JPS59500201A - 生物組織への生理活性物質投与のパターンを制御する方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 生物組織へ投与する化学刺激のパターンを制御するための方法 技術分野 本発明は、その自然の栄養供給から分離された生物組織へ化“学刺激を与える方 法に関する。特Ｋ、時間内のどの時点においても組織へ作用する化学刺激剤の濃 度が概知であり、種々の強さ、持続時間、速度の動力学、周期性、振動の度数、 ノツチ、プラトー、２項値および化学刺激の期相関などのパラメーターが制御で き利用できるような化学刺激の供給方法に関する。

背景技術 自然の栄養供給から分離された器官のごとき生物組織の維持は非常に重要である 。体から除去された器官に関して多くの研究がなされている。単に特定の器官を 体外で生存させる事の試みから種々の化学刺激に対する分離された器官の複雑な 応答の研究まで多くの種類の研究がある。培養培地は器官の老廃物および自然の 分泌物により非常に速かに汚染されるので、この壓の系は器官を生物的に生きて いる状態に維持する能力により限定される。

静的な系の不完全さは、培養培地および器官を保っているチェンバーが補充され 、かなり長〜・間生物的生命を維持できるような動的な系の発達を導く事となっ た。これらの系は通常潅流、堅リフニージョンまたはスーパ−フュージョン系と 言われており、体外での器官および他の組織の研究に使用できる時間を顕著に増 加させた。

ベリフュージョン系は、器官を栄養を含む培養培地で周°囲を囲み器官が栄養を 吸収する系である。潅流系では器官の心血管系を通して器官に栄養を供給する。

スーパーフュージョン系は潅流およびはリフユーズ系両方の系で栄養を器官に与 える系である。

典型的には動的系にはチェンバ２−があり、その中へ器官または他の組織を置く 。チェンバーには栄養含有培養培地を提供する入口およびチェンバー中の培養培 地の量を一定に保つのに良好な速度で培養培地を除去する出口がある。動的系は いくつかの利点を持っている。第１に、培地を連続的に交代しそれにより分泌物 および老廃物の蓄積の影響を最小にしているので静的系の条件に比べ動的系の条 件は体内の条件とよりぴったりと類似している。

第２に、チェンバＺ−から器官を除去する事なしに異った試薬と接触させる事が できる。第６Ｋ、栄養および他の化学刺激の影響をチェンバーの出口からの試料 を集め分析する事により研究できる。

しかしながら、先行技術の潅流、ペリフュージョンおよびスーツミーフュージョ ン系もいくつかの限界がある。

第１Ｋ、化学刺激の静的濃度のみを器官に供給し、それＫより期間中どの時点で もその濃度が概知となる。化学刺激を１パルス“Ｋより与え濃度を動的に変化さ せると、培養チェンバー中の器官に作用する化学刺激の時間に関する濃度が未知 となる。その結果動的系を用いた種々の濃度の化学刺激の器官への応答を決定す る研究は、しばしば時間に対し意味がなくなる。

第２に、器官に対し静的またはパルス状の栄養または他の化学刺激の濃度だけし か存在しえないのでしばしば過剰量または過少量となる。器官を生物的に生きて いる状態に維持しようとすると、時間により器官の栄養要求が変化するので適当 な濃度の器官への供給が、器官の生物的生命の延長または動的状態での化学刺激 への器官の応答を分析しようと試みる場合は特に重要である。

発明の開示 本発明は生物組織へ化学刺激を制御された方法で供給する方法である。化学刺激 の制御は期間中どの時点においても組織に作用する化学刺激の濃度が既知である ように行い、使用者にインービボ条件または他の条件にまさろうと努める事を可 能にする。

本方法は組織に作用する化学刺激の既知の濃度を含む養育培地の第１の既知の量 で出発する。同時Ｋ、既知量の化学刺激を含む第１の既知の養育培地の量を組織 への作用から除去し、組織へ作用する第２の既知の量を残す；既知量の化学刺激 を含む第２の既知量の養育培地を組織へ作用している第２の既知量へ加え、それ により、第６カ組織へ作用する既知量を形成する。添加された第２の量は異った 濃度を持ち、組織へ作用している量へ拡散し、その濃度を変化させる。組織へ作 用する濃度は、前の量およびその濃度を辿る事で決定する。前記工程を組織へ作 用する化学刺激の濃度が期間中のすべての時点で既知となるように繰り返す。

本発明の方法は時間に関して、組織へ作用する化学刺激の濃度の変化を制御する 。化学刺激の濃度の増加または減少を−望む時は、加える化学刺激の濃度を増加 または減少させる。本方法は時間に関しての化学刺激のふらつきを正確に制御す る事を可能にし、それにより、強さ、持続時間、速度の動力学周期性、振動の度 数などをノツチ、プラトー、二項値および期相関などと同様に研究できる。

図面の簡単な説明 第１図は先行技術の方法を用いる化学刺激または薬物の静的量の受渡しを図示し たグラフであり；第２図は化学刺激または薬物の濃度を段階的方法で変化させた 先行技術の過程を用いる化学刺激または薬物の受渡しを図示したグラフであり； 第６図は生物組織へ受渡されるべき化学刺激または薬物の濃度の典型的に望まれ る変化を図示したグラフであり： 第４図はペリフュージョン、潅流およびスーパーフュージョンなどの先行技術を 用い、化学刺激または薬剤の濃度が不明な期間を図示したグラフであり；第５図 は同時に２つの化学刺激または薬剤の濃度を制御する本発明の能力を図示したグ ラフであり；第６図は本発明の方法を図示した図式であり；５ 第７図は本発明の方法の構成図であり；第７Ａ図は本発明の他の具体例の構成図 であり；第８図は本発明の方法を制御する適したコンピューター制御系の図式で あり； 第９図は培養チェンバー中の薬剤濃度を予測し実施例で得られたデータポイント 間の相関を図示したグラフであり； 第１０図は多くの可能なＲ／Ｖ比を図示したグラフであり； 第１１Ａおよび１１Ｂは本明細書に記載されている実施例で使用した器具の構成 図であり； 第１２図は本明細書に記載されている実施例の実験結果を示した一連のグラフで あり； 第１３図は本明細書に記載されている実施例で使用した時間に関する濃度の希望 の変化を図示したグラフであり； 第１４−１６図は本明細書に記載されている実施例において培養卵巣のエスロジ エン分泌を図示したグラフで本発明の方法は自然の栄養供給から分離された生物 的に生きている組織に対し、エヱー〈！条件または他の条件と劣らないようにし ようとするものである。先行技術においては自然の栄養供給から分離された組織 には第１図に実線で図示したように栄養またはホルモンの如き化６　１８表顯５ ト５１川２（Ｊｌ　（４）学刺激または薬剤の静的量を一定に投与するか、また は組織を徐々に増加または減少させた化学物質濃度の液へ移し、第２図の実線で 図示した如く、組織にとって時間に関して畔の段階型プロットができる。望まし いパターンは各々の図において点線で示しである。

