JPS60145097A - ３−ヒドロキシブチレ−トポリマ−含有微生物細胞からの３−ヒドロキシブチレ−トポリマ−以外の細胞物質の除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物からの３−ヒドロキシブチレートポリマ
ーの分離方法に関する。

ポリ（３−ヒト９０キシブチレート）は、多くの微生物
、殊に例えばアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
　）、アチオｐ−ジウム（Ａｔｈｉｏｒｈｏｄｉｕｍ）
、アゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　）　、バ
フルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）、ノカルジア（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ）、シュウトモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）及びスピリ
リウム（５ｐｉｒｉｌｌｉ皿）属の細菌によって、エネ
ルギー備蓄物質として蓄積される熱可塑性ポリエステル
であって、下記式 ％式％ の繰返し単位からなるものである。

とのポリマーは、微生物を、水性培地中でエネルギー及
び炭素源としての炭水化物またはメタノールのような適
当な基質で培養することによって都合よく作られる。基
質は、もちろん、微生物によって同化されうるものでな
ければならない。ポリマーの蓄積を促進するには、培養
工程の少なくとも一部分を、微生物の成長のために必須
であるけれとも該ポリマーの蓄積のためには要求されな
い栄養素の制限条件下で実施するのが好ましい。

適当な培養方法の例は、欧州特許ａｘ　１５６６９号及
び第４６３４４号明細書に記載されている。

３−ヒドロキシブチレート単位とその他のヒドロキシカ
ルボン酸単位（例えば３−ヒドロキシバレレート単位）
との両方を含むポリマーも、微生物により産生されうる
。従って、微生物により産生された３−ヒト９０キシブ
チレート残基と３−ヒドロキシバレレート単位を含むヘ
テロポリマーはウオーｖ　ｙ　（Ｗａｌｌｅｎ）　＠に
よって、「エンピロンメンタル・ツ°イエンス・アンド
・チクノロシイ」第８巻（１９７４）、第５７６〜５７
９頁に記載されている。また、欧州特許第５２４５９号
及び第６９４９７号明細書に記載されているように、抽
々なコポリマー類が、特定の基質で微生物を培％するこ
とによって産生されうる。例えはプロピオン酸を基質と
すると、コポリマー中に３−ヒドロキシバレレート単位
が生じる。

従って、この明細１．において用いる「ＨＢポリマー」
なる用語は、ホモポリマーであるポリ（３−ヒドロキシ
ブチレート）のみでなく、上記のようなコポリマー類を
も意味するものである（但し、３−ヒドロキシブチレー
ト単位がポリマー鎖の少なくとも４０モルチ、好ましく
は少なくとも５０モルチをなすものとする）。

ＨＢポリマーを含む細胞は、そのままで成形用材料とし
て（例えば米国特許第３１０７１７２号明細書参照）使
用できるけれども、普通はポリマーを残部の細胞物質か
ら分離するのが望ましい。

現在までに提案されてきている分離方法の大多数におい
ては、）ＩＢポリマーが可溶である溶剤によって細胞か
ら重合体を抽出し、次いでその重合体溶液（以下「シロ
ップ」と称する）を細胞残渣から分離することがなされ
る。普通、そのような抽出工程は、細胞を抽出溶剤が透
過しうるようになす処理（例えば磨砕、噴霧乾燥）に付
した後に、実施される。典型的浴剤抽出法は、欧州特許
第１５１２３号明細書に記載されている。

細胞残渣からのシロップの分離は、通常、濾過または遠
心分離によってなされるが、約５重量％以上のポリマー
を含むシロップは非常に粘稠である傾向があり、そのた
めに涙膜や遠心分離工程を困難にする。ＨＢポリマー以
外の分離されるべき細胞物質（以下）’ＮＰＣＭＪと称
する）の割合が多いときには殊にその困難がある。分離
されるべきＮＰＣＭの割合は、もちろん、微生物細胞の
ＨＢポリマー含量に左右される。

文献には高割合のＨＢポリマーを含む微生物細胞の報告
もなされてきているが、培養操作の経済上の考慮から微
生物細胞中のＨＢポリマーの割合にはしばしば実用上の
限度があシ、従ってシロップからのＮＰＣＭの分離を容
易にするに充分なようにシロップを稀釈するには多量の
抽出溶剤の使用が必要とされる。そのような稀釈シロッ
プの使用を必要とされ、大型容器の使用が必要とされ、
そして多量の浴剤回収コストがかかるのみならず、（比
較的効率的な溶剤回収操作法を用いた場合であっても）
可成シの溶剤の損失が起こシ易い。従って、５重量−の
シロップ濃度を使用する場合、９５重量％の溶剤が再使
用のために回収されたとしても、１　ｋｇのポリマーを
抽出するために、１ｋｌｉｌの溶剤が損失される。さら
に低濃度のシロップ及び／または低効率の溶剤回収操作
を用いれば、溶剤損失量はさらに多くなる。従って、そ
のような抽出法は、抽出処理（含：溶剤回収）コストに
加うるに、可成シの原料コスト（すなわち不回収溶剤の
コスト）がボ＋Ｊマー生産コストに上乗せされることに
なる。

上記の抽出法においては、ＨＢポリマーは溶剤中への溶
解によって抽出され、ＮＰＣＭは不溶解のまま残こる。

しかし若干のＮＰＣＭ、例えば脂質も、ＨＢポリマー抽
出用溶剤に可溶性であることがあシ、従ってシロップ中
に存在することがある。そこでもしそのように溶解され
たＮＰＣ’Ｍ不純物を含まないＨＢポリマー製品を得た
い場合には、ＨＢポリマーが可溶性でない溶剤を用いて
の予備抽出工程が、ＨＢポリマー抽出溶剤に可溶な不純
物を除去するためにＨＢポリマーの抽出前に、必要とさ
れ、あるいはＨＢポリマーはシロップから、例えば沈澱
によシ、選択的に分離されなければならない。選択分離
（例えば沈＃）工程の採用は、溶剤回収操作をさらに複
雑化することが多い。

ここに我々は、そのような大量の溶剤の損失やそれに伴
なう原料コストの増大を引き起こすことな（ＨＢポリマ
ーからｌｌｌＰＣＭの大部分を分離しうる方法を案出し
た。

本発明においては、ＮＰＣＭのほとんどの部分は可溶化
され（好１しくは酵素により）、ＨＢポリマーを不溶状
態で残す。

従って本発明においては、従来と逆の操作が採用される
。すなわちＮＰＣＭ（不純物）を溶解させて、ＨＥポリ
マーを不溶状態で残す。ＮＰＣＭの溶解はいくつかの段
階で実施しうるので、次第に向上する純度のＨＢポリマ
ー生成物を得ることができる。も“ちろん、そのような
段階が多くなればなるほど、操作コストは高くなる。Ｈ
Ｂポリマー生成物のある種の応用については、他の応用
に必要とされるよシも低い純度の生成物が許容されうる
ので、不純物（ＮＰＣＭ）を段階的に抽出することによ
って、そのような許容しうる、低純度の生成物を、高純
度生成物よシも安価に生産できる。

Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１旦（１
９５８）第１９８〜２０９頁には、微生物細胞を次亜塩
素酸ナトリウムのアルカリ性溶液で処理することによシ
細胞からポリマーを分離することが提案されている。

この処理ではＮＰＣＭの可溶化がなされるけれども、そ
れと同時にＨＢポリマーの著しい分解が引き起こされ、
ＨＢポリマーが多くの応用に対し不適当にされてしまう
ことを、我々は発見した。

またＨＢポリマー類についての多くの学術文献、例えば
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　８　Ｂ　（１９６４
年７月）、第６０〜７１頁（特に６１頁）、では、微生
物細胞をリゾチーム含有溶液中に懸濁し、懸濁液を超音
波に付し、次いでグリセロール上に層状とした懸濁液を
遠心分離することによシ、ＨＢポリマー顆粒を細胞砕片
から分離することからなる、微生物細胞からのＨＢポリ
マー顆粒の分離法が提案されている。しかし、そのよう
な酵素は比較的高価であシその操作が大規模運転に向か
ないはか夛でなく、比較的小割合のＮＰＣＭが可溶化さ
れるにすぎない。

本発明によれば、ＨＢポリマー含有微生物細胞の水性懸
濁液を少なくとも１種の可溶化剤で消化することによシ
該細胞中のＮＰＣＭを可溶化させ、次いでＨＢポリマー
を含む不溶性残留物を懸濁液から分離することからなる
、ＨＢポリマー含有微生物細胞からのＮＰＣＭの除去方
法であって：可溶化剤として蛋白分解酵素組成物及び／
または界面活性剤を用いるーまたはそれ以上の段階を消
化工程が含むこと、そして消化工程の前または消化工程
中、及びいずれかの蛋白分解酵素消化の前に懸濁液を８
０Ｃ以上の温度に加熱することを特徴とする上記ＮＰＣ
Ｍ除去方法が提供される。

好ましくは、加熱段階及び消化段階は、初期細胞中のＮ
ＰＣＭの少なくとも５０Ｍ量チを可溶化させ、そして少
なくとも７０重ｉ％のＨＢポリマー含量の不溶性残留物
を生じさせるに充分なだけ実施される。

ヘプチドグリカ／、蛋白性物質（グリコ蛋白を含む）、
及び若干の場合には燐多糖類、ならびにその他の炭化物
類からなる。蛋白性物質は普通、ＮＰＣＭの少なくとも
４０重量％をなす。

本発明の方法においては、上記のＮＰＣＭ成分の少なく
ともいくつかが可溶化される。これは、細胞を、可溶化
剤によって１またはそれ以上の段階で消化することによ
ってなされる。少なくとも１つの段階における可溶化剤
は酵素組成物であるのが好ましく、そして消化工程は、
ペプシン、トリプシン、フロメリン、ノ々パイン、フィ
シン、Ｖミン、キモトリプシン、及び細菌または真菌の
蛋白分解酵素あるいはそれらの混合物のような、蛋白分
解酵素で懸濁液を処理する少なくとも１つの段階を含む
のが好ましい。適当な酵素組成物は、「微生物学的」（
酵素配合）洗剤粉末に普通使用されているものである。

少なくとも１つの消化段階における可溶化剤は蛋白分解
酵素及び／または界面活性剤（殊にアニオン系界面活性
剤）である。

消化工程の前もしくは消化工程中、しかしいずれかの蛋
白分解酵素による消化工程の前に、細胞は８００以上の
温度に付される。そのような加熱工程は細胞中の核酸類
のいくつかの変性及び可溶化を引き起こす。そのような
加熱工程を省くと、蛋白分解酵素消化工程後の不溶性残
留物の満足すべき分離がで１！なくなる。なんとなれば
、そのような予備加熱工程がなされないと、核酸類が細
胞から放出され、細胞が蛋白分解酵素で消化される際に
非常に粘稠な懸濁液を与えるからである。そのような核
酸類は蛋白分解酵素での処理＝ｉＪにチオキシリボヌク
レアーゼを添加することによシ可溶化しうるであろうが
、比較的高価なデオキシリボヌクレアーゼの高濃度が必
要とされる。同様に蛋白分解酵素での処理後にデオキシ
リボヌクレアーゼで処理することは、そのデオキシリボ
ヌクレアーゼと粘稠な懸濁液との混合が困難であるので
、実用的でない。

消化工程が蛋白分解酵素での消化処理を含む場合には、
懸濁液を１００Ｃ以上に加熱するのが好ましく、殊に水
性媒を液体状態に維持するに足る大気圧以上の圧力の下
で１２０Ｃ以上に加熱し、次いでその圧力を、（例えば
加熱懸濁液を水性媒が蒸発する圧力に保持した領域中へ
押出すことによシ、または懸濁液を単に冷却することに
よシ）低減させるのが好ましい。

核酸類の可溶化及び変性を行なうのに必要とされる熱処
理時間は、使用温度によシ変ることになる。従って、そ
の必要時間は、懸濁液が付される温度が高いほど、短縮
される。少なくとも５分間、好ましくは少なくとも１０
分間の加熱が約１００Ｃの温度において必要とされうる
が、さらに高い温度例えば１５０Ｃにおいては、一層短
い加熱時間を使用することができ、２０秒間というよう
な短い加熱時間を使用できることもある。可溶化剤とし
て界面活性剤を用いるいずれの消化段階も、普通は、界
面活性剤による迅速な可溶化を行なうためには８０Ｃ以
上の温度で実施される。

核酸類の変性及び可溶化を行なう加熱工程のためには広
範囲のｐＨ条件を使用できるけれども、そのｐＨ条件は
ＨＢ　ｄＦ　リマーの分解のおそれを最小化するには中
性付近、例えばｐＨ６〜８であるのが好ましい。

前述の、本発明の好ましい一態様においては、可溶化の
少なくとも一部分は、酵素組成物での細胞９消化によシ
なされ、特に、可溶化剤として蛋白分解酵素組成物を用
いる少なくとも１つの消化段階を採用することによシな
される。

