JPS5948487A - 固定化補酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化補酵素の製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に熔解
させて、この水溶液中で反応を行なわせている。しかし
、このような方法によれば、反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非富
に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、
反応が回分式であるから生産性に劣る。このような問題
を解決するために、既に水不溶性の担体に酵素を固定化
し、この固定化酵素に基質を反応させることが提案され
ている。

一方、酵素によっては、その触媒作用を発現するために
補酵素を必要とする場合がある。このような場合には、
固定化酵素にどのようにして必要とする補酵素を結合さ
せるかが極めて重要な問題である。よく知られているよ
うに、補酵素はアポ酵素と結合し、ホロ酵素となって酵
素反応を行なうが、酵素と補酵素間の結合は一般に可逆
的であり、且つ、比較的弱いため、補酵素が容易にアポ
Ｐｉ’ｌ素から分離するからである。酵素についてと同
様に、補酵素を水不溶性の担体に固定化して用いること
も既に知られているが、従来、酵素及び補酵素の固定化
に用いられている担体は、通常、セルロース、デキスト
ラン、アガロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルア
ミＩＳゲル、多孔性ガラス等の径１＋ＩＩＮ乃至数丁の
粒子であり、担体に一定長さの鎖状構造、所謂スペーサ
基を介して酵素や補酵素を結合させ、その自由度を高め
ても、固定化酵素や固定化補酵素自体がいずれも反応系
内で固定されておれば、それぞれの自由運動範囲は極め
て限られているので、酵素と補酵素とが接触する機会は
非常に少なく、目的とする酵素反応は行なわれ難い。

本発明は−Ｊ−記した問題を解決するためになされたも
のであって、反応系においてＭ離の補酵素と同様に自由
に移動でき、また、反応系からの分離、回収が容易であ
り、更に、遊離の酵素や従来の形態の固定化酵素と結合
せて用いるのに適する固定化補酵素の製造方法を提供す
ることを目的とする。

本発明による固定化補酵素の製造方法は、（ａｌアクリ
ル酸エステル又はメタクリル酸エステル５〜９８重量％
、（ｂｌこの単量体と共重合し得る第１の単量体０〜９
０重量％、（Ｃ）多官能性内部架橋用単量体１〜２０重
量％、及び（ｄ＋第２の単量体としてのアクリロニトリ
ル又はメタクリロニトリル１〜６０重量％とからなる単
量体組成を乳化共重合させ、得られる水分＋ｉ＆性高分
子重合体粒子をケン化することを特徴とする。

本発明においては、アクリル酸エステル及び／又はメタ
クリル酸エステル（以下、（メタ）アクリル酸エステル
と称する。）を１成分とする２以上の単量体組成を、好
ましくは乳化剤の不存在下で乳化共重合し、かくして得
られるボ分散千り高分子重合体粒子が側鎖に有するエス
テル基、正確にはアルコキシ又はアリロキシカルボニル
基をケン化することにより、その表面に高い密度でカル
ボキシル基を生成させ、このカルボキシル基を介して＾
ゲ素を共有結合により固定化するのである。

ここに、（メタ）アクリル酸エステルとしては、一般式 ％式％ （但し、Ｒ１ば水素又はメチル基を示し、鷹Ｒ２は炭素
数１〜３のアルキル基又はヘンシル基を示す。）で表わ
されるものが好ましく、特に、ノキル及びエチルエステ
ルが好ましい。

かかる（メタ）アクリル酸エステルと共重合さ七る第１
の単量体としては、アクリロニトリル、メタクリロニト
リル、及び上記した（メタ）アクリル酸エステルを除い
て、これらと共重合性を有し、且つ、得られる共重合体
が酵素反応の行なわれる温度よりも高いガラス転移点を
有する限りは特に制限されるものではないが、好ましく
は、エチレン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、
プロピオン酸ビニル、スチレン、メチルスチレン、ビニ
ルトルエン、ブクジエン、イソプレン、アクリルアミド
、メタクリルアミド等の１種又は２種以上が用いられる
。特に、スチレンが好ましく用いられる。但し、この第
１の単量体は、必ずしも単量体成分として単量体組成に
含有される必要はない。

尚、本発明においては、重合時の安定化やｉＦＩられる
高分子重合体粒子の水分散性安定化のために、全単量体
組成の５重量％以下の範囲でイオン性基を有する単量体
を用いてもよい。かかるイオン性基としては、例えば、
スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基等の酸基、第
３級アミノ基、第４級アミノ基等の塩基性基等を挙げる
ことができる。

