JPS59210891A - 酵素を用いる方法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プロトンを生ずる生成物の生成を触媒する酵
素を含み、且つプロトンを消費する生成物の生成を触媒
する酵宮を含む固定された生体触媒を、該固定された生
体触媒中に存する酵素のだめの基質を含む媒体に接触さ
せるＮ’素方法を行なうための方法に印する。

Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３６　（１９７３）
、８９〜９６６：５で印刷発表された研究では、ちる酵
素によるプロトンの生成又は消量が他の酵素へ及＃ｆす
影荷について研究されていた。大部分の実験は、ポリア
クリルアミド粒子中に相互陥入（ｃｏ−ｅｎｔｒα−ｐ
ｐｅｄ）２つのＣ４Ｚ　Ｒｙ、用いることにより、そし
て５＊ｔＪ／緩絢液中の該酵素の７）　１１に依存した
活性曲線を測定することにより行ガわれた。該実腺のう
ちの１では、グルコースオキシダーゼがウレアーゼとと
もに相互陥入され、グルコースに対するグルコースオキ
シダーゼ活性は、基質トシてグルコースのみを用い次の
実験忙おいてはグルコースと尿素を用いて、５−ｒＩＬ
Ｍ緩衝液中の種々のｐＨ値で測定した。グルコースオキ
シダーゼ活性のｐＨ最高値は、ウレアーゼ活性があると
酸性側にずれるようであった。使用する緩衝液のモル濃
度を５から５０ｍＭＫ増やすと、活性曲線のｐＨのずれ
が見服できた。

Ｂ、７トキｙ　７７　（Ａ　ｔｋｉｎｓｏｎ　）、Ｊ、
ロフト（，７？ｏＨ）及び１．ルソー（Ｒｏｓｓｓｅｃ
ｔｕ　）　（−Ｂｉｏ−１ｅｃｈｎｏＬｏｇｙαｎｄ　
Ｂｉｏａｎｇｉｎｅｇｒｉｎｇ、第ｘｔｘａ１０３７〜
１０６３頁（１９τ７）〕並びにＢ。

アトキンソ／及び１．ルソー〔同書、１０６５〜１０８
６頁（１９７７））は、尿素溶液と接触した固定された
ウレアーゼグル粒子の内部ｐＨは１基質溶液の外部ｐＢ
＊が＆８３の範囲でない限シ、一般に該外部ｐＪＩ本と
り３：なることを示１２ている。

該内部ｐ　；Ｉ　ｉ　ｉ、ｔＸＩま崇加水分解反応生成
ζウノ、すなわちアンモニウム及び二Ｉ、’：Ｉ゛：化
炭素の自己綬衝作用能力の結果でちる。

本発明の方法は、１つの、補助的醇禾反応を、第２の、
−生産的醇二（反応に有利力内部ｐｌｆｉを生成するた
めに用いることの可能性を見出したことに基づく。内部
ｐＲｉは、もつほら補助的反応の反応条件を７：：、３
　ｊ、；１することにより維持することができ、一方、
例えは基質１八体へのアルカリ、「傭又はＩ；さ衝剤の
添加による外部ｐ　、／／　ｔＪ：；節は用いられない
。

したがって、ゾロトンを生ずる生成物の生成を触ｔ／、
＆する［唇ヲ・；を含み且つプロトンを１１１費する生
成物の生成を触が５する［孝；：：を含む同定された生
体触ＩＪりを、該固定された生体ｎ二虞中に存するＣＩ
’　索のための基質を含む媒体に（どこ鳴させる本発明
の方法において、：″−′：ｆ、累反応のうちの１つに
有利なｐＨ色件を、基質媒体に緩衝剤を加えずに他の酵
素反応の反応伯仲を調節することにより維持する。

不方法では、プロトンを生ずる生成物の生成を；凶媒可
能ないかなる酵素でも、グロト／を消費する生成物の生
成を触媒可能な他のいかなる酵素とともに用いることが
できる。精製した酵素調製物も使用できるが、生長可能
又は生長不能な＠素的【で活性な微生物細胞も同様に使
用できる。工業上重要な系は、炭素−窒素結合を加水分
解するアシラーゼ、ｆ’Ｊｔはペニシリンアシラーゼ、
セファロスポリンアシラーゼ及びＤ−父はＬ−アミノ酸
アシラーゼである。これらの酵括は大規模で用いられて
いる。グロト／を生ずる生成物の生成を触媒すると素の
さらに重要な群は、エステルヒドロラーゼ及びグロテア
ーゼ、例えばα−キ七トリグンン、パ・ぐイン等である
。プロトンを消量する生成物の生成を触媒する重要な＃
素は、ウレアーゼである。

