JPS59193827A - 新規免疫抗癌剤及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は哺乳動物の内臓器の生の細胞の細胞膜から分離
された水溶性ないし易水分散性の蛋白質及び糖蛋白質を
有効成分とする新規な免疫抗癌剤に関し、またその製法
に関する。

癌の治療剤又は予防剤として癌細胞に対して細胞膜とし
て作用する化学治療剤は従来いろいろのものが提案され
ている。また、癌細胞に対する免疫性を、人を含めて動
物に付与することによって癌を治療又は予防することも
いろいろと試みられている。例えば、癌細胞をウィルス
で溶解処理して得られる細胞溶解液（１、イｉ（、鱈、
。ｃｏｌｙｓａｔ。）をワクチン（抗Ｗ）として動物に
注射し、癌細胞に特有な特殊蛋白質と特異的に反応する
抗体を動物生体内に生成させ、こうして癌細胞に対する
免疫性を動物に人工的に付与することによって癌の予防
又は治療を行うことも試みられている（例えば英国特許
第１５２０２００号、米国特許第４１０８．９８３号参
照）。

一般に、人工免疫は、生体に侵入した有害な異物に対し
て特異的に作用する抗体が生体内で生成されることによ
って発現され、この抗体のもつ特異性は人工免疫の付与
に用いた抗原に左右されるから、その用いるべき抗原は
生体内において無害化すべき有害な異物と全く同じ物質
又は極めて類似している物質であることが必要である。

そして、免疫付与に用いる抗原は、生体内において無害
化すべき異物について物質としての同−性又は類似性が
高いほど特異性がより高い抗原であると言える。これら
のことは癌を免疫により予防又は治療しようとする場合
にも言える。

従って、一般に、免疫には、より特異性の高い抗原を用
いることが望才しく、癌免疫も例外ではない。その意味
で、癌細胞あるいはその構成成分を免疫付与の抗原とし
て用いることが生体内で無害化すべき癌細胞に対して高
い特異性をもつ抗体を生成させ得る点で秀れている（　
Ｐ、Ｆｒｏｓｔ、　Ｃ，Ｊ。

５ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｔｕｍｏｒ　ｉｍｍｕｎｏｐｒｏ
ｐｈｙｌａｘｉｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅｕｓｉｎｇ　　ｇｌ
ｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ−ｔｒｅａｔｅｄ　　ｓｙｎ
ｇｅｎｅｉｃ　　ｔｕ−ｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ″’Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ”、５５：ｐ、２６４６−２
６５０（１９７５）　）が宿主を悪液質に導く有害成分
の混入が完全にｎ避できるとはいえない。また癌腫の種
類により有効な抗体の特異性に差が認められること、ま
た常に均一な抗原を量産することがむずかしい。

そこで、動物の胎仔の内臓器の細胞は未分化であるのみ
ならず、癌細胞と同じような代謝パターンを示し、例え
は嫌気解糖系の細胞内酵素の多くを含むこと、さらにあ
る種の癌のように胎仔性（胎仔期）の蛋白質（α−フェ
トプロティンなど）を保持するものがあり、両者の性質
には共通な点が多く存在することに本発明者は着目した
。胎仔はあくまで生理的であり且つ一定期間（妊娠期間
）后に娩出される点が癌の場合と大きく異なるけれども
、ある意味では胎仔は生理的な癌とも考えることができ
る。

また、癌細胞が癌細胞である以上は、正常細胞と相違す
るところがあるはずであり、その相違性は癌細胞表面に
倒れかの形で表現されているはずであり、そして正常細
胞の表面を構成する蛋白質及び糖蛋白質とは何らかに相
違する蛋白質及び糖蛋白質が癌細胞表面に存在するはず
であり、それは必らず癌細胞特異抗原として認識できる
はずであり、その抗原に特異的な抗体もあるはすである
。

そのような癌細胞特異抗体を動物生体内に人工免疫の手
法で生成さぜれは、生体内でその抗体によって特異的に
癌細胞を攻撃、破壊できるはずである。そこで本発明者
が考えたところによれば、そのような癌細胞特異抗体を
生成させるのに適当な抗原物質を、癌細胞以外の材料か
ら採取できるとすれは、そのような適当な抗原物質は癌
細胞それ自体から採取される抗原と違って宿主を悪液質
に導く恐れが無い又は微小であるはずであり、またその
ような抗原物質は癌の免疫療法に極めて有用である。

そして、本発明者は、前述したように、嘩乳動物給仕の
内１藏器細胞は癌細胞と共通する性質を多くもつことに
着目して給仕の内臓器の細胞膜の構成成分を、細胞膜の
物質的な基本的構築を可及的に破壊、変質させることな
く採取し、こうして採取した蛋白質及び糖蛋白質又はこ
れらを主成分とする物質を抗原として宿主に投与するこ
とが癌の免疫治療又は予防に有効な手段であると考えた
。

そこで、本発明者は、ブタ、ウシ、ウマ等の哺乳動物給
仕の内臓器、例えば肝臓、膵臓又は胸腺を取出し、その
臓器としての細胞塊を等脱液中で細胞形態がなくなるま
で機械的に破砕且つホモジナイズし、得られたホモジナ
イズ液（細胞溶解液）を遠心分離して不溶解の固体残渣
と上清液とに分別し、内臓器細胞の細胞膜に由来する水
溶性ないし易水分散性の蛋白質及び糖蛋白質、並びに細
胞内容質（原形質及び小器官）に由来する種々な水溶性
−ないし易水分散性物質を含有する前記上清液を分取し
、この上清液から細胞膜由来の蛋白質及び糖蛋白質を分
離する意図の下に上清液を水又は等張渡に対して透析し
、これによって低分子量の水溶性物質、例えばアミノ酸
、オリゴペプチド類。

