に応
じて適宜選択される。
例えば、グルコシダーゼを検出する場合には。
発色剤としてp−ニトロフェニル−β−D −クルクロ
ニドが用いられる。発色剤とグルコシダーゼとが反応し
てp−二トロフェノールが生じコロニー周辺の培地が黄
色に発色する。ホスファターゼを検出する場合には1発
色剤としてp−二ト1コフェニルホスフエートを用いる
と、p−二トロフェノールによる発色が観察される。酸
化還元酵素を検出する場合には1発色剤として、2・3
・5−トリフェニルテトラゾリウムを用いる。酸やアル
カリを検出する場合には検出する酸やアルカリのpHに
応した既知のpl+支持薬が用いられる。
被検出物質に適当な発色剤がない場合には、適当な酵素
と発色剤とを組み合わせて使用することができる。例え
ばガラクトースを検出する場合にはガラクトース酸化酵
素と螢光性ヒドラジドとを使用する。ガラクトースとガ
ラクトース酸化酵素とが反応するとアルデヒドが生し、
これが螢光性ヒドラジドと反応して螢光性物質が生成す
る。この物質の発する螢光によりガラクトースの存在が
確認できる。
被検出物質が菌体内酵素である場合には、親水性高分子
層を、リゾチームなどの溶菌酵素を加えて調製する。リ
ゾチームの含有量は親水性高分子層に対して通常0.1
〜30.0■/m1.好ましくは1.0〜10.0■/
mρである。
本発明のスクリーニング用プレートは2通常。
親水性高分子層で構成されるが、必要に応じてこれを支
持する支持板を構成要素に加えることができる。支持板
ば親水性高分子層を支持し、高分子層をコロニー」−に
密着させるまでの間、その形状を所定のものに保ち得れ
ばどのような素材であってもよい。支持板の素材として
は2例えばポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネー
ト、アクリル樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレンテレ
フタレート、ポリビニルクロリドなどがある。支持板が
透明であればスクリーニング用プレートを培地上に積層
したときに2支持板をとおして発色状態を観察すること
ができる。支持板は不透明でもよく、その場合には親水
性高分子層をコロニーに密着させた状態で支持板を高分
子層から剥離するか。
さもなければ発色状態をコロニー生育培地の裏側から観
察すればよい。支持板の厚さには、特に制限はないが2
通常0.5〜1.0鶴程度である。支持板の厚さが薄す
ぎると支持板としての機能を有し得す、したがって親水
性高分子層との剥離性が悪くなる。極端に厚いと取りあ
つかいに不便である。
支持板が存在しなくてもスクリーニング用プレートの機
能には変わりはない。
本発明のスクリーニング用プレートは上記の親水性高分
子溶液に発色剤、酵素、溶菌酵素などを加えて混合し親
水性高分子層を形成して調製される。親水性高分子層は
9通常、支持板上に一定の厚さの層に形成され、その水
分含量が50%以上。
好ましくは70%以上で99.5%以下となるように調
製される。親水性高分子のゲル状層を形成しておき1発
色剤などを含む溶液を表面に塗布してもよい。発色剤な
どを含む溶液に親水性高分子のゲル状層を浸漬してもよ
い。塗布もしくは浸漬により作製された親水性高分子層
でなるスクリーニング用プレートは1表面に発色剤を有
するため1発色剤とコロニーとの接触状態が良好である
。親水性高分子層の厚さは発色に必要な量の発色剤や酵
素を含有できる厚さであればよく1通常1〜51である
。親水性高分子層は含水状態であっても乾燥状態であっ
てもよく、そのため、調製されたスクリーニング用プレ
ートを凍結乾燥させれば長期間の保存が可能である。
上記スクリーニング用プレートは任意の形状・大きさに
切断されて使用される。例えば、培地用の直径9cm程
度のシャーレの大きさにあわせて切断される。スクリー
ニング用プレート1は1例えば、第1図に示すような親
水性高分子層4とこれを支持する支持板6を有する。第
2図に示すように、微生物のコロニー2の生育した培地
3上に親水性高分子層4が接するようにスクリーニング
用プレート1をコロニー2上に積層し、所定温度にて所
定時間インキュベーションを行う。被検出物質が存在す
る場合には、第3図に示すように、コロニー周辺に発色
領域5が認められる。支持板6が透明である場合には発
色状態が支持板6を通して目視観察できる。支持板6が
不透明である場合には、これを親水性高分子層4から剥
離する。シャーレの裏側から観察することもできる。ス
クリーニング用プレートをコロニー上に積層してインキ
ュベートする温度や時間は被検出物質および発色剤の種
類によって適宜選択される。このようなスクリーニング
用プレートは遺伝子組み換え技術により形質転換された
ある種の微生物の遺伝子導入にもとづくある種の酵素発
現能の検出にも有用である。
(実施例) 本兇明を実施例により説明する。
去遣」ロー pH7,5の0.01Mリン酸緩衝液100 m、ll
に寒天粉末3.0gを加え、100℃の温浴中で溶解さ
せた。
これを寒天が凝固する直前の温度である約60℃に冷却
し、塩化リゾチーム150■および0.1Mp−ニトロ
フェニル−β−D−、7’ルクロニF水i?[5mp、
を加えて混合した。この寒天溶液を厚さ100μmのポ
リウレタンフィルム上に厚さ2fiとなるように延展し