Ｓ　＝　’／　ＩＪ　：／　７　’／　ラ−セは一般に
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉから得られ、ペニシリ
ン、特にベンジルペニシリン又はフエノギシ被ニシリン
ヲ脱アシル化する九上媒として用いられる。これは、６
−アミツベニシラン＋Ｊ　（６−ａｍｉｎｏ　ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌａｎｉｃαｃｉｄ、　　Ｇ−ＡＰＡ　）を生成
し、この酸はペニシリンの半合成ＩＣ重要か出発原料で
ある。ベンジルペニシリンの脱アシル化反応は、６−Ａ
ＰＡとフェニル酢酸を生成する。この酵素反応の最適ｐ
Ｒ１ずなわちｐ　ＩＩ　９．０では、フェニル酢酸は主
として解番しプこ形で存在する。したがって、従来技術
の゛　　方法では、一定のｐａｌは、塩基を加えるか又
は多量の緩碕剤を用いることによってのみ維持し得る。

ｐＨを最適値に維持する心壁がある。なぜなら、さもな
ければ酵素の活性及び安定性が低下するからである。

ウレアーゼは、プロトン消費生成物の生成を触媒する酵
素として本発明で使用される好ましい酵素である。ウレ
アーゼは尿素のアンモニア及び二酸化炭素への加水分解
を触媒し、生成物は、大きな緩衝作用能力を有する溶液
を形成する。プロトンを生ずる生成物を生成する系、例
えばペニシリンアシラーゼ、セファロスポリンアシラー
ゼ若しくハ他のアシラーゼ、エステルヒドロラーゼ又ハ
ブロチアーゼが対応する基質と接触する系、のｐＨを調
節するために、尿素の加水分解生成物による固定された
酵素の内部緩衝作用を用いることは非常に有利である。

この方法では、ウレアーゼ及びペニシリンアシラーゼを
固体担体の細胞質基質（ｍａｔｒｉｘ）中に含有する固
定された生体触媒での内部ｐＨを調節できる。これは、
固定されたアシラーゼの活性及び安定性の重要な改良を
もたらす。

本方法において用いられる固定された生体触媒はいかな
る公知の固定化技法によっても製造できる。一般忙かか
る技法には、セルロース又はアノパーライトのような、
不溶性担体への共有結合、べ／トナイトのよう々、不溶
性担体への吸着、又は不溶性細胞質基質への陥入が含ま
れる。くぼんだ合成樹脂繊維への又はｒル粒子への陥入
は広く用いられる。好ましいケ゛ル細胞質基質は、ぼり
アクリルアミドケ゛ル及びグルタルアルデヒド架橋ゼラ
チン粒子ルでるる。架橋したゼラチン粒子への陥入は、
その方法が１１１ｊ便で良好な結果を与えるため、最も
好ましい。

本発明はさらに、ペニシリンアシラーゼと尿素を含有す
る固躍された生体は媒を用いる方法によりし・ｌ証され
る。ｉ〜かしながら、本発明がこの方法に限定されない
ことは、明白であらねばならない。

最も商業的なウレアーゼ旦・２造の最適ｐＨは、６．３
から６．５の間におかれる。ペニシリンの活性は、基質
、例えばベンジルペニシリンの濃度により影像される。

この酵素の最適ｐＨはｐ　ｉｆ　＝　８である。該酵素
は、生成物、６−アミノペニシラン飯及びフェニル酢酸
によっても阻害される。６−アミツペニシラニ／酸は非
拮抗阻害剤として作用し、フェニル酢？！４＆Ｊｉ拮抗
阻害剤である。おそらくフェニル酢酸の解離した形が阻
害剤でちる。ベンジルペニシリン濃度が０．０ＩＡｆよ
り高いときは、生成物による阻害の結果として反応速度
は低下する。