多くの酵素組成物は６０Ｃ以上の温度で変性される傾向
があるので、核酸を変性及び可溶化させるための加熱工
程は、酵素組成物での処理に先立って実施される。

酵素消化工程を採用する場合に、その消化は当該酵素が
変性される温度よシも低い温度で実施されるべきである
。多くの場合に、変性温度は６５Ｃよシも低いであろう
が、若干の酵素については変性温度がそれよシも高く、
従ってそのような酵素を用いるときには６５Ｃよシも高
い消化温度を使用しうる。その消化温度は８０Ｃ以下で
あるのが好ましい。酵素が６０Ｃ以上の温度に耐えうる
場合を除いて、消化は６０Ｃ以下、特に５０〜６０ｔｌ
’の温度で実施するのが好ましい。酵素消化工程を採用
する場合、懸濁液は酵素消化段階で使用される温度よシ
も高い温度に通常は加熱されるから、普通は酵素消化に
先立って細胞の冷却が必要とされることになる。細胞は
、例えば濾過または遠心分離によって、加熱懸濁液から
分離し、次いで別の水性媒に再懸濁してよく：あるいは
加熱懸濁を単に所要の消化温度にまで冷却し、それに対
して酵素消化工程を行なうこともできる。

酵素消化によってもたらされる可溶化ＮＰＣＭは、所望
ならば、追加量のＨＢポリマー含有微生物の培養のだめ
の基質の一部として再使用し、かくしてＨＢポリマー含
有微生物の生産における原料コストの節減を行なうこと
ができる。酵素によって可溶化されたＮＰＣＭは培養工
程へ再循環させてもよい（但し必要とされうる滅菌処理
のような処理の後）。

従って可溶化は酵素によってなされるのが好ましい。酵
素消化後の残る残留物中のＮＰＣＭをさらに可溶化させ
ることは、可溶化剤として界面活性剤を用いて実施しう
る。

可溶化を、可溶化剤として蛋白分解酵素組成物及び界面
活性剤の両者を用いて実施する場合、消化はいくつかの
段階で実施し、界面活性剤消化段階を酵素消化段階（単
または複数）の後に実施するのが好ましい。その理由に
は二つｉ、第１は酵素組成物が界面活性剤によシ失活す
ることがあることであり、第２は、微生物懸濁液を作る
ために用いられる培養工程へ可溶化ＮＰＣＭを再循環さ
せようとする場合、懸濁液の可溶化部分中に界面活性剤
が存在すると、そのような再使用を妨げることがあるこ
とである。

ＮＰＣＭの充分な可溶化またはそれ以上の可溶化を達成
するには、消化工程は、普通初期細胞のＮＰＣＭの約６
〜ｌＯ重量％を占める燐脂質類を可溶化するためにホス
ホリパーゼ酵素を用いての消化処理段階を含みうる。

酵素消化は、酵素組成物を添加した細胞懸濁液を所要温
度及び６．５〜９．０の範囲のｐＨに、所要の処理炭を
達成するまで、維持することによって行なうのが好まし
く、この時間は、通常的０．２〜２時間であろう。

酵素消化はいくつかの段階にわけて実施してよく、例え
ば最初の段階では一つの酵素組成物を用い、次いで同一
または異なる酵素組成物を用いる−またはそれ以上の処
理段階を実施しうる。しかしながら、１種よシも多くの
酵素を使用する場合には、一つの酵素混合物を用いて単
一の段階で細胞を処理するのが、便宜であシうる。

実際に、我々は、若干の場合には酵素混合物を用いると
相乗効果が得られ、従って酵素同志が相互に消化し合わ
ないならば、若干の場合には酵素混合物を使用すると、
酵素を単独でまたは順々に使用する場合よシもＮＰＣＭ
の高度の可溶化がもたらされることを、発見した。

酵素、例えば蛋白分解酵素及び／またはホスホリパーゼ
酵素の必要量は、酵素の種類及び活性に依存するもので
１、典型的には蛋白分解酵素の量は、初期細胞中のＮＰ
ＣＭの１００ｇ当り０．５〜１０　Ａｎｓｏｎ単位（Ａ
Ｕ）、好ましくは１〜６ＡＵを与えるような量である。

蛋白分解酵素の活性は、変性ヘモグロビンを酵素で２５
ｒ及びｐＨ７，５において１０分間消化することによ）
測定しうる。ＩＡＵは、１ミリ当量のチロシンと同じ色
をフェノール試薬で呈する量のＴＣＡ可溶生成物を１分
車シ（初期速度において）放出させる酵素量である。こ
の分析法の詳細な説明はノボ・インダストリイス（Ｎｏ
ｖａ　Ｉｎｄｕ　−５ｔｒｉｅｓ）　ｑ行のリーフレツ
）ＡＦ’４に与えられている。

リゾチワムのようなある種の酵素は投ブチドグリカンを
可溶化させるけれども、我々は、ＮＰＣＭ中のイプチド
グリカンの可溶化をほとんどまたは全く行なわない酵素
組成物を、少なくとも初期の消化段階において用いるの
が望ましいことを、発見した。この理由は、もしはブチ
ドグリカンが可溶化されると、可溶化された物質からの
不溶性ＨＢポリマー顆粒の分離が一層困難になる傾向が
あポリマー顆粒の集塊体を包み込むある種の網または袋
状物を形成するのではないかと考えられる。

そのような集塊体は水性媒からは、集塊から解かれた顆
粒よシも容易に分離されうる。ペプテドダリカンの存在
は、ＨＥポリマーを含む不溶性残留物のジアミノピメリ
ン酸含量を測定することにょシ確認できる。

前述のように、ＮＰＣＭの可溶化は、可溶化剤として界
面活性剤を使用することによってもなしうるものであシ
、これは好ましくは蛋白分解酵素消化工程の後に実施す
る。界面活性剤、例えば硫酸化またはスルホン酸化脂肪
酸（殊に硫酸ドデシルナトリウム塩）のよりなアニオン
系界面活性剤を用いての可溶化は、界面活性剤を添加し
た懸濁液を８０ｒ以上の温度に加熱することによシ実施
するのが好ましい。界面活性剤の使用量は懸濁液中に残
っているＮＰＣＭの１０〜２０重量％であるのが好まし
い。界面活性剤に対してエチレンジアミン四酢酸のよう
な錯化剤を添加することは、ＮＰＣＭの可溶化を助長す
る点で有利であシうる。

我々は界面活性剤処理を酵素消化の後に実施する若干の
場合、殊に酵素消化に先立つ熱処理が特には苛酷でない
場合（例えば温度が１００Ｃを越えない場合）には、そ
のような界面活性剤処理のトキにエマルジョンが形成さ
れうろこと、そしてそのようなエマルジョンからは固型
分が極めて分離され難いこと、を発見した。我々は、そ
のようなエマルジョ／にカチオン系凝集剤または電解質
を添加してもその分離の助長には余シ効果的でないこと
を発見した。しかし、ｐＨ２以下までの酸性化、または
珪藻土のような吸収剤鉱物の添加は分離を助長する。し
かし酸性化は、界面活性剤で可溶化されたＮ　Ｐ　ＣＭ
のいく分かの沈澱を生じさせることがある。