塩類を除去し、得られた透析液を凍結乾燥し、こうして
給仕内臓器細胞の細胞膜の蛋白質及び糖蛋白質又はこれ
らを主成分とする物質を採取した。

更に、このようにして得た蛋白質及び糖蛋白質からなる
物質を抗原としてワクチンの形でマウスに皮下注射又は
経口投与してマウスの免疫機序を刺激し、抗原に対応す
る抗体が生成して免疫が確立された期間を経過した後に
、実験腫瘍細胞をマウスに接種し、さらに腫瘍の発生の
経過を対照群と比較しながら観察したところ、上記のよ
うに給仕細胞の細胞膜から分離された蛋白質及び糖蛋白
質よりなる物質が免疫抗癌剤として実際に有効であるこ
とを知見した。

従って、先に、本発明者らは哺乳動物給仕の内臓器の生
の細胞の細胞膜から分離された水溶性ないし易水分散性
の蛋白質及び糖蛋白質を有効成分として含むことを特徴
とする、免疫抗癌剤に係る発明を完成した（特願昭５８
−７３８４号明細書参照）。

上記の発明における基本着想から転じて、本発明者は、
出生后の哺乳動物の内臓器の生の細胞から細胞膜の蛋白
質及び糖蛋白質又はこれらを主成分とする物質を同様に
採取した場合この物質が免疫抗癌活性を有する可能性を
推定した。

そして、このようにして出生后の哺乳動物の内臓器の細
胞の細胞膜から得た蛋白質及び糖蛋白質からなる物質を
抗原としてワクチンの形でマウスに皮下注射又は経口投
与してマウスの免疫機序を刺激し、抗原に対応する抗体
が生成して免疫が確立された期間を経過した後に、実験
腫瘍細胞をマウスに接種し、さらに腫瘍の発生の経過を
対照群と比軟しながら観察したところ、上記のように出
生后の哺乳動物の内臓器の細胞の細胞膜から分離された
蛋白質及び糖蛋白質よりなる物質も、給仕内臓器の細胞
の細胞膜から分離されたものと同様に、免疫抗癌剤とし
て実際に有効であることを知見した。

従って、第１の本発明によれば、哺乳動物の内臓器の生
の細胞の細胞膜から分離された水溶性ないし易水分散性
の蛋白質及び糖蛋白質を有効成分として含むことを特徴
とする、免疫抗癌剤が提供される。

本発明においても、本発明の抗癌剤を製造するのに用い
る原料としては、一般的には、マウス。

ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ又は
ウマの如き哺乳動物の給仕の肝臓、腎臓。

膵臓、肺臓、胸腺又はリンパ腺の如き内臓器が使用でき
る。特に、ウシ、ブタ、ウマの肝臓、肺臓及び胸腺を使
用するのが好ましい。そして、哺乳動物の内臓器は新生
仔のものが好ましいが、成熟した動物の内臓器も使用で
きる。目的の有効物質を採取する操作を簡便にするため
には、内臓器内に結合組織、脂肪組織が未だ十分に発達
してないような内臓器を用いるのが適当である。

本発明の抗癌剤の有効成分として用いられる蛋白質及び
糖蛋白質は、一般的には次の手法により採取できる。す
なわち、前記の哺乳動物から内臓器を摘出し、その生の
内臓器から血液、血管、結合組織及び脂肪組織の部分を
可及的に除去した臓器残部の細胞を等張渡と共に細胞形
態が無くなるまで破砕且つホモジナイズし、得られたホ
モシナ膜を通して等張渡又は水に対して透析して上清液
からアミノ酸、低分子量のオリゴペプチド、糖類及び塩
類を除去し、得られた透析液を乾燥又は濃縮することに
よって採取できる。

更に具体的に、本発明の医薬の有効成分物質の採取法を
説明すると、次の通りである。すなわち先ず動物の所要
臓器を可及的に無菌的に摘出し、ヘパリンなど抗血液凝
固剤を含む等張渡で十分潅流して血液を除去する。

この際、等張渡としては、生理食塩液、ブドウ糖液、蔗
糖液ＰＢ８．ＩＪンゲル液などの塩含有緩衝溶液が使用
できる。

こうして洗浄した内臓器から５血管、血液、結合組織お
よび脂肪組織の部分をナイフにより可及的に除去し、細
切する。

次に、このようにして得た内臓型細片を３〜５倍の容量
のＰＢＲの如き等張渡と混ぜ、ブレンダーツミキサー、
ホモジナイザー（ガラス、テフロン製など）、ポリトロ
ン型破砕器、フレンチプレスなどに入れて破砕及びホモ
ジナイズする。この破砕及びホモジナイズの工程は、可
及的に低温で５１Ｊえば氷冷下に行うのが好ましく、ま
た内臓器に含まれる酵素系を不活化するために等張渡中
に０．１〜１％、好ましくは０．５％（重量）のホルム
アルデヒド又はグルクールアルデヒドを添加しておくの
が好才しい。このホモジナイズ工程に際して用いる等張
渡としては、ＰＢＳに少量のグルクールアルデヒドおよ
びフンカナバリンＡを添加して得られる緩衝液を使用す
ることもできる。

上記のようにして得られたホモジナイズ液は、次に、こ
れを１５００ｒｐｍ　、２００Ｏｒｐｍ　（３００−６
００ＸＰ）の回転速度で５〜１５分間遠心分離して上清
液画分を分取する。

さらに、その上清液を流水あるいはＭ／ＩＱＯのＰＢＳ
等の如き等張渡に対して透析する。

この際、透析膜としては、市販のセルローズ透析膜、そ
の他各種の限外ｐ過膜を使用できる。透析完了后、透析
液中の蛋白量を測定し、例えば波長２８０ｍμの紫外部
吸収法、韮たはビュウレット法で蛋白量を測定し、必要
に応じて等張渡を追加することによって蛋白量を一定の
値、例えば１０〜３０　”？　／　ａｔの蛋白濃度にす
るのが好ましい。