有利で一定なｐＨ条件を維持できるようにしてこれらの
酵素系をいっしょにすることが可能かどうかを決めるよ
うにするため、実験は緩衝剤のない争件下での酵素反応
中のｐＨ変化を求めるため可溶性の尿素及びペニシリン
アシラーゼを用いて行なわれた。

ｐＨ変化は記録ｎ１とつながったｐＪＩメーターでと）
１ｆ足した。反応はウレアーゼ及び１μグ／　ｒａｒｒ
濃度のベニシリ／アシラーゼを用いて行なった。尿素ト
（／シルベニシリ／の濃度は０．０１３ｆであった。

該基質を蒸留水にむかした。６′ｏ、のｐＨを酸又はア
ルカリのどちらかを用いて初期ｐ、Ｈ７−０に調節した
。ウレアーゼのみを上記混合した基質溶液に加えると、
反応生成物、アンモニアはプロトン濃度の減少を起こし
、ｐＲを１ｌＬ７７へ＃Ｊ加させた。

ペニシリンアシラーゼのみをｐＨ７の混合基質溶液に加
えると、ｐ／７ｉｉ４．９１の値に低下した。

尿素の酵曇的加水分解の生成物、すなわちアンモニアと
二酸化炭素は、ｐＨ９，０で自己緩衝作用能力を有する
溶液を生成し、ベンジルペニシリンの脱アシル化生成物
は、ｐ　１１４．５で緩衝作用能力を有する溶液を形成
する。

１０μＹ　／　ｗｆの濃度のウレアごゼ及び１００μｔ
／　ｍ／　ｆ１５度のベニシリ／アシラーゼを用いて該
２つの酵素の反応を同時に行なうと、溶液のｐＨは２０
分で７．８の値に達する。ベニシリ／アシラーゼ濃度を
２００μｆ　／　ＩＩ＋／に増やすとｐＨ変化を抑え、
ｐＨは２０分以上７．０の値に保たれた。これらの実験
は、２つの酵素をいっしょにすると、ｐ　１１変化を抑
え得る系を提供することを実証してｂる。

本発明に従う酵素反応を行なうときけ、基質のモル比は
最適生産性範囲での、Ｈ値を維持するようにして選択さ
れる。ペニシリンアシラーゼとウレアーゼの場合は、等
モル比のペニシリンを尿素基質が、ベンジルペニシリン
の脱アシル化に最適範囲でのほぼ一定なｐＨをもたらす
。

基質媒体中の基質濃度は臨界的でない。当然最も可能性
のある濃度が用いられる。約０．２モルのベンジルペニ
シリン濃度を用いると良好な結果が得られた。

ｒＦ素反応はバッチ式又は連続的に行なうことができる
。連続的（、七作は、流動層反応器又は固定層反応器で
行なうことができる。固定層反応器が、固定されたｍネ
ガ法において最も利用される反応器の型である。１５１
定層反応器が好適であるのにはいくつかの理由がるる。

これらの理由とけ、高い効率、簡ヰ９女設舊及び操作の
しやすさである。従来技術の固定ｒＭ″、反応器での酵
素を用いた方法の事大な欠点ｄ：　、　　ｐ　／／　ｒ
、＋−！節が動差的でないことである。

べ二シリノの脱アシル化は、脱アシル化中に形成される
フェニルｔ！、′ｌ：ｒＪ：、又は他の９により生じる
軸方向へのｐ〕ｌの低下により起こる著しい活性及び酵
素安定性の低下ために、単一段階固定片“；反応器では
行なうことができない、、　ＩＪｉｏｔｅｃ、ｈｎｏｌ
ｏｇｙ　ａｎｄＨｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　　＠　
ＸＸ　Ｖ巻、　　１８７３〜１８９５Ｂ　（１９８３）
に記載されるように、反応器の間でｐＥを調整する多段
階固定層、反応器が使用されねばならない。この従来技
術方法の欠点は、固定された酵素粒子での内部ｐＨ調節
を用いる本方法によシ取除かれる。本方法は、単一段階
の固定層反応器でうま〈行なうことができる。

相互固定された（　ｃｏ　−ｉｍｍｏｂｉｌ　ｊｚｇｄ
　）酵素系の連続的操作は、長時間にわたシ維持するこ
とができる。ペニシリンアシラーゼ活性は、８００時間
たつと極めてわずか低減する。この時、該酵素活性忙お
いて１０４の損失が起きる。したがって、両酊素とも内
部ｐｎ調整を維持しつつ長時間にわたり同時に反応する
ことができる。ウレアーゼの反応生成物は、ペニシリン
アシラーゼにとって最適に近いミクロ環境的ｐＨ条件を
提供する。