静的系または一定量の過程においては（第１図に図示）組織は時間が進行するに つれ、過少量または過剰量の特定の化学刺激または薬剤を受けそれは多くの化学 物質濃度が時間に関して動的である４ｙ−ｅ４の環境における刺激の自然な供給 とかなり異った様式となる。栄養の如き物質の一定濃度での定常的供給は、代表 的には移植に使用する為器官の生存を保つような状況の際使用される。

定常的量ではある程度の期間器官を生きたまへ保てるが、その期間は短く、器官 はすばやく移植しなければならない。静的な系は、±乙−に匹で栄養または薬剤 が供給されている最適の方法と同様な方法で器官へ渡す栄養量が制御されない。

濃度を増加したりまたは減少させたりする他の先行技術の方法は第２図に図示し である。この方法における組織はより以上またはより以下の物質濃度を含む養育 培地に物理的に移される。組織が暴露される物質濃度はその結果段階型様式とし てグラフに表わされる。第２図に図式で図示されたこの方法は前記の静的な系よ り４：ｙ−ｅ！条件により正確に似ているが、過少量および過剰量が短い時間々 隔で起こる。さらに、ある物質濃度から他へ器官を移す事は一般的には器官にと って有害である。

（ｙ−ｇ、ｉ条件に劣らないように組織へ供給される刺激量を変化させようとし た、ベリフュージョン潅流、ス一）ξ−７ユージヨンの如き他の以前の試みも失 敗した。

しばしば器官に供給される物質量は一連の段階ですばやく変化し、または数種の 物質は同調しないで変化する。

例えば、第６図に図示した如く、薬剤量を２段階で減少し、第６段階で増加させ 、再び第４段階で減少させる事が器官の要求に応答して望まれる。典型的には物 質の初期濃度で培養チェンバー中た位置している器官に、既知濃度の物質を既知 量培養チェンバーに注入しで、培養チェンバー内で新しく、異った濃度のものを 与えると放置により培養チェンバー内で以前の濃度の中へ拡散し、平衝拠達し、 新しい濃度となる。器官に作用している物質の初期濃度および容量が既知であり 、注入した物質の濃度および容量が既知であるので、この時点で器官に作用する 新しい濃度がわかる。しかしながら、系は流れ去る系であるので、組織に作用す る濃度は時間とともに変化する。物質注入後の器官に作用する物質の濃度は未知 となる結果に終る。この事は第４図に図式的に図示しであるが、第１および第２ のパルスが図示されているが、パルス間の張度は未知である。

本発明の方法ば歪ヱーに星の状態または他の期待されるどのような条件にも匹敵 でき、理論的には第５図のグラフに図示した如く、先行技術のどれもが全くかな わないものである。本発明の方法を用いると、化学刺激量は制御された方法で変 化可能であり、その際組織に作用する濃度の変化は実質的に直線的である。器官 に用いる化学刺激濃度庁期間内どの時点においても既知であり、期間内どの時点 においても制御可能であり、第５図の実線および点線で示した如く、多数の物質 が同時にこの方法で制御できる。使用できる物質の数は養育培地への溶解性に依 存する。

本発明の方法による１つの重要な利点は実験に”無傷の生体″（生きている動物 ）の使用を避ける事ができる点である。その代わり、組織または器官はインービ ドロテ望マシイマたは４７−ｅｚに匹敵する条件下保たれる。

ホルモン、放出因子、神経伝達物質、神経ペプチド調整物質、バラクリン、１サ イベルニン″、成長因子、薬物の如き物質の効果は、グルコース、トリプトファ ン、乳酸およびグリセロールおよび他の物質と同様に、これらの物質の既知の変 動をシミュレートし、それらを分離した器官、組織または細胞株に与える墨によ り決定される。

発明の方法は批判が年々増している生きている動物の試験に代わる方法を提供し 、不必要な痛みおよび動物の苦しみを除き、実験のコストも減じる。本方法は（ ７−ｅ！条件に匹敵し、培養における組織は無傷の生体中にある如く応答する。

例えば、最近消費者製品安全委員会を含む連邦機関は化粧品の試験のためドレイ ズ（Ｄ　ｒａｉｚｅ　）試験の使用を要９ 求した。推定５００．ＯＤＤのウサギが毎年この試験のため化粧品会社で利用さ れ、この試験は生きているウサギの目に化学物質をのせ、試薬が炎症を起こさな いのみでなく動物に痛みを与えない事も同定するものである。

ドレイズ（Ｄｒａｉｚｅ）試験は炎症性応答の機構を含んでいる。本質的に、哨 乳類生体中のすべての組織は刺激物に応答して炎症反応を起こす能力がある。本 発明の方法は選択された組織（例えば、皮膚結合組織、角膜細胞）を４７−　ｅ 　）　ｏで維持でき、時間忙関して前もって決定されている量の刺激物を供給し その間普通の±ｙ−ｅ４の動力学に匹敵する。炎症反応を示すいくつかの機構が 知られており、容易に検定される。イン−ビトロで既知の刺激物から炎症性応答 を誘起するのに必要な最適の条件を決定した後、潜在的な刺激物の使用者適用を シミュレートするのに本方法を使用できる。本方法で培養した組織の応答をモニ ターする事により非常に正確で費用のかからない試験能力を動物に痛みや苦しみ を与える事なく提供する。

