JPS6011426A - 糖尿病患者を治療する際に有用なガラクトシル−インシユリン複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、インシュリン依存性の糖尿病にかかったもの
（１ｎｓｕｌｉｎ　−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｉａｂｅ
ｔｉｃｓ　）　、特に糖尿病にかかったヒトの治療に使
用するターゲットされるインシュリン配送系（ｔａｒｇ
ｅｔｅｄ　１ｎｓｕｌｉｎｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔ
ｅｍｓ　）に関する。

インシュリンは、ヒトの全代謝に影響を及ぼすホルモン
であり、最も観察可能な効果は血中グルコース濃度の減
少である。摂取さ扛た炭水化物は、通常、臓器内で単純
な糖に破壊さｎ、次いで門脈循環内に吸収される。膵臓
は、この糖負荷に応答し、インシュリンを門脈循環に離
脱し、この門脈循環は吸収された糖および離脱されたイ
ンシュリンを肝臓に運ぶ。肝細胞上のインシュリン受容
体は、大部分のインシュリンを結合して肝細胞内のグル
コースの代謝および合成を調整する。若干のインシュリ
ンは、末梢（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　）体組織に通過し
て筋肉および脂肪組織によるグルコース取込みを容易に
する。インシュリンによる血液グルコースの総減少は、
肝臓内および末梢組織内の両方におけるこのような効果
による。

真性糖尿病は、腎臓、神経系、および目および体肢内の
血管の漸進的変性をもたらすことのある一般的慢性代謝
１章害である。多ぐの糖尿病患者においては、膵臓は、
不十分なインシュリンしか・生成しないか離脱しない。

他のものにおいては、適量のインシュリンが生成または
離脱されるが、インシュリン自体の若干の欠点または内
生インシュリンに対する個体発育の抵抗性のいずれかの
ため。

体によって有効には取シ扱ゎれない。いずれの場合にも
、使用可能なインシュリンの欠如が、＄＞５、それ故人
部分の組織は血中グルコースを代謝できす、最後にはひ
どい過血糖状態を生する。更に、体の組織は、他の栄養
を適当に代謝できない。成長は、通常損われる。未治療
のままにしておくならば、これらの組織内のインシュリ
ンの欠如は、最後に異常に多量の毒性ケトン代謝物を血
液中に生する。最後の組み合わせ効果は、昏睡および死
であることがある。

インシュリンネ足糖尿病個体の場合には、インシュリン
投与は臨界的になる。現代の医療においては、経口投与
が多分タンパク質加水分解のため効率的ではないので、
イ・ンシュリンは、皮下注射される。皮下投与されたイ
ンシュリンは、血液グルコース量の低下を生ずる。しか
し、注射によるインシュリンの投与は、糖尿病にはかか
っていない個体における膵臓生成インシュリンとは生理
学的に等価であるとは考えられない。注射する場合、周
辺組織は、インシュリンに初めに出会う。このことは、
糖尿病にはかかつていない個体のまさに正反対である。

末梢組織は、この注射されたインシュリンを吸収し、こ
ｎは肝ＭＡＫ到達するインシュリン量を減少し、そして
有意なグルコース調整機構としての肝臓の有効さを減少
する。有意量のインシュリンが注射されて適当な肝制御
を達成するならば、末梢組織は過剰調整される。それ故
、注射によって投与さｎたインシュリンは、糖尿病にか
かつていない個体の膵臓から離脱されるインシュリンと
同一の生理学的作用を与えない。

これらの問題を克服する１つの方法は、インシュリンを
肝臓に特異的にターゲットする（　ｔａｒｇｅｔ　）こ
とである。このようなターゲットされる配送系の１つの
基準は、インシュリン分子による有意な生物活性の保持
である。米国特許第４　、００３　、７９２号明細書〔
ペクチンのような多糖類と生物活性のままであるインシ
ュリンのようなポリペフーチドとの非ターゲットの複合
体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　）　：詳細に開示されたア
ルギン酸とインシュリンとの複合体〕。

米国特許Ｆ　３，６４５，８５２号明細書（ジシアンハ
ライドを使用して水不溶性多糖類またはそれらの誘導体
、例えはデキストランを水溶性ペグチド、例えばインシ
ュリンに結合して、生物活性を保持する非ターゲットの
複合体を生成する方法）参照。

別の望ましい特徴は、容易な経済的な方法によってター
ゲットされるインシュリン配送系を調製する能力である
。また、ターゲットされる系は、好ましくは長期間にわ
たって安定のままであるべきである。

