JPS5982096A - ステロイド配糖体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素反応によるステロイド配糖体の製造法に
関するものである。

ジギタリス、ケジギタリス、チョウセンアサガオ等の薬
用植物類に含まれているステロイド配糖体は、種々の循
環器疾患、殊にうつ血性心不全症の特効薬として重用さ
れてお勺、寿命の延長に伴ってその重要性は益々増大し
ていぐものと期待されている。しかしこれら配糖体は一
般に高毒性であシ、薬用量と中毒量が極めて接近してい
るという欠点に加え、蓄積性に富むという問題があυ、
患者への投与に当っては細心の注意を払わなければなら
ない。この様なところから、前記配糖体における部分構
造を変え、有効性を維持しつつ毒性のみを軽減しようと
いう試みがなされておシ、これらの研究の中から、配糖
体における糖部分、特にステロイド骨核（アグリコン）
に直接結合する糖部分が薬理効果及び毒性に対して特に
重要な関係を有す茗ということが明らかにされた。その
為前記配糖体における糖部分の入れ換えが検討され、ア
グリコンたるステロイドに色々な糖類を結合させる研究
が展開されている。しかし従来の方法はステロイド骨核
に対して糖を直接反応させる純化学的方法であシ、反応
条件の下で置換基類の脱離や分解、或はその他の化学的
変化を招くという危険が大きく、色々なステロイド配糖
体を自由に製造できるという域には至っていない。

本発明者等はこの様な状況を憂隨し、ステロイド骨核の
アルコール性水酸基に対して色々な糖頬を自由に置換さ
せることのできる方法を提供すべく種々研究を重ねた結
果、α−（又はβ−）アリールグリコシドを塘の供与体
とし、グリコシダーゼを触媒として遊離ステロイド（１
級、２級或は３級のアルコール性水酸基を有するステロ
イド）を反応させたところ、極めて緩和な条件で反応が
進行し、前記ステロイドをアグリコンとする様々な配糖
体が得られることを知力、更に検討を重ね本発明を完成
するに至った。

即ち本発明は、水溶液中、有機溶媒を含有する水溶液中
、または水相と有機浴媒相とからなる分散媒体中で、α
−グリコシダーゼ及び／又はβ−グリコシダーゼの存在
下に、α−アリールグリコシド及び／又はβ−アリール
グリコシドと、アルコール性水酸基を有するステロイド
化合物との反応を行なわせる点に要旨が存在する。

本発明の反応を化学式によって例示的に説明すＨ ＣＨ２０１（ と表わすことができる。但し上記化学式におけるグルコ
ース等は本発明の一例を示すものに過ぎない。

捷ず一方の原料物質たるα−（又はβ−）アリールグリ
コシドとは、アリール基ト糖類がα（又はβ）−クリコ
シド結合したものであシ、Ｂｙクリ−１４としてハ、フ
ェニル基、ナフチル基、アントリル基、フエナントリル
基等が例示され、これらはアルキル基（例えばメチル基
、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等
の低級アルキル基）、ニトロ基、ハロゲン、アルコキシ
基（例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イ
ソプロポキシ基、ブトキシ基等の低級アルコキシ基）、
アＶル基（例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリ
ル基等の低級アルカノイル基）、アシルオキシ基（例え
ばアセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、プチリル
オキン基等の低級アルカノイルオキシ基）等を置換基と
して有することができる。

一方糖類としては、単糖類、三糖類、三糖類或はその他
のオリゴ糖が利用され、又炭素数についても、六炭糖、
五炭糖等の別を問うものではないが、代表的なものを例
示してお（と、グルコース、ガラクトシド、ワムノース
、フコース、マルトース、リクトース、ゲンチオビオー
ス等を挙げることができる。

そして本発明の原料物質として用いられる前記アリール
グリコシドとは、上記の如く例示した糖に対して同じく
上記の如（例示したアリール基を置換させたものであシ
、その組合わせは任意であるが、特に代表的なものを例
示すると、フェニル−α（又ｕβ）−Ｄ−ガラクトシド
、フェニル−α（又ｔｄβ）−Ｄ−グルコシド、トルイ
ル−α（又はβ）−Ｄ−ガラクトシド等を示すことがで
きる。

