JPS59220186A - 生物学的包括法による固定化酵母およびそれを用いるエタノ−ル醗酵法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的包括法による固定化酵母およびそれを
用いるエタノール醗酵法に関する。

従来、固定化微生物の製法としては、共有結合法、イオ
ン結合法、物理的吸着法などの和体結合法；架橋法；な
らびに格子型、マイクロカプセル型の包括法が知られて
いる〔固定化酵素、千畑一部編集、講談社、１９７７年
８月３０日第３刷発行〕。従来の格子型包括法は、ポリ
マーゲルの格子の中に微生物を包み込んで脱離できない
状態にして固定化する方法であって、例えば微生物の懸
濁液中アクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリ
ルアミドなどのアクリル酸誘導体の架橋剤などを重合さ
せ、形成したポリアクリルアミドゲルの微細な格子の中
に微生物を包み込んで固定化する方法が最もよく用すら
れておシ、そのほかアルギン酸カルシウムゲル、Ｋ−カ
ラギーナンゲル、光硬化性樹脂などを用いる包括法が知
られている。

これらの方法によれば、比較的微生物の活性が高く、安
定で、機械的にも強固な固定化微生物が調製でき、低分
子の基質あるいけ生成物は自由にゲルの格子を通過でき
るが、微粒子の微生物はゲルから漏出しないなどの利点
があった。しかしながら、これらの方法による固定化微
生物を大量に用いて工業的に連続使用する場合には、反
応させる基質溶液を通すと、固定化微生物がその基質溶
液の圧力により圧縮されて目詰り状態を生じ、長期間連
続して使用することが不可能となって、固定化微生物の
製造コスト高につながるだけでなく、固定化支持体を再
使用できないという決定的な欠点があった。

そこで、本発明者は、従来の固定化の定義にとられれる
ことなく、工業的に連続使用が可能であり、固定化支持
体が再使用可能な固定化法を見出すべく種々研究を続け
、そしてＰＡ１材などの用途として市販されている立体
網状連続多孔質構造をイイする水不溶性ポリビニルホル
マール樹脂シートを微生物の固定化支持体として使用す
ることに着目して研究を続けた結果、微生物の中でもサ
イズの比較的大きい酵母を上記樹脂シートの共任下で液
体培養すると、上記樹脂シートの多孔内に入り込んだ酵
母のうち、凝集性を有する酵母が凝集して樹脂シートの
孔径より大きくなるため忙孔外に漏出できなくなって孔
内にｔｈｊじ込められた状態の形で固定化されること、
基質溶液を連続的に流しても樹脂空隙が大きいため、目
詰υも起さず連続使用がｉ」能であること、孔内に取り
込まれた酵母の活性が低下［また場合には、再培養によ
る増殖によって酵旬活性を回復させることができるばか
シでなく、孔内に敗り込まれた酵母が加熱処理により凝
集性を喪失して該樹脂から脱離するため、上記樹脂シー
トを回収して再使用できることを知った。

上記の新規な固定化法は、従来の両軍化法の定義に当て
はまらないため、本発明者は、微生物を多孔性支持体の
共存下培養することによシ増殖した細胞が該支持体の孔
内に入り込んで、凝集するか、または細胞同志が絡み合
うことにより該孔径より犬きくなるために該孔外に漏出
できなくなり、該孔内に取り込まｊした状態となって固
定化される固定化法を生物学的包括法（Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ　ｒｎｅｔｂｏｄ　）と定
義することを提案する。

本発明は上記の新知見に基すて安成されたものであり、
凝集性酵母を立体網状連続多孔質構造を有する水不溶性
ポリビニルホルマール担体と共に培養シ７、増殖した酵
母が凝集することにより該担体の多孔内に生物学的に包
括されで１４１．ｊ１定化ｒ１γ母であって、その発明
の目的とするところは、新規な生物学的包括法による固
定化支持体を提供することにある。また、本発明は、凝
集性エタノール酵母を立体網状連続多孔質構造を有する
水不溶性ポリビニルホルマール担体と共に培養し、増殖
Ｌ５た酵母が凝集することにより該担体の多孔内に生物
学的に包括されてなる固定化酵母にエタノール醗酵性糖
含有液を作用させることを特徴とするエタノール醗酵法
も包含され、その発明の目的とするところは、新規な生
物学的包括法により得られた固定化エタノール酵母を用
いることにより、工業的に連続便用が可能であり、同定
化支持体の再使用で可能なエタノール醗酵性全提供する
ことにある。