本発明の方法はまた薬物試験に応用できる。生きている動物に″′５０％致死“ 量（ＬＤ−５０）の薬物を注入するかわりに、動物の循環系中のすべての時間の 薬物の濃度を決定し、かわりに±と一胚に匹敵する条件下の分離組織にイン−ビ トロで与える。この方法で、より生理的に有効な方法での量および時間の投与系 列を決定する事により、最も適しかつ便利な方法での薬物投与がめ１０　特表” ２５９−５００２ｔｌｌ（５）られる。副作用はより容易に決定および最小にで き発ガン効果もわかりやすい。

製薬工業は医師が生体機構を左右するのに使用する薬物の処方または放出系を提 供する。全身性療法は薬物のパルス（例えば食事時）または化学物質の一定の血 清水準を得ようとする試みの両方から成る。両方の場合の見解は１治療のウィン ドウ“、すなわちそれ以下の時は薬物は少しまたはまったく効果がなく、それ以 上の時は毒性があるという血清濃度または体内総量の範囲である。

この型の見解は何が最適のパターン化された物質濃度であるべきについての単な る根本的技術的近似であることを証明する。なぜなら濃度を、波にかえて情報を 運ぶことがますます明らかであるからである。これらの波は信号であり、それら の行動を決定する細胞過程である。治療のウィンドウの見解は動的でなく、それ 故信号でもない。

本方法を利用すると、特定の量の薬物の量および投与予定のみでなく放出の速度 もまた決定できるような方法を医科学者に提供できる。本発明に従Ｍヱーｇ上！ 試験により副作用をより容易に決定でき薬物の直接の原因を入手できる。

別の応用としては移植器官の保存がある。典型的には、一旦その供与者から除去 されたらそのような器官は非常に限られた期間しか生存できない。静的投薬量の 系を用いると器官の要求は前ＶＣ議論したように時間に関して変わるので、器官 の生物的寿命を長くするためＫは過剰量１ または過少量の栄養が要求される。±ｙ−ｅ４条件をまねた栄養を供給する墨に より器官を生物学的に生きている状態に保つのに必要な最適の栄養量を決定する ため、本発明の方法を使用し、流出物の生物的応答を検定する。

各々および期間中のすべての時点で器官に作用する栄養量は既知であるので、こ れらの栄養量を検定結果と合わせる事ができ、目的の時間に目的の量を投与する 前もって決定されたプログラムを決定する。前もって決定された投与の予定を決 定したら、器官に目的の時間に目的の濃度を供給するために本発明の方法を使用 し、いままで決して達せられなかった４：ｙ−２４での期間のように、一連の化 学刺激に対し器官は応答する。

本方法を使用し、ラット卵巣を維持でき、土ニーΩ旦でシミュレートした４日周 期の間化理学的活性を残している事が示される。それは４日周期の終りに排卵す るラットのインービボ条件を模倣した一連の化学刺激に応答する。さらに、卵巣 は成長し、４：ｙ−ｅｇの卵巣と非常に類似した物質を分泌する。この分野に精 通する者はこの事は注目すべき成果である事を認めるだろう。この方法において 更に長時間卵巣が応答を続けないという指摘はない。

また別の応用には薬物またはその類似物の静脈内投与がある。患者に与える薬物 または類似物の用量はすべての時間制御可能である。その結果、薬物の予定され た投与が決定されたら、薬物は目的の時間に目的の量だけ与えられる。

すべての生物的現象は物理化学であることが知られているので、適当な動的記述 がいつもあるにちがいない。

本方法を利用して、これらの動力の影響を研究し、どのように細胞活性の制御を しているかを見い出す事が可能である。結局ゴールは治療の目的で細胞の応答を 制御する事である。この事が達成されたら、ガン、糖尿病、生まれつきの欠陥、 老化合併症、肥満およびホルモンの不均衡という名前の少なからぬ病気などの治 療法の発見に非常に貴重な情報が得られる。

本発明の方法は第６図にダイアダラムとして図示しである。典型的には、自然の 環境および栄養供給から除去された組織を第７図に図示した構成図系に置く。第 ８図に図示した系には、ガス人口２２および圧力抜き口２４を持つ保持フラスコ ２０がある。ポンプ２６は化学刺激または薬物を培養チェンバー２８に送り込み 、チェンバー内に組織６０が位置する。最初の既知の濃度の化学刺激（薬物また は栄養）の既知量を培養チェソノ：−２＝’ｓ内の組織６０に供給する。採集系 ６２は分析のため潅流液を採集する。

あるいは、組織は体内に残っているがその自然栄養供給から切断されている場合 でもよい。栄養液の如き化学刺激を潅流系と同様なその自然の心血管系６４を通 し第７α図に図示した如く組織に供給する。

組織に作用する既知量の化学刺激を第２の既知容量と１３ して第１の既知容量から除く。その結果、残存する容量およびその化学刺激濃度 は既知となる。同時に、既知量の既知のしかし異った濃度の化学物質を第３の既 知容量として、組織に作用している量に加える。その結果、組織に作用する最終 容量は最終濃度ととも忙決定できる。

前記工程をすぐに繰り返し、もし連続的な条件で行えば、培養チェンバー４リフ ニージヨン系または潅流系の両方へ適用できる連続的フロー系として定義される 。

培養チェンバー内の物質の濃度を変える為、良好なのは多数の保持フラスコを用 い、各々には培養チェンバー内の物質の出発濃度と異った濃度の物質を含んでい る。

例えば、もし保持フラスコ甲の物質濃度が培養チェンバー内の濃度より高ければ 、培養チェンバー内の濃度は特定の保持フラスコから供給される物質が培養チェ ンバー内の物質とおき代わるので時間とともに増加する。