他方の反応試剤である。遊離の水酸基を有するステロイ
ド化合物としては、ステロイド骨核の８位にβ−水酸基
又は時にα−水酸基を有する天然ステリンや合成ステリ
ンをはじめとして、任意の位置に１級、２級或は８級の
遊離水酸基を有するステロイド化合物が利用される。該
ステロイド化合物の選択範囲は極めて広く、天然又は合
成の如何を問うものではないことは前述の通シであるが
、生理的乃至薬理的作用面から分類される各御ヌテロイ
ド、例えば前述のステリンの他、ビタミンＤ１胆汁酸、
勇往ホルモン、女性ホルモン、副腎皮質ホルモン、植物
心蔵毒、ガマ勇、ステロイドサポニン、ステロイドアル
カロイド、トリメチルヌテロイド等の全てが本発明の対
象になる。

反応に用いられるα（又はβ）−グリコシダーゼとして
は、如何なる基原のものでも良く、糖の種類に応じてグ
ルコンダーゼ、ガラクトシダーゼ等を利用するが、工業
的規模における反応を行なうことを考慮すれば微生物基
原のものが望ましい。

又反応を有機溶媒の存在下に行なう場合（後述）には、
酵素の活性が若干抑制されるので、水溶液中での酵素活
性に対して５係以上の相対活性を残留するもの、例えば
アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　
ｏｒｉｚａｅ　）由来のグリコシダーゼ、或ハクルイベ
ロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｒｎｙｃｅｓ
Ｌａｃｔｉｓ　　）由来のグリコシダーゼ等が望ましい
。

伺酵禦の相対活性が低いときには、酵素使用量を増やし
て補う様にすることが望まれる。

上記反応試剤からなる反応は溶媒中で行なわれるがα（
又はβ）−グリコシダーゼ、並びにα（又ハβ）〜アリ
ールグリコシドは、いずれも一般に水浴性が高いので、
他方の反応試剤たるステロイド化合物が水溶性であると
き、例えばコハク酸プレドニゾロン、デキサメタシン硫
酸エステル、デキサメタシンリン酸エステル、ベタメサ
ゾンリン酸エステルなどを用いるときは水溶液中で反応
を行なえば良い。尚ここに言う水溶液とは、爪に水溶液
である場合の他、酸又は塩基によってｐＩＩを調整した
もの、緩衝能のある物質を加えてｐＨを調整したもの、
或は適当な塩類を含むもの等を包含する。ｆＭ　ｐ　Ｆ
ｌの上記調整に当っては、通常ｐＨ８〜９の中から選択
するが、前述のアスペルギルス・オリゼー出来のグリコ
シダーゼを用いる時はｐ　Ｔ（５、又クルイベロマイセ
ス中うクチス…来のグリコシダーゼを用いる場合は、ｐ
Ｈ７という様に、酵素に応じた最適のｐＨを選択しりけ
ればならない。

上記水溶性ステロイド化合物以外の一般ステロイド化合
物は、程度の差とそあれ水に対して史ＩＬ溶性であるか
ら、この場合は上記水浴敢に適当な有機溶媒（好寸しく
は親水性有機溶媒）を加えることが望ましい。該有機溶
媒としては、＃酸エチル等のアルキルエステル類纂アセ
トンやメチルエチルケトン等のアルキルケトン類；アセ
トニトリル；ジオキサン；ジメチルホルムアミド；ジメ
チルヌルホキサイド；ジクロロメタンやクロロホルム等
のへロメタン類；ピリジンやピリミジン等の塩基」酢酸
やプロピオン酸等の酸類等を例示することができる。即
ちステロイドの溶解性を高めはするが、グリコシダーゼ
を失活させず適度の活性を前記程度ＶＣ，１＋ｌｉ：持
するものであれば、単独及び併用の如何を問わず自由に
利用できる。同有機溶媒の混合倉は、親水性及び上記諸
効果を考慮して定めれば良く、（水−有機溶媒）混合溶
媒全量に対して５〜８０重量係、好ましくは１０〜６０
：ｆｆｉ！％の範囲で配合する。

