JPS5978686A - フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスからアルカリ性プロテア−ゼを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物のプロテアーゼは理論的にもまた実用的にもかな
りの興味がもたれている。プロテアーゼはしばしば、細
胞外の物質であり、消費された培地の濾液から活性型で
単離することができる。

蛋白質分解酵素は−・般にその金倉ｐＨ、ジイソプロピ
ルフォスフオフルオリチー）　（ＤＦＰ）に対する感度
、及び活性の金属依存性を基準として、４種の群に分け
られる。即ち、 ｌ）酸性プロテアーゼ； ２）ＤＦＰ１４ｇ受性プロテアーセ（セリンΦアルカリ
州プオテアーゼ）： ３〕金属キレータ−・感受性プロテアーゼ：４）チオー
ル・プロテアーゼ に区別される６ 第一の群には、微生物のレンニンのような酵素か含まれ
、牛乳の凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）及びチーズの熟成（
ｒ　１ｐｅｎ　ｉｎｇ）のような酪農工業において価値
をもっている。酸性プロテアーゼは大部分カビ類が原料
である。

本発明のプロテアーゼがその範囲に入る第二の群は多数
の公知のプロテアーゼから成り、最も広い分類学りの分
’ｈｔもっている。最も良く知られている特徴はへシル
ス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）により生産
される細胞外生成物であるスブチリジ７類、及びグラム
陽性バクテリア［例えばストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）　、アルトロ八クテル（：Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ）コ及びカビ類［例えばアスヘ）レギ
ルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）　、　サン力ロマイ
セス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　］によりつく
られる数種の伸、の酵素である。洗剤用の酵素はこれら
のプロテアーゼに対する大きなＴ業師用途である。驚く
べきことには、ダラム陰性バクテリアでは極〈僅かな、
！１ｊ！類だけしかこの種のプロテアーゼを生産しない
ことが見出だされた。これらは米国ニューヨークのアカ
デミンク・プレス（Ａｃａｄｅｌｃ　Ｐｒｅｓｓ）社１
９７１年発行、ピー拳ディー・ポイヤー（Ｐ、　Ｄ、　
Ｈａｙｅｒ　）　ＭＡ集、「酵素（Ｅｎｚｙｍｅｓ　）
　Ｊ第３版＄３巻、７２１〜７９５頁のマツバラ等の論
文に記載されている。この文献の７９２〜７９４頁が特
に適切である。

諺屈キレーター感受性のプロテアーゼはいわゆる天然プ
ロテアーゼの群を形成している。これらの酵素は通常そ
の活性及び安定性が亜鉛及びカルシウムに依イＦしてい
る。このプロテアーゼのあるものはヒール工業に用いら
れている。

微生物源のプロテアーゼの最も小さい群は千オール・プ
ロテアーゼの群である。このようなプロテアーゼは二、
テしか同定されておらず１例えば７トレブトコツカスφ
ラクテイス（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕＳ　１ｄｃｔｉ
ｓ）及びクロストリディウ１１・ヒストリティクｌ、（
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｙｏｌｙｊｉｃｕｍ）
から１１られるプロテアーゼがある。これらの酵素には
Ｔ業師用途が知られていない。

本発明は土壌微生物であるフラウォバクテリウム０アル
ボレッセンス（Ｆｌａｖａｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｒｂ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ）から（！Ｉられる細胞外のアルカリ
性セリン會プロテアーゼの分離、同定、及び使用に関す
る。これらの微生物を用いて他の酵素、即ちグルコース
・イソメラーゼを製造する方法はシー・チー・シーＣＣ
，Ｋ、　Ｌｅｅ　）の米国特許第４，０８１，５３９号
に記載されている。本発明によれば、グルコース・イソ
メラーゼの製造に適したものとしてこの特許に開示され
ているフラウォへクテリウト・アルホレンセ／スの２種
の菌株、即ち、ＮＲＩ’！Ｌ　Ｂ−１１，０２２及びＡ
ＴＤＣ４３５８はプロテアーゼの製造にも良く適してい
ることが見出だされた。に記米国特、負第４゜０６１．
５３９号にはこの種の微生物が微生物のアルカリに１プ
ロテアーゼの製造にもイ１用であることは指摘されてい
ない。