消化工程後に残る不溶性残留物は、ＨＢポリマーと共に
いく分かの残留未溶＃ＮＰＣＭを含んでいる。

いずれかの所与の段階におけるＮＰＣＭの可溶化度は、
初期細胞と当該段階で得られるＨＢポリマー含有組成物
とのそれぞれのＨＢポリマー含ｉから都合よく計算でき
る。この計算の目的のためには、損失がないこと及びＨ
Ｂポリマーは全く可溶化されなかったこと、を仮定する
。

かくして、初期細胞がＰｏｌ景％のＨＢポリマーを含み
、当該段階の生成物が９１重量％のＨＢポリマー含量を
もつとすれば、可溶化されたＮＰＣＭの百分率Ｎは下式
によって与えられる。

熱処理及び消化工程は、初期細胞のＮＰＣＭの少なくと
も５０重量％が可溶化され、かつ残留物が少なくとも７
０重量％、好ましくは少なくとも８５重量−〇ＨＢポリ
マーを含む、ように実施するのが好ましい。

これを達成するのに必要とされる消化の量は、もちろん
微生物細胞の初期ＨＢポリマー含量Ｐ。

に依存することになる。微生物は、ＨＢポリマー含量Ｐ
Ｏが少なくとも５０重量％となるような条件下で培養す
るのが好ましい。しかし前述のように経済的な考慮から
、細胞のＨＢポリマー含量Ｐ。

は８０重量％以下に限定されうる。

本発明の好ましい一態様においては、酵素及び／まだは
界面活性剤によるＮＰＣＭの可溶化の後に、残渣を過酸
化水素で処理する。蛋白性ＮＰＣＭの大部分が蛋白分解
酵素で可溶化されてしまっている場合、過酸化水素によ
る処理は、さらに行われる残留ＮＰＣＭの可溶化に対し
てほとんどまだは全く影響を与えず、そしてＨＢポリマ
ー含有残渣の着色の除去に望ましいものである。過酸化
水素による処理は、ＨＢ　、ｌ？　＋）マー含有残渣を
水性培゛　地から（例えばｐ過によｌ一層容易に分離で
きるようにすることにより利点をもたらしうる。

その他の場合（例えば蛋白性ＮＰＣＭの一部分だけ（可
溶化するのに蛋白分解酵素による消化処理を用いた場合
、及び／または界面活性剤による消化処理を採用した場
合）、過酸化水素処理によって、追加量のＮ　Ｐ　ＣＭ
の除去を行ないうる。

ＨＢポリマー含有残渣のＤＩ’　Ｐ　ＣＭが脂質を含む
場合、例えばホスホリ／％−ゼ酵素を用いての消化を実
施しなかった場合、脂質を溶解するがＨＢポリマーを溶
解しえない溶剤、例えばメタノール、でそのＨＢ　ｙｇ
　リマー含有残渣を洗浄することにょシ、脂質を除去で
きる。そのような溶剤洗浄工程は、脱臭工程として望ま
しいことがある。

上記の操作によって、不溶性の残液が得られ、このもの
は普通少なくとも７０重量％、好ましくは少なくとも８
５重量％、殊に少なくとも９０重量％の）ＩＢポリマー
を含む。

前述のようにペプチドグリカンの顕著な可溶化を行なわ
ないのが好ましい。従って、好ましい生成物は少なくと
も９０重量％のＨＢポリマー及び少なくとも１重量％、
殊に１〜３重量％のへブチドグリカンを含む。好ましく
はそのような生成物の蛋白性物質の含量は６重量多収下
である。

若干の場合、消化工程からの生成物は、そのまま、例え
ば成形材料として使用できる。別法として、ＨＢポリマ
ーは、ＨＢポリマーに対する溶剤、殊に塩化メチレン、
クロロホルム、または１，２−ジクロルエタンのような
ハロゲン化炭化水素を用いての溶剤抽出によシ抽出でき
る。ＮＰＣＭの残留割合は小さいので、例えば濾過によ
るシロップからのＮＰＣＭの分離は、直接溶剤抽出法に
おけるよシもはるかに容易であシ、従ってさらに濃厚な
シロップ、例えば５〜１５重量％のポリマーを含むシロ
ップを採用できる。それ故、抽出溶剤の必要な割合を削
減でき、従って不完全な溶剤回収による溶剤損失を低減
できる。

実施例 本発明を以下の実施例でさらに説明する。実施例中にお
けるすべてのチは重量基準で示されている。実施例１〜
５．７〜１６及び１８〜１９で使用した懸濁液は、基質
としてグルコースを用い窒素制限下での連続培養で増殖
したアルカリゲネス・オイトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　ＮＣより＃ｆ、ｊＦｔ第
１１５９９号）の培養液の遠心分離によって得られたも
のであった。

実施例１ この実施例では、約６０チの３−ヒドロキシブチレート
ホモポリマー（ＰＨＢ）含量の細胞を５０１／１１の濃
度で含むいくつかの懸濁液を、１００Ｃにおいて還流条
件下で種々の時間にわたシ沸とうした。次いでそれらの
懸濁液を冷却し、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン・塩酸塩を緩衝剤として添加し、５０ｍＭの緩衝剤
濃度とした。

次いでこれらの緩衝剤処理懸濁液を、初期細胞乾燥重量
に基き１％の蛋白分解酵素組成物を用いて、５５Ｃ及び
ｐＨ８，２において１時間温飯した。ここで用いた蛋白
分解酵素組成物は、ノボ（Ｎｏｖｏ　）インダストリイ
ス社から入手した「アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ：
商標）０．６ＬＪであシ、同社発行のセールス文献では
０．６１Ｕ／Ｉの活性を有するとされている。この「ア
ルカラーゼ」の量は、初期細胞中のＮＰＣＭの１ｏｏ１
１当シ約１．５　Ａ　Ｕに相当する。

結果の消化法の懸濁液の試料を氷冷水で稀釈し、次いで
２０，０ＯＯＧにおいて１〜２分間遠心分離した。得ら
れた遠心分離ベレットを水で３回洗浄し、次いでそれら
の蛋白含量を、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

１９３（１９５１）２６５　にロウリイ（Ｌｏｗｒｙ　
）等が発表した比色分析法に基く方法によって測定した
。結果を以下に示す。

アミノ酸分析法による蛋白分析値と比較したところ、比
色分析法はアミノ酸分析法で得られた値の約７５％の値
を与えることが判った。

実施例２ 熱処理段階の効果は、熱処理後、いずれの酵素処理もし
ない前の懸濁液の沈降速度を測定することによっても評
定できる。

使用した水性懸濁液は７２％のＰＨＢを含む細胞を２０
　ｇ／ｌの濃度で含んでいた。この懸濁液をオートクレ
ーブ中で５分間加熱する仁とにょシ熱処理し、次いで１
０００　ｒｐｍにおいてストローブ遠心分離機で遠心分
離した。いろいろな遠心処理時間経過後に固型分／液体
界面の高さを測定した。

