JPS60161994A - フラクトース―２，６―ジホスフエート含有溶液の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はフラクトース−２，６−ジポスフエー）（Ｆ−
２，６−Ｐ２）を含む溶液の調製のためにイオン交換ク
ロマトグラフィーと分子ろ過を組み合わせて実施する方
法を提供するものである。本発明はまたこのようにして
得られた物質の医薬としての使用に関する。

フラクトース−１，６−ノホスフエートナトリウム塩（
１”ＤＰ）は優れた代謝活性剤であり、窒素バランスを
調節し、酸素伝達系や赤血球の変形を改善し、溶血に抵
抗し、末稍循環を再活性化する目的で、近年、医学の分
野で汎用されている。

特に、ＦＤＰ異性体、すなわちβ−Ｄ−フラクトースー
２．６−ジポスフエート（１”−２，６−Ｐ２）は特異
なホスホフラクトキナーゼの刺激特性を宵することが証
明されている。本発明者らの実験によれば、Ｆ−２，６
−Ｐ２は高い活性を示し、細胞内ＦＤＰの著しい上昇を
もたらずことが確認されノこ。

本発明者らは、先にＦＤＰおよび／またはその異性体を
細胞へ伝達するに適したりボゾーム製剤の製造法につい
てイタリヤ特願２２４０３Ａ／８３号の出願を行った。

上記の優れた特性にも拘わらず、Ｆ　−２，６−１）　
２の使用は高価であることに加え、主としてそれ自体や
そ溶液がプラスマのそれに対応するｐｌ＋環境において
不安定てあ−）たり、介在性液体が不安定であるため、
種々の不便を伴う。本発明者らが行ったその後の研究に
よれば、Ｆ−２、６−１）　２はりボゾームならびに次
の物質の少なくとも１種以上を配合したときには生理的
ｐｌ＋（７〜７．４）において安定であることが見出ノ
ドされた　ａ）フラクトース−６−ジホスフェート（Ｆ
−６−Ｐ）、ｂ）Ｆ’ＤＰおよびｃ）Ｆ　〜２．６−Ｐ
２の生産の中間体であるフラクト−ス−１，２−サイク
リックホスフェート−６−ボスフェート（ＦＤｌ）Ｃ）
。

この発見の結果、Ｆ−２，６−Ｐ２にｐｌ＋約７４のり
ボゾームを次の少なくとも１つの物質と共に配合するこ
とにより、かがるｐｌ値で安定な製剤を得ることが可能
になる・Ｆ−６−ＰＳＦＤＰおよびＦＤＰＣｏ このようにして調製したＦ−２，６−Ｐ２を細胞中へ導
入すれば、ホスホフラクトキナーゼの活性化によって上
記の如く治療作用を有する細胞内ＦＤＰが大量に生産さ
れることになり、理想的条件となる。

Ｆ−２，６−Ｐ２を製造するには本発明方法によって行
なイっれるが、その具体例は次の通りである。なお、記
述に当たって参照する図面の第１図〜第３図は本発明方
法の種々の段階で行なわれたクロマトグラフィーの像を
表すグラフである。

ｒ”−２，６−Ｐ２の製造例 Ａ）環化 ＦＤＰ　１９を蒸留水２ｍｇに溶解し、予めピリジンで
洗浄したダウエックスＧ５０樹脂を使用した急速イオン
交換に付してナトリウム塩をピリジン塩に変換する。こ
のＦＤＰ溶液にピリジンｌＯｘ＆を加え、樹脂と共に急
速に混合する。遠心（５００ＸＧ、５分間）によりＦ　
Ｄ　Ｐ含何溶液からピリジン型になった樹脂を除去する
。別途、ジシクロへキンル力ルポジイミド（ＤＣＣＤ）
４ｇをピリジン２０靜に熱時に溶解させ、トリエチルア
ミン（ＴＥＡ）１．５ｘｆ２を加える。この溶液を面記
ＦＤＰ含有溶液に加え、速やかに混合した後、ピリジン
を加えて最終の容積を８０Ｒ１２に調節する。淡Ｍ色混
合物を２０℃に２４時間保持すると凝固物が析出する。

