JPS5977354A

JPS5977354A - 化学発光増感法

Info

Publication number: JPS5977354A
Application number: JP18743382A
Authority: JP
Inventors: Kazunari Imai; 一成今井; Teruaki Kobayashi; 映章小林
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1982-10-27
Filing date: 1982-10-27
Publication date: 1984-05-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の利用分野〕本発明は化学発光ｖＱ買の検出法に係シ、特に化学発光
物質の定量、並びに化学発光の針側を基とする免疫ず搬
、酵累矩量等の感度同上に好適な、化学発光の増感法に
関するものでるる。

〔従来技術〕

１ヒ学発光Ｃ吻質は、１９世紀末にロフィンが、２０世
紀初めにルミノール、ルシゲニンが発見されて以来、各
種研死されてきておυ、七の発光強度（発光効率）、発
光波長などは浴媒の棟刀４、ｐＨ，発光物質の置換基、
触媒の存在などに依存して大きく変化することが知られ
ている。

フルオレツセイン、ローダミンなどの螢光色素を化学発
光系に共存させると、その発光がしばしば、これらの螢
光に変わることが、知られており、たとえば、電子線ビ
ーム（ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｂｅａｍ）を用いたルミノー
ルの発光において、フルオレッセイ（Ｙ、Ｈａａｓ　＆
　Ｅ、ＷＬｌｅｒｚｂｅｒｇ　、　Ｊ、　Ｐｈｙｓ、　
Ｃｈｅｍ、。

８３、２６９２−２６９６　（１９７９）　）。

また、バ’／Ｖ７　（Ｖ、Ｉ　、　Ｖａｓｉｌｅｖｌら
によって、ルミノールを電気化学的に発光させた部会（
Ｅｌｅｃ　ｔ　ｒｏ　ｃｈｅｍｉ　ｌ　ｕｍｉｎｅｓｃ
　ｅ二１ｃｅ）に、フルオレツセインの共存により、発
光が、フルオレッセインの螢光に変わり、発光強度が増
すことが報告されている（　Ｋｈｉｍ、　Ｖｙｓ、　Ｅ
ｎｅｒｇ、、　８．４６５　（１９７４）　）。

化学的な触媒によって発光を開始させた場合についても
、ルシン（Ｂ　、　Ａ　、　Ｒｕ５ｉｎ）　らによって
、ルミノールをＣ（Ｎ０ｚ）４１’（ｖｏｗ系の触媒で
発光させる際に、フルオレツセインを共存させると、ル
ミノールの発光が、フルオレツセインの螢光に変わるこ
とが報告されている（Ｂ、　Ａ、　Ｂｕｓ　ｉｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｋｈｉｍ、　ＶＭＳ、　ｇｎｅｒｇ、
、　ｉｏ、　８９−９１（１９７６））。

しかし、螢光色素以外の、例えばアミノ酸などを用いて
、発光量の増加を報告した例はない。

−万、化学発光物質を用いた免疫定量法（Ｃｂｅｍｉ　
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
については、特に近年その研究が盛んになってきておシ
、例えば、ヒ）ＩｇＧにルミノールを標識してヒ）Ｉρ
を測定したバーシュ（Ｌ、Ｓ、Ｈｅｒｓｈ）等の報告（
Ａｎａ　１．３ｉｏｃｈｅｍ、、　９３．２６７　（１
９７９）　）、抗ウサギＩｇＧにルミノールを標識して
ウサギＩｇＧを測定した’／７プソ７　（Ｊ、　Ｓ、　
Ａ、　Ｓ　ｉｍｐｓｏｎ）等の報告（Ｎａｔｕｒｅ、　
２７９．６４６　（１９７９）　）、テストステロン′
・アルブミンにルミノールを標識してテストステロンを
測定したプラン）　（Ｊ、　Ｊ、、　Ｐｒａｔ　ｔ）等
の報告（Ｊ、Ｉｒｒｍｕｎｏ　Ｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　
２１＋　１７９　（１９７８）　）、　Ｔ＜にイソルミ
ノールを標識してＴ、を測定したシュレーダー（Ｈ，Ｅ
３ｂ　５ｃｈｒｏｅｄｅｒ）等の報告（Ｊ、　Ｉｍｍｕ
　ｎｏｔ　。

Ｍｅｔｈｏｄ、　２５．２７５　（１９７９）　）等が
知られている。これらの報告は、いずれも原理的なもの
であり、感度においても、他の測定法と比較して、特に
すぐれたものではない。また研凡の主眼が、化学発光物
質の標識方法、及び高発光効率の化学発光物質誘導体の
探索におかれている。