温度が高けれは高いほど、分離が一層容易に行なわれる
ことが判る。

実施例３ 実施例１の操作を繰返えしたが、本例ではＰＨＢ含量５
２％の細胞を５０９／ｌ）含む懸濁液を用いた。

沸とうは１０分間行なった。燐脂質を除去するために、
「アルカラーゼ」による消化後に、懸濁液を、種々の量
のホスホリパーゼ酵素組成物を添加して、４０Ｃで、ｐ
Ｈ８，６において１時間温飯した・ホスホリパーゼ酵素
組成物は、ノボ・インダストリイス社のｔ−レシターゼ
（Ｌｅｃｉｔａｓｅ）　１００ＳＪであった。

「レシターゼ」処理の前後の生成物の蛋白含量を実施例
１のように測定し、そしで燐脂質を溶剤抽出しその抽出
物を酵素法で検定することによシ、残留燐脂質含量を測
定した。その酵素による検定法では、ホスホリパーゼＣ
＃素を用いた。これは、ホスファチジルエタノールアミ
ン以外のホスファタイド類を比較的遅く加水分解するの
で、存在す燐脂質の約５０％だけがこの方法で検出され
る。

従って下記の表においては、全燐脂グ１ではなくホスフ
ァチジルエタノールアミン含量と表示しである。

比較のため、上記の操作を、「アルカラーゼ」消化を省
略して、繰返えしだ。

※　初期細胞乾燥重量に基く重量饅 ※※　生成物及び初期細胞のＰ）ＩＢ含量から計算低い
ホスファチジルエタノールアミンのレベルヲ達成しうる
けれども、熱処理と「レシターゼ」消化とだけでは、比
較的多量の「レシターゼ」を用いた場合であって、７０
％以上のポリマーを含む生成物を与えるに足るＮＰＣＭ
を可溶化しえないことが判る。しかし「アルカラーゼ」
処理後に「レシターゼ」処理を行なうと、ポリマー純度
の著しい向上を達成可能とし、「レシターゼ」は少量の
蛋白のみの可溶化に影響を与える。

実施例４ 本例では［アルカラーゼ０．６ＬＪ蛋白分解酵素の種々
の濃度の比較及び種々の消化時間の比較を行なう。

実施例１の操作を繰返えした。本例では沸とう時間を１
時間とし、次いで種々の濃度の１アルカラーゼｏ、　６
Ｌ　Ｊで消化した。各消化処理から一定時間毎に試料を
採取して、比色分析法によシ蛋自分析した。生成物の実
際の蛋白含量ではなく、「可溶化された、初期細胞中の
蛋白の割合」を下表に示す。

※　初期細胞の重量に基く。

実施例５ 本例では、界面活性剤による消化の効果を評定する。

使用した細胞懸濁液は実施例３のものと同一であった。

下記の処理を採用した。

Ａ、還流条件下に１００Ｃで１時間沸とう。

Ｂ、細胞乾燥重量に基き１０％の硫酸ドデシルナトリウ
ム塩の添加、次いで還流条件下に１００Ｃで１時間沸と
う。

Ｃ０Ｂと同様、但し、５ｍＭの溶液を与えるに足るエチ
レンジアミン四酢酸を添加してから沸とう。

１１、Ａと同様、次いで細胞乾燥重量に基き１％の１ア
ルカラーゼ０．６ＬＪを添加し、５５Ｃ１ｐｉ（８，２
で１時間消化。

Ｅ、Ｄと同様、次いでＢを実施。

Ｆ、Ｄと同様、次いでＣを実施。

本実施例では、版白含量をアミノ酸分析法で測定した。

ジアミノピメリン酸含量は、残留はプチドクリカンの濃
度の指標を与える。ペプチドグリカン含量は、表示した
ジアミノピメリン酸含量のほぼ５倍である。

Ｄ、Ｐ、Ａ、＝ジアミノピメリン酸 Ｐ、Ｅ、　＝ホス７アチジルエタノールアミンＮ、Ａ、
＝核酸類 ＫＤＴＡ　＝エチレンジアミン四酢酸 上記の種々の処理は著しく低減した蛋白濃度を与えたけ
れども、ジアミノピメリン酸含量はイブチドグリカンが
ｔｌとんど可溶化されなかったことを示している、こと
が判る。

もう一つの実験では、ＰＨＢ含量６０％の細胞を５０１
／１３の濃度で含む懸濁液を上記処理Ｆに付したところ
、同様な結果を得た。処理Ｆの後に「アルカラーゼ」ま
たは硫酸ドデシルナトリウム塩を用いてさらに消化して
も、生成物の純度の著しい改善はなかった。

実施例に の実施例では、グルコースとプロピオン酸トの混合物を
基質として用いて窒素制限下で連続培養によシ増殖させ
たアルカリゲネス・オイトロフス（ＮＣｉＢ寄託第１１
５９９号）の培養液を遠心分離することによシ得た、３
−ヒドロキシブチレート／３−ヒトゝロキシバレレート
共重合体（１０モルチの３−ヒドロキシバレレート単位
を含む）を４８％含む該微生物細胞を５０１１／ｌの濃
度で含む懸濁液を使用した。

実施例５の処理Ｆを繰返えしたが、本例では１−アルカ
ラーゼ」消化の前の最初の沸とうは１時間ではなく１０
分間行なった。硫酸ドデシルナトリウム塩による消化後
に生成物をいくつかの部分に分割して、遠心分離してベ
レットを得た。

１個のベレットを、５０　ｍＭ燐酸塩緩衝液（既にＥ：
ＤＴＡが１ｍＭの濃度で添加されていた）に懸濁させた
。ベレットの重量に基き０．１％の卵白リゾチーム〔シ
グマ・ケミカルス（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ　）
社製〕を加え、その懸濁液を２０Ｃ及びｐＨ６，５で１
時間消化した。

もう１個のベレットを、１ｍＭのＥＤＴＡを添加した５
０ｍＭの酢酸塩緩衝液中に懸濁させ、はレットの重量に
基き０．１％の［ノボチーム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）　２
３４　Ｊ　（ノボ・インダストリイス社製）を加え、そ
の懸濁液を５０Ｃ及び１）Ｈ４，５で１時間消化した。

もう１個のベレットを０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
中で２０Ｃにおいて１時間消化した。このアルカリ消化
処理を、上記のりゾチーム及び「ノボチーム」による消
化から得られたそれぞれの生成物にも適用した。

※　アミノ酸分析による。

リゾチームがジアミノピメリン酸含量を著しく低減させ
たことが判る。アルカリ処理及び「ノボチーム」はジア
ミノピメリン酸の含量には著しい効果を示さないけれど
も、アルカリ処理を単独で採用した場合またはアルカリ
処理をリゾチームの後に採用した場合にはＨＢポリマー
の純度が向上した。