本発明の方法は微生物のアルカリ性プロテアーゼの製造
方法に関する。本発明によれば適当な栄去分を含む水性
栄養媒質中において回収Ｃ１丁能な酸の酵素を生成する
のに十分な時間、フラウォｚへクテリウム拳アルボレッ
センス種からの微生物を培養することを特徴とする微生
物のアルカリ性プロテアーゼの製造方法が提供される。

プロテアーゼの生産中にフラウ′オパクテリウム・アル
ポレンセンスを培養するのに種々の生育培地を用いるこ
とができる。例えば水性の培地は０．０５〜０．２％の
酵母エキス、０．５〜２゜０％のキシロース、５〜ｌＯ
％のコーンステイープリカー、及び０．５〜１．０％の
燐酸カリウ１、紮含むことができる。ここですへての割
合は重量／容積（Ｗ／Ｖ）基準である。ｐＨは約６８〜
７．２のし・ベルに調節することか好ましい。

使用できる他の培地は１％の酵母エキス、またはＲＮ源
を含みまたは含まない栄養汁を含んでいる。典型的には
、細胞は選ばれた媒質中においで、２９〜３２゛Ｃの温
度で１６〜２４時間の間、通常攪拌して生育させる。培
養した後、例えば遠心分離により細胞を取り除き、プロ
テアーゼを含む透明な上澄液を残留させ、これから当業
界で公知の精製方法によりプロテアーゼを回収すること
ができる。例えば、プロテアーゼは硫酸アンモニラｌ、
を加え、沈澱させ濃縮した後ジェチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）セルロース上でクロマトグラフィーにかけ、庶
糖の勾配遠心分離によって精製し均一化する。収率は１
１当り４．Ｏ’００〜１ａ　、ｏｏｏ単位の範囲にあり
、ここで１単位は温１１！Ｌ５０’Ｃ，ｐＨ９，０でカ
ゼイノを基質として毎分１０ノナモルのチロシンをＭ離
する酵素の量と回等である。

プロテアーゼ活性は全容積２　、６ｍ　ｌで試験される
。反応混合物は０．７％のカゼインを０．０５Ｍのトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタノ−ＨＣｌ緩衝液中
に含み、ｐＨ９で酵素及び緩衝液を用いて全容積を２ｍ
Ｍにしたものである。反応は等容にの１．８％（ｗ／Ｖ
）のトリクロロ酢酸を加え、遠心分離により沈澱した蛋
白質を除去することにより終結させる。ｔ＝ｒ溶性フラ
クション中に放出されたチロシンとして活性が測定され
る。チロシンの量は反応混合物及びブランク（蒔間Ｏで
停止にさせた反応混合物）の２７５ｎｍにわける吸光係
数の差としてａｉ算される。

フラウ゛オパクテリウム会アルボレッセンスによりつく
られた酵素は、分子量が１９，０００であり、珪つ変性
条件ドでポリアクリルアミド・ゲルの゛電気泳動法で測
定すると単一・のポリペプチド鎖から成っていることが
わかる。