このようなイオン性基を有する単量体の具体例としては
、スヂレンスルポン酸、スルホプロピルメタクリレート
のようなスルボン酸基を有する単量体、アクリル酸、メ
タクリル酸、イクコン酸のようにカルボキシル基を有す
る単量体、アシッドホスホキシエチルメタクリレート、
３−クロロ−２−アシッドホスホキシエチルメタクリレ
ートのようなり゛′改基を有する単量体、ジメチルアミ
ノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタ
クリルアミドのような第３級アミノ基を有するｆ１体、
メック１１ルアミドプロピルトリメチルアンモニウムク
ロライド、メタクリロイルオキシエチルトリメチルアン
モニウムクロライドのような第４級アミノ基を有する単
量体を挙げることができる。

また、内部架橋用多官能性単量体としては、多価アルコ
ールのポリ　（メタ）アクリレートが好ましく、具体的
には、エチレングリコールジメタクリレ−１−、ジエチ
レングリコールジメタクリレー）・、トリエチレングリ
コールジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメ
タクリレート、１，３−ブヂレングリコールジメタクリ
レート、トリエチレングリコールジアクリレー１−、ト
リメチロールブロパントリメタクリレニト、トリメチロ
ールレフ。

ロパントリアクリレート、テトラメチロールメタンテト
ラアクリレート等が用いられる。ジビニルヘンゼンも好
ましく用いられる。

更に、本発明においては、水分散性高分子重合体粒子を
得るだめの単量体として、単量体組成は第２の単量体成
分として、アクリロニトリル及び／又はメタクロロニト
リルを含有することが必須である。

本発明においては、以上のような各〔１１屋体を水媒体
中にて通糸′の方法にて乳化共重合体させることにより
、側鎖にエステル基を有する水分散性高分子重合体粒子
を得ることができるが、得られるることがあるので、乳
化共重合体に際して、は乳化剤を用いないのが好ましい
。本発明による上記単量体組成によれば、特に乳化剤を
要せずして安定に共重合させることができるが、乳化剤
が補酵素に対して有害な影響を与えなければ、乳化剤を
必要に応じて用いてもよい。

本発明におりる単量体組成は、アクリル酸エステル又は
メタクリル酸エステル５〜９８重量％、好ましくは２０
〜９３市量％、この単量体と共重合し得る第１の単量体
０〜９０重量％、好ましくは０〜８０重量％、多官能性
内部架橋用中量体１〜２０重量％、好ましくは２〜１０
重量％、及び第２、の１体としてのアクリロニトリル又
はメタクリロニトリル１〜６０重景％、好ましくば５〜
４０重量％とからなる。

ｒｐ、　（Ｊ体組成において（メタ）アクリル酸エステ
ル単量体の量は、これからｆ５られる水分１に、性器分
子重合体粒子をケン化して生しるカルホキシル基量、従
って、このカルボキシル基に固定化し得る補酵素の固定
化量とも関連し、少なすぎるときば補酵素を十分な量に
て固定化することができず、多すぎるときは重合の安定
性を損なうと共に、得られる重合体粒子の安定性も損な
われるので、好ましくない。

本発明で用いる（メタ）アクリル酸エステルＣｎ量体は
疎水性であるため、水溶性重合体を生じることがなく、
しかも、これを本発明に従って（メタ）アクリロニトリ
ルとを乳化共重合させることにより、重合が非１著に安
定に行なわれて、凝集物が殆ど生成しない。（メタ）ア
クリロニトリルの量が上記範囲よりも少ないとき、又は
多すぎるときは、重合の安定性が１０なわれるおそれが
あるので好ましくない。また、内部架橋用単量体は、こ
のようにして得られる重合体粒子をケン化する際の安定
性を高めるのに寄与し、かくして、ケン化度を大きくし
て、重合体粒子上に高い密度でカルボキシル基を形成さ
せることができる。内部架橋用単量体の使用量は特に上
記範囲が好適である。

本発明によれば、上記のようにして得られたエステル基
を有する水分散性高分子重合体粒子は酸又はアルカリの
水溶液によりケン化され、エステル基はカルボキシル基
に変えられる。酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン
酸等が、また、アルカリとしては、水酸化すトリウム、
水酸化カリウム、アンモニア等が、それぞれ適宜に用い
られる。これら酸又はアルカリ水溶液の濃度は、通常、
０．０１〜５規定、好ましくは０，０５〜２規定である
。