実施例７−１１ これらの実施例では懸濁液は、ＰＨＢ含量７９−の細胞
を９０１／ｌの濃度で含むものであった。

懸濁液をオートクレーブ中で加圧スチームを吹き込み３
分間１４０Ｕに加熱することによシ加熱処理した。次い
でこの懸濁液を冷却し、遠心分離した。

固型残渣の分割部分を水に再懸濁して、固型分含量５０
９／ｌの懸濁液（複数）を作った。これらの懸濁液に種
々の市販酵素組成物を添加して、懸濁液を、それぞれの
酵素組成物供給業者によって推奨されるｐＨ値（必要に
よシ水酸化ナトリウムの添加により調節）において５０
Ｕで６０分間消化した。

次いで不溶性残渣を遠心分離によって水性媒体から分離
し、脱イオン水で洗浄した。結果を下表に示す。

※　マイルズ社（英１）製 十　ノボ・エンザイム社（英国）製 ※※生成物及び初期πＩＩＩＪ］ｌｌ！ＩのＰＨＢ含凰
から計算。

実施例９及び１０の生成物中のＮＰＣＭは、残渣をさら
に酵素消化及び／または界面活性剤によるン肖化に付す
ことによシ、さらに可溶化できた。

実施例１１を、実施例９及び１０と比較することによシ
、蛋白分解酵素の混合物を使用すると、個々の酵素の同
等量を用いた場合よシもすぐれたＮＰＣＭ可溶化ができ
ることが判る。

実施例１２ 実施例１１の生成物を水に再懸濁させた。［ニュウトラ
ーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ）　０．５　Ｌ　Ｊの０．２５
　ｇ／１３を［アルカラーゼ０．６ＬＪの０．２５１／
ｌｊと組合せたものを用いて、上記懸濁液を５０ｔｌｌ
’及びｐ）１７゜０において６０分間消化した。残渣を
遠心分離によって水性媒から分離し、脱イオン水で洗浄
した。

残渣は９６％のＰＨＢを含んでいた。これは８４チの総
合ＮＰＣＭ可溶化に相当する。

実施例１３〜１６ 実施例７〜１１の操作を繰返えしたが、ＰＨＢ含量７５
％の細胞の懸濁液を用い、穐々の蛋白分解酵素組成物を
用い、そして消化処理はそれぞれの酵素組成物供給業者
によって推奨される温度においてｐＨ７で６０分間実施
した。各側において使用した酵素組成物の童は初期細胞
乾燥重量に基き１チであった。

ズロメリン・コンセントレート（活性１２９５ＢＴＵ／
１！；　パイナツプルの幹から得られる）及びパパイン
（活性３０，０００　ＰＵＡ；パパイヤ果実から得られ
る）の両者は、米国インディアナ州エルノ・−トのマイ
ルス・タカミネから供給されたものである。［オールプ
ロテアーゼ（Ａｌｌｐｒｏｔｅａｓｅ）　Ｊ及び［ハイ
（Ｈｉｇｈ　）　Ｔ　ｊは米国ケンタラキイ州しキシン
トンのオール・チク（Ａ１１−Ｔｅｃｈ）社から供給さ
れたものである。「オールプロテアーゼ」は、真菌、細
菌及び植物の酵素の混合物であるが、「ハイＴＪはバシ
ラス・リケニホルミス（Ｂ。

１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）から得られる。

実施例１７ この実施例で使用した懸濁液は、基質としてメタノール
を用い窒素制限下での回分式培養によシ得られたメスロ
バクテリウム・オルガノフィルム（Ｍｅｔｈｌｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ　；　Ｎ　Ｃ
Ｉ　Ｂ寄託第１１４８３号）の細胞懸濁液であった。細
胞は１７％のＰＨＢを含んでいた。

実施例７〜１６の操作を繰返えしたが、本例では、０．
５％の［アルカラーゼ０．６ＬＪ及び０．５％の「ニュ
ウト２−ゼ０．５ＬＪ（それぞれ初期細胞乾燥重量に基
く％）の混合物を酵素組成物として使用し、消化時間６
０分、ｐ　Ｈ７，０、温度５５Ｃを用いた。生成物をさ
らに複数の消化段階に付した。

その際に同じ条件を用い、各消化毎に新しい酵素を用い
、そして消化段階の間で生成物を遠心分離し、脱イオン
水に再懸濁させた。

結果は下記の通りであった。

実施例１８ この実施例で用いた懸濁液は、ＰＨＢ含量５％の細胞を
１００１／１３の濃度で含んでいた。

ｓｏｏｍｚの懸濁液を第１の攪拌機付きオートクレーブ
に仕込んだ。同量の水を第２の攪拌機付きオートクレー
ブに仕込み、窒素圧下に３５０Ｃに加熱した。第１のオ
ートクレーブは、第２、のオートクレーブ内の圧力を越
える圧力まで窒素で加圧し、次いで第１のオートクレー
ブの内容物をその超過窒素圧の力によって第２のオート
クレーズ中へ圧入した。第２のオートクレーブの併合内
容物を２時間激しく混合した。第２のオートクレーブ中
の併合内容物の温度はほぼ１７０Ｃでおったが、加えら
れた圧力は液体状態を維持するに足る値であった。次い
で第２のオートクレーブの内容物を窒素圧によって、大
気圧の捕集容器中へ押し出した。

得られた生成物を遠心分離し、遠心分離はレットを５０
０ｄの脱イオン水に再懸濁させ、次いでその懸濁液に０
，５ｇの［アルカラーゼ０．６Ｌｊを添加した。懸濁液
を５５ｔｌ’及びｐＨ７において３０分間保持した。次
いで懸濁液を５０００Ｇにおいて１０分間遠心分離した
。遠心分離ベレットを、次いで５００ｄの脱イオン水に
再懸濁した。

５ｇ、すなわち残留ＮＰＣＭの約１０７％の硫酸Ｆデシ
ルナトリウム塩を加え、懸濁液を１０００で１時間加熱
した。次いで懸濁液を５０００Ｇで１０分間遠心分離し
てはレットを得て、これを脱イオン水で２回洗浄した（
それらの洗浄の間にペレットを遠心分離により回収した
）。最後に乾燥して褐色の生成物（生成物Ａ）を得た。

上記の操作を繰返えしたが、「アルカラーゼ」消化段階
と「レシターゼ」消化段階を併合して行ない、消化のた
めにｏ、ｓＩｉの「アルカラーゼ」及び０．５ｇのルシ
ターゼ」の混合物を用いた。

