JPS5978686A - フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスからアルカリ性プロテア−ゼを製造する方法 - Google Patents

フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスからアルカリ性プロテア−ゼを製造する方法

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JPS5978686A
JPS5978686A JP58177167A JP17716783A JPS5978686A JP S5978686 A JPS5978686 A JP S5978686A JP 58177167 A JP58177167 A JP 58177167A JP 17716783 A JP17716783 A JP 17716783A JP S5978686 A JPS5978686 A JP S5978686A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物のプロテアーゼは理論的にもまた実用的にもかな
りの興味がもたれている。プロテアーゼはしばしば、細
胞外の物質であり、消費された培地の濾液から活性型で
単離することができる。
蛋白質分解酵素は−・般にその金倉pH、ジイソプロピ
ルフォスフオフルオリチー) (DFP)に対する感度
、及び活性の金属依存性を基準として、4種の群に分け
られる。即ち、 l)酸性プロテアーゼ; 2)DFP14g受性プロテアーセ(セリンΦアルカリ
州プオテアーゼ): 3〕金属キレータ−・感受性プロテアーゼ:4)チオー
ル・プロテアーゼ に区別される6 第一の群には、微生物のレンニンのような酵素か含まれ
、牛乳の凝固(clotting)及びチーズの熟成(
r 1pen ing)のような酪農工業において価値
をもっている。酸性プロテアーゼは大部分カビ類が原料
である。
本発明のプロテアーゼがその範囲に入る第二の群は多数
の公知のプロテアーゼから成り、最も広い分類学りの分
’htもっている。最も良く知られている特徴はへシル
ス・エスピー(Bacillus sp、)により生産
される細胞外生成物であるスブチリジ7類、及びグラム
陽性バクテリア[例えばストレプトマイセス(Stre
ptomyces) 、アルトロ八クテル(:Arth
robacter)コ及びカビ類[例えばアスヘ)レギ
ルス(Aspergillus ) 、 サン力ロマイ
セス(Saccharomyces ) ]によりつく
られる数種の伸、の酵素である。洗剤用の酵素はこれら
のプロテアーゼに対する大きなT業師用途である。驚く
べきことには、ダラム陰性バクテリアでは極〈僅かな、
!1j!類だけしかこの種のプロテアーゼを生産しない
ことが見出だされた。これらは米国ニューヨークのアカ
デミンク・プレス(Acadelc Press)社1
971年発行、ピー拳ディー・ポイヤー(P、 D、 
Hayer ) MA集、「酵素(Enzymes )
 J第3版$3巻、721〜795頁のマツバラ等の論
文に記載されている。この文献の792〜794頁が特
に適切である。
諺屈キレーター感受性のプロテアーゼはいわゆる天然プ
ロテアーゼの群を形成している。これらの酵素は通常そ
の活性及び安定性が亜鉛及びカルシウムに依イFしてい
る。このプロテアーゼのあるものはヒール工業に用いら
れている。
微生物源のプロテアーゼの最も小さい群は千オール・プ
ロテアーゼの群である。このようなプロテアーゼは二、
テしか同定されておらず1例えば7トレブトコツカスφ
ラクテイス(StreptococcuS 1dcti
s)及びクロストリディウ11・ヒストリティクl、(
Clostridium hisyolyjicum)
から11られるプロテアーゼがある。これらの酵素には
T業師用途が知られていない。
本発明は土壌微生物であるフラウォバクテリウム0アル
ボレッセンス(Flavabacterium arb
orescens)から(!Iられる細胞外のアルカリ
性セリン會プロテアーゼの分離、同定、及び使用に関す
る。これらの微生物を用いて他の酵素、即ちグルコース
・イソメラーゼを製造する方法はシー・チー・シーCC
,K、 Lee )の米国特許第4,081,539号
に記載されている。本発明によれば、グルコース・イソ
メラーゼの製造に適したものとしてこの特許に開示され
ているフラウォへクテリウト・アルホレンセ/スの2種
の菌株、即ち、NRI’!L B−11,022及びA
TDC4358はプロテアーゼの製造にも良く適してい
ることが見出だされた。に記米国特、負第4゜061.