ステロイド化合物が同十分に溶解されないときは、α（
またぽβ）−アリールグリコシド及び酵素を前記水溶液
として準備すると共に、ステロイド化合物を有機溶媒に
溶解し、これらを２相糸で反応させることが推奨される
。ここで用いられる溶媒として前記例示の有機溶媒であ
って配合比を大きくすることによって２相となるものの
他、ヘキサンやペンタン等の鎖状炭化水紫類ＩＶクロヘ
キサンやシクロペンタン等の環状炭化水素類纂シクロヘ
キサノンやシクロペンタノン等の環状ケトン類蓼クロル
ベンゼンやニトロベンゼン等の芳香族溶媒が例示される
。これらについてもステロイド化合物を浴解し、且つ酵
素り泊の活性を前記程ル“に維持し揚るという限度にお
いて自由に使用できるが、水相と有機溶媒相の混合比（
Ｖ／Ｖ）は、（１：１０）〜ｒｌＯ：ｌ）であることが
望ましい。

反応温度やその他の条件については本発明を制限するも
のではないが、一般的な売件を述べると、反応温度とし
ては４〜５０℃程度、反応時間としては５〜３００分（
時によれば２４時１■近（）程度で反応を遂行させるこ
とがｇ！ましい。

本発明で得られるステロイド配糖体は、公知物質及び新
規物ｒｇを含むが、夫々の生地的乃至薬理的作用に基づ
き、医薬品として使用することができる。

次に本ｉｔ明を実施例によって説明する。

実施例 ｌ６β−ｄｉ　ｈｙｄｒｏｘｙ−５β−Ｃａｒｄ−２０
（２２）−ｅｎｏｌｉｄｅ）の合成 フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド１．２８　ｇ　（５ｍ
ｍｏ１）とシトキンゲニン０．５０ｇ（１，２８ｍ　ｍ
ｏｌ）とを２５１ｎＩ！のアセトニトリルと１５ｍｆｆ
の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５）に懸渇し、さらに、
アヌベルギルヌオリゼーのβ−ガラクトシダーゼｓｓｏ
ｍｇを１２−のリンｍ緩衝液（ｐＨ５）に溶かした液１
０１ｎｌを加え、２０℃で２０分間インキュベート後沸
とう浴中に５分間置き、次で濾過する。沈殿を洗浄し、
炉液と洗液を合してエバポレータで溶媒を除去したのち
水８０ｒｎ／を加え、この液よジクロロホルム２００ｍ
ｆｆ数回にでシトキシゲニンを抽出する。水腹を濃縮し
、セファデックスＧ−２５を水飽和ｎ−ブタノールで平
衡化させたカラムにかけ、水飽和ｎ−ブタノールで展開
する。反応生成物の分画を集め溶媒を留去する。残渣は
、シリカゲルの中圧カラムにかけ、クロロホルム１００
ｍ／、＆で、メタノール−クロロホルム混液で順次溶出
する。反応生成物の分画を集め、溶媒を留去する。残渣
は、シリカゲル６９層に展開する。溶媒は、クロロホル
ム−メタノール混酸である。反応生成物の分画を集め、
溶媒を留去し、目的物を得る。

ｒｎｐ　　２１８−２２０収量１８．７ｍｇ、（２６％
　）実施例２ Δ フェニル−β−Ｄ−グルコシド１．２８　ｇ（５１βｍ
ｏｌ　）とジギトキシゲニン５００ｍ９（１，８４ｍ　
ｍｏｌ　）とを２５　ｍｅのアセトニトリルと１５ｍ／
の０．　Ｉ　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５）の混液に溶解す
る。一方、アスベルギルスオリゼーのβ−ガラクトシダ
ーゼ１．０８ｇを１２ｍｅの０．１Ｍリン酸Ｍ衝ｇＩ（
ｐＨ５）に溶解し、この１０ｍ１を先の混液に加え、１
０℃にて１８時間放置する。反応液を沸とう水浴中５分
間加熱して反応を止め、濾過し。

このＰ液と、残渣の洗液とを合してエバポレーターで溶
媒を除去する。残渣に水８０−を加え、この中に含まれ
るシトキシゲニンをベンゼンで抽出除去する。水層ば、
水飽和ｎ−ブタノールで平衡化したセファデックスＧ−
２５カラムにかけ、同じ溶媒で溶出する。反応生成物の
分画を集め、溶媒を留去する。残渣をシリカゲル中圧カ
ラムにかけ、最初クロロホルム次いでメタノール−クロ
ロホルム混液で順次溶出する。反応生成物の分画を集め
、溶媒を留去し、さらに為層クロマトグラフィーにて精
製する。ｍｐ　２８４−２８６℃、収量１Ｂ、４ｒｎｇ
（１，９係）実施例８ フェニル−β−Ｄ−ガラクトシ）’１．２８ｇと１６β
、１７β−エポキシ−１７α−ジギトキンゲニン５００
ｒｎｇとを実施例１の条件で反応させる。このあとも同
様にゲニンの除去、セファデックスＧ−２５カラムクロ
マトグリフイー。