更に、この透析液を凍結保存するか又は凍結乾燥、好ま
しくは凍結真空乾燥する。あるいは、透析液は濃縮して
、そのｒｅ　、＊　ｉを凍結保存又は凍結乾燥してもよ
い。この際、各種賦型剤および防腐剤としてのチメロサ
ールなどを配合してもよい。

上記の手法で哺乳動物の内臓器の生の細胞の細胞膜から
分離された物質は水溶性ないし易水分散性の蛋白質及び
ａＷ蛋白質から実質的に成り、本発明の抗癌剤の有効成
分として使用されるが、この有効成分物質は白色粉末又
は黄色を帯びた白色乃至黄橙色の粉末であり、その色調
は原料の臓器により異なる。胸腺、肺臓、腎臓から得た
ものは白色であるが肝臓および肺臓から得たものは淡黄
色乃至淡い黄橙色を呈する。これらの点で、先の発明に
より哺乳動物給仕の内臓器から得られた有効物質と性状
が同じである。

本発明の有効物質の溶解性をみると、水には極めて溶解
又は分散しやすいが、メタノール、エタノール、アセト
ン、クロロホルムには殆んど溶けない。

本発明の有効成分物質を水に溶解した液は中性であり、
そのｐＨは７２〜Ｚ４で全く刺戟性は認められない。

本発明の有効成分物質はアンプル又はバイアルビンに入
れて低温下で保存できるが、前記の透析液の形のまＸア
ンプル又はバイアルビン内に分注、密封して凍結保存で
きる。また、透析液を乳糖、ショ塘、ブドウ糖、マンニ
トール、ソルビトールなどの賦形剤と混合してから、凍
結乾燥することもできる。

本発明の有効成分物質は、分子量１万以上の蛋白質及び
糖蛋白質よりなると考えられる。これを加水分解すると
、加水分解物中にＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセ
チルガラクトサミン、シアル（１１，ｐ　カラクトース
、マンノース、クルコース。

フコースの糖と、各種アミノ酸が検出さイｔた。本発明
の有効成分物質は、その精確な組成が未だ精成物質例え
ば、核、ミトコンドリア、小胞体の如き細胞小器官の物
質から由来する成分も不可避的に随伴しているとも考え
られる。しかし、現在の分離技術では、細胞から細胞膜
成分を完全に純粋の形で分離することは実際上極めて困
難である。

本発明について前述した手法で分離された蛋白質及び糖
蛋白質よりなる物質は、その精確な組成が未解明である
けれども、これを生体に投与すれば癌細胞特異抗体を産
生できる抗原としての生理学的活性を有し、そして免疫
抗癌剤として有効であることは明らかである。

本発明の有効成分物質を動物の内臓器の細胞の細胞膜か
ら採取する過程においては、その細胞膜成分の蛋白質及
び糖蛋白質が共存する酵素系などの作用を受けて変質す
ることは可及的に避けることが望ましい。その細胞膜成
分の変質を防止するには、従来生物組織の固定剤として
知られるアルデヒド化合物、例えはホルムアルデヒド、
アセトアルデヒド又はゲルタールアルデヒドが有効であ
ることを本発明者は知見した。すなわち、内臓器細片の
ホモジネート／＆を遠心分離して得られた上清液に対し
て、１〜６％、好ましくは２〜３％（重量）の濃度にな
る量の該アルデヒド化合物を添加して′５０〜９０分間
、好ましくは５０〜６０分間低温〜室温で放置すると、
酵素の不活化が行われる。この際、蛋白質類は多少とも
変性を受けて固定処理が達成されるが、更に変質するこ
とは防止される。このようにアルデヒド固定剤化合物の
固定処理を受けた後に上清液から分離された水溶性ない
し易水分散性の蛋白質及び糖蛋白質は、アルデヒド化合
物による変性を多少とも受けているが、その免疫抗癌活
性を向上しており、また更に変質せずに保存できる貯蔵
性が向上されていることが認められた。

従って、第２の本発明によれは゛、哺乳動物の内臓器の
生の細胞の細胞膜から分離され且つ生物組織固定剤とし
て知られるアルデヒド化合物で固定処理されることによ
る変性を受けた水溶性ないし易水分散性の蛋白質及び糖
蛋白質を有効成分として含むことを特徴とする、免疫抗
癌剤が提供される。

第２の本発明による抗癌剤の有効成分物質の採取法は、
一般的には、哺乳動物から可及的に無菌的に所要の内臓
器を摘出し、その生の内臓器から血液、血管、結合組織
及び脂肪組織の部分を可及的に除去した臓器残部の細胞
を等張渡と共に細胞形態が無くなるまで破砕及びホモジ
ナイズし、得られたホモジナイズ液を遠心分離にかけ、
得られた上清液に、その中の蛋白質及び糖蛋白質の変質
を防止する量のアルデヒド化合物を混和して固定処理し
、その固定処理を受けた上滑液を透析膜を通して等張渡
又は水に対して透析して該上清液からアミノ酸、低分子
量のオリゴペプチド、糖類及び塩類並びに使用アルデヒ
ド化合物を除去し、得られた透析液を乾燥又は濃縮する
ことによって行われる。この採取法の各段階は、第１の
発明の有効成分物質を分離する夫々対応の段階と同じ要
領で行える。但し、遠心分離された上清液をアルデヒド
固定剤で固定処理する段階は、この上清液にこれと実質
的に等容量の量の、アルデヒド固定２〜５％を含むＰＢ
Ｓ又は他の緩衝液を混和し、水冷下又は室温で３０〜９
０分間、好ましくは５０〜６０分間放置することによっ
て実施される。