既知の量既知速度で培養チェンバーに運搬される物質濃度の既知の供給に応答す る培養チェンバー内の物質濃度の変化は、デジタルコンピューターを結合した系 の使用により容易に決定される。

本方法においてはある速度依存の容量が既知の時間間隔で培養チェンバーから除 去される。同時に、培養チェンバーの頂上から他の速度依存の量の滴下がある。

結局このしずくは培養チェンバーにはいり、培養チェンバー内の物質と平価とな る。

シミュレーション系列を始めるため、下記のパラメ−１４特表１１Ｕ５９−５０ （１２０１（６）ターを定義する： これらの定義したパラメーターとともに、下記のループをデジタルコンピュータ ーにプログラムし過程をシミュレートする。下記の仕事を各々の化学刺激の各々 のループの間に実行する； １、培養チェンバー内の総ユニット数（ＵＴ）を決定すル（ＵＴ　＝Ｇｉ　ユニ ツ）　／ｍｌ　Ｘ　Ｖ　ｍ）。

２、培養チェンバーから容量（ＶＲ）を除去する。

■、はＲおよびＴの関数である ３、培養チェンバーの新しい容量を決定する（Ｖ二Ｖ−ＶＲ） ４、ＶＲを決定する事による培養チェンバーから除去されたユニットの量（ＵＲ ） ＵＲはＣｉおよびＶ、の関数 （ＵＲ＝（Ｃｉユ＝ット／ｍｉ）　（ＶＲｍｌ　）　）５、培養チェンバー中の 新しいＩＪＴの決定（ＵＴ　：ＵＴ−ＵＲ） ５ ６、保持フラスコから培養チェンバーへ加えた量（ｖＡ）。もし培養チェ７・Ｚ −に空気もれがないなら■ムはｖＲと等しくなる（■ム＝　ＶＲ）７、培養チェ ンバーの新しい容積の決定（Ｖ　＝　Ｖ　＋”／Ａ　） ８、■ムを決定する事による培養チェンバに加えられたユニット数 （ｖＡ　＝　（Ｇｉ　ユニット／ｍＡ’）　（Ｖｈ　ｒｎｌり　）９、培養チェ ンバー中の新しいＵＴの決定（ＵＴ＝ＵＴ＋ＵＡ） １０、新しいＣｚの決定 培養チェンバー容量が一定に保たれている時、どんな拡散できる物質の濃度も数 学的に決定できる（式（１））。

この方程式は本方法のコンピューター補助分析から誘導Ｃ（ｔ）　＝時間ＴＫお ける培養チェンバーの濃度Ｃ８＝保持フラスコ中の化学刺激の濃度（Ｔ−■にお ける最終培養チェンバー濃度→Ｃ！−初期培養チエンバー衾度（ｔ＝０）Ｒ＝保 持フラスコから培養チェンバーへの物質送り出し供給速度（ゴ／ルｒ） ■　＝培養チェンバー内の培地の容量（褐Ｔ　＝時間（時間） より高いまだははり低い濃度の同じ薬物を一定の速度で培養チェンバーに送り出 した時培養チェンバー中の物質の濃度を式（１）が正確に予測するかどうかを試 験するため以下の実験を実施した。色素、メチルオレンジ（ＭＯ）、をこれらの 実験の供給物質として選択した。その理由は：１）培養チェンバー中の色素の濃 度は分光々変針を利用し、４６０ナノメーターの極大吸収における透過パーセン トを測定する事により容易に検定でき、および２）検定終了後、培養チェンバー 液体の試料は培養チェンバーに戻す事ができる。この事は式（１）のどんな・ク ラメーター（即ち培養チェンバー容積およびＣｚ）も変える事なく、すべての時 間連続的にサンプリングできるので重要な事である。

より高い濃度の同じ薬剤を保持フラスコから一定の速度で送り出した時培養チェ ンバー濃度の変化を予想する式（１）の能力を試験するため、１００Ｍの標準溶 液を保持フラスコ中に入れる。このＭＯ浴溶液、　１０％透過の値になるように 調整されており、１００％緯度溶液と考える。２０ｄの蒸留水（１００％透過　 ）を培養チェンバーに入れ、０％濃度溶液と考える。１０および１００パーセン ト透過度の値は既知のＭＯ濃度およびパーセント透過度と比べて０．９９９９５ の相関係数で標準曲線の直線部分にのる。１００％溶液を１８．５　ｒｒＬｌ／ 　ｈｒの速度で培養チェ１７ ンバーに送り出す。２時間の期間１５分間隔で、ポンプを切り、培養チェンバー から２１ｎｌの試料を取り、分光々度肝で検定する。パーセント透過度は光学的 濃度に変換し、標準曲線か、ら濃度を記録する。試料は培養チェンバーに再び戻 し、ポンプを再スタートする。

より低い濃度の供給薬物を保持フラスコから送り出した時培養チェンバー濃度の 変化を式（１）が予想する能力があるかどうか試験するため、１００ｄの蒸留水 （０％濃度）を保持フラスコに入れる。２０ｍ＃）ＭＯの１００％濃度溶液を培 養チェンバーに入れる。０％濃度溶液を培養チェンバーにポンプで押し出し前記 の如く、メチルオレンジの濃度を決定する。これらの実験の結果は第９図に示し である。それは本方法を表示する表現として式（１）が使用できる事を示してい る。

培養チェンバー中の濃度変化を正確に予測できる能力とともに、培養チェンバー 中で時間の関数として拡散できる物質濃度がプロットできるようなデータに匹敵 する可能性がある。培養チェンバーの物質の初期濃度が既知で、培養チェンバー 中の目的の最終濃度の値（Ｏｓ、ｔ）が既知の時間々隔の間また既知である。保 持フラスコ中に入れられる物質の濃度は式（１１から誘導される式（６）を利用 因数分解し： 因数分解し： Ｃ８について解くと： インービボ条件により正確に匹敵するため、培養チェンバー中の組織に作用する 望ましい送り出し速度（ロ）および望ましい容量（ト）を決定しなければならな い。他の表現で行うと、もし、培養チェンバー内の物質濃度を初期濃度（伝）か ら異った濃度（Ｑｔ））　Ｋ変化させる時は時間に対して直線性を示す墨が望ま しく、Ｃｉからｃ　（ｔ）への変化はＲおよび■の関数である。図１０にグラフ として示したように、Ｒ／Ｖ比は最大パーセント変化に影響し、既知の時間々隔 てべてで起こっている。既知の時間々隔の間に可能な最大パーセント変化は直接 的にＲ／Ｖ比で変化している。しかしながら、初期点（Ｃｉ　）および最終点（ Ｃ（ｔ））間の線の直線性は既知の時間々隔の間Ｒ／Ｖ比と逆に変化している。