本発明を実施する方法をさらにド記実施例により例示す
る。

実施例　ｌ ト°記の方法により微生物のアルカリ性プロテアーゼを
つくった。

フラウォバクテリウム会アルポレンセンスＮＲＲＬ　　
Ｂ−１１，０２２及びＡＴＣＣ４３５８の内方を別々に
、７Ａ留水中に酵母エキスを１％（ｗｚ’ｖ）含む溶液
の中で培養した。夫々の場合１重量／容積基準で０．１
５％の酵母エキス、０．５％の燐酸カリウム、７．０％
のコーンステイープリカー、及び１％のキシロースを蒸
留水中に含む培地５０ｍ１に細胞を加える。この培地は
最初細胞密度が２Ｘ　１０’個／ｍ１．ｐ！（７゜０で
あり、これを２４時間３０”Ｃにおいて、３゜Ｏｍｌの
フラスコ中で、偏心率１インチの２５Ｏｒ’ｐｍで振盪
機にかけて培養する。２４時間培養した後、細胞を遠心
分離で除去する（１０，０００×ｇで５分）。透明な上
澄液には粗製のプロテアーゼが含まれ、副生ずるグルコ
ース−イソメラーセは細胞中に保存される。

実施例　２ ＮＲＲＬ　　Ｂ−１１，０２２から実施例１によってつ
くられたプロテアーゼを、ト記のように５段階で精製し
た。

細胞を除去した一回使用した培養基（透明な上澄液）を
粗製酵素と名付ける（フラクションｌ）。この物質中の
蛋白質は硫酸アンモニウムを７０％の飽和度で加えて沈
澱させることにより濃縮した。２３．０００Ｘｇ”？’
３０分間遠心分離により沈澱を集め、７０％飽和度の硫
酸アンモニウム溶液（ｐＨ７，４）　で−回洗浄り、ｐ
Ｈ８，０テ０　、０２Ｍ（７）Ｎ　ａＣ１を含むトリス
−ＨＣＩ０．０５Ｍ溶液に加える。この非常に濃い暗褐
色の蛋白質を、ＮａＣ１を含まない同じ緩衝液に対して
透析を行い、４０．０００Ｘｇで３０分間遠心分離にか
け、不溶性物質の残りを除去する。二の透析した物質（
フラクションＩりを上記の緩衝液中に０．０２ＭのＮａ
Ｃ１を含む液とコド衡させたＤＥＡＥ−セルロース番カ
ラムにかける。この方ラムを、流出液のＡ２１１゜がほ
とんど０になるまで・１１．衡緩衝液で洗浄し、０．０
５Ｍのトリス−ＨＣ１緩衝液中にＮａＣ１（０，０２〜
１．００Ｍ）を含むｐＨ８，０の溶液で勾配をつけて展
開する。活性物質の大部分は吸着されず、明褐色の溶液
として緩衝液と共に流出した。流出した酵素をアミコア
　（Ａｍｉｃｏｎ）社の限外濾過装置で、ＵＭ−１０の
膜（分子〜耶１０，０００以りを排除）を用いて濃縮す
る。これをフラクション■と名利ける。

ＤＥＡＥセルロースによる精製段階をフラクション■に
ついて繰返し、フラクション■を得た（まだ明褐色）。

これをｐＨ７の０．ＯＩＭの燐酸カリウムと平衡させた
ヒドロキシルアパタイトのカラｔ・にかける。この場合
も大部分の活性物質は、＋衡緩衝液と共に溶出したか、
褐色の不純物はほとんどカラムの中に捕捉された。この
プロテアーゼの淡莢色の溶液（フラクションＶ）を限外
濾過により濃縮し、０．２５ＭのＮａＣ１を含むｐＨ８
，０の０．０５Ｍ）リス−１（ＣＩ緩衝液中で５〜３０
％（ｗ／ｖ）の勾配をもたせた蔗糖（３６ｍ　ｌ）で展
開する。これを７０時間２８゜０００ｒｐｍでぺ・シフ
−ｙ　７　（Ｂｅｃｋｍａｎ　）社の５Ｗ２８０−ター
を用いて遠心分離にかける。−・定の活性をもったこの
クラクションを−・緒にしくクラクション■）、濾過し
て滅菌し、４°Ｃで貯蔵する。