本発明においては、重合体粒子の表面のみをケン化すれ
ば足り、ケン化条件は適宜に選ばれる。通常、上記のよ
うな酸又はアルカリを用いて、２０〜７０℃の温度で数
分乃至数十時間ケン化する。

酸又はアルカリの濃度が高すぎるときは、重合体粒子の
安定性が悪くなり、重合体粒子が凝集したり、水溶化し
たりする。また、濃度が低すぎるときは、ケン化に不必
要に長時間を要するので好ましくない。温度が高すぎる
場合も、重合体粒子の安定性が悪くなるので好ましくな
い。

このようにして得られる水分散性高分子重合体粒子は表
面に高密度にてカルボキシル基を有するが、その粒子径
はケン化の前後で殆ど変わらず、ケン化後に僅かに大き
くなる程度である。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、そ
の平均粒径が０．０３μ〜２μ、好ましくは０．０７μ
乃至１μである。粒径が小さすぎると、これを担体とす
る固定化補酵素を水中に分散させて、所定の酵素と共に
目的とする酵素反応を行なわせた後の回収が困維となり
、一方、粒径が大きすぎると、単位体積当りの粒子表面
積が小さくなり、補酵素の固定化量が少なくなると共に
、水中に分散させるのが困難となるので好ましくない。

水分散性高分子重合体粒子の有するカルボキシル基を介
して補酵素を共有結合にて固定化する方法は特に制限さ
れず、従来より知られている方法が適宜に採用される。

例えば、一つの方法として、例えば、ニコヂンアミドー
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を固定化する場合、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩や１−ンクロへキシル−３−（２−モ
ルホリノエチル）カルボジイミド−メト−１）−）ルエ
ンスルボネート等の水溶性カルボジイミドを用い、通常
の条件下で補酵素と反応させればよい。例えば、カルボ
キシル基の５〜５０倍当量のカルボジイミドの水溶液に
ＮＡＤ熔液を加え、温度５°Ｃ程度、ｐｌ＋４．５〜６
．０に保持して、重合体粒子とＮＡＤとを一夜反応させ
ればよい。

別の方法として、重合体粒子の表面のカルボキシル基に
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミＦをカルボジイミドの存在
下に反応させた後、ＮＡＤのアミノ基を反応させること
もできる。

更に別の方法として、重合体粒子のカルボキシル基にカ
ルボジイミドとジアミンとを反応させて、重合体粒子に
アミン基を導入し、このアミン基に従来より知られてい
る種々の方法にてＮＡＤを反応させることもできる。

以上のようにしてζ補酵素を重合体粒子に共有結合させ
た後、用いた反応試薬や固定化されていない酵素を遠心
分離、膜分離等の適宜の手段によって除去すれば、本発
明の固定化補酵素を得る。

本発明による固定化補酵素は水分散液として用いられ、
アポ酵素及び基質と接触される。アポ酵素ばｉｆ　Ｍｌ
でも、固定化酵素でもよい。例えば、アポ酵素がセルロ
ース誘導体やポリアクリルアミドゲル粒子に固定化され
ている従来の固定化酵素を用いる場合、固定化酵素をカ
ラムに充填し、このカラムに基質を含む本発明の固定化
補酵素を通過させる。反応終了後、固定化補酵素は膜分
離その他適宜手段により分離される。

本発明において固定化される補酵素は特に制限されない
が、具体例として、ニコヂンアミトーアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤ）　、ニコチンアミド−アデニンジヌク
レオチドリン酸（ＮＡＤＰ＞、フラビン−アデニンジヌ
クレオチド°（ＦＡＤ）、ピリドキザルリン酸、補酵素
Ａ、補酵素Ｑ、ジアノコバラミン、ビオチン、アデノシ
ントリホスフェート（ＡＴＰ）　、アデノシンジホスフ
エ−１・（ＡＤＰ）、アデノシンモノボスフェート（Ａ
ＭＰ）等を挙げることができる。

本発明においては、水分散性高分子重合体粒子に補酵素
を結合するに当って、その自由度を高めるためにスペー
サ基を介在させるのが有利である。

スペーサ基は予め重合体粒子に結合さゼ、この後に補酵
素と結合させてもよく、或いはスペーザ基を予め補酵素
に結合させ、この後に重合体粒子と結合させてもよい。

また、補酵素と重合体粒子にそれぞれ予めスペーサ基を
結合させ、これらスペーサ基にて相互に結合してもよい
。

スペーサ基としては、ヘキザメチレンジアミン、ドデカ
メチレンジアミン、キシリレンジアミン等のジアミン、
６−アミノカプロン酸等のアミノアルキルカルボン酸等
が好ましく用いられるが、また、グリシルグリシルグリ
ジン等のようなものも好ましく用いられる。但し、これ
ら例示したものに限定されるものではない。