１つのこのようなターゲットされるインシュリン配送系
は、１９８０年４月１６日発行の欧州特許量ｊＬ３９，
８４２号明細誓に開示されている。インシュリンは、極
性脂質、好ましくはジステアロイルレシチンの大部分お
よびジガラクトシル誘導体、好ましくはジガラクトシル
ジグリセリドの小部分からなる脂質膜構造物内にカプセ
ル化さ扛てインシュリン含有小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ　）
を形成する。ジガラクトシル誘導体は、このインシュリ
ン含有小胞の場合には肝臓標的剤（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
　ａｇｅｎｔ　）として作用する。このような小胞は、
基本的には、極性脂質およびジガラクトシル誘尋体を一
緒に混合し、インシュリンを添加し、次いで得られる混
合物を音波処理することによって形成される。２層壁が
小胞によって担持さｉするか小胞内に担持される薬物ま
たは他の有益な薬剤（例えば、ホルモン）を制御自在に
離脱する荷電親水基を有する各種のコレステロール誘導
体または炭化水素と一緒にコレステロールおよびジステ
アロイルレシチンを包含する脂質小胞を開示し、そして
コレステロールの成る種のアミノガラクトース訪導体が
小胞を体の各種の部分に標的する特性を有することを開
示している１９８Ｊ年５月加日発行の欧州％許出願第２
８゜９１７号明細書も参照。

インシュリン含有小胞は、インシュリンを肝−に配送す
る実行可能な方法を提供する。小胞内含有されるインシ
ュリンの生物活性は、疑いなくインシュリン分子が化学
的に未変性のままであるという事実のため有意である。

しかし、特に前記欧州特許出願第９，８４２号明細書に
開示の音波処理法によるインシュリン含有小胞の製造は
、制御′１〜ることが困難であることがある。特に、イ
ンシュリン含有小胞の収量は、極めて低いことがあり、
インシュリンのＰ）使用用の困難な分離工程を必要とし
、この工程はその生物活性を保持することもあるし保持
しないこともある。更に、小胞の膜構造物が長期間の間
に解体し、インシュリンを離脱する傾向があり、それ故
ターゲットさｎるインシュリン配送系が破壊される。イ
ンシュリン含有小胞は生物活性の基準を満たすが、製造
の困難さおよび長期間の間の安定性のポテンシャル欠如
は、別のターゲットされるインシュリン配送系を魅力的
にさせる。

それ故、本発明の目的は、小胞を必要としない肝臓用の
ターゲットされるインシュリン配送系を提供することに
ある。

本発明の別の目的は、生物活性なインシュリンを肝臓に
与えるターゲットされる配送系を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、通常の合成法によって調製で
きるターゲットされるインシュリン配送系を提供１−る
ことにある。

本発明のなお更に他の目的は、長期間にわたって比較的
安定であるターゲットされるインシュリン配送系を提供
することにある。

本発明のこれらの目的および更に他の目的は、後述され
る。

他の背景技術 リー等「乾燥状態におけるタンパク負と還元糖との反応
；Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース
、Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンとカゼインとの反応」。

Ｂｉｏｃｈ＋ｍ　、　ｅｔ、　ＢｉｏｐＨｙｓ、Ａｃｔ
ａ、、　Ｖｏｌ、　９　、　（１９５２）　ｓｐｐ、　
５６−６０　（Ｃｈｅｍ、Ａｂｓ、　４７　：　６４５
２　ｄ　）は、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−
ガラクトース、Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミンとカゼインとの反応を開示している。

米国特許第３，８４７，８９０号明細書は、インシュリ
ンを酸性単糖、特ＫＮ−アセチルノイラミン酸またはグ
ルコン酸と反応させることによって生成される減少した
抗原応答を有する複合体を開示している。

ロス等の「インシュリン−リチンＢ鎖樋合体：リチン結
合活性およびインシュリン生物活性を有する混成分子Ｊ
　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　２５６
．Ｎｏ。

１１、　（１９８１）　、　ｐｐ、　５３５０−５４は
、インシュリン受容体に結合し−かつ天然の（ｎａｔｉ
ｖｅ　）　イン７ユリンの効力のかの効力を有するイン
シュリン−リチンＢ＠複合体を開示している。

インシュリン−デキストラン錯体および複合体も、既知
である。米国特許第３　、７８８　、９４８号明細畜；
カゲダル等、「臭化シアンおよび有機シアネートによる
共有タンパク質の多糖類への結合：可溶性グリシン−、
インシュリン−およびアンピシリン−デキストランの生
成Ｊ　、　Ａｃｔａ、　Ｃｈｅｍ、　５ｃａ−ｔＩｄ−
＋　Ｖｏｌ　、２５　＊　（１９７１）　＋　ｐｐ、］
　８５５−５９　；　特開昭４８−８９１６号公報；特
開昭４８−４６２３号公報；ベルギー特許第８１３，２
５１号明細書；タルイ等、「隔膜内での合成インシュリ
ン−デキストラン錯体による糖輸送およびグリコーゲン
生成の平行刺激」。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　９１　、　
（１９７２）　＋　ｐｐ、　１４４２−４６（Ｃｈｅｍ
、　Ａ、ｂｓ、　７５：　５３０１２ｘ）　：　スズキ
等、「インシュリンの作用法：インシュリン−デキスト
ラン錯体の性質および生物活性Ｊ　、　Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ。

９０　＋　（１９７２）　＋　ｐｐ−１２２０−３０（
Ｃｈｅｒｎ、Ａｂｓ、　７７　ｔ５６９４４　ｔ　’）
　；　カルウィン等、１“セファロース−インシュリン
によるチロシンアミノトランフェラーゼの誘導Ｊ　、Ａ
ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　Ｖ
ｏｌ、　１６４　。