粒子内ｐＥ調節に加えて、相互固定された系は固定層カ
ラムの軸方向に沿ってのｐＨＡＮｆＪを提供する。内部
ｐＨ調節によシ、高変換率でペンジルベニシリ／の高ｎ
度の脱アシル化がなされる。ペニシリンの酵素的脱アシ
ル化の改良は、生成物の実質的コスト低下及び６−ＡＰ
Ｉの回収をもたらす。

両基質を等モル礎度で用いると、相互固定された酵素系
を最７１ｐｕ付近にすることができる。尿素濃度が低下
すると、ｐＨは低下し、したがって脱アシル化速度の低
下をもたらす。

尿素加水分解生成物の炭酸アンモニウム及び炭酸水累ア
ンモニウムを比較的高濃度、すなわち０．４Ｍで入れて
も、粒子内ｐＨを必要な値に維持することができなかっ
た。このことは明らかに、ｐ　Ｉ！調節イ万／種の内部
発生と外部拡散の有効性を実証している。

本方法の他の利点は、変換に影響を与えずに、ｐ　Ｉｌ
に依存して起こる副反応を無視できる値に供給溶液中の
ｐＨを維持できることである。

以下の実施Ｎ＃ｉ、本発明の方法を例証する。これらの
実施例は、本方法を行なういくつかの可能な方法を示す
ためにのみ例示するものである。

実施例１ 固定された生体触媒の製造 ゼラチン溶液は、０、ＩＭのホスフェート緩衝液、ｐ　
、Ｈ＝　６．０、に２０壬（Ｗ／Ｖ）のゼラチンを溶解
することによ＃）製造した。溶液を溶解を促進するため
に６０℃に加熱した。

ペニシリンアシラーゼ（１ｏ　ｏ＊９／７り　トウｖア
ーゼ（３０即／−）をホスフェート緩衝液ｐＨ＝　６．
０　、にＧ解した。ペニシリンアシラーゼ′ｆＡ製物か
ら細胞破片を取シ除くために遠心分離した・ゼラチンと
酵素溶液を等容量で４０’Ｃ＆Ｃて混合した。混合物を
冷たい酢酸ブチル（氷浴）に−滴ずつ加え、約３龍の直
径を有する球状グル粒子を形成した。グル粒子を酢酸ブ
チル炊ら取除き、２憾（Ｆ　／　Ｖ　）　ｆ３１（のグ
ルタルアルデヒド中で室温（約１８℃）又は４“Ｃて３
０分間架橋させた。

架橋した酵素グル粒子をホスフェート緩衝液、ｐＨ＝ｆ
、、Ｔ絃［ｉＥｌ＆浄Ｌ、同シ緩ｇ３Ｊｒｒｉ中Ｋ　４
℃で貯蔵した。粒子は、１０　ｔ＋　（ＩＶ／Ｖ　）　
セ−ｙ−ｆ−／、５０１ｎり／２ペニシリンアシラーゼ
及びｌ　５　Ｗ、７／タウレアーゼを含イ１（うていた
。

固定された生体触媒の使用 上記記載の方法で製造された粒子１．Ｏｆ’のパッチを
５０−の反応器に入れた。基質溶液（２ｓ　＝ｐ、　）
を加え、温度を３７℃（て保った。６−アミツベニシラ
ン蔽（６−／Ｉ　Ｐ　Ａ　）の５％１１Σは時間の閏斂
として決めた。見出された値を第１図に示す。

最靭の実験では、基質ｊ′ｈ液は０．０２　Ｍの蒸留水
中ぺ／ジルペニシリンであり、ｐＨはアルカリを加える
ことによりＦ’−ＱにＶＬ持した。結果は第１図の曲線
ｌで与えられる。その曲線は６−ＡＰＡの生成が時間と
ともに急激に減少することを示す。

この実験での時間の関数としてのフェニル酢酸の生成は
、第４図に示される。フェニル酢酸の濃度は加えられた
アルカリの量から計算した。

第２の実験では、基質溶液は、蒸留水中の０．０２Ｍの
ベンジルペニシリンと０．　ＯＩ　Ｍの尿素、２５ｍｅ
であった。第１図に曲線２で示されるように、ペニシリ
ンアシラーゼの活性は、２５倍に増えた。