本発明で使用する立体網状連続多孔質構造を有する水不
溶性ポリビニルホルマール担体（以下、単に本担体とか
多孔性ＰＶＦと称する）としては、治過材などの用途と
して市販されておシ、平均孔径が３０〜７００μ、好ま
しくは６０〜３５０μ、特に好ましくは６０〜１５０μ
の範囲の孔径を有する多孔質構造の水不溶性ポリビニル
ホルマール樹脂が用いられる。上記多孔質構造はその組
織が樹板状の完全連続気孔構造であり、且つ気孔率が高
込ために流体抵抗が低い担体である。本川体は水中では
変質せず、栄養培地の加熱滅菌温度に耐え得るような性
質を有するものが好１しく、ホルマール化度約８０％以
上のものを使用するのがよい。本担体は弱酸、アルカリ
および多くの有機溶媒に対１．て耐薬品性を示すものが
よい。

市販の多孔性ＰＶＦは通常シートの形態であり、本発明
において使用する場合には、そのま＼シルトの形で、あ
るいは適宜切断した形または粒状で使用さｉｔ得る。

本担体に固定化する凝集性酵母としてけ、増殖［７た紐
１胞が少なくとも１０個位から数百個凝集するような性
質を有し、細胞内に存在するある種の酵素作用により該
酵素の基質から有用な生産物を変換することのできる酵
母が使用され得る。例えばエタノール酵母が挙げられる
がこｉｔＫ限らず、細胞内に存在する酵素活性を利用し
て該酵素基質から有用な生産物に変換することのできる
酵素活性を有し、且つ凝集性を有する酵母であれば、ど
の種の酵母でも使用され得る。

凝集性を有するエタノール酵母の例としては、サツカロ
マイセス・セレビシェＮＣＹＣ１１１９、ＮＣＹＣｌ　
２５１、ＮＣＹＣ１２５６、ＮＣＹＣ１２５７、ＮＣＹ
Ｃ１２６１などが挙げられる。

本担体に凝集性酵母を固定化するには、先ず本。

担体の共存下前記酵母を培養すればよい。培養方法Ｉ・
ま公知の酵母培養法が用いられ、適当な栄養源を有する
液体培地で培養される。培地の栄養源としては、酵母の
培養に通常用いられるものが使用され得る。炭素源とし
ては、同化可能な炭素化合物であればよく、例えばブド
ウ糖、庶糖、乳糖、麦芽糖、可溶性澱粉、デキストリン
、糖蜜、コーン・スチープ・リカーなどが使用され得る
。窒素源としては、利用０工能な蟹素化合物であればよ
く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・
スチープ・リカー、カゼイン加水分解物、アンモニウム
塩、尿素などが使用され得る。その他、リン酸塩、マグ
ネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、
鉄、マンガン、銅などの水溶性塩が必要に応じて使用さ
れる。上記培地の加熱滅菌は本担体の共存下で行うこと
ができる。

培養条件は目的とする酵母の酵素活性の有無によシ異な
り、好気的培養あるいは嫌気的培養が行われる。例えば
、エタノール酵母を培養する場合には、静置培養のよう
な嫌気的培養が行われる。

培養温度および時間は酵母の種類、培養条件などによシ
異なるが、通常、培養温度は２５〜３５℃、培養時間は
１〜４日程度であって、増殖期の終了時を検討して適当
な時期に培養を終了すればよい。

このようにして増殖した酵母細胞は、多孔性ＰＶＦの孔
内に入り込むが、その凝集性のために凝集し、凝集し７
た細胞のサイズが本担体の孔径より大きくなるため、孔
外に漏出できなくなって孔内に閉じ込めれ、−わゆる生
物学的に包括される形で酵母が本担体に固定化される。