（１９７４）、ｐＩ）、　５５２−５９（Ｃｈｅ、Ａｂ
ｓ、８１：１６３６８６ｑ）；７−ムストロング等、「
デキストラン結合インシュリン：生体内または試験管内
で生物活性を有する可溶性高分子量誘導体Ｊ　、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　Ｖｏ
ｌ、　４７　、　（１９７２）　ｑ　ｐ。

３５４−６０　（Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓ、　７７　：５６
９２７　ｑ　）　；　バーカー等、「テキストランヵー
ボネートトアミノ酸およびポリペプチドとの反応Ｊ　、
　Ｃａｎｂｏｈｙｄ、　Ｒｅｓ、。

Ｖｏｌ、　２５．　（１９７２）　、　ｐｐ、　２３７
−４１　（Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓ。

７８：　５８７８０　ｆ　）　；　トラパー等、「超活
性インシュリン、ノロラクチンおよび胎盤ラクトゲンの
特性化」、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ
ｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　Ｖｏｌ、　６６゜（１９７
５）　、　ｐｐ、　７９３−９８　（Ｃｈｅｍ、　Ａｂ
ｓ、　８４：　５１０ａ　）；トラバー等、「インシュ
リンおよび乳腺上皮細胞膜Ｊ　、　Ｒｏｌｅ、　Ｍｅｒ
ｎｂｒａｎｅｓ　Ｍｅｔａｂ、　Ｒｅｇｕｌ、　Ｐｒｏ
ｃ。

Ｓｙｍｐ、、　（１９７２）　、　ｐｐ、　３４１−４
７　（Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓ、　７８：１１９５６８　ｓ
　）　＋　コルブ等、「インシュリン作用の研究用道具
としてのセファロース−インシュリンの再評価Ｊ　、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、
　Ｓ、　Ａ、。

Ｖｏｌ、　７２．　（１９７５）　、　ｐｐ、　２４８
−５３　（Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓ。

８２　：　１０６７０９ｗ　）　；サカモト等、１−脂
肪組織の代謝に対する天然インシュリンおよびインシュ
リン−デキストラン錯体の比較効果Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ、　Ｂ−ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、、　Ｖｏｌ、
　４９８　、　（１９７７）　ｅ　ｐｐ、１０２−１３
（Ｃｈｅｍ、Ａｂｓ、　８７　：　９６３３８　ｍ　）
　；りｉ−ターカサス、「インシュリンと細胞膜と゛の
相互作用：インシュリンの主要作用ｊ　、　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、ｅＶｏ
ｌ、６３．（１９６９）、　ｐｐ、４５０−５７（Ｃｈ
ｅｍ、Ａｂｓ。

７１：　８８１６０ｂ　）　；モルテニ、「巨大分子化
合物の生成による薬物の活性を長くする方法」、Ｅｕｒ
。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ−Ｃｈｉｎ、　’Ｊ：ｈｅｒ
、、　Ｖｏｌ、　９．　（１９７４）　＋ｐｐ、　６１
８−２０　（Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓ、　８３：　４８１３
０　ｈ　）参照。

グルコース−インシュリン複合体も、既知である。タネ
ンバウム、「タンパク質カルボニル褐色化系ニゲルコー
スとインシュリンとの反応の研究」。

Ｊ、　Ｆｏｏｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　３７．　（
１９６６）　＋　Ｉ）Ｉ）、５３−５７；　シュワルツ
等、「乾燥状態におけるタンパク質と還元糖との反応：
インシュリンのα−およびε−アミノ基の相対反応性」
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、。

Ｖｏｌ、　５０．（１９５２）、　ｐｐ、　７１３−１
６　；　アンゼンパツヒヤー等、ｒＤ−グルコースのイ
ンシュリンへの結合Ｊ　、Ｂｉｏｃｌｌｉｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、、　Ｖｏｌ、　３８６゜（１９
７５）　、　ｐｐ、　６０３−７　（Ｃｈｅｍ、　Ａｂ
ｓ、　８３：　１３２０ｅ　）；クラーク等、［タンパ
ク質カルボニル褐色化系からの０累の単離および特性化
：２種のインシュリン−グルコース色素用のモデル」、
Ｊ、　Ａｇｒｉｃ。

Ｆｏｏｄ　Ｃｈｃｍ、、　Ｖｏｌ、　２２．　（１９７
４）　、　ｐｐ−１０８９−９３（Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓ
、　８７：　１４７２０６　ｃ　）参照。