539号にはこの種の微生物が微生物のアルカリに1プ
ロテアーゼの製造にもイ1用であることは指摘されてい
ない。
本発明の方法は微生物のアルカリ性プロテアーゼの製造
方法に関する。本発明によれば適当な栄去分を含む水性
栄養媒質中において回収C1丁能な酸の酵素を生成する
のに十分な時間、フラウォzへクテリウム拳アルボレッ
センス種からの微生物を培養することを特徴とする微生
物のアルカリ性プロテアーゼの製造方法が提供される。
プロテアーゼの生産中にフラウ′オパクテリウム・アル
ポレンセンスを培養するのに種々の生育培地を用いるこ
とができる。例えば水性の培地は0.05〜0.2%の
酵母エキス、0.5〜2゜0%のキシロース、5〜lO
%のコーンステイープリカー、及び0.5〜1.0%の
燐酸カリウ1、紮含むことができる。ここですへての割
合は重量/容積(W/V)基準である。pHは約68〜
7.2のし・ベルに調節することか好ましい。
使用できる他の培地は1%の酵母エキス、またはRN源
を含みまたは含まない栄養汁を含んでいる。典型的には
、細胞は選ばれた媒質中においで、29〜32゛Cの温
度で16〜24時間の間、通常攪拌して生育させる。培
養した後、例えば遠心分離により細胞を取り除き、プロ
テアーゼを含む透明な上澄液を残留させ、これから当業
界で公知の精製方法によりプロテアーゼを回収すること
ができる。例えば、プロテアーゼは硫酸アンモニラl、
を加え、沈澱させ濃縮した後ジェチルアミノエチル(D
EAE)セルロース上でクロマトグラフィーにかけ、庶
糖の勾配遠心分離によって精製し均一化する。収率は1
1当り4.O’00〜1a 、ooo単位の範囲にあり
、ここで1単位は温11!L50’C,pH9,0でカ
ゼイノを基質として毎分10ノナモルのチロシンをM離
する酵素の量と回等である。
プロテアーゼ活性は全容積2 、6m lで試験される
。反応混合物は0.7%のカゼインを0.05Mのトリ
ス(ヒドロキシメチル)アミノメタノ−HCl緩衝液中
に含み、pH9で酵素及び緩衝液を用いて全容積を2m
Mにしたものである。反応は等容にの1.8%(w/V
)のトリクロロ酢酸を加え、遠心分離により沈澱した蛋
白質を除去することにより終結させる。t=r溶性フラ
クション中に放出されたチロシンとして活性が測定され
る。チロシンの量は反応混合物及びブランク(蒔間Oで
停止にさせた反応混合物)の275nmにわける吸光係
数の差としてai算される。
フラウ゛オパクテリウム会アルボレッセンスによりつく
られた酵素は、分子量が19,000であり、珪つ変性
条件ドでポリアクリルアミド・ゲルの゛電気泳動法で測
定すると単一・のポリペプチド鎖から成っていることが
わかる。
本発明を実施する方法をさらにド記実施例により例示す
る。
実施例 l ト°記の方法により微生物のアルカリ性プロテアーゼを
つくった。
フラウォバクテリウム会アルポレンセンスNRRL  
B−11,022及びATCC4358の内方を別々に
、7A留水中に酵母エキスを1%(wz’v)含む溶液
の中で培養した。夫々の場合1重量/容積基準で0.1
5%の酵母エキス、0.5%の燐酸カリウム、7.0%
のコーンステイープリカー、及び1%のキシロースを蒸
留水中に含む培地50m1に細胞を加える。この培地は
最初細胞密度が2X 10’個/m1.p!(7゜0で
あり、これを24時間30”Cにおいて、3゜Omlの
フラスコ中で、偏心率1インチの25Or’pmで振盪
機にかけて培養する。24時間培養した後、細胞を遠心
分離で除去する(10,000×gで5分)。透明な上
澄液には粗製のプロテアーゼが含まれ、副生ずるグルコ
ース−イソメラーセは細胞中に保存される。
実施例 2 NRRL  B−11,022から実施例1によってつ
くられたプロテアーゼを、ト記のように5段階で精製し
た。
細胞を除去した一回使用した培養基(透明な上澄液)を
粗製酵素と名付ける(フラクションl)。この物質中の
蛋白質は硫酸アンモニウムを70%の飽和度で加えて沈
澱させることにより濃縮した。23.000Xg”?’