このようにして得られた固定化酵母は、先ず醗酵容器か
ら培養液を排出し、醗酵容器から取り出すか、あるいは
取シ出す仁となく、残在する培養液を洗出することによ
り得られる。

上記固定化酵母の酵母活性あるいは酵素活性が低下した
場合には、固定化酵母に無菌的に液体培地を４入ｔ、て
再度培養して酵母を増殖させることにより酵母活性ある
いは酵素活性を回復させることができる。従って再培養
を行う必要があるような場合には、醗酵容器が固定化酵
母の反応容器として兼用される。

上記固定化酵母は、酵母活性あるいは酵素活性が低下し
たためにそれ以上使用する必要がなくなった場合には、
該固定化酵母を加熱した水性媒体で処理することにより
、酵母が凝集性を失なって多孔性ＰＶＦの孔内から漏出
してしまうので、酵母を水性媒体で洗出し、本担体を再
度新たＶ？４Ｊｌ母の固定化に使用することができる。

これによシ産業廃棄物量が減少１．７、工業上有利であ
る。

次に、固定化エタノール酵母を用いるエタノール醗酵に
ついて述べる。

本発明にお−ては、エタノール醗酵性糖含有液に上記固
定化法により得られた固定化エタノール酵母を作用させ
るエタノール醗酵が行われる。上記エタノール醗酵はバ
ッチ式でもカラム式でもよいが、工業的には固定化エタ
ノール酵母を連続使用するのが生産コスト上有利である
ので、連続使用の可能なカラム式が好ましい。上記のエ
タノール醗酵は通常３０〜３７℃で行われるので、固定
化エタノール酵母に作用させるエタノール醗酵性糖含有
液をその反応温度に調節して使用すｎばより０ 上記エタノールｒｌｌｌｆｌ性糖詮有液としては、公刈
のエタノール醗酵に使用し得る醗酵性糖を含有する溶液
が用いられる、例えば、糖液、澱粉糖化液繊維素糖化液
などが挙げられる。これらの糖含有液はｂずれの植物起
源のものでもよいが、エタノール醗酵性糖を含有するこ
とははうまでもな−。

これら糖含有液中に本川体で沖過［、得るような固形分
が含有する場合には、予め上記固形分を適当な濾過剤を
用（八て除去しておく必要がある。

連続的にエタノール醗酵を行う場合には、固定化アルコ
ール酵母の充填した反応容器にエタノール醗酵性糖含有
液槽から該糖含有液を導入し、生成した醗酵ブロスを精
留塔に導入して連続的にエタノールを精留すればよい。

該糖含有液の導入速度は、固定化アルコール酵母のエタ
ノール生成活性の強さおよびその量、反応容器の長さな
どにより異なるが、固定化エタノール酵母の活性が出来
るだけ低下せず、生成するエタノールが出来得る限り高
濃度で得られるよう適宜該糖含有液の導入量を調節すれ
ばよい。エタノール醗酵性糖含有液はエタノール醗酵に
最適な温度に保持しながら導入されることは言うまでも
ない。

このようにして生成されたエタノールは、連続的に公知
の精留装置に尋人し、精留すればよｈ０本発明にお−て
は、エタノール生産を工業的に行う場合には、前記エタ
ノール酵母の培養、いわゆる［６１定化エタノール酵母
の潤製とエタノール醗酵およびエタノール精留を連続的
に行うのが極めて有利であるうその工程の一例を図面の
７０−シートに従って説明する。

複数個の反応塔ｌ　（説明を簡省化するため１つの反応
塔を挙げて説明するが、他の反応塔も示す場合には、反
応塔１′の如く表示する場合がある）には、その底部に
給入口２とその頂部処排出口３を設け、該給入口２け加
圧蒸気、加圧されていてもよい熱水または無菌化された
水など−の媒体を反応塔ｌ内に通すための配置がなされ
ており、また該排出口３は使用した媒体を反応塔１外に
排出するための配管がなされている。これらの給入口２
および排出口３は６＋ｓ記媒体の種類にょシ各々別々の
給入口２′および排出口３′を設けてもよいし、同一の
口を兼用してもよ−。