■、ウエックスカルー　「ガラクトースおよびインシュ
リンＪ　、　Ｚ、　Ｆ、　Ｋ１１ｎ、　Ｍｅｄｉｚｉｎ
、　Ｖｏｌ。

１４０、（１９４２）、ｐｐ、　３２７−４２は、特に
インシュリンによるガラクトース代謝の研究に関する。

各種の非糖類−インシュリン複合体は、既知であり、そ
の多くは低血糖剤として有用である。米国特許第３，８
２３，１２１　号明細書（Ｎ−アミノアシル置換インシ
ュリン）；西独特許第２，６００，９７１号明細書（イ
ンシュリンと有機塩基との反応によって生成される低ア
レルキーーインシュリン複合体）；ベルギー特許第７７
０　、７５８号明細書（インシュリンのアシル誘導体）
；西独特許第２，１６２１１６４号明細書（ビス（ｔ−
ブチルオキシカルボニル）インシュリン複合体）；米国
特許第３，５２８゜９６０号明細ｔ（Ｎ−カルボキシア
ロイルインシュリン複合体）参照。

発明の開示 本発明は、インシュリン依存性の糖尿病にかかったもの
、特に糖尿病にかかったヒトの治療に有用な生物活性ガ
ラクトシル−インシュリン複合体に関する。これらの複
合体は、インシュリンに共有結合された少なくとも１つ
のＤ−ガラクトシル基からなる。Ｄ−ガラクトシル基は
、複合体を肝細胞にターゲットし、それ故インシュリン
のより良好なバランスが肝臓および筒辺組織に与えられ
て、糖尿病にかかったものの血液グルコース量を制御で
きる。インシュリンを肝臓にターゲットすることによっ
て１本発明の複合体は、糖尿病にかかつていないものの
インシュリン離脱機構（膵臓によって生成されたインシ
ュリンは、最初に肝臓に配送される）の近い近似を可能
にさせる。

技術分野および背景技術の章に既述のように、インシュ
リンと各種の糖または糖様分子との間の多数の生物活性
錯体および複合体は、技術上既知である。しかし、本発
明の鍵は、特定の糖分子、即ちＤ−ガラクトシル基をイ
ンシュリンに共有結合すること、および生成された複合
体が生物活性インシュリンを肝臓にターゲットするのに
使用することに存する。肝細胞のアシアログリコフ′ロ
チイン（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　）受
容体ｔま、Ｄ−ガラクトシル基、ｌｖｆ［Ｎ−アセチル
−Ｄ−ガラクトシルアミンに対する高度の優先を示すこ
とが確認されている。これらの肝細胞は−このようなり
一ガラクトシル基が共有結合されているインシュ１ｊン
分子に対する強い親和力を示すことも見い出されている
。このように、本発明のガラクトシル−インシュリン複
合体は、肝臓への配送用に特異的にターゲットさ扛る。

本発明のガラクトシル−インシュリン複合体は、ターゲ
ットされるインシュリン配送系の要件を満たす際に特に
良好である。複合体のインシュリン分子の生物活性は、
天然インシュリンに比較して著しい。事実、肝臓ターゲ
ット性のため、本発明の複合体は、注射された天然イン
シュリンよりもかなり少投与量で有効である（即ち、糖
尿病にかかった犬で測定された肝効果）。また、これら
の複合体は、他の糖類をインシュリンに結合させる既知
の合成法によって容易に生成され得る。更に、これらの
複合体は、長期間にわたって生物活性および肝臓ターゲ
ット能力に関して比較的安定である。

Ａ、ガラクトシル−インシュリン複合体本発明のガラク
トシル−インシュリン複合体の生物活性成分は、インシ
ュリン分子である。本明細書で使用するｌ−生物活性な
」なる用語は、糖尿病にかかったものの血液グルコース
量を制御、特に減少するインシュリン分子の能力を意味
する。

本発明の複合体のインシュリン分子は、天然の化学的に
非結合のインシュリンに比較して著しい生物活性を有す
る。典型的には、こｎらの複合体の生物活性（糖尿病に
かかってい７ｍ−いマウスで測定された周辺効果）は、
天然のインシュリンの生物活性の約７０〜７５％である
。

本明細書で使用する「インシュリン」なる用語は、本発
明に従ってガラクトシルーインシュリン複合体を生成で
き、かつ糖尿病にかかったものに投与した場合に生物活
性である如何なるインシュリン分子も意味する。好適な
インシュリンの例は、ヒトインシュリン、牛インシュリ
ンおよび豚インシュリンである。特定のインシュリン源
は、本発明の実施には特別にはＮ茨ではない。このよう
に、組換えＤＮＡ技術によって作られた微生物から誘導
されるインシュリンは、本発明のガラクトシル−インシ
ュリン複合体用に好適であることができる。

本発明のガラクトクルーインシュリン複合体の肝臓ター
ゲット成分は、Ｄ−ガラクトシル基である。本明細書で
使用する「Ｄ−ガラクトシル基」Ｂる用語は、複合体を
肝細胞にターゲットできるガラクトシルクリコシドを意
味する。好ましいＤ−ガラクトシル基は、Ｄ−ガラクト
シルおよびＮ−アセチルーＩ）−ガラクトシルアミン（
２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトシル）
グリコシドである。肝細胞は、Ｄ−ガラクトシル基にお
いて特に好ましいＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトシルアミ
ン部分に対して高度の親和力を有する。