本実駿の反応中のｐＨ変化は、第２図に示される。

はじめに、ｐＨは１５分でｐ　Ｈ８，５〜９．０、尿素
加水分解生成物が自己緩衝作用能力を示す値に増加した
。増加したｐＨは、尿素がベンジルベニシリ／よりも拡
散しやすいという事実の結果であると推測できる。次い
でｐＨは１７０分で＆１５に徐々に低下した。

続く実験では、基質溶液は、蒸留水中の０．２Ｍのぺ／
ジルペニシリンと０．００５＆の尿素であつた。これは
、第１図の曲線３により示されるように、ベニシリ／ア
ンラーゼの活性の３倍の増加をもたらした。対応するｐ
Ｈ−グラフ、第３図は、ｐＨが４５分で８．０に徐々に
増加し、次いで７．５にゆっくりと低下することを示す
。

固定された酵素粒子は、２００時間の連続的使用の後で
も活性の損失を示さなかった。第１図に示された結果は
明らかに、酵素的尿素加水分解の反応生成物での緩衝作
用の結果としての内部ｐＨ調節が、固定されたペニシリ
ンアシラニゼ活性の増加をもたらすことを示している。

実施例 連続的攪拌反応器（Ｃ５ＴＲ） 本実施例は、５０ｍｆｆの恒温（３７’Ｃ）に保たれた
連続的攪拌反応器（ＣＳＴＲ）中でのペンジルペニシＩ
７７　（Ｂ　Ｐ　）の脱アシル化について記載する。反
応のｐ７７を、ベンジルペニシリンとともに尿素を供給
することによシ内部的に調節した。Ｃ５ＴＲで使用され
る操作パラメーターは第１表に載せた。

架橋したゼラチングル粒子は実施例１で記載したように
して製造した。グル粒子中の溝素濃度は、第１表に示す
。

汚染を避けるために、反応器を高圧減菌し、基質溶液を
０．２２μ飢フイルターで濾過した。グル粒子を無菌で
グルタルアルデヒド溶液から反応器中に移した。

’Ｊ？−５図ハ、ｌＯｒｎＭのぺ／ジルペニシリンと１
０ｍ、Ａｆの尿素をさらした相互固定された系を７４０
時間以上無菌作用したものを示す。ＡＦｉバルク（ｂｕ
ｌｋ）溶液２１本を示し、Ｂは尿素の濃度と変換を示し
、Ｃは６−ＡＰＩの濃度と変換を示す。他の実数パラメ
ーターは第１表に与えられる。

ベニシリ／アシラーゼの濃度は１■（酵素）／ｆＣグル
）でおった。約８５ｃｆ）の変換が作用するはじめの５
５０時間で観測された。その後徐々に変換の低下が起こ
った。、ｐＨは、８００時間の作用中に約８０の一定値
に維持きれた。第５図は明らかに、２つの固足された酵
素が長期間にわたり同時に反応かつ作用できることを実
証している。

実施例３ この実施トリでは、ぺ／ジルペニシリンの脱アシル化を
固定層反応器で行なった。これは、恒温（３７’Ｇ）に
保たれた高さ１４．５　ｃ７ｎ内径Ｚ４ｃｙのクロマト
グラフィーカラムであり、はじめにそれに５　ａｎの局
のガラスピースを満だ【７だ。ビーズの上にグル粒子を
元てんし、た。輸励性ボ／ゾを用いて、供給浴数を一定
速度で送った。溶出液の流れを試料採取器に呆め、試料
のｐＨ，６−ＡＰＡとＮｉｌ、−形成を分析した。反応
器は、１１．５４ｒ＋／の液体容積と１７．　Ｏｆのグ
ル層を有した。これらの実検では相互固定された系に、
１００ｍＡｆのぺ／ジルペニシリンをさらした。本実駿
に含まれる種々の実験・ぞラメ−ターは第１表及び第２
表に要約する。

供給液の尿素濃度変化が反応器バルクｐＨ＊へ、したが
って基質変換へ及ぼす影響は、６．５時間で第２表に示
す。１００ｍＭのベンジルペニシリン一定濃度において
、尿素濃度を１００ｍ、Ｍから５０ｍＭに減少すると、
１２本は８．５から６．５に低下し、約３８．７　’ｌ
の低い基質変換度となる。