30分間遠心分離により沈澱を集め、70%飽和度の硫
酸アンモニウム溶液(pH7,4) で−回洗浄り、p
H8,0テ0 、02M(7)N aC1を含むトリス
−HCI0.05M溶液に加える。この非常に濃い暗褐
色の蛋白質を、NaC1を含まない同じ緩衝液に対して
透析を行い、40.000Xgで30分間遠心分離にか
け、不溶性物質の残りを除去する。二の透析した物質(
フラクションIりを上記の緩衝液中に0.02MのNa
C1を含む液とコド衡させたDEAE−セルロース番カ
ラムにかける。この方ラムを、流出液のA211゜がほ
とんど0になるまで・11.衡緩衝液で洗浄し、0.0
5Mのトリス−HC1緩衝液中にNaC1(0,02〜
1.00M)を含むpH8,0の溶液で勾配をつけて展
開する。活性物質の大部分は吸着されず、明褐色の溶液
として緩衝液と共に流出した。流出した酵素をアミコア
 (Amicon)社の限外濾過装置で、UM−10の
膜(分子〜耶10,000以りを排除)を用いて濃縮す
る。これをフラクション■と名利ける。
DEAEセルロースによる精製段階をフラクション■に
ついて繰返し、フラクション■を得た(まだ明褐色)。
これをpH7の0.OIMの燐酸カリウムと平衡させた
ヒドロキシルアパタイトのカラt・にかける。この場合
も大部分の活性物質は、+衡緩衝液と共に溶出したか、
褐色の不純物はほとんどカラムの中に捕捉された。この
プロテアーゼの淡莢色の溶液(フラクションV)を限外
濾過により濃縮し、0.25MのNaC1を含むpH8
,0の0.05M)リス−1(CI緩衝液中で5〜30
%(w/v)の勾配をもたせた蔗糖(36m l)で展
開する。これを70時間28゜000rpmでぺ・シフ
−y 7 (Beckman )社の5W280−ター
を用いて遠心分離にかける。−・定の活性をもったこの
クラクションを−・緒にしくクラクション■)、濾過し
て滅菌し、4°Cで貯蔵する。
身性条件−1で電気泳動により測定すると、分−f% 
19 、050の単一の蛋白質バンドか存在することが
わかる。この(4は、上記蔗糖による勾配の実験と平衡
して行われたキモトリプシノーゲン(25,000)及
び卵白アルブミ>−(43,000)マーカー蛋白質の
沈降速度の比較から計算された分子量19 、400と
非常に良く−・致している。
プロテアーゼ活性は、全く精製をしないFiij、及び
各精製段階の後で決定した。この実験の結果を:fS1
表に小す。
追」−表 アルポレンセンス・プロテアーゼの車装比活性 フラグ  (中位/酩     精製 収率2・1/ 
   イ゛白−→ へ’li−−mU因−一」;多フー
工粗製物1−澄液31.2 129.800  1.0
0  +00.0II硫酸ア/ モニウム   2Ei、0 109,900  .0.
83 84.6111第1段11EAE −セルローヌB3a、o   eft、100 20.