Ｄ−ガラクトシル基は、生成される複合体が著しい生物
活性を保持するようにインシュリンに共有結合される。

この複合体は、式 ％式％］ （式中、ＧａｌはＤ−ガラクトシル基であり；工はイン
シュリン分子であり；ＬハＧａ１を工に共有結合する結
合基であり；そしてｎは少なくとも１である） によって構造的に表わされ得る。好適なＬ基の例は、Ｄ
−ガラクトシル基をインシュリン分子に結合する共有結
合を含有するアミド−アミン、エステル、尿素、チオ尿
素、またはエーテルを与えるものである。

しばしば、Ｑａ　Ｉ−Ｌ分子は、インシュリン分子への
結合前に天然存在物から合成的に生成される。

例えは、ラクトースおよびメリビオースは、それツレラ
クトビオン酸およびメリビオン酸に酸化され得る。更に
、Ｄ−ガラクトシル基は、それぞれ０−１Ｓ−またはＮ
−グリコシド結合によって各種のヒドロキシカルボン酸
、メルカノトカルボンばまたはアミノカルボン酸と結合
されてＤ−ガラクトシル結合分子を生成できる。９−Ｄ
−ガラクトシル結合分子の例は、０−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−（１→４）−Ｄ−グルコン酸（ラクトビオン酸
）、０−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−Ｄ−グ
ルコン酸（メリビオン酸）、０−Ｄ−ガラクトシル（１
→２，３．ｔｈ：たけ５）−Ｄ−グルコン酸。

０−Ｄ−ガラクトシル−（１→２，３，４．５または６
）−ガラクトース＋　０−Ｄ−ガラクトシル−（１→２
，３．４または５）−Ｌ−アラポン酸、０−Ｄ−ガラク
トシル−（１→２，３．４ｆ、たは５）−Ｄ−キシ０ン
酸、０−Ｄ−ガラクトシル−（１→２または：３）−酒
石酸−〇−Ｄ−ガラクトシル−（１→２）−リンゴ酸、
０−Ｄ−ガラクトシル−（１→２）−グリコール酸、０
−Ｄ−ガラクトシル−（１→２）−乳酸、０−Ｄ−ガラ
クトシル−（１→４）−酪酸および９−Ｄ−ガラクトシ
ル−（１→３）−クエン酸である。

５−Ｄ−ガラクトシル結合分子の例は、５−Ｄ−ガラク
トシル−（１→６）−Ｄ−グルコン酸、旦−Ｄ−ガラク
トシル−（１→４）−酪酸、旦−Ｄ−ガラクトシル−（
１→３）−プロパン酸、互−Ｄ−ガラクトシル−（ｌ→
２）酢酸および０−Ｄ−ガラクトシル−（１→４）−３
−Ｄ−グルコシル−（１→６）−ヘキサン酸である。

Ｎ−Ｄ−ガラクトシル結合分子の例は、Ｑ−β−Ｄ−ガ
ラクトシル−（１→４）−Ｎ−Ｄ−グルコシル−（１→
４）−酪酸、０−Ｄ−ガラクトシル−（１→６）−Ｎ−
Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−プロパン酸、Ｎ−
Ｄ−ガラクトシル−（１→２）−酢酸、およびＮ−Ｄ−
ガラクトシル−（１→５）−ペンタン酸テある。

前記ガラクトシル結合分子の場合、Ｄ−ガラクトシルの
代わりにＮ−アセチル−ガラクトースアミニル基を使用
できる。

Ｄ−ガラクトシル結合分子は、好ましくはアミド結合に
よってインシュリン分子のアミン基に共有結合される。

インシュリンは３つのこのようなアミノ基（末端フェニ
ルアラニンおよびグリシン残基およびリシン残基上の６
−アミノ基）を含有するので、１．２または３Ｄ−ガラ
クトシル基が、アミド結合によって共有結合され得る。

このように、Ｄ−ガラクトシル基対インシュリンのモル
比が１：１から３：１（ｎが１〜３）の範囲内である複
合体の混合物が一調製され得る。これらの混合物（典型
的にはモル比約１．３：１から約２．６＝１）は、精製
されてｎが１〜２である複合体を得ることができる。

Ｂ、ガラクトシル−インシュリン複合体の製法本発明の
ガラクトシル−インシュリン０合体は、ペズチドの合成
に使用される成る種の常法によって生成され得る。例え
ば、カルボン酸基を含有するＤ−ガラクトシル結合分子
は、インシュリンのアミン基に結合されてアミド結合を
形成できる。

この方法は、通常、カルボン酸基を、アミン基と反応す
る活性形態に転化することを必要とする。

酸塩化物、混合無水物、アシルイミダゾール、カルボシ
イはド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等が、
この目的で使用され得る。反応が水性媒体中において温
度およびｐｎの温和な条件下で実施できるので、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルは、ガラクトシル−イ
ンシュリン複合体の生成用に特に有用である。

活性エステルの生成に関しては、酸および結合剤、例え
ばＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドが、非７
０トン性溶媒、例えばピリジンに溶解される。この溶媒
系は、好ましくは水を実質上含ます、結合剤の失活およ
び生成された活性エステルの前加水分解を防止する。