身性条件−１で電気泳動により測定すると、分−ｆ％　
１９　、０５０の単一の蛋白質バンドか存在することが
わかる。この（４は、上記蔗糖による勾配の実験と平衡
して行われたキモトリプシノーゲン（２５，０００）及
び卵白アルブミ＞−（４３，０００）マーカー蛋白質の
沈降速度の比較から計算された分子量１９　、４００と
非常に良く−・致している。

プロテアーゼ活性は、全く精製をしないＦｉｉｊ、及び
各精製段階の後で決定した。この実験の結果を：ｆＳ１
表に小す。

追」−表 アルポレンセンス・プロテアーゼの車装比活性 フラグ　　（中位／酩　　　　　精製　収率２・１／　
　　　イ゛白−→　へ’ｌｉ−−ｍＵ因−一」；多フー
工粗製物１−澄液３１．２　１２９．８００　　１．０
０　　＋００．０ＩＩ硫酸ア／ モニウム　　　２Ｅｉ、０　１０９，９００　　．０．
８３　８４．６１１１第１段１１ＥＡＥ −セルローヌＢ３ａ、ｏ　　　ｅｆｔ、１００　２０．
３３　５０．８ＩＶＭ２段［ＩＥＡＥ −セルロース８Ｑ９．ＯＳ５，１００　２５．９０　５
９．１■ヒドロヤシ アパタイト　１０８３．０　　５７，８００　３３．９
０　４４．２Ｖｌ庶糖勾配　１８８３．０　　２９，９
９６　８０．３５　２３．０第１表はプロテアーゼは一
６三の簡単な段階を経て、許容できる収率で精製しイ１
することを示してい乙。

実施例 この実験は温度の関数としてフラヴオパクテリウＬ、・
アルホレンセンスの活に１と安定性を決定するために杓
われだ。

表記の温度においてプロテアーゼ活性を測定した。安定
性は１５または３０分間成る笑えられたｌ晶ｌで酵素を
加熱した後、３７°Ｃで評価を行うことにより試験した
。フラクショ／ＶＩ（第１表）を使用した。この実験の
結果を第２表に、Ｊ＼Ｔ。

／Ｍ度　°Ｃ【　　、−女　　１５　　　　３０）３０
　　　　　．１．１ｆ（１００，０！００．０３７！、
７Ｅｌ　　　　　　１００．０　　　１００．０４２　
　　　　　２．２４　　　　　　９４．＋　　　　　８
８．２５０　　　　　２．５５　　　　　３３．３　　
　　　＋１．８５５　　　　　２．５９　　　　　　　
Ｑ、ＯＯ，０Ｌ３０　　　　　２．５６　　　　　　０
．０　　　　０．０実施例　４ フラウ′□バクテリウム・アルポレンセノスの活性をｐ
Ｈ及び温度の関数として前記の方法で決定した。

この実験の結果を第３表に示す。

４２　　　　　５．５７　　　　１７ ５．８４　　　　、’２３ ６．６５　　　　４６ ７．６０　　　　７０ ８．６２　　　　８５ ９．６２　　　　　　９３ １０．４９　　　　　１００ １１．３７　　　　　　　　５ ５０　　　　　　　７．４７　　　　　　８６８　　、
　４５　　　　　１　０１） ８．８８　　　　　　　９７ ９　　、　３９　　　　　　　９　”ｔ’９．９４　　
　　　　８５ １０．１９　　　　　　６６ １１．０１　　　　　　　　６ １１．６５’　　　　　　　　３ （ａ）このアッセイの温度で１（ＩＩＩ冗。

温度が１−昇すると最適ｐ　Ｈ（ｆ＋が低い力に移動す
る。酵素は広い範囲のｐＨ（５，５〜１０．５）で活性
をもっている。クラクションＶｆ（２，５４弘ｇ）をこ
のアッセイに使用した。

実施例　５ フラウォ／染、クテリウム・アルポレンセンスの活性に
対する種々の抑制剤の効果を決定する実験をｉっだ。ク
ラクション■及びＶＩ　（第１表）を第４表記載のよう
に使用した。