高い基質濃度で固定層カラムの性能を試験するために、
イノジルベニシリ／と尿素の濃度を２００ｍＭＫ増加し
た。３０時間での第２表は、同様の流出速度を用いて、
１１００ｒｎのべ／ジルペニシリンと比較すると、低い
変換（約４０憾）がこれらの高濃度とともに得られたこ
とを実証している。

この低い変換値は、おそらくカラム中の低い酵素充填、
シたがってベニシリ／アシラーゼの不十分な活性に依る
。１７かしながらウレアーゼの活性は、８．５の一定ｐ
Ｈ値を維持するのに十分でおった。

空間速度として表わされる供給流出速度の基質変換への
影響は、第２表の３７．４４．５２及び８１時間での値
により例証される１、カラ人中の流体空間速度が増加す
ると、期待通り、低い変換度をもたらす、３．６ｈ−”
の空間速度では、５２４弓の変換しか１００ｍＭベンジ
ルペニシリンとともに得られなかった。低い基質変換は
、通常バルク溶液ｐＨ＊の増加と関連していた。、これ
は、粒子中に過剰に存在し、高い比活性を有するウレア
ーゼがより高い空間速度を許容できるからである。

したがって、晶空間速期でよりよい性能を得るためには
、高濃度のペニシリンアシラーゼを用いるべきである。

外部級衝作用の固定層カラムへの効果は、第２表での２
２及び８８時間での値により示される。

各々０．１　Ｍ及び０．３　Ｍのトリス緩衝液を用いた
。

０、１ＡＩのトリス緩衝液を使用しても、脱アシル化に
より生成される酸を打消せなかった；したがってｐｌｌ
は６．０以下に低下し、３５．０４の低変換が得られた
。緩衝液の濃度を０．３Ｍに増すと、溶液の緩衝能力は
改良され、約５０冬の変換を得ることができた。０．３
Ｍの濃度のトリス緩衝液もなお、約７．２に減少した溶
液ｐＨ本によシ反映されるように、反応中に形成される
フェニル酢酸を打ち消すことができなかった。

カラムを用いた最後の実験では、全部で１２０時間の作
用後、該層を１００−のべ／ジルペニシリンのみにさら
し、緩衝液又は尿素を取υ除いた。

ｐ　ＩＩの約５０への低下が２６時間後に観測され、ベ
ンジルベニシリ／の変換は１０係以下であった。

９Ｈ−調節のない状態では、べ／ジルペニシリン脱アシ
ル化生成物はｐ　Ｉｆ　＊　＝　４．５で緩衝液を形成
する１゜ 実施例 前述の一連の実験においては、３４．０岬（酵素）／カ
ラムのイニンリ／アシラーゼ充填は２００ｍＭのベンジ
ルペニシリンの高変換を維持するのに十分でないことが
認められた。該反応器の変換を高めるために、その１１
体積を５７．０９に増し、且つベニシリ／アシラーゼの
充ｊ／ｌを５η（酵素）／２（グル）に増やした。本固
定Ｒ１の実験パラメーターのもつと詳細なことは、第１
表に与える。

供給流出速度の供給液中の、２００ｍＭベンジルペニシ
リンの変換への影響を、第３表に示す、。

６．０／Ｌ−’の空間速度では、８０鴫以上のベンジル
ペニシリン変換が得られた。流出速度の増加は変換度の
減少と関連した。したがってフェニル酢酸の生成の減少
は、尿素加水分解の同様の減少につながらず、第３表に
示した如くバルク溶液ｐＲ＊の増加をもたらす。

一定流出速度において異なる（より低い）尿素ｆＱ度で
カラムを作用させると、ベンジルペニシリン変換度は鋭
く減少する。この減少は、系の緩衝能力の減少の結果で
ある。したがって、グル粒子内のｐＨｉの低下は、ベニ
シリ／アシラーゼの反応速度に重要な影響を及ぼす。供
給液中に加水分解生成物Ａ’Ｈ４／／　ＣＯ、により尿
素を置き換えた結果を第３表に示す。（＃７／４）　ｔ
ｃ　Ｏｓ又はＮＨ，ｌＩＣ０，のどちらを加えても、十
分な緩衝てれた系は得られず、したがって、より低いｐ
Ｈ＊値と変換が、固定層反応器により得られた。＃ｆ４
ＨＣＯ，の場合は、変換は０．２　Ｍ及び０．４Ｍを用
いて各々３５．０係及び３９．６４であったＣ第３表参
照）。０．２Ｍ又は０．４Ｍの（Ｎｌ１４）　ｌ　Ｃ０
３を用いたときは、変換は各々３６６係及び４０．０イ
・であった。（Ｎｌｌ、）　２ＣＯ。