ガラクトシル−インシュリン複合体の生成に関しては、
活性エステルは、水に溶解され、次いで１ンシユリンを
含有する生理食塩水溶液に小増分（例えば、１滴すつ）
で添加される。Ｄ−ガラクトシル基対インシュリンの特
定のモル比は、インシュリンの量に比較して使用される
活性エステルの址および反応混合物のｐＨＫ特に依存す
る。活性エステル対インシュリンの比率を増大すること
は、一般に複合体中のＤ−ガラクトシル基対インシュリ
ンの比率を増大する。ｐＨ７においては一リシンの６−
アミノ基（ｐＫａ約１０）はゆつくシとアシル化され、
一方グリシンおよびフェニルアラニンのアミン基は容易
にアシル化される（　ｐＫａ７．６〜８．４）。２：１
よシも低いＤ−ガラクトシル基対インシュリンＱ比率を
有する複合体は、多分更にそうである。ｐＨ８，５にお
いては、リシンの８−アミン基は、より高い程度アシル
化される。

２：１よりも高いＤ−ガラクトシル基対インシュリンの
比率を有する複合体は、十分量の活性エステルが使用さ
れるならば多分更にそうである。

本発明のガラクトシル−インシュリン複合体の別の製法
は−Ｙ、Ｃ，リー、Ｃ，Ｐ、ストウェルおよびＭ、Ｊ、
フランツ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５（１Ｂ）、
　３９５６（１９７６）に記載の方法を適当に修正した
方法である。この方法においては、シアンメチル−１−
チオーＤ−ガラクトシドは、メタノール中のＨｅ　ｌま
たはナトリウムメトキシドで２−イミノ−２−メトキシ
エチル−１−チオーＤ−ガラクトシドに転ベヒされる。

２−イミノ−２−メトキシエチルグリコシドは、インシ
ュリンのアミノ基と若干アルカリ性の条件下（ｐＨ約８
．５）で反応されて、アミン結合によって結合されたガ
ラクトシル−インシュリン複合体を与える。

本発明のガラクトシル−インシュリン複合体の別の製法
は、Ｑ−アミノアリール−Ｄ−ガラクトシドを対応のイ
ソチオシアネートに転化することを包含する。インチオ
シアネートは、インシュリンのアミン基と結合されてチ
オ尿素壓のガラクトシル−インシュリン複合体を生成す
る。

本発明のガラクトシル−インシュリン複合体の別の製法
は、Ｑ−アミノアリール−Ｄ−ガラクトシドを対応のジ
アゾニウム塩に転化し、そしてジアゾニウム塩をインシ
ュリンと反応させる方法である。

本発明のガラクトシル−インシュリン複合体の別の製法
は、アミン含有Ｄ−ガラクトシドのブロモアセトアミド
誘導体を生成し、その後ブロモアセトアミドをインシュ
リンのアミノ基（１個または２個以上）と結合する方法
である。

本発明のガラクトシル−インシュリン複合体の別の製法
は、グレー、Ａｒｃｈ、　１３ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、＋１６３、４２６（１９７４）に開示の方法
に従ってインシュリンと非還元末端Ｄ−ガラクトシル基
含有二糖またけオリゴ糖との混合物をアルカリ金属シア
ノボロヒドライドで処理する方法である。

本発明のガラクトシル−インシュリン複合体のなお別の
製法は、アグリコン部分がアミノ基を有するＤ−ガラク
トシルクリコシドを、カルボジイミド結合剤を使用して
インシュリンのカルボキシル基と結合する方法である。

この方法においては、インシュリンのアミン基は、好ま
しくは封鎖され、イｙ　ｙ　ｚ　Ｉ）　７　Ｇ＋ｌ’Ｊ
］　ｌ’）え、工□１お。ｊ本発明のカラクトシルーイ
ンシュリン複合体は、インシュリン依存性糖尿病にかか
ったもの、特に糖尿病にかかった哺乳動物、特に糖尿病
にかかったヒトの治療に際して有用である。従って、本
発明は、ガラクトシル−インシュリン複合体を糖尿病に
かかったものに糖尿病にかかったものの血液グルコース
量を安全に減少するのに有効な量で非経口投与すること
によって、このような糖尿病にかかったものを治療する
方法を提供する。本明細書で使用する「非経口投与」な
る用語は、局所適用または経口投与以外によって複合体
または複合体を含有する組成物を体の組織に導入するこ
とを意味する。このように、非経口投与は、限定せずに
、例えば胞膜内投与、硬膜外投与、筋肉内投与、静脈内
投与、腹腔的投与および皮下投与である。

本明細書で使用する「血液グルコース量を安全に減少す
るのに有効な量」なる用語は、薬物療法に伴う合理的な
利益／危険比において、糖尿病にかかったものの血液グ
ルコース量の著しいが安全な減少を与えるのに有効であ
る複合体の量を意味する。健全な医学判断の範囲内で、
複合体の投与量は、糖尿病にかかったものの状態の重篤
度、治療期間、使用される特定の処方、および使用され
る特定の処方内の同様の因子、および患者ｔｒｓは主治
医の特定の知識および紗験の範囲内の同様の因子に応じ
て変化するであろう。不発明のガラクトシル−インシュ
リン複合体は、典型的には約１０ミクロ単位／に９／日
〜約１０単位／ｈ７日の割合、好ましくは約５００ミク
ロ単位／初／日〜約１単位／に４／日の割合で投与され
る。