前記媒体は、場合により反応塔ｌの頂部から給入しても
よい。その場合には前記排出口３．３′が給入口となり
、前記給入口２．２′が排出口となる。

該反応塔工には、液体培地が液体培地槽４と該反応塔ｌ
を循環できるようにその頂部と底部に循環管５を接続し
、頂部または底部のいずれから循環してもより構造を有
する。さらに該循環管５に種培養槽６を設け、核種６で
調製し、た種母を該循環管５を介して反応塔ｌに移送さ
れるが、核種６は該液体培地槽４と兼用してもよい。

さらに、反応塔ｌの底部にはエタノール醗酵性糖含有液
、例えば糖蜜を導入する導入ロアを４１（１、該導入ロ
アけ糖蜜槽８と接続していて、調整した糖蜜溶液が連続
的に該反応塔ｌに供給できる構造を有する。反応塔１の
頂部には生成し７ヒ醗酵プロスが流出する流入口９が設
けられ、精留装置ｌ。

と接続している。

先ず、本担体を反応塔ｌに各々充填し、給入口２より加
圧蒸気を通じて本担体を滅菌する。反応塔ｌ内の冷却は
通常無菌化した水を通して行わｉＬる。無菌化した水の
給入は、給入口２またけ２′あるいは排出口３または３
′より通じ、排水は排出口３または３′あるいけ給入口
２または２′よシ排出する。

次に、エタノール酵母を予め種培養槽６で静置培養して
得た種母を循環管５を通じ反応塔ｌに頂部または底部か
ら移植した後、液体培地槽４の滅菌した液体培地を反応
塔１のｙ４部または底部から循環管５を介して循環され
る。この液体培地は熱交換礪を介し、てエタノール酵母
の培養に適した温度に保持される。

次に、反応塔ｌ内に無菌化し、濃１．ｆｆ調整した糖蜜
を導入ロアより導入Ｌ７てエタノール醗酵を行うが、こ
の導入速度は、醸酵グロスが反応塔ｌの流出口９より流
出するまでに糖饗が充分に消費され、且つエタノール濃
度が最高（Ｃなるようエタノール醗酵が完了することを
見計って適宜決定すればよＬｎ。

流出したＩ援酵プロスは）！Ｊ：沈的に精留Ｊ装置１０
に導入され、エタノールが精留式れる。

酵母が固足化されている支持体から酵母を脱離させる場
合には、該当する反応塔ｌの使用を停止シフ、給入口２
より熱水を通すことにより本州体からエタノール酵母が
脱離さ九、その廃液は排出口３より反応塔ｌ外に排出さ
えしる。上記本担体にｐ）度エタノール酵母ケ固定化す
る場合には、本州体の滅菌も兼ねて熱水の代りに加圧さ
れた熱水を通し、てもよい。

上記の本担体からエタノール酵母の脱離工程中は、他の
反応塔１′を用いて連続反応を行えばよい。

このようにして得られた本州体は前述した通り、エタノ
ール酵母を再固定化することができる。

上記の通り、本発明によるエタノールｊ撥酵法によれば
、固定化エタノール酵母は勿論、その支持体である本担
体も反応容器から取り出すことなく、連続的にエタノー
ル醗酵が出来、従来の固定化酵母による連続エタノール
ｄ酵法〔化学の領域、Ｖｏｌ　、３７　、Ｎｏ、２．９
４〜１０１　　（１９８３））よシ極めて有利であるば
かりでなく、それだけ産業廃菓＊都が減少するので、工
業的にも得策である。