第２の本発明の有効成分物質の理化学的性質は、第１の
本発明の有効成分物質のそれと実質的に区別できなかっ
た。

本発明の免疫抗癌剤は、経口、皮下、皮肉、筋肉内又は
腹腔内に投与することができ、ザルコーマ１８０．ロイ
ケミアＬ−１２１０，ロイケミアＰ−６８８に有効であ
ることが確認された。またエールリッヒ、カルシノーマ
及びマウス癌細胞Ｍｅｔｈ−Ａに有効であろうと推定さ
れるから、抗癌スペクトルが広いという利点がある。

さらに、本発明の免疫抗癌剤は、リンパ球を幼若化する
作用をもつと知らｎるＰ　Ｉ４　Ａ　（ｐｈｙｔｏｈ−
ｅｍａ−ｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　植物性血球凝集素）、及
び／又はリンパ球を幼若化する作用と癌細胞を凝集する
作用をもつと知られるコンカナバリンＡ　（ｃｏｎｃａ
−ロａｖａｌ　ｉｎ　Ａ、　ＰＨＡの一種）と配合して
使用すると、その抗癌効果を増強できる。

さらに、第３の本発明によれば、］Ｉ１■乳動物の内臓
器の生の細胞の細胞膜から水溶性ないし易水分散性の蛋
白質及び糖蛋白質を採取し、この蛋白質及び糖蛋白質を
生物組織の固定剤として知られるアルデヒド化合物固定
処理し、更にアルデヒド化合物での固定処理による変性
を受けた蛋白質及び糖蛋白質を免疫抗癌剤として分離す
ることを特徴とする免疫抗癌剤の製法が提供される。

次に本発明を実施例及び試験例について具体的に説明す
る。

実施例１ イ）屠畜場において屠殺Ｍ本された３ケ月令の仔ウシ（
メス、体重約１００〜）から可及的に無菌的に実質臓器
、すなわち肝臓、肺臓、および胸腺を摘出し、各臓器内
の血液、血管、結合組織および脂肪組織をできるだけ取
り除いた。

（ロ）　前記のように処理した仔ウシの胸腺２５Ｊ’を
ビーカーに取り、ステンレス製ハサミで細切した。

得られた胸腺の細片に、　０．１ＭＰＢＳ　（ｐＨ７：
　４　）の１００ｍ１を加えてから、ホモジナイザー（
Ｐｏ１ｙｔｏｒｏｎ、Ｔｙｐｅ　　ＰＴ　　１０−３５
．　　　Ｋｉｎｅｍａｔｉｅａ　　社製）に装入し、水
冷下で１０，０００ｒｐｍの回転速度で破砕及びホモジ
ナイズした。得られたホモジナイズ液を遠心分離器に移
し、５℃で２００Ｏｒｐｍ（６００ｘ　ｔ　）の回転速
度で１０分間遠心分離した。遠心分離で生じた沈澱物に
は、脂肪、血球、結合組織および未破砕の細胞物質等の
不溶固体分が混入しており、この沈澱物を捨てた。一方
、乳白色を呈した遠心上清液画分の１１５−がとれた。

この上清液画分には細胞膜の主要構成成分が含まれる。

このように調製した試料ｆｉＡ　１５−をセルローズ透
析膜の袋（商品名Ｖｉｓｋｉｎｇ膜、米国ビスキング社
製）に入れて透析した。この透析は外液としてのＩ　Ｏ
−”　Ｍ　ＰＢＳの中に前記の透析膜の袋を懸吊して、
５℃にて４日間外液をスターラーで撹拌しながら行い、
この間１日に１回外液を新しいものと交換した。

透析完了した試料液１２６ａｖが得られた。この透析液
の蛋白量をビウレット法によって測定し。

総蛋白量は１７２４ノとなり、原料の胸腺２５１から６
８．９６％の収量で蛋白質類を抽出し得たことになる。

この透析液の蛋白量を１０＋＋ｖ／ｉの蛋白量を含むよ
うに０．１ＭＰＢＳを加えて調整した。

上記のように調製した希釈透析液をバイアルビンに５ｍ
Ｊずつ分注して液体窒素で瞬間凍結したのち、凍結真空
乾燥を行った。本発明の免疫剤物質として用いられる白
色の水溶性の粉末（全ＩＺ９４りを得た。

この粉末中の総蛋白（蛋白質＋糖蛋白質）の量をビウレ
ット法で測定すると、９６２■／ｌであった。また、こ
の粉末は使用したＰＢＳに由来する塩類を含有した。

実施例２ 実施例１イ）で前処理した仔ウシの肝臓２５Ｐをビーカ
ーに取り、ステンレス製ハサミで細切した。

これに０．１　Ｍ　ＰＢＳ（ｐＨ７，４）の１００−を
加えて。

ホモジナイザー（Ｐｏ１ｙｔｏｒｏｎ、　Ｔｙｐｅ　Ｐ
Ｔ　Ｉ　Ｄ　−５５゜Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）に入
れ、水冷下に１０．００Ｏｒｐｍの回転速度で破砕及び
ホモジナイズした。この得られたホモジナイズ液を遠心
分離器に移した后、５℃で２００Ｏｒｐｍ（６００ＸＰ
’）の回転速度で１０分間遠心分離した。遠心分離で生
じた沈澱物には。

脂肪、血球、結合組織および未破砕の細胞物質等の不溶
固体分が混入しており捨てた。また遠心上清液の最上層
に２〜３關位の厚さに脂肪層が析出していたので、この
脂肪層を取除いて上清液画分を分取した。この上清液画
分は淡い黄赤色を呈した液体１Ｇ６ｎｌｌであった。こ
のように調製した試料液１０６ｍｌ全てをセルローズ透
析膜の袋（商品名Ｖｉｓｋｉｎｇ　）に入れて透析した
。透析は外液としての１０−３Ｍ　ＰＢＳの中に透析膜
の袋を吊して５℃にて４日間外液をスターラーで撹拌し
ながら行い、透析中は１日１回外液を新しいものと交換
した。

