JPS59210900A - 血中プラスミン活性の測定法 - Google Patents
血中プラスミン活性の測定法Info
- Publication number
- JPS59210900A JPS59210900A JP8466483A JP8466483A JPS59210900A JP S59210900 A JPS59210900 A JP S59210900A JP 8466483 A JP8466483 A JP 8466483A JP 8466483 A JP8466483 A JP 8466483A JP S59210900 A JPS59210900 A JP S59210900A
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- Japan
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- fibrin
- plasmin
- blood
- peroxidase
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、血中のフィブリン溶解酵素プラスミンの活性
を１哀感度１迅速に測定する方法に関する。
を１哀感度１迅速に測定する方法に関する。
血液凝固系ではフイブリノケゞンがトロンビンの作用で
フィブリンに変換されて田面し、一方、線溶系ではフ０
ラスミノケ＋７がウロキナーゼ等により活性化されたフ
０ラスミンがフィブリンに作用して溶解し、その後ノ０
ラスミンは血中の７０ラスミン阻止因子によって失活す
る。このように生体内では、凝固系と線ａ￥系が巧みに
調節されているが、線溶系に異常がおこったときには、
プラスミン活性が元通して出血に、また異常に低下すれ
ば血栓形成に関係する。従って種々の血栓症、血管同凝
固症候群（ＤＩＣ）の予知及び診断において血中プラス
ミンの活性を高感度で迅速に測定する方法が望まれてい
る。
フィブリンに変換されて田面し、一方、線溶系ではフ０
ラスミノケ＋７がウロキナーゼ等により活性化されたフ
０ラスミンがフィブリンに作用して溶解し、その後ノ０
ラスミンは血中の７０ラスミン阻止因子によって失活す
る。このように生体内では、凝固系と線ａ￥系が巧みに
調節されているが、線溶系に異常がおこったときには、
プラスミン活性が元通して出血に、また異常に低下すれ
ば血栓形成に関係する。従って種々の血栓症、血管同凝
固症候群（ＤＩＣ）の予知及び診断において血中プラス
ミンの活性を高感度で迅速に測定する方法が望まれてい
る。
従来の血中プラスミンの活性測定方法は■カゼイン、変
性ヘモグロビンあるいはその他の蛋白質をプラスミンの
基質とし消化させ、除蛋白後、断片化したペプチドを分
光学的に測定する方法。■フイブリノーケゞン分子中の
チロンン残基を 工で標識し、プラスミンの酵素作用に
よって蛋白分子より遊離するペプチド中に存在する１２
５■をノンチレーンヨンカウンターで測定する方法。■
フイブリノーケ゛ンの抗血清あるいは抗体を用い免疫学
的手段を用いる方法。■フィブリンを薄膜とし７、その
中に孔をあけ血漿の一定量を入れ、一定時間後に溶解し
て透明となった部位の直径を測定する方法。■ブルーデ
キストランをフィシリン膜中にうめこみ、プラスミンの
酵素作用で溶出するブルーデキストランを測定する方法
。■プラスミンをｐ−）ルエンスルホニル・アルギニン
メチルエステル（ＴＡＭＥ）、リジンエチルエステル（
ＬＥＥ） 、Ｓるいはベンノルアルギニン・ｐ−ニトロ
アニリド（ＢＡＰＡ）のような合成基質に作用さぜ分光
学的に７１１１定する方法等がある。■乃至■の方法は
、１１１定か繁雑であり測定に長時間を要する。■の合
成基質を用いる方法は短時間でイｉｌ］］定可能である
が、血中に存在するビリルビン等が基質の分解（で伴な
うスペクトル変化を著しくさまたげる欠点があった。
性ヘモグロビンあるいはその他の蛋白質をプラスミンの
基質とし消化させ、除蛋白後、断片化したペプチドを分
光学的に測定する方法。■フイブリノーケゞン分子中の
チロンン残基を 工で標識し、プラスミンの酵素作用に
よって蛋白分子より遊離するペプチド中に存在する１２
５■をノンチレーンヨンカウンターで測定する方法。■
フイブリノーケ゛ンの抗血清あるいは抗体を用い免疫学
的手段を用いる方法。■フィブリンを薄膜とし７、その
中に孔をあけ血漿の一定量を入れ、一定時間後に溶解し
て透明となった部位の直径を測定する方法。■ブルーデ
キストランをフィシリン膜中にうめこみ、プラスミンの
酵素作用で溶出するブルーデキストランを測定する方法
。■プラスミンをｐ−）ルエンスルホニル・アルギニン
メチルエステル（ＴＡＭＥ）、リジンエチルエステル（
ＬＥＥ） 、Ｓるいはベンノルアルギニン・ｐ−ニトロ
アニリド（ＢＡＰＡ）のような合成基質に作用さぜ分光
学的に７１１１定する方法等がある。■乃至■の方法は
、１１１定か繁雑であり測定に長時間を要する。■の合
成基質を用いる方法は短時間でイｉｌ］］定可能である
が、血中に存在するビリルビン等が基質の分解（で伴な
うスペクトル変化を著しくさまたげる欠点があった。
本発明の方法は、ペルオキシダーゼを埋め込んだフィブ
リンに、血漿及び必要（・で応じてプラスミノケ゛ン転
化促進物質を作用させ、遊離するベルオキ７ダーゼ゛の