剃工省 酵毒フラ クション　　試Ｗした抑制　木　　占　（単位）ＩＩＩ
−５０ｔｔｇ　　　−−−４，１３，８５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　　　　　４．１１１％　Ｃｗ／ｖ）　ＳＳＩ　　　
　　１６Ｖｉ−’ｒ、２７ｇｇ　　−−−’　　　　　
２．００、１７ｍＭ　ＤＦＰ　　　　　　　　０．１０
．８３ｍＭ　ＰＭＳＦ　　　　　　　１．９８３．００
ｄ　ＮＥＷ　　　　　２．０略号の説明： ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸 ５ＳＩ＝ストレプトマイセス・スブチリシン抑制剤 ＤＦＰ＝ジイソプロピルフォスフオフルオリデート ＰＭＳＦ＝フェニルメチルスルフォニルフルオリト ＮＥＭ＝Ｎ−エチルマレイー′酸イミドプロテアーゼが
活性を小すためには金属イオンを必要としないか、スブ
チリンノ抑制剤及びＤＦＰにより強く抑制される。驚り
べきことには、Ｐ１’ｖｌｓＦは何の効果も示さない、
ＬＩＦＦ感度とＰＭＳＦ感度とは通常−緒に現れるため
。このことはＷ常なことである。

実施例　６ 木工雄側は第１表のクラクションＩを試験酵素として使
用し、洗濯用添加剤としてのフラウ′オパクテリウム・
アルポレ・ンセラス・アルカリ性プロテアーゼの効果を
例示する。

この酵素の染み抜き能力はエイドゲネシンセーマテリア
ループリューフングスーアンシュタルト（Ｅ　Ｎ　Ｐ　
Ａ）　　（Ｅｉｄｏｇｅｎｏｅｓｓｉｓｃｈｅ−Ｍａｔ
ｅｒｉａトρｒｕｅｆｕｎｇｓ−Ａｎｓｔａｌｔ　）　
−１１６、血液、牛乳、及び里！１で均一に汚れた繊維
布の試験法（Ｔｅｓｔ　ＦａｂｒｉＣｓ、　Ｉｎｃ、　
、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）により測定した。使用した方法
は米国インディアナ州、エルクハルト（Ｅｌｋｈａｒｔ
　、Ｉｎｄｉａｎａ）　′？イルズ・ラボラトリーズ（
Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社酵素製造部
門の技術サービス部／Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　５ｅｒｖｉ
ｃｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｚ
ｙｍｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）発行の
「染み抜き試験法Ｊ　（”５ｔａｉｎ　Ｒｅａ＋ｏｖａ
ｌ　Ｔｅ５ｔ”　　）　（Ａｓｓａｙ　Ｎ　ｏ　。

３５０９５、ｐ、９９．１）である。この方１人はティ
ー・コイル（Ｔ、　Ｃｏｙｌｅ）記載の方法（Ｊ、　Ａ
ｍ、Ｏｉｌ　［：ｈｅｍ、　Ｓａｃ、、　４１３．５１
５．　（＋９６９））と類似している。

原料の洗剤基質はアメリカンφホーム・アプライアンス
会マニュファクチャーズ・アソシエーシ゛　、Ｊ　　７
　　（ＡＨＡＭ）　　　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｈｏｍ
ｅ　　Ａｐｐｌｉａｎｃｅ　　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ
ｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）の標準燐酸塩含有洗剤組
成物であった。ガードナー（Ｇａｒｄｒ＋ｅｒ　）　Ｘ
Ｌ−２０トリスチムラヌ（Ｔｒｉｓｔｉｍｕｌｕｓ　）
色度計（Ｇａｒｄｎｅｒ　Ｌａｂｏ　ｒａ　ｔａｒ　ｉ
ｅｓ、　Ｉｎｃ、　、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　、Ｍａｒｙ　
１ａｎｄ）を測定に用い、活性はブランクに対する適当
な補正をした後、酵素の濃度の関数とじての反射率の変
化で測定すれる。結果を第５表に示す。