透析完了した試料液、すなわち透析液の蛋白量をビウレ
ット法によって測定し、蛋白量が１０ｍ９／　ｍｅにな
るようにＰＢＳを加えて全液量を１１８５ｄにした。こ
の希釈した透析液の総蛋白量は１１．８５１となるから
、原料の肝臓組織２５ｐから４７．４１％の収量で蛋白
質を抽出し得たことに相当する。

上記のように調製した希釈透析液をバイアルピンに５＃
＋６ずつ分注して液体窒素で瞬間凍結した后、凍結真空
乾燥を行った。

本発明の抗癌剤物質かや＼黄白色の水溶性の粉末として
得られた。全収１７１２．１６Ｐ０実施例 実施例１（イ）で前処理した仔ウシの肺臓２５７’を実
施例１（ロ）と同様に処理した。本発明の免疫剤物質と
して用いられる白色の水溶性粉末１１．＜ＳＩＪ’が？
ｑらイｔた。

実施例４ 実施例１げ）と同様にして処理した仔ウシの胸腺２５Ｊ
’をビーカーに取り、ステンレス製ノ１サミで細切した
。得られた胸腺の細片に、酵素を不活化させるため、ゲ
ルタールアルデヒドの０．５％を含むり、ＩＭＰＢＳ（
ｐＨ７，４）の１００１１！７！を加えてから、ホモジ
ナイザー（Ｐｏ１ｙｔｏｒｏｎ、Ｔｙｐｅ　ＰＴ　１０
−３５゜Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）に装入し、水冷下
で１０，０００ｒｐｍの回転速度で破砕及びホモジナイ
ズした。このホモジナイズ液を遠心分離器に移し、５℃
で２０００ｒｐｍ　（６０（］ｘｙ）　　の回転速度で
１０分間遠心分離した。遠心分離で生じた沈澱物には、
脂肪、血球。

結合組織および未破砕の細胞物質等の不溶固体分が混入
しているので、この沈澱物を捨てた。一方。

乳白色を呈した遠心上清液両分の１０８−がとれた。こ
の上清液両分には細胞膜の主要構成成分が含まれる。こ
の上清液に、ゲルタールアルデヒド５％（重量）を含む
０．ＩＭＰＢＳの１０８−を加えて６０分間水冷下に静
かに撹拌して固定処理した。

このようにゲルタールアルデヒドで処理した試料液２１
５ｄをセルローズ透析膜の袋（商品名Ｖｉｓｋｉｎｇ膜
、米国ビスキング社製）に入れて透析した。この透析は
外液としての１０−３ＭＰＢＳの中に前記の透析膜の袋
を懸吊して、５℃にて４日間外液をヌターラーで撹拌し
ながら行い、この間１日に１回外液を新しいものと交換
した。

透析完了した試料液、すなわち透析液の蛋白量をビウレ
ット法によって測定し、１０■／　ｗｅの蛋白量を含む
ように０．ＩＭＰＢＳを加えて全量を１６６５−にした
。この希釈した透析液の全体中の総蛋白量は１６．３４
Ｊ’となり、原料の胸腺２５Ｊ’から６５、５４％の収
量で蛋白質類を抽出し得たことになる。

このように調製した試料液をバイアルビンに５−ずつ分
注して液体窒素で瞬間凍結したのち、凍結真空乾燥を行
った。本発明の有効成分物質とＰＢＳ由来の塩類との混
合物からなる白色の水溶性の結晶状粉末を得た。

この粉末中の総蛋白量はビウレット法で測定すると９７
１＋＋ｙ／ｌＬｌであった。

実施例５ 実施例２で得られた仔ウシの肝臓細胞由来の上清液画分
の１００ｍ１に対して、ゲルタールアルデヒド５％を含
む０．ＩＭＰＢＳの１００−を加えて６０分間水冷下に
静かに撹拌して固定処理した。

このように処理した試料液２０〇−全てをセルローズ透
析膜の袋（商品名Ｖｉｓｋｉｎｇ　）に入れて透析した
。透析は実施例２と同様に行った。

透析完了した試料液、すなわち透析液の蛋白量をビウレ
ット法によって測定し、蛋白量が１０■／―になるよう
にＰＢＳを加えて全液量を１１８９ｄにした。この希釈
した透析液の総蛋白量は１１．８９１となるから、原料
の肝臓２５／から４Ｚ５４％の収量で蛋白質を抽出し得
たことに相当する。

このように調製した試料液をバイアルビンに５ｍｌずつ
分注して液体窒素中で瞬間凍結した后、凍結真空乾燥を
行った。

本発明の有効成分物質とＰＢＳ由来の塩類との混合物よ
りなりやメ黄白色の水溶性の結晶状粉末が得られた。収
量１１．６８Ｊ’０この粉末の蛋白質含量はビウレット
法で′６１］］定すると９６６■／Ｐであった。

実施例６ 実施例１イ）で前処理した仔ウシの肺臓２５Ｊ’を実施
例５と同様の手法でクルタールアルデヒドを用いて処理
した。本発明の免疫剤物質として用いられる白色の水溶
性粉末１０．２６ノが得られた。

実施例７ （イ）屠畜場で屠殺、解体された成牛（去勢オス。

体重約３００　Ｋｙ　）から可及的に無菌的に各々の実
゛質臓器、すなわち肝臓、膵臓、胸腺を夫々に摘出し、
各臓器内の血液、血管、結合組織および脂肪組織をでき
るだけ取り除いた。

（ロ）　前記のように処理した成牛の胸腺２５１をビー
カーに取り、ステンレス製ハサミで細切した。

得られた胸腺の細片に、０．１　Ｍ　ＰＢＳ　（ｐＨ７
，４）の１００−を加えてから、ホモジナイザー（Ｐｏ
１ｙｔｏｒｏｎ、　Ｔｙｐｅ　ＰＴ　１０−３５　、　
Ｋｉｎｅｒｎａｔｉｅａ社製）に装入し、水冷下で１０
．００　Ｏｒｐｍの回転速度で破砕及びホモジナイズし
た。得られたホモジナイズ液を遠心分離器に移し、５℃
で２００Ｏｒｐｍ（６００Ｘｊ’　）の回転速度で１０
分間遠心分離した。