本発明の〃ラクトシルーインシュリン複合体は、好まし
くは非経口投与用組成物に調製される。これらの組成物
は１本発明の複合体および製薬上許容可能なキャリヤー
（１穐または２種以上）からなるか、本質上それらのみ
からなる。本明細書で使用する「製薬上許容可能なキャ
リヤー」なる用語は、製薬組成物に使用できる液体物質
ｆ意味する。製薬キャリヤーとして役立つことができる
物質の例は、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水お
よびホスフェート緩衝液である。製薬キャリヤー（１種
または２種以上）は９本発明の複合体と一緒に使用され
て、投薬間係で実際的サイズに十分な複合体濃度を与え
る。典型的には、！Ｂ薬キャリヤーは、組成物の少なく
とも約９９重ｉ％、好ましくは少なくとも約９９．９９
重量％を構成する。

以下の具体例は、ラクトピオニル−およびメリオビオニ
ルーインシュリン複合体の製法に関し、そして本発明に
係るガラクトシル−インシュリン複合体の製法を説明す
る。

具体例１ 生成 ピリジン１０ｆｎｌに溶解されたラクトビオン酸２．０
２が、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１、
２０　ｔと一緒に０℃の温度で０．５時間攪拌された。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．６４Ｆか、この混合
物に添加され、次いで３℃で肋時間攪拌された。

１この反応混合物は、−過されてジシクロヘキシル尿素
（ＤＣＵ）を除去した。Ｐ液は、回転蒸発器（浴温４０
℃）上で蒸発乾固されてＮ−ヒドロキシスクシンイミド
のラクトビオン酸エステルを含有する残渣を与え、この
残渣は使用されるまで３℃で貯蔵された。メリビオン酸
エステルは、メリビオン酸を使用して出発して、同一方
法によって得られた。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのラクトビオン酸エステ
ル０，６ｖが、水に溶解さ１１だ。この水溶液は、濾過
されて残留ＤＣＵ　を除去した。Ｖ液は、塩化メチレン
の一部分１５ｍで３回抽出さ扛て未反応ＤＣＣを除去し
た。ラクトビオン酸エステルを含有する水層は、インシ
ュリン６０００単位を含有する攪拌生理食塩水溶液２０
−に室温で３０分にわたツ？　−滴ずつ添加された。ラ
クトビオン酸エステルの添加時に、生理食塩水溶液は、
０．５Ｎ水酸化ナトリウムの添加によってｐＩＩ７に維
持さ１また。

すべてのラクトビオン酸エステルが添加さ′ｎだ後、反
応混合物は、室温で１時間放置され、次いで３℃で貯蔵
された。反応混合物は、ゲル濾過によって分離さ１１て
ラクトピオニル−インシュリン複合体の混合物を得た。

ラクトピオニル−インシュリンの収量ハ、０．２４２で
あった。複合体は、デュバス等、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、。

２８、３５０　（１９５６）のフェノール−硫酸法によ
って測定してラクトピオニル対インシュリンのモル比１
．３：Ｉを有していた。この複合体の混合物は、リンド
セイおよびシャル、Ｂｉｏｃｂｅｍ、　Ｊ、、　１２１
゜７３７−４５　（１９７１）　の方法に従ってＤＥＡ
Ｅ　５−ｅｐｈａｄｅｘ　カラムクロマトグラフィーに
よって分離さｎてＮ−末端フェニルアラニン（Ｂ−１）
で置換さ扛たラクトピオニル−インシュリン複合体（ｎ
＝１）を得１こ。インシュリン２０００単位が前記のよ
うなＮ−ヒドロキシ゛スクシンイミドメリビオネ−１ｏ
、ｏｓｙで処理された場合、メリビオニルーインシュリ
ン複合体の収量はｏ、ｏｓｒであシ、メリビオニル対イ
ンシュリンのモルｊｉＪｊ　１．３　：　１　テ、１．
．ツた。

具体例２ 生理食塩水溶液のｐＨが８．５に維持された以外は具体
例１におけるようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドのラ
クトビオン酸エステル１．８２がインシュリン６０００
単位を含有する生理食塩水溶液と反応された。複合体の
収量は、０．２６ｆであった。

複合体は、ラクトピオニル対インシュリンのモル比２．
６：１を有していた。この複合体の混合物は、ＤＥＡＥ
　５ｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフイーによって
分離されてＮ−末端グリシン（Ａ−１）およびフェニル
アラニン（Ｂ−１）で置換されたジラクトビオニルーイ
ンシュリン複合体（ｎ＝２）を得た。