その後、水８０叶（希釈度１：Ｉ）を加えて反応を阻止
し、エーテルで急速に抽出する。抽出は、それぞれ混合
物の４倍容のエーテルを使用し、３回にわたって行なわ
れる。その都度エーテル含宵層、ずなイつちＤＣＣＤ含
有層を除去する。この層を回転蒸発器中で処理してエー
テル、ｌ）　ＣＣＩ）４５よびピリジンを回収する。こ
の時点でＦ　Ｉ）　Ｐは好ましい程度においてＦＤＰＣ
に変換されており、水層４０ｍＱ、中に存在する。Ｆ−
２，６−Ｐを得るには一連のカラムクロマトグラフィー
を行なうことか必要である。

１３）第１段階：　Ｆ−２，６−Ｐ２の分離ＤＥ八へ−
セファデックス（２５０ｍＭ’Ｊ’ＥΔ−ＨＣ０，＋　
１１１１１８．４）上のクロマトグラフィー試料の４０
村を最終濃度２５０ｍＭ　ｉ’ＥΔ−ＩＩＣ０３ｐ１１
８．４でｐｌ＋８．４に調節する。この同しバッフｙ　
（２５０ｍＭ　ＴＥＡ　ＨＣＯ３ｐ１１８．４）てＤＥ
ＡＥ−セファデックス（１６ＣＮＸ　Ｉ　、５ｃｍ′）
を平衡化する。樹脂はダブルファンクション、すなわち
イオン交換（ＤＥＡＥ）とろ過（セファデックス）であ
り、低分子量のグルシド分子を分離するのに適している
。全試料をパーコレートし、ペースバッファーで洗浄し
、イオン強度が２５０ｍＭから５００ｍＭ　ＴＥＡ−Ｈ
ＣＯ３ｐＨ１８，４に上昇する２００靜の連続的グラジ
ェントを適用する。

各フラクションについてグルンド含量とＦ−２゜６−Ｐ
２の酵素含量を明らかにする。グルンド含量の適用によ
り２つのピークが証明される。その各々はＮａＯＨアル
カリ雰囲気で前処理し、ホスホフラクトキナーゼの刺激
活性を評価することが可能である。試料０　、３　ｚ（
ｌに５Ｎ　ＮａＯＨ６０μ（！を加え、全体を３７℃で
１０分間にわたり培養する。５ＮＨＣｆｆ６０μｇで中
和する。この操作はサイクリックＦＤＰを開環するだめ
のものであり、これによってＦ−６−ＰＫの特異活性を
有するＦ−２，６−Ｐ２の一定量か得られる。グルシド
含量ピークのうち、３００ｍＭ　Ｔ　ＥＡ　ｌ−ＩＣＯ
３ｐＨ８４で溶出したものはＦ　−６−１）　Ｋについ
て注目すべき刺激活性を与える。従って、このピークの
みがサイクリックＦＤＰを含むものであり、一方、他の
ものは非環状ＦＤＰまたはＩｉ’　−２、６−Ｐ２に起
因する（第１図参照）。

Ｃ）Ｆ−２，６−Ｉ）２の第２精製工程ＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（１０ｍＭ　ＴＥＡ−１−ＩＣＯ３ｐＨ８，
４）上のクロマトグラフィーホスホフラクトキナーゼの
活性化化合物を含むピークを取り、最終ｌＮＮａ０１−
１て処理し、３７℃で１０分間培養する。次いで試料を
Ｈ２Ｏ４容て蒔め、希釈し、９０℃に３０分間加熱４′
る。その後試料を逆浸透て脱塩、濃縮し、その後のり［
７マトグラフイーに適当な最終容積とする。Ｉ）　Ｅへ
Ｅ−セファデックス樹脂塔（８ｃｍｘ０．８ｃｍ）を調
製し、Ｉ　ＯｍＭ　ＴＥＡ　ＨＣＯ３ｐＨ８，４ノ＼ツ
’７７−で平衡化する。試料をバッファーと同一濃度と
し、パーコレートし、ｌ１容のフラクションを集める。

ペースバッファーで洗い、ＩＯ〜５００ｍＭＴＥＡ−Ｈ
ＣＯ３ｐＨ８，４の連続的グラジェント１００ｘＣを適
用する。各試料についてグルンド含ｍ調節し、Ｆ　−６
−１”　Ｋの活性度を比色定態する（第２図参照）。