Ｈ＝熱処理 Ａ　−「アルカラーゼ」消化 Ｌ　＝４レシターゼ」消化 Ａ＋Ｌ＝　「アルカラーゼ」及び「レシターゼ」を同時
に用いて消化 Ｓ　−硫酸ドデシルナトリウム塩消化 Ｗ　＝最終洗浄 ※　生成物及び初期細胞のＰＨＢ含量から計算「アルカ
２−ゼ」消化処理を初期懸濁液に直接に実施すると（す
なわち熱処理工程を省略して実施すると）、懸濁液は極
めて粘稠になり、攪拌することかできず、または不溶性
部分を分離するための処理もできなかった。

前記の褐色の生成物Ａの１部を、還流条件下で１０部の
塩化メチレンによって抽出し、得られたシロップを濾過
した。このシロップの高粘度にもかかわらず、三酢酸セ
ルロースフィルム製造に採用される如き標準的なシロッ
プ濾過法が使用できた。その理由は、除去されるべきＮ
ＰＣＭの割合がシロップの約０．５％にすぎないからで
あった。

濾過後の７０ツゾはキャストしてＰＨＢフィルムを作る
ことができた。

シロップの一部を石油エーテルＫ　加、ｔ　テ、ＨＢポ
リマーを沈澱させて微細白色粉末（Ｂ）を得た。

生成物Ａ及び粉末Ｂのそれぞれの試料を下記の方法で溶
融押出した： ３．５ｇの試料を、直径２ｕ、ランド長８朋の円形オリ
フィスをもつダイ金偏えたメルト７０−グレーダ−（英
国ウェルウィン、デイブンテスト社製）のバレルに仕込
んだ。バレルは１９０Ｃに維持した。５分間のウオーミ
ング・アップ時間後に１０ｋｇの荷重をピストンに掛け
た（ピストンの重ｚ□、ｔｉｃｌ。メルトフロ一時間は
、合計２ｇの試料がダイを介して押出されるに必要な合
計時間（上記５分間のウオーミング・アップ時間を含む
）である。

メルトフロ一時間は下記の通シであった。

生成物Ａ　Ｉｏ、５分 粉　末Ｂ　８．０分 比較のために述べると、欧州特許第１５１２３号明細書
に記載される如き噴霧乾燥／液体抽出／溶剤抽出法によ
ってアルカリゲネス・オイトロ７ス細胞から分離された
ＰＨＢ試料のメルト７０一時間は、典型的には８〜１０
分の範囲である。このことは、上記塩化メチレン抽出工
程の前または後のいずれの、ｈｂ　リマーのメルト安定
性も、直接溶剤抽出ルートによって抽出されたポリマー
のそれと同等であることを、示している。

生成物Ａは、ゲル透過クロマトグラフィで測定して約ｉ
、ｏ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏの重量平均分子量を有した。

比較のため、本例の出発原料として用いたものと同じ懸
濁液から、次亜塩素酸ナトリウム（細胞乾燥重量に基き
１５％）を用いて４０Ｃで３０分間消化することによ、
９ＰＨＢを抽出した場合には、わずかに約１０１，００
０の重量平均分子量の生成物が得られた。このことは、
過塩素酸塩による消化はポリマーの著しい分解をもたら
すことを示している。

実施例１９ この実施例で使用した懸濁液は実施例１８で使用したも
のと同じであった。５００ｍ１の懸濁液を、その中に浸
したスチーム加熱コイルによって８０Ｃに加熱し、次い
で５５Ｃまで冷却した。実施例１８に記載の１アルカラ
ーゼ」、「レシターゼ」及び硫酸ドデシルナトリウム塩
による処理を順に実施した。

懸濁液は「アルカラーゼ」消化後にわずかに粘稠になっ
たが、それでもなお攪拌可能であった。

しかし「アルカラーゼ」消化及び「レシターゼ消化」の
それぞれの後の遠心分離段階は、さらに困難であった。

その理由はフロックが極めてデリケートであって、実施
例１８で得られた堅いはレットとは異なシゲル状のはレ
ットが得られた。しかし硫酸ドデシルナトリウム塩での
処理後には安定な懸濁液が形成され、このものは遠心分
離によって容易に分離できた。この懸濁液の沈降特性を
調べるため、その２０ｍ１宛を試験管に入れて、懸濁液
の高さ６ｃＴＬの垂直カラムを与えた。褌々の添加剤を
懸濁液に添加し、種々の時間経過後に固体／液体界面の
高さを観察した。結果を下記の表に示す。

ｍ＝界面なし 電解質（Ｃａ　Ｃ７２）またはカチオン系凝集剤（「ア
クアフロック；ハ皿ｆｌｏｃｋ　Ｊ　４０５１または４
０６７）は効果を示さないが、珪藻土または多量のＨ（
Ｊの添加はｐＨを２以下に下げて沈降を生じさせうろこ
とが判る。

同様な懸濁液のカラムの低い重力加速度（Ｇ）における
遠心分離も、未変性懸濁液、及びＨＣｌでｐＨ１，６０
に酸性化した懸濁液について実施した。

５００Ｇでの種々の遠心分離時間後の界面の高さを下表
に示す。

実施例２０ アルカリゲネス・オイトロフス（ＮＣＩＢ寄託第１１５
９９号）を水性媒地中で、グルコース及びプロピオン酸
の混合物を基質とし窒素条件下に回分培養し、３−ヒド
ロキシズチレート（ＨＢ　）／　３−ヒドロキシパレレ
−ｈ　（ＨＶ）コポリマー（ＨＢ：ＨＶのモル比＝４．
９：１）を７１％含む細胞を２１１１７１１の濃度で含
む培養液を得た。

培養液を培養器から、１３５Ｃに維持した滅菌器を介し
て、次いで７０Ｃの冷却器を介して１３０１）Ａｔｊの
流量で貯蔵容器中へ送った。滅菌器での滞留時間は約７
分であった。

貯蔵容器中の培養液のｐＨを８に調節し、次いで温度が
５０Ｃに降下したときに０．２１／ｌ　の「アルカラー
ゼ０．６ＬＪを添加した。その混合物を貯蔵容器中に１
晩放置した。その間に混合物の温度は２７Ｕに下がった
。次いで混合物を遠心分離した。固体残渣のｌ−Ｉ　Ｂ
コポリマー含量は８４％であり、これはＮ　Ｐ　ＣＭの
５３％の可溶化に相当するものである。この残渣を水に
再懸濁して、固型分含量２０　ｊｉ／ｌの懸濁液を作シ
、次いでこの懸濁液を二つの部分に分割し、別々に処理
した。

Ａ、第１の部分に０．２１１７１３の「アルカラーゼ０
．６Ｌ」を添加し、その混合物を５５ｃでｐＨ８におい
て１時間消化し、次いで遠心分離した。残渣（Ｄ　ＨＢ
　：ｒ　４　リマー含童は９２％であシ、これはＮＰＣ
Ｍの７９％の可溶化に相当するものであった。