９ もし、培養チェンバー中で大きな濃度の直線的増加を与えられた時間々隔で望む なら、ＣｉからＧ（ｔ）への直線の傾きが大きくなくてはならない。培養チェン バー中の濃度の増加の直線性はＲ／Ｖ比の逆関数であり、大きな増加はＣ（ｔ） 点に与えられた時間々隔で直線的に到達するかどうかは問題がある。供給する物 質の濃度を増加させる事で濃度変化の直線性が維持され、従ってＲ／Ｖ比を変化 させなくてもよくなる。

保持フラスコ中の物質の最小濃度はゼロであるので、培養チェンバー中の画度を 大きく減少させたい時は前記の場合と異る。それ故、最小Ｒ／Ｖ比（最大直線性 ）が決定できる。このＲ／Ｖ比を第１０図と比較する。計算したＲ／Ｖ比が問題 のデータポイント間（ＣｉおよびＣ（ｔ））の直線性の望ましい範囲に匹敵する か決定する。

ＣｉおよびＣ（ｔ））間のノーセント濃度変化を達成するのに最小Ｒ／Ｖ比が必 要とされるかを決定する為、供給する物質濃度（Ｃｓ）をゼロとして既知の望ま しい時間々隔の間濃度減少の負勾配を分析した。ＧｉおよびＣ（４１間の時間々 隔ｔにおける変化量（△Ｃ）を式（力により決定した：もしＣ（ｔ）がゼロであ れば１００％の変化が起こる（△Ｃ＝１）。従ってＣ（ｔ）の濃度は１００％変 化（△Ｃ−１）および実際の変化の差であり、式（８）で表現される二〇（ｔ） ＝　１−△ｃ（８） １００％変化を起こすためには供給物質製１（Ｏｓ）がゼロでなければならない 。もし、初期濃度（ＣＬ）が１と仮定すｌ８式（８）は式（３）に代入でき、（ その決定は次に議論する）ＱＢ＝＝ＱおよびＣ１＝１　であれば最小Ｒ／Ｖ比か ら誘導される表現は： 式（２）を（３）に代入して式（４）を得る：簡単にして： 簡単にして： Ｒ／Ｖについて解くと： （力式をＵ式に代入して 簡単にして 式Ｑωは培養チェンバー内、与えられた時間々隔で目的の濃度に達するのに必要 な最小Ｒ／Ｖ比の表現型を提供２１ する。もし、計算したＲ／Ｖ比による直線性が与えられたデータの群に匹敵する ほど十分でなければ、濃度の変化は少くとも２つの段階にわけられる。初期濃度 Ｇｉから最終濃度Ｃ（ｔ）までｔの時間々隔で直線的に変化するようなデータの 群に匹敵しようと望む事を仮定すれば、第１段階は２つの間隔へこの変化を分裂 させる。この事はＣｉおよびＣ（ｔ）の間の中間点に新しい点（Ｎを設定する事 により達成される（即ち、ｔ−＝３ＡｔＶｃ＞。それ故第２に、保持フラスコ中 の新しいＣ８および新しい最小Ｒ／Ｖ比はＣｉを初期点とし、変化点Ａを最終点 のための新しいＣ（ｔ）として用いて計算できる。ＣｉおよびＡ間に必要なノミ −セント変化はＣｉおよび元来のＣ（ｔ）間より小さいので、最小Ｒ／Ｖはより 小さくなり、直線性は増加する。この過程は十分な直線性が達成されるまで繰り 返す事ができる。

このようにして、本発明の方法は土工−に前条件おヨヒ他の条件に匹敵し、各々 の期間中のどの時点においても組織に作用する濃度を知る方法を提供する。

実際的には、各々供給物質の異った濃度（Ｏｓ）のものを含む多数の保持フラス コを用い、良好な方法を使用して供給＠質濃度を変化させる。異った濃度の供給 系物が必要な時は、１つの保持フラスコを他のものと交換する。

この分野に精通する者は、必要なフラスコの数およびフラスコ中の供給薬物の磯 度間の相違は本過程の特定の応用の関数である事を理解されたい。

ぜん動性ポンプは保持フラスコから培養チェンバーに２２　１１ＲＢａ５９−５ ００２ｔｌｌ（８）供給物質を運ぶのに良好な器具である。運搬の速度は適当な 速度可変式のモーターで制御し、制御体はポンプを運転する。

培養チェンノ２−から既知の量を取り出し、物質に対する組織の応答を決定する ため検定する。さらに、培養チェンバーはプローブを受け入れるように設計され ており、それにｐＨ１酸素消費、温度、選択的イオン、膜電位および興味ある他 の変動をモニターするため適した器械に接続する。

時間の関数として既知の組織の応答および時間の関数として既知の組織に作用す る物質の濃度から、既知の数学的方法で原因と効果として相関を確立する。直ち 忙前記の過程を繰り返し、“対照″見本に対して実施し、特定の組織に対する適 当な薬物濃度および投与を決定する。

この分野に精通するものには明らかなように、本方法は同じ保持フラスコ中に一 緒に物質を混合する事により、培養チェンバーへ、同時に一つ以上の化学刺激を 送り出す事ができる。多数の物質を利用する場合においては、最小Ｒ／Ｖ比は各 々の時間々隔の最大の勾配から決定されなければならない。この結果はその間隔 におけるすべての変化と同じであつう。以前は不可能であった複雑な実験も本発 明を使用し、既知の４ｙ−ｇ並および他の条件に匹敵する歪ヱ一旦上二条件下で 実施できる。工乙−ビトロ条件は思うま〜に調整でき、高価な生きている動物の 実験なしに応答を観察できる。さらに加え、特定の３ 組織に対する実験への体の応答からの不必要な妨害が除けるので、統計的な信頼 性を達成するのに必要な実験の数を減じる事ができる。