遠心分離で生じた沈澱物には、脂肪、血球、結合組織お
よび未破砕の細胞物質等の不溶固体分が混入しており、
この沈澱物を捨てた。一方、乳白色を呈した遠心上清液
画分の１０７ｄがとれた。この上精液両分には細胞膜の
主要構成成分が含まれる。

このように′ｒＡ製した試料液１０７ゴをセルローズ透
析膜の袋（商品名Ｖｉｓｋｉｎｇ膜、米国ビスキング社
製）に入れて透析した。この透析は外液としての１０−
３Ｍ　ＰＢ　Ｓの中に前記の透析膜の袋を懸吊して、５
℃にて４日間外液をスターラーで撹拌しながら行い、こ
の間１日に１回外液を新しいものと交換した。

透析完了した試料液１１６−が得られた。この透析液の
蛋白量をビウレット法によって測定し、総蛋白量は６６
．７２Ｍ’となり、原料の胸腺２５ｔから６６．８８％
の収量で蛋白質類を抽出し得たことになる。この透析液
の蛋白量を１０　”ｌ；’　／　ｍｌの蛋白量を含むよ
うに０．１ＭＰＢＳを加えて調整した。

上記のように調製した希釈透析液をバイアルビンに５　
ａｔずつ分注して液体窒素で瞬間凍結したのち、凍結真
空乾燥を行った。本発明の免疫剤物質として用いられる
白色の水溶性の粉末（全量１６．４９／）を得た。

この粉末中の総蛋白（蛋白質＋糖蛋白質）の量をビウレ
ット法で測定すると、９６６■／ｆであった。また、こ
の粉末は使用したＰＢＳに由来する塩句を含有した。

実施例８ 実施例７（イ）で前処理した成牛の肝臓２５１をビーカ
ーに取り、ステンレス製ハサミで細切した。

これに０．１　Ｍ　ＰＥ　Ｓ　（ｐＨ７、４）の１００
−を加えて。

ホモジナイザー（Ｐｏ１ｙｔｏｒｏｎ、Ｔｙｐｅ　ＰＴ
　１０−３５゜Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）に入れ、水
冷下に１０．ＯＤＯｒｐｍの回転速度で破砕及びホモジ
ナイズした。この得られたホモジナイズ液を遠心分離器
に移した后、５℃で２００Ｏｒｐｍ　（６００ＸＪ’）
の回転速度で１０分間遠心分離した。遠心分離で生じた
沈澱物には、脂肪、血球、結合組織および未破砕の細胞
物質等の不酵固体分が混入しており捨てた。また遠心上
滑液の最上層に４〜６　ｍｍ位の厚さに脂肪層が析出し
ていたので、この脂肪層を取除いて上清液画分を分散し
た。この上清液画分は淡い黄赤色を呈した液体１０８ｍ
／であった。このようにル４製した試料液１０８−全て
をセルローズ透析膜の袋（商品名Ｖｉｓｋｉｎｇ　）に
入れて透析した。透析は外液として１０−”Ｍ　ＰＢＳ
の中に透析膜の袋を吊し、て５℃にて４日間外液をスタ
ーラーで撹拌しながら行い、透析中は１日１回外液を新
しいものと交換した。

透析完了した試料液、すなわち透析液の蛋白量をビウレ
ット法によって測定し、蛋白量が１０ｑ／ｄになるよう
にＰＢＳを加えて全液量を１０９６ｍ１にした。この希
釈した透析液の総蛋白量は１０．９６ノとなる力１ら、
原料の肝臓組織２５１から４３．８４％の収量で蛋白質
を抽出し得たこさに相当する。

上記のように調製した希釈透析液ヲパイアルビンに５　
ｒａｌずつ分注して液体窒素で瞬間凍結した后、凍結真
空乾燥を行った。

本発明の抗癌剤物質かや′＞黄白色の水溶性の粉末とし
て得られた。全収量１０．２６．Ｐ。

実施例９ 実施例７（イ）で前処理した成牛の肺臓２５Ｊ’を実施
例７（ロ）と同様に処理した。本発明の免疫剤物質とし
て用いられる白色の水溶性粉末１１．６７１が得られた
。

実施例１０ 実施例フイ）と同様にして処理した成牛の胸腺２５７’
をビーカーに取り、ステンレス製ハサミで細切した。得
られた胸腺の細片に、酵素を不活イヒさせるため、ゲル
タールアルデヒドの０５％を含むｏ、１ＭＰＢＳ　（ｐ
Ｈ７，４）の１００ｍ１を加えてから、ホモジナイザー
（Ｐｏ１ｙｔｏｒｏｎ、　Ｔｙｐｅ　ＰＴ　１０−６５
゜Ｋｔｎｅｍａｔｉｃａ社製）に装入し、水冷下でｉ　
ｏ、ｏ　ｏ　。

ｒｐｍの回転速度で破砕及びホモジナイズした。このホ
モジナイズ液を遠心分離器に移し５５°Ｃで２　［１０
（ｌ］　ｒｐｍ　（６００Ｘ４）の回転速度で１０分間
遠心分離した。遠心分離で生じた沈澱物には、脂肪。

血球、結合組織および未破砕の細胞物質等の不溶固体分
が混入しているので、この沈澱物を捨てた。

一方、乳白色を呈した遠心上清液画分の１１１ＴＬｌが
とれた。この上清液画分には細胞膜の主要構成成分が含
まれる。この上清液に、グルタールアルテヒド５％（重
量）を含む０．１ＭＰＢＳの１１１ｄを加えて６０分間
水冷下に静かに撹拌して固定処理した。このようにグル
クールアルデヒドで処理した試料液２２１ｒｎｌ！をセ
ルローズ透析膜の袋（商品名Ｖｉｓｋｉｎｇ膜、米国ビ
スキング社製）に入れて透析した。この透析は外液とし
ての１０−”　Ｍ　ＰＢＳの中に前記の透析膜の袋を懸
吊して、５℃にて４日間外液をスターラーで撹拌しなが
ら行い、この間１日に１回外液を新しいものと交換した
。