この残渣を次いで水に懸濁して、約２６０Ｆ／！の固型
分含量とし、１０　ｖｏｗ％過酸化水素５００　ｍｌ／
１３　を用いて８０ｃで２時間消化した。

この脱色した残渣を遠心分離によって分離し、水洗し、
乾燥した。この残渣のＨＢコポリマー含量は９２％であ
った。これは過酸化水素処理がＮＰＣＭをさらには可溶
化しなかったことを示している。

Ｂ、前記２分割懸濁液の第２の部分に２１／／）の硫酸
ドデシルナトリウム塩を添加し、その混合物を１時間沸
とう加熱した。次いでこの混合物を遠心分離し、８７％
のＨＢコポリマー含量ノ残渣を得た。この数値はＮＰＣ
Ｍの６３％の可溶化に相当する。

との残渣を二つの部分に分割し、別々に処理した。

■、残渣の第１の部分を水に懸濁して約１９０　ｇＡの
固型分含量の懸濁液とし、１０ｖｏ１％過化水素を５０
０　ｍｌ／ｌの量で用いて８（Ｉ’で２時間消化処理し
た。脱色残渣を遠心分離で分離し、水洗し、乾燥した。

この乾燥残渣のＨＢコポリマー含量は９６チであシ、こ
れはＮ’　Ｐ　ＣＭの９０％の総合可溶化に相当するも
のであった。

■、残渣の第２の部分をメタノールで洗浄し、次いで水
洗した後、遠心分離で分離した。この残渣のＨＢ　ニア
　、１＝　ＩＪママ−量は９３％であシ、これはＮＰＣ
Ｍの８２％の可溶化に相当するものであった。この湿潤
残渣を水に再懸濁して、２００１／／ｌの固型分含量と
し、１０　ｖｏ１％過酸化水素を５００　ｍｌ！／ｌの
濃度で用いて８０Ｕにおいて２時間消化した。得られた
脱色スラリーを遠心分離して、残渣を得て、次いでこれ
を水で洗浄し、乾燥した。この乾燥残渣のＨＢコポリマ
ー含量は９８チであシ、これはＮＰＣＭの９５チの可溶
化に相当するものであった。

実施例２１ アルカリゲネス・オイトロフス（ＮＣより寄託第１１５
９９号）を、グルコース及びプロピオン酸の混合物を基
質として窒素制限下に水性培地中で回分式培養シテ、Ｈ
Ｂ／ＨＶ：Ｉポｌｊ　−ｒ　−（ＨＢ　：　ＨＶモル比
＝４　：　１　）を７５チ含む細胞を４５１／／１の濃
度で含む懸濁液を得た。

（この実施例では、酵素及び界面活性剤の量を初期細胞
乾燥重量に基くチで表わす。）懸濁液をパイプを介して
流し、このパイプにスチームを吹き込んで１５０Ｃに加
熱した。１５０Ｃにおける滞留時間は２０秒であった。

得られた懸濁液を７０Ｃに冷却し、その温度において０
．５チの「アルカラーゼ０．６ＬＪ及び０．５％の［ニ
ュウトラーゼ０．５ＬＪの混合物を用いてｐ　Ｈ７，５
で２時間消化した。

得られた懸濁液を遠心分離によって濃縮し、次いで３チ
の硫酸ドデシルナトリウム塩を添加し、還流条件下に１
００Ｃで２時間沸とうした。

結果の懸濁液を次いで噴霧乾燥した。噴霧乾燥粉末を還
流条件下にメタノールで洗浄し、沢過し。

乾燥した。上記のいろいろな段階におけるＨＢポリマー
含量を次表に示す。

※　生成物及び初期細胞のそれぞれのＨＢポリマー含量
から割算。

（外５名） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号優先権主
張　＠　１　彊体革５月８日［相］イギリス（ＧＢ）■
８４１１６０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）３−ヒどロキシズチレートポリマー含有微生物細
   胞の水性懸濁液を少なくとも１種の可溶化剤で消化する
   ことによシ該細胞中の３−ヒドロキシブチレートポリマ
   ー以外の細胞物質を可溶化させ、次いで３−ヒドロキシ
   ブチレートポリマーを含む不溶性残留物を懸濁液から分
   離することからなる、３−ヒドロキシノチレートポリマ
   ー含有微生物細胞からの３−ヒドロキシブチレートポリ
   マー以外の細胞物の除去方法であって： 可溶化剤として蛋白分解酵素組成物及び／または界面活
   性剤を用いるーまたはその以上の段階を消化工程が含む
   こと、そして 消化工程の前または消化工程中、及びいずれかの蛋白分
   解酵素消化の前に懸濁液を８０Ｃ以上の温度に加熱する
   こと、 を特徴とする上記方法。 （２ン　可溶化剤として酵素組成物を用いるーまたはそ
   れ以上の段階を消化工程が含む特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 （３）可溶化剤として蛋白分解酵素組成物を用いる少な
   くとも一つの段階を消化工程が含む特許請求の範囲第２
   項に記載の方法。 （４）蛋白分解酵素による消化段階の前に懸濁液を少な
   くとも１００Ｃの温度に加熱する特許請求の範囲第３項
   に記載の方法。 （５）　蛋白分解酵素組成物がペプチドグリカ／の可溶
   化をほとんどまたは全く行なわないものである特許請求
   の範囲第３または４項に記載の方法。 （６）可溶化剤として界面活性剤を用いる少なくとも一
   つの段階全消化工程が含み、その界面活性剤による消化
   を、蛋白分解酵素による消化の後に実施する特許請求の
   範囲第３〜５項のいずれかに記載の方法。 （力　可溶化剤としてホスホリパーゼを用いる少なくと
   も一つの段階を消化工程が含む特許請求の範囲第２〜６
   項のいずれかに記載の方法。 （８）酵素による消化を８０Ｃ以下の温度で行なう特許
   請求の範囲第２〜７項のいずれかに記載の方法。 （９）可溶化剤として界面活性剤を用いる少なくとも一
   つの段階を消化工程が含み、その界面活性剤による消化
   を少なくとも８０Ｃの温度で行なう特許請求の範囲第１
   〜８項のいずれかに記載の方法。 θ０）少なくとも一つの消化段階において、エチレンジ
   アミン四酢酸と混合された界面活性剤を可溶化剤として
   用いる特許請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の方
   法。 Ｕυ　酵素及び／または界面活性剤による消化後に、残
   留物を過酸化水素で処理する特許請求の範囲第１〜ｌＯ
   項のいずれかに記載の方法。 ０り　少なくとも９０重８７−％の３−ヒト９０キシブ
   チレートポリマーと少なくとも１重量％の被ブチドグリ
   カンからなる組成物。