一度、化学刺激および組織間の相関が決定されたら、続いての組織に対し最適の 方法で化学刺激を与えるのに本方法を使用する。例えば、移植片が栄養を要求す るのＫあわせた速度および濃度で本方法を用い栄養を供給し、器官移植組織をよ り長く生物学的に生きた状態に保てる。

本発明の他の重要な利点は、特に適当なインターフェース回路と一緒のプラグラ ムされたデジタルコンピューターの如き、電気的手段で制御するのに非常に適し ている（第８図に図示したように）。より特別には、投与の際の放出速度、およ び組織へ供給する化学刺激の濃度は適当なマイクロプロセッサ−を基本にした制 御系で制御可能である。一度時間に関して目的の濃度変化でプログラムされたら 、マイクロプロセッサ−はぜん動性ポンプなどの本方法の器具を動かす。もし異 った濃度の化学刺激を保持するのに多数のフラスコを使用したら、フラスコカラ フラスコへの転換はマイクロプロセッサ−により制御される。

本発明の方法のより十分な説明のため、実施例を以下に説明する。実施例は特に 詳細に説明されるが、どの点においても本発明の方法の範囲を制限すると解釈し てはならない。

実施例 本実験は波状にホルモンを投与した場合は同量のホルモンを静的に投与する場合 と比べて分離された器官において異なる応答を誘導するか否かを試験するため企 図された。

使用するモデル系は発情後期ラットの単離された卵巣である。卵巣ホルモン（Ｌ Ｈ）はラットでは脳の脳下垂体前方より脈打つように遊離される事が知られてい る。このためＬＨのプラズマ中の濃度がラット体内で変動する事となり、ＬＨ濃 度は１時間毎にピークとなる。このピークは第１１図に図示しである。本発明の 方法の前にはこの変動の意味について試験できなかった。

ＬＨはアンドロジエンの生成を促進させる事が知られている。これは卵巣内の卵 胞の生長速度に間接的に影響を与える。そのため、ＬＨがパルス的に投与された 場合と、静的に投与された場合で、異なる効果を示すか否かを試験するため、分 泌されるエストラジオール−１７βの量と卵胞の増殖様式を検定した。ホルモン ＦＳ’Ｈはアンドロジエンをエストラジオール−βの如きニストロジエン忙転換 する酵素を活性化する。

動物 ９匹の成熟したメスのスプラグ−ドーリ−（Ｓｐｙαｙμｌ−Ｄａｗｌｅｙ　） のラットを温度、湿度および光の制御された状態下で保持した。動物は１２光／ １２暗サイクルにさ２５ らした。発情サイクルは０８００時間と１０００時間の間膣垢を取って毎日モニ ターした。成熟したラットは実験する前に連続した６サイクルの間観察した。呼 吸器の障害、乳腺腫瘍および他の大きな病気のないラットのみ実験に使用した。

培養系 本研究に使用するフロー系の概略を第１１図に図示した。５００−のガラスの吸 引フラスコを保持フラスコ４０ａ、−ｃ’として使用した。２０ＣＣの注射筒は 培養チェンバー４２α、４２ｂとして使用した。保持フラスコ４０α−Ｃ内の培 地は２２．８　ｍＡ！　／　ｈｒの一定速度でぜん動性ポンプ４４　ＣＬ−ｃＶ ｃよってＴ　ｙｇｏｎ食物チューブ（％“Ｏ９Ｄ、）を通して輸送される。培養 チェンバー４２α、４２ｂはゴムのシールで密封する事により培養チェンバー中 の培地の容量が一定になる。培養チェンバー４２α、４２ｂはＴｈｅｌｃ。

恒温器中で６７℃に保維される。潅流液はそれぞれの培養チェンバー４２α、４ ２ｂからフラクションコレクター４８α、４８ｂにより採取される。１５分毎に 分画な採取する。

第１３図に図示したようなＬ）ｌの３時間パルスを模倣するため、２つの保持フ ラスコを培養チェンバー毎に使用した。碗初の保持フラスコ４０ｈは１４４　ｎ ｙ／ｍｌのＬＨ−ＲＰ−１と２００Ｗｇ／ｌｄのＦＳＬ（−ＲＰ−１を含有する 。

保持フラスコ４０Ｃはｏ、５ｓｎｙ／ｍｌのＬＨ−ＲＰ−１および２００　ｎｙ ／ｍｌのＦＳＨ−ＲＰ−１を含有する。培養チェ２６　特表昭５９−５００５９ −５００２０１（２ｈは最初の濃度が１［１ｎ１７ｍ１）ＬＨ−ＲＰ−１と２０ ０　ｎｙｍｌのＦＳＨ−ＲＰ−１である。第１の保持フラスコ４Ｄｔトら培養チ ェ／バーへ実験の各時間の最初の０．２時間の間輸送される。０．２時間後最初 の保持フラスコポンプ４４ｂが閉じられ第２の保菌フラスコポンプ４４Ｃが始動 し、各時間の残りの０．８時間の間稼動する。

このように第１４図に図示されたグラフ通りに培養チェンバー４２ｂ　において 正確に行なわれる。ＬＨを、ξルス的に投与する効果を試験するため対照として ６時間で輸送したＬＨの全量を第１３図における・ξルス曲線の面積を積分する 事忙よ゛り決定した。この積分の結果は６時間の間、培養チェンバーへ供給した ＬＨと正確に同量であり、６時間静的に投与するＬＨの量を決定するために使用 した。２９．２５す／ゴのＬＨ−ＲＰ−ｉが計算され対照として決まり、保持フ ラスコ４０α中に２００　ｎ！Ｉ／ｍ１ＦＳＨ−ＲＰ−１と混合された。この混 合物は培養チェンバー４６ｃＬに同じ初期濃度で輸送された。