Ｄ）化合物のナトリウム塩への変換 Ｆ−２．６−Ｐ２含有フラクションを取り、逆浸透法で
脱塩濃縮し、回転蒸発器中で乾燥させる。

残渣を蒸留水で３回にわたって洗い、化合物をナトリウ
ム塩型のダウエックス５０塔（０，５ｃａ＋ｘ５Ｃ１＆
）上でクロ７トグラフする。塔を５０＋ＩＩＭ　ＮａＣ
（！、５０ｍＭ）リス−ＨＣ＆ｐＨ８で平衡化し、同一
バッファーに試料を懸濁してパーコレートし、上昇イオ
ン強度により非連続的グラジェントを常にトリス−１−
Ｉ　Ｃ１２５０ｍＭ　ｐｉｔ　８を適用する（１００ｍ
Ｍ　ＮａＣＱ。

２００ｍＭ　ＮａＣＱ、５００ｍＭ　ＮａＣ＆）。

最後の濃度で溶出した試料中でホスホフラクトキナーゼ
酵素の最大活性は後記使用量において注目される（第３
図参照）。

Ｅ）この溶出液は逆浸透法ににり濃縮、脱塩し、凍結乾
燥する。

グルンド含量の定量 ＤＥＡＥ−セファデックス塔の各フラクション中に存在
するグルシドのｍの測定はモンゴメリー法（１５）によ
り行なわれる。各試料０２酎を取り、これに５％フェノ
ール０，５靜、濃＋−ｒ　２　Ｓ　０　。

３　ｍＱ、蒸留水０３靜を加える。攪はん後５分間培養
し、着色を４８５ｎｍにおいて比色法で読み取って測定
する。標準はＦＤＰとフラクト−スて調製する。

酵素の使用量（ホスホフラクトキナーゼの活性化） 採用された方法はＡＴＰによって生産されるホスホフラ
クトキナーゼ酵素（Ｆ−６−ｐ＋＜）の阻止を排除する
Ｆ−２、６−Ｐの容量に括づく。試験のため各キュベツ
ト中には次の組成物か存在４゛る１−１ｅｐｅｓ　５０
ｍＭ　（ｐＨ７，４）ＥＤＴＡ　ＩｍＭ ＭｇｃＱ２　５ｍＭ ＮＨ４Ｃ（１ｍＭ ＮＡＤＨＯ，１６ｍＭ ジヂオトレイトール（ＤＴＴ）　２．５ｍＭフラクトー
ス−６−ボスフェート　ＩｍＭ（脱塩化）アルドラーゼ
　０．４単位 ＴＩＭ　２．４単位 α−グリセロホスフェートー デヒドロゲナーゼ　８，４単位 Ａｉ’Ｐ１．２ｍＭのＦ−６−ＰＫ３０ｍＵを添加後、
２分間培養する。Ｆ−２、Ｇ　−１’　２　（活性化因
子）を加えると反応が始まる。

上記条件下、Ｆ−６−ＰＫは活性化剤（Ｆ’−２゜６−
Ｐ２）の不存在下にはいかなる活性も発揮しない。比色
測定の読み取りは３４０ｎｍギルボード装置を用いて、
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈが消失してＮＡＤへ酵素酸化したことを
確認して行う。Ｆ−６−Ｐ　Ｋ活性の容量は事実次の一
連の反応に括づく：Ｆ６Ｐ　＋　Ａ’ｌ’Ｐ ↓ＦＫ ＦＤＩフ＋ＡＤＰ ＤＰ ↓ＡＬＤ ジヒドロキシアセトン−ｌフ ↑↓ＴＩＭ グリセロアルデヒド−３−Ｉ〕 グリセロ−３−Ｐ　＋　ＮＡＤｉ−Ｉ　＋　Ｉビα−ク
リセロポスフェート十　Ｎ　Ａ　Ｉ）　”従って、この
使用はアルドラーゼ、ｉ”１Ｍおよびグリセロホスフェ
ート−脱水素酵素を使用するＦＤＰ形成とＮ　Ａ　Ｄ　
Ｉ−１酸化の結合に基づく。この使用に際して用いられ
る酵素は、ヘーリンガーヒオケミア（ミラノ）によって
生産されたしのである。