より具体的には、本発明においては、補酵素に予めスペ
ーサ基を結合させ、これを重合体粒子に結合させるのが
よい。このように予めスペーサ基を結合させた補酵素の
具体例°として、例えば、Ｎ６−〔（６−アミノへキシ
ル）カルバモイルメチル）、−ＮＡＤ、Ｎ　　−スクシ
ニル−ＮＡＤ、Ｎ”　Ｌ（４−（３−ヒドロキシブチル
））−ＮＡＤ、Ｎ６−〔（６−アミノヘキシル）カルバ
モイルメチル）−＞Ａｖｐ等を挙げることができる。

本発明による固定化補酵素は以上のように、表面に高密
度にカルボキシル基を有する水分＋１＆型高分子重合体
粒子に、上記カルボキシル基を介して補酵素が共有結合
により固定化されており、従来のセルロース誘導体粒子
等を担体とする場合と異なり、固定化補酵素自体が遊離
の補酵素と同様に反応系内を自由に移動できるため、酵
素との接触機会が非常に高く、円滑に酵素反応を行なゎ
−ヒることができる。

しかも、本発明による固定化補Ｉ！ｉ？素は、補酵素が
水不溶性の担体に共有結合にて固定化されているために
、容易には脱離せず、更に、酵素反応後には遠心分離、
塩析、凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離
等によって容易に回収でき、かくして、長′期間にわた
って繰返して使用することができる。

また、本発明の固定化補酵素をその製造面からみれば、
一般にカルボキシル基を有する単量体は水溶性であるた
め、他の単量体との乳化共重合が容易ではないうえに、
単独重合体を生成することが多く、また、共重合体を得
ても重合体粒子表面の水酸基の密度が小さく、重合体粒
子における補酵素の負荷量を大きくすることが困ゲ１ｔ
であるが、本発明によれば、沿記単量体組成により、乳
化剤を特に用いることなく、望ましくない水溶性重合体
の生成を抑えて、安定に水分、散性高分子重合体粒子を
得、これをケン化してカルボキシル基を生じさせるので
、表面に高密度でカルボキシル基を有する水分ｌｔ＆性
高分子重合体粒子を安定に得ることができ、従って、高
い負荷量で補酵素を固定化することができる。更に、（
メタ）アクリロニトリルと内部架橋用単量体を併用する
ことにより、得られる水分散性高分子重合体粒子は強度
が大きいと共に、粒子相互の粘着も起こらない。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により限定されるものではない。

実施例１ メチルアクリレ−１−８０ｇ、トリエチレングリコール
ジメタクリレート２ｇ及びアクリロニトリル１５ｇを范
留水２３０ｇに加え、２，２”−アゾビス−２−アミジ
ノプロパンニ塩酸塩０．３ｇを水１０ｇに溶解した重合
開始剤水溶液を６０”ｃの温度で窒素気流下に加え、１
２　Ｏｒｐｍで攪拌しつつ８時間重合させて、固形分３
０％、平均粒径０．４μの重合体粒子の水分散液を得た
。重合は非常に安定に行なわれて、凝集物は０．０４％
であった。

次に、上記の重合体粒子水分散液に２Ｎ力性ソ一ダ水溶
液１００ｍ１を加え、室温で一夜攪拌した後、２Ｎ塩酸
水溶液を加えて中ｆｌ比、重合体粒子を遠心分離し、洗
滌した。このようにして得た重合体粒子は、Ｉｇ（乾燥
重量）当り１３．３−：ブチルのカルボキシル基を有し
ていた。

子を水１００ｍ１に分散させた。

この重合体粒子を再び水１００ｍ］に分散させ、Ｎ−シ
クロヘキシル−Ｎ’−（β−（Ｎ−メチルモルホリノ）
エチル〕カルボジイミドーｐ−トルエンスルホネート１
．５　ｇを水３０ｍ１にｆ８解し、塩酸でｐｌ＋を５．
０に開整したカルボジイミド水溶液をＪ配分散液に加え
、更に、Ｎ−（（６−アミンヘキシル）カルバモイルメ
チル）−ＮＡＤ０．２ｇを水１０ｍ１に溶解し、塩酸で
ｐＨを５．０に調整した補酵素水溶液を加え、５°Ｃの
温度で２４時間放置後、未反応のカルボジイミド′と未
固定の上記ＮΔＤ誘導体を除くため、遠心分離して上澄
を除去した。