33 50.8IVM2段[IEAE −セルロース8Q9.OS5,100 25.90 5
9.1■ヒドロヤシ アパタイト 1083.0  57,800 33.9
0 44.2Vl庶糖勾配 1883.0  29,9
96 80.35 23.0第1表はプロテアーゼは一
6三の簡単な段階を経て、許容できる収率で精製しイ1
することを示してい乙。
実施例 この実験は温度の関数としてフラヴオパクテリウL、・
アルホレンセンスの活に1と安定性を決定するために杓
われだ。
表記の温度においてプロテアーゼ活性を測定した。安定
性は15または30分間成る笑えられたl晶lで酵素を
加熱した後、37°Cで評価を行うことにより試験した
。フラクショ/VI(第1表)を使用した。この実験の
結果を第2表に、J\T。
/M度 °C【  、−女  15    30)30
     .1.1f(100,0!00.037!、
7El      100.0   100.042 
     2.24      94.+     8
8.250     2.55     33.3  
   +1.855     2.59       
Q、OO,0L30     2.56      0
.0    0.0実施例 4 フラウ′□バクテリウム・アルポレンセノスの活性をp
H及び温度の関数として前記の方法で決定した。
この実験の結果を第3表に示す。
42     5.57    17 5.84    、’23 6.65    46 7.60    70 8.62    85 9.62      93 10.49     100 11.37        5 50       7.47      868  、
 45     1 01) 8.88       97 9  、 39       9 ”t’9.94  
    85 10.19      66 11.01        6 11.65’        3 (a)このアッセイの温度で1(III冗。
温度が1−昇すると最適p H(f+が低い力に移動す
る。酵素は広い範囲のpH(5,5〜10.5)で活性
をもっている。クラクションVf(2,54弘g)をこ
のアッセイに使用した。
実施例 5 フラウォ/染、クテリウム・アルポレンセンスの活性に
対する種々の抑制剤の効果を決定する実験をiっだ。ク
ラクション■及びVI (第1表)を第4表記載のよう
に使用した。
剃工省 酵毒フラ クション  試Wした抑制 木  占 (単位)III
−50ttg   −−−4,13,85mM EDT
A     4.111% Cw/v) SSI   
  16Vi−’r、27gg  −−−’     
2.00、17mM DFP        0.10
.83mM PMSF       1.983.00
d NEW     2.0略号の説明: EDTA=エチレンジアミン四酢酸 5SI=ストレプトマイセス・スブチリシン抑制剤 DFP=ジイソプロピルフォスフオフルオリデート PMSF=フェニルメチルスルフォニルフルオリト NEM=N−エチルマレイー′酸イミドプロテアーゼが
活性を小すためには金属イオンを必要としないか、スブ
チリンノ抑制剤及びDFPにより強く抑制される。驚り
べきことには、P1’vlsFは何の効果も示さない、
LIFF感度とPMSF感度とは通常−緒に現れるため
。このことはW常なことである。
実施例 6 木工雄側は第1表のクラクションIを試験酵素として使
用し、洗濯用添加剤としてのフラウ′オパクテリウム・
アルポレ・ンセラス・アルカリ性プロテアーゼの効果を
例示する。
この酵素の染み抜き能力はエイドゲネシンセーマテリア
ループリューフングスーアンシュタルト(E N P 
A)  (Eidogenoessische−Mat
eriaトρruefungs−Anstalt ) 
−116、血液、牛乳、及び里!1で均一に汚れた繊維
布の試験法(Test FabriCs、 Inc、 
、 New York)により測定した。使用した方法
は米国インディアナ州、エルクハルト(Elkhart
 、Indiana) ′?イルズ・ラボラトリーズ(
Miles Laboratories)社酵素製造部
門の技術サービス部/Technical 5ervi
ces Department of the Enz
yme Products Division)発行の
「染み抜き試験法J (”5tain Rea+ova
l Te5t”  ) (Assay N o 。
35095、p、99.1)である。この方1人はティ
ー・コイル(T、 Coyle)記載の方法(J、 A
m、Oil [:hem、 Sac、、 413.51
5. (+969))と類似している。
原料の洗剤基質はアメリカンφホーム・アプライアンス
会マニュファクチャーズ・アソシエーシ゛ 、J  7
  (AHAM)   (American  Hom
e  Appliance  Manufacture
s As5ociation)の標準燐酸塩含有洗剤組
成物であった。ガードナー(Gardr+er ) X
L−20トリスチムラヌ(Tristimulus )
色度計(Gardner Labo ra tar i
es、 Inc、 、Bethesda 、Mary 
1and)を測定に用い、活性はブランクに対する適当