このようにして得られたＦ　−２、６−Ｉ）　２ナトリ
ウム塩の分析特性は以下の通りである Ｆ−２，６−Ｐ　２ＨＧ　４．３％ Ｈ３Ｓ０４　、　０．７％ Ｆ　Ｄ　Ｐ　Ｉ−１、２、９％ ＦＤＰ　ＣＩ（３１，２％ モノポスボリル化グルント　Ｉ　５％ ｌ−Ｉ２０　８．１％ Ｎａ　１７．３％ ピリジン　０．７％ 本発明の方法は多くの新しい特徴と利益をもたらすもの
である。クロマトグラフィー樹脂の再生と共に、Ａ層中
のエーテル、ＤＣＣＤおよびピリジンの日収の可能性は
公知の方法の費用に比し、全体の方法の費用を９５％以
上軽減するものである。

Ｂ層、０層およびＤｉのクロマトグラフィー後に得られ
た溶液の逆浸透法（分子ろ過）による濃縮と脱塩は、公
知方法における不利益、たとえばナトリウム型ダウエッ
クス５０クロマトグラフイーが希釈によって悪影響を受
け、塩が過剰となることを避けることが出来る。

逆浸透法による予めの脱塩と濃縮は凍結乾燥工程を容易
ならしめるものである。更に具体的にはイオン交換クロ
マトグラフィーと結合した分子ろ適法（逆浸透）の採用
は溶液の容積を減少せしめ、クロマトグラフ法、クロマ
トグラフ法から生ずる溶出液の凍結乾燥およびアルドラ
ーゼ酵素による精製処理などを妨害する塩を除去する乙
のである点において者・シく有利である。

上記した精製系を経て生産されたＦ−２、６−Ｐ２は上
記したように医薬としてｒｊ用な乙の−ζある。なお一
本発明の範囲において多くの改変が可能であることは当
業者にとって自明のとごろであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は本発明実施例にお１ノる各段階のカラ
ムクロマトグラフィー溶出グラフを示す。 特許出願人　ビオメゾイカ・フォスカマ・インドコスト
リア・キミコーファルマチ」ウ ティカ・エノセ・ビ・ア

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の工程を含むフラクトース−２，６−ジホスフェ
   ート含有溶液の製法： ａ）フラクトース−１，６−シホスフエートナトリウム
   塩溶液を環化してフラクトース−１，２−サイクリック
   ホスフェート−６−ボスフェートを含む水層とジンクロ
   ヘキシルカルボノイミドとピリジンを含むエーテル層を
   得る工程、 ｂ）２５０ｍＭ　ＴＥＡ　ＨＣＯ３、ｐＨ８、４を用い
   てＤＥＡＥ−セファデックス上クロマトグラフィーに付
   し、フラクトース−２，６−ジホスフェートを含む溶出
   フラクションを脱塩、濃縮する工程、ｃ）　Ｉ　ＯｍＭ
   　Ｔ　Ｅ　Ａ　ＨＣＯｓ、１）１１８　、４を用いてＤ
   　Ｅ　Ａ　Ｅ−セファデックス上クロマトグラフィーに
   付し、フラクトース−２，６−ジホスフェートを含む溶
   出フラクションを脱塩、濃縮する工程、ｄ）該化合物を
   ナトリウム塩型ダウエックス５０上のクロマトクラフィ
   ーによりナトリウム塩に変換し、溶出液を濃縮、脱塩す
   る工程、ｅ）凍結乾燥を行う工程。 ２、ジシクロへキシルカルボジイミドとピリジンを含む
   エーテル層を回転蒸発器中を通過せしめることによりエ
   ーテル、ジシクロへキシルカルボジイミドおよびピリジ
   ンを回収する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、ｂ）、Ｃ）およびｄ）工程においてクロマトクラフ
   ィー後に得られた溶出液を逆浸透法（分子ろ適法）によ
   って濃縮、脱塩する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、医薬として使用されるフラクトース−２゜６−ジホ
   スフェート溶液を得るための特許請求の範囲第１項、第
   ２項または第３項記載の方法。