沈降した重合体粒子を水洗し、本発明に３Ｌる固定化補
酵素を得た。

この固定化補酵素をグリセルアルデヒトホスフエ−トデ
ヒドロケナーゼを用いて測定したところ、。

活性収率は遊離の上記ＮΔＤ誘導体基準で３５％であっ
た　。

尚、比較のために、上記実施例において、アクリロニト
リルを用いない以外は全く同様にして乳化共重合を行な
ったところ、重合中に全体が凝集し、円滑に重合させる
ことができなかった。また、上記実施例において、トリ
エチレングリコールジメタクリレートを用いない以外は
全く同様にして乳化共重合を行なったところ、凝集物が
６．３％生じた。この凝集物を除いた後の水分散液を上
記実施例と全く同様にしてケン化処理したところ、全体
がゲル状となって、重合体粒子を水中に回度分散させる
ことができなかった。

実施例２ 実施例１で（Ｍたカルボキシル基を有する重合体粒子の
水分散ｎｌｌｏＯｍｌに１−シクロへキシル−３−（２
〜モルボリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−１−
ルエンスルボネーｌ−２０ｇを水３０ｍ１に溶解した水
溶液を加え、攪Ｉ４トしつつ、ｐｌ＋を５゜０に調整し
た。メタキシリレンジアミン３．０ｇを水３０ｍ１に熔
解したｐＨを５．０の水溶液を上記分散液に加え、攪拌
下にｒ）１（を５．０に調整しつつ、室温で２４時間反
応させた。この後、遠心分離して沈降した重合体粒子を
水洗し、未反応のカルボジイミド、メタキシリレンジア
ミン、反応副生物を除去し、アミン基を有する水分散性
高分子重合体粒子を得た。

この重合体粒子を水１００ｍ１に再分散さ−ｌ°、グル
リルアルデヒドの５％水溶液６０ｍ１を加え、室温で２
４時間反応さゼた後、遠心分ｑ＋ｔにより精製し、アル
デヒド基を有する水分散性高分子重合体粒子を得た。

次に、０．１Ｍリン酸水素二カリウム及び０．１Ｍリン
酸二水素から調製した緩衝液（ｐＨ７、０）　　１００
ｍ１に上記重合体粒子を分散させ、これにＮ６〜〔（６
−アミノへキシル）カルバモイルメチル〕−ＮＡＤ０．
２ｇを水１０ｍ１に溶解し、塩酸でｐｕを５．０に調整
した？ｉｌｉ酵素水／８液を加え、５℃の温度で２４時
間反応させた。この後、未固定の上記ＮＡＤ誘導体を除
くため、遠心分離し、上澄を除去した。沈降した重合体
粒子を水洗し、本発明の固定化補酵素ｖ素を得ゾζ。こ
の固定化補酵素の活性収率は、実施例１と同様にして求
めたところ、３１％であった。

実施例３ エチルアクリレ−１−３０ｇ、スヂレン４０ｇ。

ジビニルベンゼン２ｇおアクリロニトリル３０ｇを蒸留
水２３０ｇに加え、実施例１と同様にして重合させ、固
形分３０％、平均粒径０．２５μの重合体粒子の水分散
液を得た。重合は非密に安定に行なわれて、凝集物は０
．０２％であった。

この重合体粒子について、実施例１と全く同様にしてケ
ン化し、Ｎ−（（６−アミノへキシル）カルバモイルメ
チル）ＮＡＤを固定化した。活性収率は実施例１と同様
にして求めたところ、３６％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１（ａｌアクリル酸エステル又はメタクリル酸エス
   テル５〜９８重量％、ｆｂ）この単量体と共重合し得る
   第１の単量体０〜９０重量％、（Ｃ）多官能性内部架橋
   用ｔＲ量量体１之２０ 体としてのアクリロニトリル又はメタクリコニトリル１
   〜６０重量％とからなる単量体組成を乳化共重合させ、
   得られる水分散性高分子重合体粒子固定化することを特
   徴とする固定化補酵素の製造方法。 （２）　　アクリル酸エステル及びメタクリル酸エステ
   ルがそれぞれメチルエステル又はエチルエステルである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定化補
   酵素の製造方法。 （３）水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の固定化補酵素の製造方法。 （４）多官能性内部架橋用単量体が多価アルコールのポ
   リ　（メタ）アクリレートであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の固定化補酵素の製造方法。