試薬の製法 ２−４　単位／ｍｙ　（活性）１単位−１，０ｍ９ノＮ　Ｉ　Ｈ−Ｌ　Ｈ−３Ｉ ）の生物活性を持つ牛卵巣ホルモン（ＮＩＡＭＤＤ−６ＬＨ−４）と９０単位／ １ｖ（活性の１単位＝１．０Ｔｎ９）Ｎ　Ｉ　Ｈ−ＦＳＨ−８Ｉ　）の生物活性 を持つ羊卵胞刺激ホルモンは１．０■のホルモンの１０−の生理食塩水溶液を連 続的に希釈する事により製する。５００η／１！ＬｌのＬＨと５０．０００す／ ―の−ＦＳＨの最終的な溶液は添加培地１９９７ 中に製する。

培地１９９　（Ｃｘｉｂｃｏ　）は２回蒸留した脱イオン水を使用して濃縮溶液 を希釈して製する。溶液には２．：ｌ／ＬＮｚＨＧＯ３，２！１／Ｌ牛血清７／ ｌ／プミン、１　＃／Ｌダル＝ｒ−ス、５ｏａｐ／Ｌ硫酸ストレプトマイシンお よび１ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ　１．Ｕ、／Ｌ　Ｋ−はニジリンＧ（貯蔵ＴＣ１９９ ）を添加した。培地は再ビはツテインダ系（ＬａｈｉｎＩｌ＃ｔｒｉｅｚ　）で 保持フラスコと培養チェンバーに±０、ｉＱ＋ｎ７！の正確さで分配した。貯蔵 ホルモン溶液のマイクロリットル量はミクロピ纜ツ）　（０ｘｆｏｒｄ　）で± ０．０５ＷＬｌの正確さで添加した。すべての培地は続いて酸素中５％ＣＯ２と ７．４０±０．０５に調整したｐＨに平衝化した。その後珊地はミリポアフィル タ−（）ＩＡ４５）を通過させ滅菌した保持フラスコと培養チェンバＺ−に移し ５℃で貯蔵した。すべての保持フラスコは２５℃に加温しく培養チェンバーは３ ７℃に加温した）　２　Ｑ　Ｑ　Ｉ、Ｕ／Ｌの普通のイア７、すｙ　（Ｌｅｎｔ ｅ　）を注入し、使用前２０分間、酸素中５％ＣＯ２で平衝化した。保持フラス コは操作時１ｐｓｉより低い圧力で２０秒／１０分の間通気する。

実験手順 ６匹の成熟ラットを発情後期の朝０９５０にと０９５ＯＡの間に検視した。卵巣 を切除し、過剰の脂肪を除き２００１、Ｕ／Ｌインスリン（Ｉ）と４００１．Ｕ ／Ｌ硫酸ヘパリン（６）を添加し、酸素中５％ＣＯ２で平衝化し、３７℃に加温 した貯蔵ＴＯ−１９９中に置いた。１０分後卵巣を９つの培養チェンバー中に入 れた。それぞれの動物の１つの卵巣は稠パルス式“のチェンバーに他は１靜的″ なチェンバーに入れＥＸｌｏｏｏＡ［おいてはリスタポンプをスタートサセ、す べての箱に適切なしはルのホルモンをさらした。

結果 第１２図は卵胞の分布パターンの結果である。上段は３つの培養しない卵巣（無 傷の卵巣）の卵胞分布パターンを示す。中段は本発明のパルス的なＬＨ刺激にさ らした培養卵巣からの卵胞の分布パターンである。このパターンは無傷の卵巣と 有意に異っていないが、下段に示すように静的なＬＨ刺激にさらされた培養卵巣 のものとは有意ｆ（ｃｈｉ　２乗検定を使用して〈、０５の確率）異った。

第１４−１６図ではそれぞれの動物からの培養卵巣のニストロジエン分泌を図示 した。第１４−１６図における実線は静的なＬＨ刺激にさらした卵巣を示し、点 線は本発明の過程を使用したパルス的なＬＨ刺激にさらした卵巣を示す。静的お よびパルス的に刺激した両卵巣はニストロジエンのパルス的な遊離を示す。しか しパルス的刺激にさらされた卵巣ではＬＨ／＃ルスに関係してニストロジエン分 泌の６つの異なるピークを示した。さらにパルス的刺激にさらされた卵巣では静 的刺激にさらされた卵巣よりも有意に（ｔｏＴｏ　−ｔＣＬｉｌｅｄ、　５ｔｔ ｂｃＬｔｎｔｚ　”　ｔ−検定で＜ｏ、ｏｉの確率で）ニストロジエンをより多 く分泌した。

２９ 結論 本発明の方法は頻力な研究手段であり、そして円部血液信号の動力学の研究を可 能にする。これらの結果は細胞の機能を制御するのはホルモンの量だけでなく、 ホルモンを輸送する様式である事の証拠を提供する。