次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、こ
れにより本発明を限定するものではなり０実施例　１ 同定化方法 ５００　ｍｌ’　容三角フラスコにグルコース１０％、
Ｆｌ′ｉ４ｋ　コーキス（１，２５％、ＮＨ４Ｃｌ１　
Ｏ，２５％、ＮａＣ１１１，１％、Ｋ２）１１）０．０
．５５　％を含む液体培地１００ｍ１とポリビニルホル
マール樹脂シート（カネボウ合成化学社製、カネボウス
ポンジシート品名ベルイータ−１品番Ａ−３１４０、Ａ
−３１６０、Ａ−３２１０ＸＡ−３３１０，Ａ−３３２
０ＸＡ−３４ＩＯおよびＡ−３４２０）を各々１ｔＩＷ
Ｌに切１祈しＣ得た粒状物的Ｉｇを加え、１２０℃で２
０分間蒸気滅菌した後、サツカロマイセス・セレビシェ
ＮＣＹＣｉ　２５１を接才垂し、３０℃で４日間静置培
養［また。その１用２日目と３日目に滅菌した上記と同
一組成の液体培地１００ｍと入ｆ１．替えて培養を行っ
た。培養後、培養面を傾斜法にょ）分離し７た。得られ
た担体は重子崩微鯨観察すると酵母が生物学的包括法に
より固定化されていることが餡められた。

このように［２てイｌらへン七１．−１定化エタノール
酵母の醗酵力を次の方法しこより炭１ｒ１ガス元生ｋＩ
″ｒ’：ｌ：　８１１１定することにより求めた。

（１）炭酸ガス発生量の測定法 ガラス管を通１〜たゴム栓で試験Ｗを沿閉し、そのガラ
ス管と水平に設置Ｕ７た２００ｍ１荏の注射筒の注出口
とをゴム管で連結した装置を用いる。そ（７）試Ｍ％’
に１Ｉｉｉ定化エタノール酵１’Ｊ：　０−３　、ｊｉ
’　（！ニゲルゴー２１５％、酵母エキス０．２５チ、
ＮＨ４Ｃｌ１０．２５係、ＮａＣＡ！　０．１％、Ｋ２
厘）４０−５５９’　ｋ　陰む基質溶液５　ｍｌおよび
消泡剤１滴を加え、該試験’Ｙを３０℃の恒温槽で加温
［７、炭酸ガスの発生＠を１１チ間で追ｂ１ｄＶ／ｄｔ
（ｍｌ／ｍ１ｎ）の値を求めた。

（２）ｄ（１１定結果 品名　　　平均孔径　　ｄＶ／ｌｉｔ　（ｉｌ箔。１１
□）Ａ−３１４０８μ　　０．６７ Ａ−３１６０３０１，０６ Ａ−３２１０６０１，１４ Ａ−３３１０１０００，８６ Ａ−３３２０１３００，８４ Ａ−３４１０２５００，６６ Ａ−３４２０３５００，５３ 実施例 ５００　ｍｌ　’？？三’ｆ−’４フラスコに各々グル
コース１０係、（ｊ’ｊ　４ｔ　エキス０　、２５％、
ＮＨ４ｃｌＯ，２５％　、ＮａＣ１３０１１％、Ｋ、、
ｒ−１Ｐｏ４０．５５　％を含む液体培地１０ＵｘＪと
ポリビニルホルマール 成化学社！１ｑ１　カネボウスポンジシート品名ベルイ
ータ−、品４’ＦＡ−３４２（１（平均孔径３５ｏμ）
全容々１　ｍｒｎ．に切１ノＦシて得た粒状物的１ｇを
加え、１２０℃で２０分１ｄ］蒸気滅蛸した後、下記の
醇母會接挿（、７、実１イｑ例１「４載の方法と同様に
培Ｒを行って、固定化エタノール精留母を得た。これ全
実施例１記載と同様に戻酸ガス祐生−；よ孕測足した結
果は次のとおりである。