透析完了した試料液、すなわち透析液の蛋白量をビウレ
ット法によって測定し、１０πｑ　／　ａｔの蛋白量を
含むように０．１ＭＰＢＳを加えて全量を１６７０−に
した。この希釈した透析液の全体中の総蛋白量は１６．
７０ｊ’となり、原料の胸腺２５ｊ’から６６８０％の
収量で蛋白質類を抽出し得たことになる。

前記の液を液体窒素で瞬間凍結したのち、凍結真空乾燥
を行った。本発明の有効成分物質とＰＢＳ由米由来類と
の混合物からなる白色の水溶性の結晶状粉末を得た。

この粉末中の総蛋白量はビウレット法で測定すると９６
８７９／ｌであった。

実施例１１ 実施例７（イ）、（ロ）で得られた成牛の肝臓の細胞由
来の上清液画分の１１０ｍ／に対して、グルクールアル
デヒド５％を含む０．１ＭＰＢＳの１１０ｒＬｌを加え
て６０分間水冷下に静かに撹拌して固定処理した。この
ように処理した試料液２１９−全てをセルローズ透析膜
の袋（商品名Ｖｉｓｋｉｎｇ　）に入れて透析した。透
析は実施例７（回と同様に行った。

透析完了した試料液、すなわち透析液の蛋白量をビウレ
ット法によって測定し、蛋白量が１０■／ＩＩ＋７！に
なるようにＰＢＳを加えて全液量を１０１６−にした。

この希釈した透析液の総蛋白量は１０．１６１となるか
ら、原料の肝臓２５Ｐから４０．６４％の収量で蛋白質
を抽出し得たことに相当する。

前記の希釈透析液をバイアルビンに５　ｍｌずつ分注し
て液体窒素中で瞬間凍結した后、凍結真空乾燥を行った
。

本発明の有効成分物質とＰＢＳ由来の塩類との混合物よ
りなりやＸ黄白色の水溶性の結晶状粉末が得られた。収
量ｑ、ｅ＋ｑｐ０この粉末の蛋白質含量はピコ−クレッ
ト法で測定するとｑ６６ｍｙ／ｌであった。

実施例１２ 実施例７ビ）で前処理した成牛の肺臓２５Ｐを実施例１
０と同様の手法でゲルタールアルデヒド存在下にホモジ
ナイズし、遠心分離し、得られた上清液を実施例１０と
同様の手法でゲルタールアルデヒド 様に透析、凍結乾燥した。黄白色の水溶性粉末の形の本
発明の抗癌剤物質１１．７１７’が得られた。

実施例１６ （イ）屠畜場において層殺解体された６週令の仔ブタ（
オス、体重約５に７）から可及的に無菌曲番こ実質臓器
．すなわち肝臓，膵臓，胸腺を摘出し、各臓器内の血液
，血管，結合組織および脂肪組織を可及的に取り除いた
。

（口）前記のように処理した仔ブタの肝臓，膵臓。

及び胸腺を夫々に実施例１（四と同様の手法番こより処
理した。夫々に、淡黄白色乃至ベージュ色の水溶性粉末
ないし白色の水溶性粉末として本発明の抗癌剤物質が得
られた。

実施例１４ 実施例１６（イ）で前処理した仔ブタの肝臓２５ノを実
施例２と同様の手法でホモジナイズし、遠４分離し、得
られた上清液を実施例１０と同様の手法でゲルタールア
ルデヒド５％を含む０．１ＭＰＢＳで処理し、更に同様
に透析、凍結乾燥した。黄白色の水溶性粉末の形の本発
明の抗癌剤物質１１．２５１が得られた。

実施例１５ 実施例１６（イ）で前処理した仔ブタの膵臓２５１又は
胸腺２５１を実施例１０と同様の手法でゲルタールアル
デヒドで処理した。夫々に．本発明の抗癌剤が白色の水
溶性粉末の形で１５．５Ｊ’　又は１６５り得られた。

実施例１６ （イ）屠畜場で層殺解体された成豚（去勢オス、体重約
７　０　Ｋ９　）から可及的に無菌的に各々の実質臓器
、すなわち肝臓，膵臓，胸腺を夫々に摘出し。

各臓器内の血液，血管，結合組織および脂肪組織を可及
的に取り除いた。

（口）前記のように処理した成豚の肝臓，膵臓，及び胸
腺を夫々に実施例１（口）と同様の手法により処理した
。夫々に、淡黄白色乃至ベージュ色の水溶性粉末ないし
白色の水溶性粉末として本発明の抗癌剤物質が得られた
。

実施例１７ 実施例１６ビ）で前処理した成豚の肝臓２５３’を実施
例２と同様の手法でホモジナイズし、遠ＩＵｓ分離し、
得られた上清液を実施例１０と同様の手法でゲルタール
アルデヒド５％を含むＯｌＭＰＢＳで処理し、更に同様
に透析，凍結乾燥した。黄白色の水溶性粉末の形の本発
明の抗癌剤物質１０．８２１が得られた。

実施例１８ 実施例１６（イ）で前処理した成豚の膵臓２５！、又は
胸腺２５３’を実施例１０と同様の手法でり゛ルーター
ルアルデヒドで処理した。夫々１こ、本発明の抗癌剤が
白色の水溶性粉末の形で１４．６７Ｐ又（ま１６、７９
Ｐ得られた。