た。室温で1時間放置し寒天ゲルを親水性高分子層とす
るシートを得た。これをポンチで直径76mmの円板に
打ち抜き、スクリーニング用プレー1−を得た。
土壌から採取したバクテリアを寒天培地で培養し、コロ
ニーを形成させた。上記のスクリーニング用プレートを
親水性高分子層がコロニーと密着するように積層し、3
0°Cで24時間インキュベートした。p−二I・ロフ
ェノールによる黄色の着色がまわりに観察されたコロニ
ーは、コロニー130個のうち25個であった。これら
のコロニーはβ−グルコシダーゼを生産することが確認
された。
大隻開I pl(7,5の0.01Mリン酸緩衝液100mJに寒
天粉末3.0gを加え、100℃の温浴中で溶解させた
これを約60℃に冷却し、厚さ200μ−のナイロンフ
ィルム上に厚さが1fiとなるように延展し、寒天ゲル
層を有するシートを得た。これをポンチで直径85鶴の
円板に打ち抜いた。別に、塩化リゾチームおよびp−ニ
トロフェニル−β−D−グルクロニドを水に溶解させ、
それぞれ1.5■/meおよび0.1Mの濃度となるよ
うにした。この水溶液に上記円板状シートを2時間浸漬
し、スクリーニング用プレートを得た。
このプレートを用い、実施例1と同様にして土壌から採
集したバクテリアコロニーのβ−グルコシダーゼ生産能
を検出した。
叉隻■主 p−ニトロフェニル−β−D−1”ルクロニドの代わり
にp−ニトロフェニル ホスフェートを用いたこと以外
は実施例1と同様である。このスクリーニング用プレー
トを用い、ホスファターゼが存在するとき生成するp−
ニトロフェノールの黄色の発色を観察することにより、
バクテリアのホスファターゼ生産能を検出した。
実施例↓ pn 7.5の0.1Mリン酸緩衝液100+*7!に
塩化ナトリウム0.8gとに一カラギーナン5gとを加
えた。さらにフェノールレッドをその濃度が0.02%
となるように加えて混合した。 これを厚さ200μm
のウレタンフィルム上に1fi厚となるように延展し、
4℃で冷却し固化した。これを直径85酊の円板状に切
断しスクリーニング用プレートを得た。
土壌から採取したバクテリアを寒天培地で培養し、コロ
ニーを形成させた。上記のスクリーニング用プレートを
に一カラギーナン層がコロニーに接するように積層した
。フェノールレッドにより赤色の着色が周辺に観察され
たコロニーに酸生成能のあることが確認された。
スm アルギン酸ナトリウムを酢酸カルシウムで架橋した。蒸
留水100mItにアルギン酸ナトリウム5gを加えて
80℃で1時間加温して溶解させた。これに10%の酢
酸カルシウム25allを加え混合した後ガラス板上に
厚さが1鶴となるように延展し室温にて一夜放置した後
、架橋アルギン酸ナトリウムのゲル層を形成させた。こ
のゲル層の表面にp−ニトロフェニル−β−D−グルク
ロニトト塩化リゾチームとがそれぞれ0.1Mおよび2
■/piの濃度で含有された水溶液を表面に塗布した。
ゲル層をガラス板から剥離しスクリーニング用プレート
を得た。
このプレートを用い、実施例1と同様にして。
バクテリアコロニーのグルコシダーゼ生産能を検出した
(発明の効果) 本発明のスクリーニング用プレートを用いると。
このように、微生物の酵素活性や微生物の生産物を簡単
な操作で容易、迅速かつ正確に検出することができる。
、このようなスクリーニング用プレートは、遺伝子組み
換え技術により形質転換された微生物の遺伝子導入にも
とづく酵素発現能の検出などに有用である。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明のスクリーニング用プレートの一実施例
の部分断面図、第2図はコロニーが生育した培地に上記
スクリーニング用プレートを積層した状態を示す断面図
、そして第3図はそのスクリーニング用プレートにより
発色した培地上のコロニーを示す平面図である。 1・・・スクリーニング用プレート、2・・・コロニー
。 3・・・培地、4・・・親水性高分子層、5・・・発色
領域。 6・・・支持板。 代理人 弁理士 山本秀策

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、発色剤、もしくは発色剤および酵素を有する親水性
    高分子層を備えたスクリーニング用プレート。 2、前記親水性高分子層が溶菌酵素を含有する特許請求
    の範囲第1項に記載のプレート。 3、前記親水性高分子層が支持板に支持された特許請求
    の範囲第1項に記載のプレート。 4、前記支持板が透明もしくは半透明である特許請求の
    範囲第3項に記載のプレート。
JP10540384A 1984-05-23 1984-05-23 スクリ−ニング用プレ−ト Pending JPS60248165A (ja)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1994024859A1 (en) * 1993-04-29 1994-11-10 The Minister Of Agriculture Fisheries And Food In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland Bait and trap
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