音互虜 醇７　（単位　又）　　　　　反　−イ・ド化１３１３
　　　　　　　　１．５ ２６２５　　　　　　　　２．５ ５２５０　　　　　　　　５．３ ＝れらの結果によれば、反射率の変化（染み抜きの程度
）は試験系のアルカリ性プロテアーゼのｅ度増加にＩＩ
：、比例することがわかった。

実施例　７ フラヴオパクテリウム・アルポレンセンスにより同時に
つくられるプロテアーゼ及びグルコース・イソメラーゼ
をこの実施例及び第６表に例示する。

嵌旦澁 グルコース・　　　アルカリ性 Ｏイソメラーゼ本　　プロテアーゼ ａ） ：ｊ：義通り　　　　１．９２４　　　　５２０複合体
ｂ）　　１４，５６７　　　４７００ａ）媒体は１′記
のものを含む ０．２１キシロース、　０．０５駕ＫＨ２ＰＯ，，０，
０３％に：ＯＨ。

０．０２＄　Ｍｇ５Ｏａ　、Ｏ，ＯＱｌ＄　Ｆｅ５０４
　。

０．０５％　（ＮＨａ　）　　２　ＳＯ４、０，５％カ
ザミノ酸。

ビタミン及びに跡元素 （ｂ）グルコース・、イソメラ・−セ活性のｌ中（＆は
１μモルのグルコースを規定の条件ドにおいて１分間に
ｌｋのフルクトースに変える酵素の量として定義される
。［ジー拳ポグスラウスキー（Ｇ、　Ｂｏｇｕｓ　ｌａ
ｗｓｋ　ｉ）及びニス・タヴリュー争ベルチ（：Ｓ。

Ｗ、　Ｂｅｒｔｃｈ）　、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｆｔｉ
ｏｃｈｅｍ、　２．３６７−３７２゜（ＩＨＱ））　　
参１ｊ（ｉ　］　　。

０．２％のグルコースを含む規定の媒質において、プロ
テアーゼは合成されず、グルコ一ス・イソメラーゼは対
照の約５０％に低ドする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、適当な栄養分を含む水性栄養媒質中において回収Ｍ
   ｒ能な着の酵素を生成するのに十分な時間、フラヴ士バ
   クテリウム・アルボレッセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅ
   ｒｉｕｍ　ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）種の微生物を培養
   することを特徴とする微生物のアルカリ性プロテアーセ
   の製造方法。 ２、栄養媒質がすべて重量／容積基準で０．０５〜０．
   ２％の酵母エキス、０．５〜１．０％のキシロース、５
   〜１０％のコーンステイープリカー、及び０．５〜１．
   ０％の燐酸カリウＪ・を含む特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ３、栄養ｌｔｊ質のｐＨを約６．８〜７．２のレベルに
   調節する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、微生物を２９〜３２°Ｃの温度において１６〜２４
   峙間培養する特許請求の範囲第１項記載のガ、す、。 ５、プロテアーゼ生成性微生物かフラウォ／＼クテリウ
   ムΦアルホレンセノヌＮＲＲＬ　　Ｂ　　−１１，０２
   ２である特許請求の範囲第１引記載の方１人。 ６　プロテアーゼ生成性微生物がフラウォバクテリウ１
   、・アルホＬノ、セ７スＡＴＣＣ４３５８である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ７、遠心分離により微生物の細胞を栄養媒質から除去し
   、プロテアーゼを含む透明な上、澄液を残す特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ８、ｆ＆酸アンモニウムを上澄液に加えて沈澱Φ濃縮し
   、次いでジメチルアミンエチル・セルロースにでイオン
   交換グロマトグラフィーにかけ、庶糖勾配遠心分離を行
   なうことにより精製して均一化する特許６１’ｌ求の範
   囲第７項記載の方法。