試験例１（予防的試験） 先の各実施例１〜１８で本発明の免疫剤として得られた
凍結真空乾燥粉末を生理食塩水又番ま蒸留水に溶解して
総蛋白含量が１０Ｉｎｇ／＋ｖ！こなるような各種のワ
クチンを調製し、これらワクチンの１η〜３キ（　ｏ．
ｉ　ｄ−Ｄｉａｌ）を供試動物に皮下注射した。これら
ワクチンの注射は１週間間隔で３回投与しワクチン最終
注射から１週間后に，すなわち第１回のワクチン注射か
ら２１日目にそれぞれの供試動物に腫瘍細胞を皮下注射
により移植した。試験した腫瘍細胞はザルコーマ１８０
，ロイケミアＬ−１２１０及びロイケミアＰ−３８８で
ある。

ザルコーマ１８０はこれのＩＸ１０’個の細胞を被験動
物（ｄｄＮマウス、雌，７週令，各群５匹）のそけい部
皮下に移植し、癌細胞移植后６週間目（２１日目）に、
腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定し、処理群の腫瘍平均型
ｕ（Ｔ）と対照群の腫瘍平均重量（Ｃ）を算出し，Ｔ／
Ｃ値園及び抑制率（１００−Ｔ／Ｃ％）の値を求め．ワ
クチンの癌予防効果の判定を行った。また、ロイケミア
Ｌ−１２１０は５．５Ｘ１０’個，ロイケミアＰ−　３
８８は５。ＯＸ１０４個の細胞を被験動物（　ＣＤＦ＋
マウス、雌，７週令，各群５匹）のそけい部皮下に移植
し、対照群に比較しての処理群の延命時間を測定して．
対前群の値を１００％としてＴ　／　Ｃ％ｌの値を算出
した。

列えば、ザルコーマ１８０接種群について腫瘍平均重量
は、実施例１の製品粉末（仔ウシの胸腺由来の有効成分
物質、ゲルタールアルデヒド無処理）のワクチン注射群
では０．４８８り、対照群（ワクチン無投与）では２．
８５４／であった。同じく、ザルコーマ１８０接種群に
ついて、腫瘍平均重量は、実施例４の製品粉末（仔ウシ
の胸腺由来の有効成分物質、ゲルタールアルデヒド処理
）のワクチン注射群では、０．１７４ｊ’、対照群（ワ
クチン無投与）では、２．７１９Ｍ’であった。

試験結果を次の第１表〜第６表に要約して示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　哺乳動物の内臓器の生の細胞の細胞膜から分離さ
   れた水溶性ないし易水分散性の蛋白質及び糖蛋白質を有
   効成分として含むことを特徴とする、免疫抗癌剤。 ２　哺乳動物の内臓器の生の細胞の細胞膜から分離され
   且つ生物組織固定剤として知られるアルデヒド化合物で
   固定処理されることによる変性を受けた水溶性ないし易
   水分散性の蛋白質及び糖蛋白質を有効成分として含むこ
   とを特徴とする、免疫抗癌剤。 ３、　　＠乳動物はマウス、ラット、モルモット。 ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ又はウマである特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の抗癌剤。 ４、　内臓器は肝臓、腎臓、膵臓、胸腺又はリンパ腺で
   ある特許請求の範囲第１項又は第２項記載の抗癌剤。 ５、動物内臓器の生の細胞の細胞膜から分離された水溶
   性ないし易水分散性の蛋白質及び糖蛋白質とは、動物の
   生の内臓器から血液、血管、結合組織及び脂肪組織の部
   分を可及的に除去した臓器残部の細胞を等張液と共に細
   胞形態が無くなるまで破砕且つホモジナイズし、得られ
   たホモジナイズ液を遠心分離にかけ、得られた上清液を
   透析膜を通して等脹液又は水に対して透析して上清液か
   らアミノ酸、低分子量のオリゴペプチド、糖類及び塩類
   を除去し、得られた透析液を乾燥又は濃縮することによ
   って得られた水溶性ないし易水分散性の蛋白質及び糖蛋
   白質を主成分とする粉末又はａ′是縮液である特許請求
   の範囲第１項記載の抗癌剤。 ６　アルデヒド化合物は、ホルムアルデヒド。 アセトアルデヒド又はグルクールアルデヒドである特許
   請求の範囲第２項記載の抗癌剤。 Ｚ　哺乳動物の内臓器の生の細胞の細胞膜から分離され
   且つ生物組織固定剤として知られるアルデヒド化合物で
   固定処理されることによる変性を受けた水溶性ないし易
   水分散性の蛋白質及び塘蛋白質とは、動物の生の内臓器
   から血液、血管、結合組織及び脂肪組織の部分を可及的
   に除去した臓器残部の細胞を等張渡と共に細胞形態が無
   くなるまで破砕及びホモジナイズし、得られたホモジナ
   イズ液を遠心分離にかけ、得られた上清液に、その中の
   蛋白質及び糖蛋白質の変質を防止する量のアルデヒド化
   合物を混和して固定処理し、その固定処理を受けた上清
   液を透析膜を通して等張渡又は水に対して透析して該上
   清液からアミノ酸、低分子量のオリゴペプチド、糖類及
   び塩類並びに使用アルデヒド化合物を除去し、得られた
   透析液を乾燥又は濃縮することによって得られた水溶性
   ないし易水分散性の蛋白質及び糖蛋白質を主成分とする
   粉末又は濃縮液である特許請求の範囲第２項記載の抗癌
   剤。 ８、　哺乳動物の内臓器の生の細胞の細胞膜から水溶性
   ないし易水分散性の蛋白質及び糖蛋白質を採取し、この
   蛋白質及び糖蛋白質を生物組織の固定剤として知られる
   アルデヒド化合物で固定処理し、更にアルデヒド化合物
   での固定処理による変性を受けた蛋白質及び糖蛋白質を
   免疫抗癌剤として分離することを特徴とする免疫抗癌剤
   の製法。