ンリカゲル力うムクロマトグヲフィー、薄層クロマトグ
ラフィーを行なって精製する。ｍｐ１９７−１９９℃、
収量１６．１　ｍｇ　（２，８係）実施例４ フェニル−β−Ｄ−グルコシド０．２１８ｇ（Ｑ、８５
ｍ　ｍｏｌ　　）を６ｍｇの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７）に溶解する。一方りルイベロマイセスワクチスの
β−ガラクトシダーゼ０．１７０　ｇを０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７）２．４ｍｇに溶解し、先の水浴液に加
える。更にアンドロヌテロン０．２４７ｇ（０，８５ｍ
　ｍｏｌ　）をニトロベンゼン１．７　ｒｎｅに溶解し
たものを加え５０℃で８゜分ｔｉｌｌ激しく攪拌する。

反応液を０℃に冷却した水３０−と四塩化要素１ｉｍｅ
の混液にあけ、よく振シ混ぜてから遠沈する。水層をと
シ、メタノール８ｏｍｅを加え、２０℃で１時間放置後
再び遠沈する。その上清をとシエバポレータで溶媒を留
去し、残渣を得る。一方、クロロホルム２５ｍｅ、エタ
ノール２５ｍ（’と水１０ばをよく振り混ぜたのち静置
し、二相が分離したら、上層と下層をそれぞれ分取する
。この上層に先に得た６渣を溶かし、これに下層の４分
の１を加えて振シ混ぜたのち、静置して下層を分取する
。

この操作を４回行ない、下層を合わせて、エバゼレータ
ーで溶媒を留去する。残渣を少量のクロロホルムに溶か
シ、ンリカゲル力ラムにカケ、クロロホルム−メタノー
ル−水＝１６：８：１（■／Ｖ）混液の下層で溶出する
。目的物の分画を集め、溶媒を留去する。ｍｐ２２８℃
、収量０．６ｆｆ＋９　（０，２係）。

実施例５ ジギタリス配糖体の標的は、各棟の細胞膜に存在するＬ
Ｎａ＋、Ｉτ＋−ＡＴＰａｇｅ　であって、特に・Ｕ筋
細胞のＡＴＰ　ａ　ｓ　ｅを阻害することによって、強
心効果をあられすと言われている。この為、強りｕ配糖
体のスクリーニングの手段として、Ｎａ＋、に′＋−Ａ
ＴＰａｓｅの阻害作用を誠べることは、一般にジは入れ
られている。本発明者らは、本発明において合成した各
種配糖体のＮ　ａ　＋、に＋−ＡＴＰ　ａ　ｓ　ｅ阻害
作用を検討し、これら物質が強心作用を有する可能性を
検問した。Ｎａ＋、に＋ＡＴＰａ８ｅ活性は、アーメド
及びトーマスの方法（Ｋ、Ａｈｍｅｄ　ａｎｄＢ、Ｓ、
Ｔｈｏｍａｓ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４６．１０
８−１０９（１９７１）を多少改良して測定した。阻害
活性は、阻害剤濃度を種々変えて得られる阻害曲線よシ
５０係阻害濃度（■５ｏ）を求め、これで表示した。結
果を表１に示す１．これから明らかなように、合成した
配糖体は、そのゲニンとはＩ了同８！度のＩ５０を示し
１強心作用を保持している可能性が強く示唆された。

表１ 出願人　　東洋紡績株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ｍ水溶液中、有機溶媒を含有する水溶液中、または水相
   と有機浴ＤＸ相とからなる分散媒体中で、α−グリコシ
   ダーゼ及び／又はβ−グリコシダーゼの存在下に、α−
   アリールグリコシド及び／又はβ−アリールグリコシド
   と、アルコール性水酸基を有するステロイド化合物との
   反応を行なわせることを特徴とするステロイド配糖体の
   製造法。