な補正をした後、酵素の濃度の関数とじての反射率の変
化で測定すれる。結果を第5表に示す。
音互虜 醇7 (単位 又)     反 −イ・ド化1313
        1.5 2625        2.5 5250        5.3 =れらの結果によれば、反射率の変化(染み抜きの程度
)は試験系のアルカリ性プロテアーゼのe度増加にII
:、比例することがわかった。
実施例 7 フラヴオパクテリウム・アルポレンセンスにより同時に
つくられるプロテアーゼ及びグルコース・イソメラーゼ
をこの実施例及び第6表に例示する。
嵌旦澁 グルコース・   アルカリ性 Oイソメラーゼ本  プロテアーゼ a) :j:義通り    1.924    520複合体
b)  14,567   4700a)媒体は1′記
のものを含む 0.21キシロース、 0.05駕KH2PO,,0,
03%に:OH。
0.02$ Mg5Oa 、O,OQl$ Fe504
 。
0.05% (NHa )  2 SO4、0,5%カ
ザミノ酸。
ビタミン及びに跡元素 (b)グルコース・、イソメラ・−セ活性のl中(&は
1μモルのグルコースを規定の条件ドにおいて1分間に
lkのフルクトースに変える酵素の量として定義される
。[ジー拳ポグスラウスキー(G、 Bogus la
wsk i)及びニス・タヴリュー争ベルチ(:S。
W、 Bertch) 、 J、 Appl、 Fti
ochem、 2.367−372゜(IHQ))  
参1j(i ]  。
0.2%のグルコースを含む規定の媒質において、プロ
テアーゼは合成されず、グルコ一ス・イソメラーゼは対
照の約50%に低ドする。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、適当な栄養分を含む水性栄養媒質中において回収M
    r能な着の酵素を生成するのに十分な時間、フラヴ士バ
    クテリウム・アルボレッセンス(Flavobacte
    rium arborescens)種の微生物を培養
    することを特徴とする微生物のアルカリ性プロテアーセ
    の製造方法。 2、栄養媒質がすべて重量/容積基準で0.05〜0.
    2%の酵母エキス、0.5〜1.0%のキシロース、5
    〜10%のコーンステイープリカー、及び0.5〜1.
    0%の燐酸カリウJ・を含む特許請求の範囲第1項記載
    の方法。 3、栄養ltj質のpHを約6.8〜7.2のレベルに
    調節する特許請求の範囲第2項記載の方法。 4、微生物を29〜32°Cの温度において16〜24
    峙間培養する特許請求の範囲第1項記載のガ、す、。 5、プロテアーゼ生成性微生物かフラウォ/\クテリウ
    ムΦアルホレンセノヌNRRL  B  −11,02
    2である特許請求の範囲第1引記載の方1人。 6 プロテアーゼ生成性微生物がフラウォバクテリウ1
    、・アルホLノ、セ7スATCC4358である特許請
    求の範囲第1項記載の方法。 7、遠心分離により微生物の細胞を栄養媒質から除去し
    、プロテアーゼを含む透明な上、澄液を残す特許請求の
    範囲第1項記載の方法。 8、f&酸アンモニウムを上澄液に加えて沈澱Φ濃縮し
    、次いでジメチルアミンエチル・セルロースにでイオン
    交換グロマトグラフィーにかけ、庶糖勾配遠心分離を行
    なうことにより精製して均一化する特許61’l求の範
    囲第7項記載の方法。
JP58177167A 1982-09-28 1983-09-27 フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスからアルカリ性プロテア−ゼを製造する方法 Granted JPS5978686A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US425713 1982-09-28
US06/425,713 US4429044A (en) 1982-09-28 1982-09-28 Preparation of an alkaline protease from flavobacterium arborescens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS5978686A true JPS5978686A (ja) 1984-05-07
JPS6151878B2 JPS6151878B2 (ja) 1986-11-11

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US (1) US4429044A (ja)
EP (1) EP0104554B1 (ja)
JP (1) JPS5978686A (ja)
AR (1) AR231306A1 (ja)
DE (1) DE3370025D1 (ja)
DK (1) DK442083A (ja)
MX (1) MX7637E (ja)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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