ｄＶ７’ｄ　ｔ　（　Ｑ／ｉｎ　ｉ　ｎ）、７５１１１
１例　　　３ 固定化酵母によるエタノール醗酵 内径が縦横各７ｃｍ，＋％さ２０ｃｒｎの直方体からな
り、その下部は各面が狭まった借造となり、その底部に
基質導入管を設け、該直方体の上部には開閉することの
できる蓋を設け、この蓋は閉縮時、耐熱性ゴムバッキン
グで密閉でき、その頂部に反応液流出管を設けたジャケ
ット付ステンレス製醗酵槽に７×２０ｃｒｎのポリビニ
ルホルマール樹脂シート（カネボウ合成化学社製、スポ
ンジシート品名ベルイータ−、品番Ａ−３２１０（平均
孔径６０μ、〕皐さ１　ｍｍ　）を２　ｍｍ間隙毎に両
側を接着しながら上下に並べた担体を入れ、前記蓋を装
置した後、蒸気滅菌した。次いで、予めサツカロマイセ
ス・セレビシェＮＣ’ＹＣ　ｌ　２　５　１　１（−グ
ルコースｌＯ％、酵母エキス帆２５％、ＮＩＬ，Ｃ１０
．２　５％、ＮａＣｌＯ．１％、Ｋ２ＨＰＯ４０．５５
％を含む液体培地ｉｏ。

ｍｌに予備培養した種母を仕込み、さらに滅菌した上記
と同一組成の液体培地ｌｌを加え、３０℃で４日間静置
培養した。その間２日目に醗酵槽から培養液を廃出し、
新たに上記と同一組成の液体用地ｌｌを加えて培養を続
けた。この操作を３日目にも行った。

培＃後、培養液を排出１７、滅菌したグルコース１５％
、酵母エキス０．２５％、ＮＨ４Ｃ）０．２５％、Ｎａ
（Ｊ　０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４０．５　５％を含む基質
溶液１１をｓ．ｖ．　＝　ｕ．ｌＣｈ−’　］の速厭で
基質導入管より４人１、て３０℃で加温下で反応させた
。醗酵槽の上部より流出した反応液のエタノール濃度を
ガスクロマトグラフィーで追跡した。２４時間連続反応
後の反応液中のアルコール濃度は７．０　％であって、
醗酵歩合は９　１．２５％であった。この反応をさらに
１０日間連続的に行ったが、生成したアルコール０度の
変化は生じなかった。

【図面の簡単な説明】

図面は固定化エタノール酵母の調製とエタノール醗酵お
よびエタノール精留を連続的に行うフローシートである
。 特許出，顆大　清　水　祥　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ）、凝集性酵母を立体網状連続多孔質構造を有する水
   不溶性ポリビニルホルマール担体と共に培養し、増殖し
   た酵母が凝集することにより該担体の多孔内に生物学的
   に包括されてなる固定化酵母。 ２）、酵母がエタノール酵母である特許請求の範囲第１
   項記載の固定化酵母。 ３）、立体網状連続多孔質の平均孔径が約３０〜７００
   の範囲である特許請求の範囲画工項記載の固定化酵母。 ４）、水不溶性ポリビニルホルマールがホルマール化度
   的８０〜８６ｑ６のポリビニルホルマール樹脂である特
   許請求の範囲第１項記載の固定化酵母。 ５）、担体がシート、その切断物または粒状である特許
   請求の範囲第１項記載の固定化酵母。 ６）、凝集性エタノール酵母を立体網状連続多孔質構造
   を有する水不溶性ポリビニルホルマール担体と共に培養
   し、増殖した酵母が凝集することにより該担体の多孔内
   に生物学的に包括されてなる固定化酵母にエタノール醗
   酵性糖含有液を作用させることを特徴とするエタノール
   醗酵法。 ７）、立体網状連続多孔質の平均孔径が約３０〜７００
   の範囲である特許請求の範囲第６項記載のアルコール醗
   酵法。 ８）、水不溶性ポリビニルホルマールがホルマール化１
   １ｉ約８０〜８６チのポリビニルホルマール樹脂である
   特許請求の範囲第６項記載のエタノール醗酵法。 ９）、担体がシート、その切断物または粒状である特許
   請求の範囲第６項記載のエタノール醗酵法。 ｌＯ）、エタノール醗酵性糖含有液が糖液、澱粉糖化液
   または繊維素糖化液である特許請求の範囲第７項記載の
   エタノール醗酵法。