化学発光物質の検出感度は、例えばルミノールの場合で
、約１ｐＭ程度であシ、ゆえに、ケミルミネッセンスイ
ムノアッセイの測定感度は、これを上回ることは困難で
ある。

〔発明の目的〕

本発明は、化学発光を増感することによシ、例えばケミ
ルミネッセンスイムノアッセイのような化学発光物質の
検出の感度を向上させるものでおる。

〔発明の概要〕

化学発光物質は、ルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）、ロフ
ィン（１ｏｐｈ　ｉｎ）、ルシゲ＝：ｙ　（ｌｕｃｉｇ
ｅｎｉｎ）、など各種知られているが、その量子収率は
ルミノールの場合でも、せいぜい１％程度と低いもので
おる。

また、一般的に、これらの誘導体では、量子収率はさら
にイ氏いことが多い。

一方、化学発光物質の計測を応用した例であるケミルミ
ネッセンスイムノアッセイにおいては、極微量生体成分
を直接計測するかわシに、ルミノールのような化学発光
物質を、被測定物質と同種の抗原又はこれに対する抗体
に標識として結合させ、この標識した化学発光物質の発
光量を計測して、間接的に被測定物質を定量する。した
がって、ケミルミネッセンスイムノアッセイの感度は、
化学発光物質の発光量（発光収率）に依存することにな
る。

化学発光物質の量子収率の小さいことは、前にも述べた
が、抗体あるいは抗原等と結合することによシさらに低
下する＜Ｓ　ｉｍｐｓｏｎ、　ｅ　ｔ　”　１．　、　
Ｎａｔｕｒｅ。

戸’９，６４６−６４７（１９７９）、等）。　このこ
とが、ケミルミネッセンスイムノアッセイの感度を下げ
ていることは明らかである。各種化学発光物質誘導体の
利用、及び結合方法の検討がなされているが、必ずしも
感度は上がっていない（Ｈ，ＦＬＳｃｈｒｏｅｄｅｒ、
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｊｒｍ］ｕｎｏｌ、　Ｍｅｔ
ｈｏｄ、　２５゜２７５　（１９７９）等）。

発光収率が低下する原因としては、種々考えられるが、
その１つに他分子等へのエネルギー移動が考えられる。

もし、このエネルギー移動を抑制すること、あるいは、
エネルギー移動後もなんらかの手段でエネルギーを光エ
ネルギーとして取り出すことが可能ならば全体としての
収率を向上させられる、この方法の１つとして、フルオレツセイン等の螢光色素
を共存させ、発光量を増加させる方法が提案されている
が、効果の大きいフルオレツセインなどでは、それ自身
の発光によｐバックグジンドを上げ、化学発光物質の磯
度が小さい領域での８／Ｎ比を悪化させている。

本発明者らは環状基を有するアミノ酸（例えば、フェニ
ルアラニン）を共存させた化学発光系を取り上げ、実験
を行なっている過程で、ルミノール等の化学発光の減設
速度が低下し、積算発光量が増加する現象を発見した。

この際便用したアミノ酸自身が単独で化学発光を示すこ
とはなかった。

本発明は、上記の発見に基づき、化学発光物質の定量時
に、環状基を肩するアミノ酸を共存させ、検出しうる発
光量を増強させることにより、検出感度を上げ、前記の
欠点を解決したものである。

−１だ、近年、臨床検査などの分析に多種類の酵素が用
いられるようになってきた。そのうち酸化酵素は女定性
及び反応生成物の検出などの点で優れておシ、広く用い
られＪ：うとしている。酸化酵素が特定の基質に作用す
ると、酵素反応による基質の変化に伴い、一般に酸素が
消費され、過酸化水素が生じる。酸化酵素を使用した分
析においては、この過酸化水素の量を計測することが多
いが、ここに化学発光物質、例えばルミノール、を適用
すると極めて高感度、高柑度の計測が可能となる。

本発明はこのような計測の検出感度の向上にも適用出来
る。

〔発明の実施例〕

化学発光物質としては、ルミノール、イソルミノール、
ロフィン、ルシゲニン、スカトール等カ良く知られてい
るが、以下では、ケミルミネッセンスイムノアッセイで
、標識物質として、すでに利用されているルミノールを
例にとり説明する。