本発明を良好な具体例を参考に記述したが、この分野に精通する者は本発明の精 神と範囲から離れる事なくその形式および詳細な点の変更がなされる事を認める であろう。

蒸６閉

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、α）組織へ作用する既知の濃度を持つ第１の既知の容量の化学刺激で開始し ； ｂ）組織への作用から第１の既知の量の化学刺激を除き、それＫより組織へ作用 する第２の既知の濃度を有する蟹２の既知の容量が残り； Ｃ）組織へ作用する第２の既知の容量へ、異った濃度を持つ第２の既知の容量の 化学刺激を加え、それにより組織に作用する第３の既知の容量を形成し：ｄ）既 知の濃度の第１の既知の容量に基づいた該組織に作用する化学刺激の第６の既知 の濃度な核組織から除かれた第１の既知の量および該組織に加えられた第２の既 知の量によって測定し；および Ｃ）時間内のどの時点においても組織に作用する化学刺激の濃度が既知である工 程α）からｄ）を繰り返す以上の工程からなる生物組織へ化学刺激を制御された 方法で供給する方法。 ２、第２の既知の量の化学刺激を第１の既知の容量のへ作用する化学刺激の濃度 を実質的に直線的に変化させる請求の項第１項記載の方法。 ３、生物組織が器官である請求の範囲第１項記載の方法０ ４、生物組織が器官系である請求の範囲第１項記載の方法。 ５、生物組織が細胞系である請求の範囲第１項記載の方法。 ６、化学刺激がそれを通して供給できる入口および化学刺激をそれを通して除去 する出口を持つ培養チェンバー内に位置させることＫよって組織が分離される請 求の範囲第１項記載の方法。 ７、組織をその天然の栄養供給、から分離する請求の範囲第１項記載の方法。 ８、除去される化学刺激の第１の既知の量が容積において加えられる化学刺激の 第２の既知の量にほぼ等しい請求の範囲第１項記載の方法。 ９、化学刺激が同時に除去および供給される請求の範囲第８項記載の方法。 １０、請求の範囲第１項の方法に以下の工程をさらに含む方法： 組織へ作用する第１の容量から除去された選択された第１の既知の量の化学刺激 を分析し； 化学刺激の選択された濃度に関する組織応答の相関を確立するために、選択され 分析された化学刺激の第１の量を組織に作用する化学刺激の順に対応する濃度に 適合させる；および 個々の応答および化学刺激の対応する濃度を組合せて期間中の化学刺激の濃度の 変化に対する組織の反応を確立する、相関を形成させる。 １１、請求の範囲第１０項の方法に加えて第２の組織３２ からの目的の応答に良好に作用する濃度で工程α）からｅ）Ｋ記載されている方 法で第２の組織へ化学刺激を供給する工程をさらに含む方法。 １２、組織に多数の化学刺激を供給するための工程α）からｅ）を実施し、その 際各々すべての化学刺激の濃度が時間内のどの時点でも既知である請求の範囲第 １項記載の方法。 １３、工程α）からｔ）を繰り返す時、第２の既知の量を異った供給源から供給 する請求の範囲第１項記載の方法。 １４、少くとも１つの化学刺激へ制御された方法で組織を処理し： 化学刺激の濃度の変化の速度を時間に関して制御し；および プログラム化したデジタルコンピューターにより時間中すべての各時点で組織に 作用する化学刺激の濃度を制御し、わかるようＫする 以上の工程からなる組織の自然栄養供給から分離された生物組織に対しエニー胚 条件をまねるための方法。 １５、化学刺激の変化の速度の制御が、組織に作用する容量の関数として前もっ て決定されている濃度の化学物質の放出の速度を選択して組織に作用する濃度の 変化が時間に関して実質的に直線的であるようにすることを含む特許請求の範囲 第１４項記載の方法。 １６、請求の範囲第１４項の方法に加えて以下の工程をさらに含む方法。 化学刺激の濃度の変化に対する組織の応答をモニターし： 化学刺激の濃度の変化と組織の応答との間の関係を確立するために組織の応答を 解析する。 １７、組織に多数の化学刺激を供給する請求の範囲第１６記載の方法。 １８、請求の範囲第１６項記載の方法に加えて以下の工程をさらに含む方法： 第２の組織中で目的の応答を生じさせるために第２の同様の組織へ供給する時、 化学刺激の濃度を実質的に直線的に増大させる。 １９、α）組織への作用から化学刺激の第１の既知の量を除き、それにより組織 に作用する第２の既知の濃度の第２の既知の容量を残すための手段： ｈ）組織へ作用する第２の既知の容量へ異った濃度を持つ化学刺激の第２の既知 の量を加え、それにより組織に作用する第６の既知の容量を形成するための手段 ：Ｃ）除去した第１の既知の量の除去および第２の既知の量の添加に基づく組織 に作用する第６の既知の容量の第６の既知の濃度を決定する手段；およびｄ）添 加手段、除去手段および決定手段の操作を制御して組織に作用する化学刺激の濃 度の変化か時間内のどの時点においても実質的に直線状にであり、わかるようＫ する手段からなる、組織に作用する既知の濃度を４ 有する第１の既知の容量の化学刺激から出発する制御された方法で化学刺激を生 物組織へ供給するための器具。 ２０、添加手段、除去手段および決定手段の操作を制御する手段がプログラムさ れたデジタルコンピューターである請求の範囲第１９項記載の器具。 ２１、組織に作用する第１の容量から除去した選択された第１の量の化学刺激を 分析するための手段：組織応答と化学刺激の選択された濃度との関連を確立する ため選択され、分析された第１の量の化学刺激を組織に作用する化学刺激の順に 対応する第６の既知の濃度に組み合わせる手段：および 個々の応答および化学刺激の対応する濃度を組合せて期間中の化学刺激の濃度の 変化に対する組織の反応を確立する相関をつくるための手段； 以上の手段を請求の範囲第１９項記載の器具に加えてさらに含む器具。 ２２、α）組織に作用する良度変化の実質的な直線性が各々の短い期間で達成で きるまで期間全体を多数のより短い期間に分割し： ｂ）各々のより短い期間について化学刺激の選択された濃度を決定し、選択され たより短い期間での化学刺激の濃度の直線的変化を生じさせ； Ｃ）各々のより短い期間の始めに組織へ選択された濃度の化学刺激を供給し； ｄ−）各々のより短い期間の始めに化学刺激の１つの選択された濃度から他の選 択された濃度へと転換して組織への化学刺激の所望の非直線的投与を模倣し、七 の、際期間中どの時点でも組織に作用する化学刺激の濃度はわかる 以上の工程からなる、期間全体について化学刺激の濃度が非直線的に変化する、 期間全体を通して生物組織へ化学刺激を投与するための方法。 ２３、適当な濃度のものが多数の保持フラスコ中に保たれ、それから組織へ供給 される請求の範囲第２０項記載の方法。 ２４、Ｉｉｉ織へ作用する化学刺激の容量の関数として選択された濃度の化学刺 激の放出速度を選択する工程を請求の範囲第２２項記載の方法に加えてさらに含 む方法。