Ａ、実験法 糖尿病にかかった犬は、餌を与える前に投与されたレギ
ュラーインシュリン（ｒｅｇｕｌａｒ　１ｎｓｕｌｉｎ
　）２単位十登録商標ウルトラレンチ（Ｕｌｔｒａｌｅ
ｎｔｅ　）インシュリン８単位の毎日の投与量に維持さ
れた。

インシュリンの投与は、ラクトピオニル−インシュリン
複合体を注入する４８時間前に停止された。

犬は、スリング（ｓｌｉｎｇ　）に入れられ、そして０
．９％規定生理食塩水溶液が各人の１つの撓側皮靜脈に
０．５ｍＺ／分の速度で注入された。複合体を注入する
（資）分ｍ１、および１５分前および注入開始時に、血
液試料は対何の撓側皮靜脈から得られ、ミクロヘマトク
リット管に移され、そして遠心分離された。これらの血
液試料からの上澄液血漿のグルコース含量は、ベックマ
ングルコース分析機で２回で決定された。次いで、０６
９％生理食塩水溶液に溶解された複合体は、生理食塩水
溶液単独の代わりに注入された。犬５〜１０匹が、各実
験群で使用された。複合体は、１または２匹の犬に特定
の投与量で０．５ｍ／分の速度で投与された。各種の時
間間隔において（以下の表参照）、血液試料がとられ、
そしてグルコ−スフ％が測定さ扛た。複合体による血液
グルコースの相対減少率は、注入開始時（零時間）にお
けるグルコ−スキ％に比較しての各サンプリング時間に
おけるグルコースｍ９％から計算された。

Ｂ、結果 １、　ラクトピオニル−インシュリン複合体（ｐ　ｈ　
ｅＢ−１） 投与量 ０．４　０　４　４　５　１０　１１ ４．０　０　４　７　１０　１６　１６投与量 ０．６７　０　−１　１　−２　２　１　−２６．７０
　０　１　０１７　１６ ６７　０　−１　−１’０　３　１１　１７出願人代理
人　猪　股　清 手　続　ン（１１ｉＬ　ｆ村　（方１い昭和５９４７月
、、１０日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １　事件の表示 １１７１和５９年　特訂願　第５４１／１３号２　発明
の名称 糖尿病患者を治療Ｊる際にｈ用なガラク１−シルーイン
シュリン複合体 ３　補正をりる者 事ｆ１どの関係　特ｈ１出願人 ヂ、ブ「１クター、」−ンド、ギャンブル、カンパニー ４代１１１！人 １引　和　５９４ｆ　６　月　Ｇ　Ｅｌ（発送ＩＥＩ　
ＩＩＩ和５９年６１４２６１１）６　補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物活性であり、かつ肝臓にターゲットするガラク
   トシル−インシュリン複合体であって、インシュリンお
   よび前記インシュリンに共有結合すした少なくとも１つ
   のＤ−ガラクトシル基カラなることを特徴とするガラク
   トシル−インシュリン複合体。 ２、前記Ｄ−ガラクトフル基が、Ｄ　−、−７７ラクト
   シルおよびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトシルアミンから
   なる群から選択される特許請求の範囲第１項に記載の複
   合体。 ３、一般式 ％式％ Ｃ式中、ＧａｌはＤ−ガラクトシル基であり、■はイン
   シュリン分子であり、ＬはＧａｌを１に共有結合する結
   合基であり、セしてｎは少なくとも１である） を有する特許請求の範囲第１項に記載の複合体。 ４、０ａｌ　−Ｌ　が、０−１Ｓ−またはＮ−Ｄ−ガラ
   クトシル−グリコシドであり、セしてｎが１〜３である
   特許請求の範囲第３項に記載の複合体。 ５、前記Ｄ−ガラクトシルーグリコシドが、ラクトピオ
   ニルおよびメリビオニルからなる群から選択される特許
   請求の範囲第４項に記載の複合体。 ６、　ｎが１〜２である特許請求の範囲第５＊に記載の
   複合体。 ７、インシュリンおよびこのインシュリンに共有結合さ
   れた少なくとも１つのＤ−ガラクトシル基からなる複合
   体、および製薬上許容可能なキャリヤー少なくとも約９
   ９皿量％からなることを特徴とする非経口投与用の組成
   物。 ８、インシュリン依存性糖尿病にかかったものに、イン
   シュリンおよびこのインシュリンに共有結合された少な
   くとも１つのＤ−ガラクトシル基からなる複合体を糖尿
   病にかかったものの血液グルコース量を安全に減少する
   のに有効な量で非経口投与することを特徴とするインシ
   ュリン依存性糖尿病にかかったものの治療法。 ９、複合体が、約ｌＯミクロ単位／に４／日〜約１０単
   位／Ｋｇ／臼の速度で投与される特許請求の範囲第８項
   に記載の方法。 １０、複合体が、皮下投与される特許請求の範囲第９項
   に記載の方法。 １１、糖尿病にかかったものが、糖尿病にかかった哺乳
   動物である特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２、糖尿病にかかった哺乳動物が糖尿病にかかったヒ
   トである特許請求の範囲第１１項に記載の方法。