発光系に共存させるアミノ酸としては、水溶性の比較曲
部いフェニルアラニンを例にとシ説明する。

実施例　１１０−１Ｎ　ＮａＯＨに浴かした１０−’Ｍ＃ミノール
浴液２０μｔｆ、１ｃｍ角型、石英螢発セルに入れ、５
０　ｍＭＨ，０，水溶液０．１　ｍ　ｌと１　ｍＭＮａ
Ｏｃ７の１ｏ−′Ｎ　ＮａｏＨ７１ｉ１ｍＡを加えるこ
とにより発光させ、フォトンカウンタで計数した。この
際、一つの発光系には、あらかじめ１０−”Ｍのフェニ
ルアラニン水浴液１００μｔを加え、もう一つの発光系
には、蒸留水１００μｔを加え、その発光量の相違を調
べた。この際、触媒の注入は、ポンプによＬ＋＆Ｊｋ、
ｍ速を側倒した。

発光の減衰曲線は、第１図のとおシであった。

ａば、発光系に蒸留水を加えた場合であり、ｂは発光系
にフェニルアラニンを加えた場合である。

ａの場合、発光系は単調に減少するだけであるが、ｂの
場合、初めａと同様に減少するが、発光開始後５０秒ご
ろから再び発光量が増加する。やがて、極太値に達する
が、減衰速度は緩やかである。

発光量で比較すると、発光開始後６０秒間の積算値で、
ａは３．３Ｘ１０’　ｃｏｕｎｔｓ／　５　Ｑ秒に対し
、ｂは、やや小さい２．８ｘｌｏ’　ｃｏｕｎｔｓ／　
６０秒であるが、発光開始後１２０秒間の積算値では、
ａは３、７　Ｘ　１０’　ｃｏｕｎｔｓ　／　１２０秒
に対し、ｂは、４．３ＸＩＱ５ｃｏｕｎｔｓ／　１２０
秒と大きくなる。４分間（２４０秒間）の積算では、ａ
が、３．９Ｘ１０’ｃｏｕｎｔｓ　／　２４０ＳｅＣで
あるのに対し、ｂが、７．２ＸＩＱ５ｃｏｕｎｔｓ　／
　２４０　Ｓｅｃとなり、ｂｏｓｘ値がａの櫃剥、値の
約２倍となっている。積算時間を長くすれは、この差は
ますまず拡がる。

フェニルアラニン濃度を変えて（１０”５Ｍ〜１０−’
Ｍ、）　実験を行なった結果、（１）第１図すで見られ
るような、発光開始後約５０秒付近からの減衰速度の低
下、あるいは、発光量の増加は、１０−’ＩＶＩから観
察されるが、低濃度（１０”’Ｍ以下）ではその効果が
小さい。

（２）高＃！に度（１０−２Ｍ以上）では、フェニルア
ラニンによる吸光により、発光量が減少するとともに、
上記の現象も観察されない。

（３）　　フェニルアラニンだけの発光を測定したが、
いずれの濃度においても、ブランクレベル以上の発光量
は観測されなかった。

この系においては、１０−４〜５Ｘ１０−３Ｍで増感効
果が最大となる。

ルミノールの濃度を変えて実嫉を行なった結果を、第２
図ケこ示す。ａは、発光系に蒸留水を加えた場合、ｂは
、発光系にフェニルアラニン水浴液を加えた場合である
。実験の方法は、前と同様であシ、フェニルアラニンの
濃度は１０’Ｍでるる。

フォトンカウントが可能な領域にわたって、フェニルア
ラニン添加の効果が、ルミノール濃度に依存せず、ルミ
ノールフェニルアラニン系においても、ルミノールだけ
の場合と同様に、ルミノール感度と発光量に比例関係が
成立した。

上記の例では、ルミノールのみについて示したが、他の
カー光物質でも同様である。

使用するアミノ酸の種類、濃度、及び量は、測だする化
学発光物質の性質、アミノ酸の性質２発光の際の触媒系
及び測定装置の特性などによシ最適ｆヒされなければな
らないことは勿論である。

また、本発明は、発光物質が生物活性物質（例えば抗体
）７ｉｌ−どの有機高分子化合物に結合している場合に
も用いることができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、化学発光量が２〜３倍以上に増強され
るので化学発光物質の検出感度を上げることができる。

さらに、化学発光物質を標識化合物として用いたケミル
ミネッセンスイムノアッセイに応用すれば、分析感度を
上げることができるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、発光の減摂を表わす図、第２図は、発光量の
ルミノール濃度による変化を表わす図である。ａ・・・発光量に蒸留水を加えた場合の発光量、ｂ・・
・発光系にフェニルアラニン水浴液を加えた場合の発光
量。

Claims

【特許請求の範囲】１、化学発光物質？発光させる系に、環状基を有するア
ミノ酸？共存させて発光強就ヲ増強させること全特徴と
する化学発光増感法。２、　アミノ酸としてフェニルアラニンを用いることを
特徴とする特許請求の範囲笛１項記載の化学発光増感法
。３、　上記化学発光物質が有機高分子化合物に結合して
いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の化学
発光増感法。