ゴ占性を迎］定することにより、血中プラスミン活性を
測定する方法である。
リンに、血漿及び必要（・で応じてプラスミノケ゛ン転
化促進物質を作用させ、遊離するベルオキ７ダーゼ゛の
ゴ占性を迎］定することにより、血中プラスミン活性を
測定する方法である。
本発明の方法では、本来ノ°ラスミンの基質であるフィ
ブリンを用いているので特異性の点で優れており、また
血中プラスミンによりフィブリンが溶フ簀されて遊離し
たペルオキシダーゼは高感度で容易に測定可能である利
点を有する。
ブリンを用いているので特異性の点で優れており、また
血中プラスミンによりフィブリンが溶フ簀されて遊離し
たペルオキシダーゼは高感度で容易に測定可能である利
点を有する。
ペルオキシダーゼを埋め込んだフィブリンを調製するに
は、特公昭５２−１８２７２号公報に記載の方法に従い
ベルオキ７ダーゼを加えたフイブリノケ゛ン溶液に酵素
トロンビンを加えて平伏状の箱に流し込み、放置してフ
イブリノケゞンをフィブリンに変換させることによって
、ペルオキシダーゼを埋め込み固定化したフィブリン塊
を得る。このフィブリン塊を圧縮して膜状に調製後、洗
浄して埋め込まれなかった啄ルオキシダーゼを取り除き
、測定用基質を得る。このもの！ｌ′ｉ凍結保存ができ
る。
は、特公昭５２−１８２７２号公報に記載の方法に従い
ベルオキ７ダーゼを加えたフイブリノケ゛ン溶液に酵素
トロンビンを加えて平伏状の箱に流し込み、放置してフ
イブリノケゞンをフィブリンに変換させることによって
、ペルオキシダーゼを埋め込み固定化したフィブリン塊
を得る。このフィブリン塊を圧縮して膜状に調製後、洗
浄して埋め込まれなかった啄ルオキシダーゼを取り除き
、測定用基質を得る。このもの！ｌ′ｉ凍結保存ができ
る。
測定用検体は、採血した血液にクエン酸ナトリウムを捷
ぜて凝固を防止し、これを遠心分離して得た血漿を検体
とする。血中にはプラスミンがその前、型体であるプラ
スミノケゞンとして存在するので、両者の活性を測定す
る場合は、フ０ラスミノグン転化促進物質例えばウロキ
ナーゼ又はストレプトキナーゼを添加してプラスミンに
転化させて測定する。
ぜて凝固を防止し、これを遠心分離して得た血漿を検体
とする。血中にはプラスミンがその前、型体であるプラ
スミノケゞンとして存在するので、両者の活性を測定す
る場合は、フ０ラスミノグン転化促進物質例えばウロキ
ナーゼ又はストレプトキナーゼを添加してプラスミンに
転化させて測定する。
検体のプラスミン活性を迎＋定するには、上記検体溶液
に上記ペルオキシダーゼを埋め込んだフィブリノｊ挨の
一定量を加え、３７℃で一定時間保ってフィシリンに血
中ノ°ラスミンを作用させた後、反応系より一定量の反
応液を取り出して遊離したベルオキ７ダーゼ活性の測定
に供する。
に上記ペルオキシダーゼを埋め込んだフィブリノｊ挨の
一定量を加え、３７℃で一定時間保ってフィシリンに血
中ノ°ラスミンを作用させた後、反応系より一定量の反
応液を取り出して遊離したベルオキ７ダーゼ活性の測定
に供する。
ベルオキ７ダーセ＋后注の測定は、常法により行われる
が、例えばＯ−フェニレンノアミンと過酸化水素を含む
発色液に反応液を加えて一定条件の下に発色後、酸を加
えて発色を１４市さぜ、生成した酸化体の吸光度を測定
する。これら一連の測定操作は暗所で行われ、退色を防
がなければならない。検体中のプラスミン活性は別に同
条件で調製プラスミンを用いて得た標準曲線から求めら
れる。
が、例えばＯ−フェニレンノアミンと過酸化水素を含む
発色液に反応液を加えて一定条件の下に発色後、酸を加
えて発色を１４市さぜ、生成した酸化体の吸光度を測定
する。これら一連の測定操作は暗所で行われ、退色を防
がなければならない。検体中のプラスミン活性は別に同
条件で調製プラスミンを用いて得た標準曲線から求めら
れる。
以下に本発明の方法の実施例を示す。
実施例
１）ペルオキシダーゼ゛を埋め込んだフィブリンｊ摸の
調製 ヒトフイプリノケゝンを０．１５Ｍ食塩と０．４１Ｖｌ
グルコースを含む溶液に５％になるように溶解した溶液
１０ｍ１に、２．５ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭシステ
ィ／及びワザビダイコンより得たペルオキシダーゼを７
５０単位量加えて、総量を２０ｍ１とした。こ、“ − の混合液に５０単位のトロンビン溶液を加え、底面か５
Ｘ ６ ｃｍ２のプラスチック容器に流し込んで、１
時間室温に放置し、フィブリフケ８ンをフィブリンに変
換させて被ルオキシダー姿を埋め込み固定化したフィブ
リン塊を得た。このフィブリン塊を１紙にはさみ、４℃
で１日圧縮してフィブリン膜を得た。このフィブリン膜
を２０ｍＭ）’Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７４）でよく洗浄
し、埋め込まれなかったペルオキシダーゼを取シ除いた
。このベルオキ７ダーゼを埋め込んだフィブリン膜は２
Ｃ７１Ｌ２に切９わけて一２０℃に保存し、以下の測定
の基質として供される。
調製 ヒトフイプリノケゝンを０．１５Ｍ食塩と０．４１Ｖｌ
グルコースを含む溶液に５％になるように溶解した溶液
１０ｍ１に、２．５ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭシステ
ィ／及びワザビダイコンより得たペルオキシダーゼを７
５０単位量加えて、総量を２０ｍ１とした。こ、“ − の混合液に５０単位のトロンビン溶液を加え、底面か５
Ｘ ６ ｃｍ２のプラスチック容器に流し込んで、１
時間室温に放置し、フィブリフケ８ンをフィブリンに変
換させて被ルオキシダー姿を埋め込み固定化したフィブ
リン塊を得た。このフィブリン塊を１紙にはさみ、４℃
で１日圧縮してフィブリン膜を得た。このフィブリン膜
を２０ｍＭ）’Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７４）でよく洗浄
し、埋め込まれなかったペルオキシダーゼを取シ除いた
。このベルオキ７ダーゼを埋め込んだフィブリン膜は２
Ｃ７１Ｌ２に切９わけて一２０℃に保存し、以下の測定
の基質として供される。
２）検体の調製
５０ｍ１ＶＩ）リス緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ） ３．４
ｄにウロキナーゼ１０単位（０，１ｍ７りと測定検体の
血漿Ｏ５ｍｌを加えて検体溶液を調製した。
ｄにウロキナーゼ１０単位（０，１ｍ７りと測定検体の
血漿Ｏ５ｍｌを加えて検体溶液を調製した。
３）ペルオキシダーゼ活性の（則定
上記検体溶液４ ｍｅに先に調製したベルオキンダーゼ
を埋め込んだフィブリン膜２０を加え、３７℃で３０分
間よく攪拌しながら保ち、検体中の）０ラスミンをフィ
ブリンに作用させた。
を埋め込んだフィブリン膜２０を加え、３７℃で３０分
間よく攪拌しながら保ち、検体中の）０ラスミンをフィ
ブリンに作用させた。
別にＯ−フェニレンノーアミン２５ｍ！７と０５％過酸
化水素水０−６６５＋！を５０ｍＭ トＩＪス塩酸桜衝
液（ｐＨ７，４，） ２５ηｆに加えて発色液を調製し
た。
化水素水０−６６５＋！を５０ｍＭ トＩＪス塩酸桜衝
液（ｐＨ７，４，） ２５ηｆに加えて発色液を調製し
た。
この発色液９５０μｌに前記反応液５０μｔを加えてよ
く攪拌した後、３７℃で５分間保って発色させ、さらに
４Ｎ硫酸２５０μＬを加えて発色を停止させた。この発
色液について４８０ ｎｍに２ける吸光度を測定し、あ
らかじめ得られた石１製プラスミンを用いた標鵬曲線か
ら血漿検体中のプラスミン量は１学位／ ７ｎｅと測定
された。
く攪拌した後、３７℃で５分間保って発色させ、さらに
４Ｎ硫酸２５０μＬを加えて発色を停止させた。この発
色液について４８０ ｎｍに２ける吸光度を測定し、あ
らかじめ得られた石１製プラスミンを用いた標鵬曲線か
ら血漿検体中のプラスミン量は１学位／ ７ｎｅと測定
された。
特許出願人 美 浜 久 春
Claims (1)
- ペルオキシダーゼ゛を埋め込んだフィブリンに血漿及び
必要に応じてプラスミノグン転化促進物質を作用させ、
遊離するペルオキシダーゼの活性を測定することを特徴
とする血中プラスミン活性の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8466483A JPS59210900A (ja) | 1983-05-14 | 1983-05-14 | 血中プラスミン活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8466483A JPS59210900A (ja) | 1983-05-14 | 1983-05-14 | 血中プラスミン活性の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59210900A true JPS59210900A (ja) | 1984-11-29 |
Family
ID=13836979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8466483A Pending JPS59210900A (ja) | 1983-05-14 | 1983-05-14 | 血中プラスミン活性の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59210900A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0189910A2 (de) * | 1985-01-29 | 1986-08-06 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Bestimmung des fibrinolytischen Zustands von Plasma |
-
1983
- 1983-05-14 JP JP8466483A patent/JPS59210900A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0189910A2 (de) * | 1985-01-29 | 1986-08-06 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Bestimmung des fibrinolytischen Zustands von Plasma |
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