はより良好な緩価作用能力を有し、上記濃度を用いて、
７．５〜８３の７１１１１４．％に維持できる。

７５時間以上カラムを操作すると、との掃作条件下では
約２５もの活性の損失が生じた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、時間の１ジｊ舷としての６−アミンベニシラ
／酸の数匹変化を表わす。ここで各曲線は、基質溶液と
して、０．０２Ｍのべ／ジルペニシリンを用いた場合（
曲線１）、０．０１ｆのベンジルペニシリンと０．　Ｏ
Ｉ　Ｍの尿素を用いた場合（曲線２）、０．２Ｍのベン
ジルペニシリンと０．０５　Ｍの尿素を用いた場合（曲
線３）を表わす。 第２図は、基質溶液として００２Ｍのベンジルベニシリ
／とＯｏＯＩＭの尿素を用いた場合の、時間の関数とし
てのｐＲ波化を表わす。 第３図は、基質溶液として０．２　Ｍのベンジルペニシ
リンと００５Ｍの尿素を用いた場合の、時間の関数とし
ての７）　ＩＩ　’Ｒ化を表わす。 第４図は、基質溶液として０．０２　Ｍのベンジルペニ
シリンを用いた場合の、時間の関数としてのフェニル酢
酸のｄ既を表わす。 第５図は、１０ｍＡｆのベンジルベニシリ／と１ｏｍＭ
の尿素をさらした相互固定された系を７４０時間以上無
菌作用したものを示す。Ａは、バルク溶液ｐＨ＊を示し
、Ｂは尿素の濃度と変換を示し、Ｃは６−ＡＰＩの濃度
と変換を示す。 ナトウールペテンシャツペリーク・オ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、７°ロト／を生ずる生成物の生成を触媒するｎｎａ
   を含み、渥つプロトンを消費する生成物の生成を融媒す
   るξ７シ・−を含む固定された生体触媒を、該固定され
   た生体ｆプ、其中（ＩＣ存する酵素のための基質を言む
   媒体に接１独させるｉ！Ｆ　：Ｈ＜方法を行なうだめの
   方法でを・つて、【イ字反応のうちの１つに有利なｐ、
   ＩＩ糸件を、赳グ１ご餡本Ｋ　Ｉｉ　ｑ７ｊｊ剤を加え
   ずに他のＨｐ不反応の反応信性をｉＤ’ａ　ｆｕｒｌす
   ることによシ痔持することを６（−上とする方法。 ’ｉ−（１％素反応のうちの１′：）、に暦利なｐＨ央
   件を、１（Ｆ）、のｊニア　素反応のためのノ五質の、
   ７７、を税をｉｒＡ節すること１／ｃよし維持する！（
   腎を請求の籍μ、１犯１項記載の方法。 ３、　　ｆｉ”４Ｊ反応のうちの１つのための基質がベ
   ニシリ／又はセファロスポリ／であり、他の酵素反応の
   ための基質が尿素でおる特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 ４、該基質がベンジルペニシリンと尿素である特εｊ・
   請求の範囲第３項記載の方法。 ５、　ペニシリンアシラーゼ及びウレアーゼヲ含む固定
   された生体触媒がベンジルペニシリン及び尿素を含む媒
   体と接恕し、生体触媒中のウレアーゼラル度及び基質媒
   体中の尿素濃度が、生体触媒中のｐ　Ｈがベンジルペニ
   シリン脱アシル化のｆＬ逍値付近であるような濃度であ
   る特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、基質媒体中のぺ／ジルペニシリンと尿素の７−２丸
   が丑モルである特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、該固定された生体触媒が、グルタルアルデヒド架橋
   ゼラチングル中に陥入した酵素を含有している特Ｊ′ｌ
   −請求の範囲第１項記載の方法。